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Artigo de método

Um ensaio in vitro para degradação de LpxC pela protease FtsH ligada à membrana e pelo adaptador LapB de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71092

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22 de junho de 2026

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1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Escherichia coli regula a biossíntese de lipopolissacarídeos (LPS) principalmente controlando a degradação da LpxC, a desacetilase que catalisa a primeira etapa comprometida da síntese de LPS. O objetivo deste protocolo é estabelecer um ensaio sensível e quantitativo de degradação in vitro para LpxC, utilizando a protease AAA+ reconstituída FtsH e o adaptador LapB em proteolipossomos.

Resumo

Este protocolo apresenta um ensaio sensível e quantitativo de degradação in vitro de LpxC usando protease AAA+ reconstituída (ATPase associada a diversas atividades celulares) FtsH e adaptador LapB em proteolipossomos. As proteases AAA+ são máquinas moleculares dependentes de ATP que mantêm a homeostase das proteínas e regulam diversos processos celulares no citoplasma ou nas membranas celulares. Comparadas às suas contrapartes citoplasmáticas, as proteases AAA+ ligadas à membrana continuam pouco caracterizadas devido a desafios técnicos na reconstituição e medição de sua atividade in vitro. Aqui, utilizamos o sistema FtsH–LapB–LpxC como modelo para desenvolver um ensaio de degradação baseado em fluorescência em proteolipossomos. FtsH e LapB são reconstituídos em proteolipossomos para imitar o ambiente de membrana nativo, e LpxC é marcado covalentemente com o corante fluorescente Atto488. A degradação é iniciada combinando proteolipossomos com LpxC e ATP marcados e terminada pelo ácido tricloroacético (TCA). Um ensaio bem-sucedido é definido por um aumento dependente do tempo na fluorescência na fração sobrenadante solúvel após a precipitação do TCA, correspondendo à liberação de fragmentos peptídicos fluorescentes gerados pela proteólise LpxC. Esse sinal permite a quantificação direta das taxas iniciais de degradação sob condições definidas. Comparado aos ensaios tradicionais baseados em eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), este método proporciona sensibilidade substancialmente aprimorada e possibilita análise cinética quantitativa. Além disso, o sistema de proteolipossomos permite uma investigação sistemática de como componentes proteicos, como adaptadores e anti-adaptadores, bem como a composição lipídica, influenciam a degradação do LpxC. Embora desenvolvido para o sistema FtsH–LapB–LpxC, esse ensaio é facilmente adaptável a outras proteases AAA+ e substratos ligados à membrana, fornecendo uma base geral para o estudo da proteólise associada à membrana in vitro.

Introdução

As proteases AAA+ são máquinas moleculares conservadas, dependentes de ATP, que desempenham papéis centrais no controle de qualidade das proteínas e na proteóliseregulatória 1,2. Essas máquinas contêm um anel hexamérico de domínio AAA+ ATPases, que hidrolisam ATP, reconhecem, desdobram e translocam os substratos para o domínio compartimental da protease paradegradação 1. Enquanto proteases citoplasmáticas AAA+ como ClpXP3 e Lon4 foram amplamente caracterizadas por ensaios in vitro bem estabelecidos, proteases AAA+ vinculadas a membranas permanecem relativamente pouco compreendidas. Essa lacuna reflete em grande parte os desafios técnicos associados à reconstituição das proteínas de membrana em ambientes lipídicos definidos e à medição quantitativa de sua atividade proteolítica in vitro. O objetivo geral desse método é estabelecer ensaios sensíveis e quantitativos para investigar a atividade proteolítica de proteases ligadas a membranas.

FtsH é a única protease AAA+ essencial em Escherichia coli e serve como uma protease AAA+ prototípica ligada àmembrana 5,6,7. Ancorado à membrana interna por hélices transmembranaras N-terminais, o FtsH degrada um conjunto diversificado de substratos citoplasmáticos e associados à membrana, regulando assim o controle de qualidade das proteínas de membrana, as respostas ao estresse e a homeostaselipídica 8,9,10,11. Um dos substratos mais bem caracterizados é a LpxC, uma desacetilase solúvel que catalisa a primeira etapa comprometida na biossíntese de lipopolissacarídeos (LPS) 12,13. A degradação eficiente de LpxC por FtsH requer a proteína de membrana LapB, que funciona como um adaptador para reconhecer especificamente LpxC e entregá-la à protease 14,15,16,17,18.

Apesar de sua importância fisiológica, a análise quantitativa da proteólise mediada por FtsH in vitro tem sido limitada, especialmente para substratos citoplasmáticos como LpxC. Ensaios tradicionais de degradação in vitro utilizam FtsH purificado em micelasdetergentes 13,19, que não fornecem o ambiente de membrana para a protease ancorada na membrana. Além disso, os ensaios de degradação frequentemente dependem da detecção do desaparecimento dosubstrato 13 baseada em SDS–PAGE, o que pode ser trabalhoso, de baixo rendimento e insuficientemente sensível para análises cinéticas. Mais recentemente, o FtsH reconstituído em bicelas tem sido usado para estudar a degradação de substratos membrananos, como pioneiro do grupo20 de Heedeok Hong; no entanto, ainda falta um sistema comparável para análise de substratos citoplasmáticos. Aqui, adaptamos a reconstituição da bicela de Heedeok Hong para a reconstituição de proteolipossomos para imitar o ambiente de membrana. Além disso, o substrato solúvel em água LpxC é marcado por fluorescência, o que permite medições sensíveis e quantitativas da cinética da degradação dependente de FtsH/LapB de LpxC in vitro.

Esse método deve ser usado quando pesquisadores precisam medir quantitativamente a proteólise mediada por FtsH de substratos solúveis em água. Ela oferece várias vantagens em relação às abordagens existentes. Primeiro, a detecção baseada em fluorescência de produtos proteolíticos, em vez do desaparecimento do substrato, melhora substancialmente a sensibilidade e a faixa dinâmica, facilitando comparações quantitativas da atividade proteolítica. Segundo, o uso de proteolipotômicos preserva o contexto membranar necessário para a função do FtsH, permitindo um controle preciso sobre a composição de proteínas elipídios 18. Por fim, embora tenha sido desenvolvido usando o sistema FtsH–LapB–LpxC, esse protocolo é facilmente adaptável a outras proteases AAA+ limitadas por membrana e seus substratos citoplasmáticos que requerem maquinaria de degradação associada à membrana.

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Protocolo

1. Rotulando LpxC com Atto488

  1. Preparação para o LpxC
    1. Exprima e purifique a proteína LpxC conforme relatadoanteriormente 18. Troque o tampão de LpxC purificado de Tris para tampão fosfato de 50 mM, pH 7,6 (6 mMNaH 2PO4, 44 mM Na2HPO 4, 150 mM NaCl) por filtração em gel usando uma coluna de filtração em gel de alta resolução (por exemplo, coluna Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Concentre LpxC usando uma coluna de ultrafiltração até uma concentração final de pelo menos 5 mg/mL a 4 °C.
  2. Rotulando LpxC com Atto488
    1. Dilua 0,5 mg de LpxC em um tampão fosfatado de 50 mM, pH 7,6, até um volume final de 225 μL. Adicione 25 μL de 1 M de bicarbonato de sódio para ajustar o pH para aproximadamente 8,3.
    2. Dissolver 0,24 mg de corante reativo Atto488 em 20 μL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M para preparar uma solução estocada (0,012 mg/μL). Prepare uma solução de trabalho diluindo 2 μL da solução padrão com 18 μL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M, obtendo uma concentração final de 0,00¹² mg/μL.
    3. Adicione imediatamente 4 μL da solução de trabalho Atto488 à solução proteica (correspondente a uma razão molar de LpxC: Atto488 de 3:1). Enrole o tubo com papel alumínio e incube a 4 °C por 2 horas com uma agitação suave (18 rpm).
      NOTA: Tanto o estoque Atto488 quanto as soluções de trabalho podem ser congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C.
  3. Separação de LpxC–Atto488 do corante livre
    1. Equilibre uma coluna de dessalinização PD-10 com 10 mL de água ultrapura, seguido por 15 mL de tampão fosfato de 50 mM, pH 7,6.
    2. Aplique a mistura de reação de marcagem na coluna e deixe que ela entre completamente na resina.
    3. Elute com 5 mL de tampão fosfato de 50 mM, pH 7,6. Duas bandas distintas correspondentes a LpxC–Atto488 (primeira banda) e o corante livre Atto488 (segunda banda) devem se tornar visíveis. Colete frações da primeira faixa em ~0,5 mL alíquotas.
    4. Analise frações eluídas por SDS-PAGE. Visualize a fluorescência sob iluminação UV antes da coloração com Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. Agrupe frações contendo LpxC–Atto488 e concentre a proteína marcada em aproximadamente 2 mg/mL.
    6. Estima a eficiência da marcação medindo a concentração de proteína e Atto488 usando um espectrofotômetro de microvolume.
      NOTA: Uma razão de concentração de Atto488 (em pmol/μL) para concentração de LpxC (em mg/mL) na faixa de 2–5 indica um nível de marcação apropriado. Isso corresponde a uma razão molar de Atto488 para LpxC variando de 1:15 a 1:6 após a marcação.
    7. LpxC–Atto488 aliquot em tubos microcentrífugas de 1,5 mL, congela rapidamente em nitrogênio líquido e armazena a -80 °C. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado por até 3 meses.
      ATENÇÃO: Nitrogênio líquido é extremamente frio; Manuse-o com equipamentos de proteção adequados (luvas criogênicas, proteção ocular).

2. Reconstituição de FtsH/LapB em proteolipossomos

  1. Preparação de lipossomos
    1. Transfira 100 mg de 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) em clorofórmio para um tubo de ensaio de vidro. Evapore o solvente sob um fluxo suave de N₂, seguido por uma secagem durante a noite sob vácuo.
      NOTA: O POPC possui uma temperatura de transição de fase de ~-2 °C e é amplamente utilizado em biofísica de membranas, formulações de lipossomos e sistemas modelos celulares.
      ATENÇÃO: O clorofórmio pode prejudicar os olhos, pele, fígado, rins e sistema nervoso. Equipamentos de proteção adequados (luvas, proteção ocular, máscara) são necessários durante o manuseio. Manuseie em um capuz usando uma seringa de vidro.
    2. Adicione 1.315 μL de buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) ao filme seco de POPC. Ressuspenda os lipídios alternando 1 minuto de sonicação em banho-maria com 1 minuto de vórtice em velocidade máxima, totalizando ~15 minutos, ou até que estejam totalmente dispersos. (concentração final de lipídios: 100 mM).
      NOTA: Para melhorar a ressuspensão lipídica, ajuste a profundidade de imersão do tubo de ensaio de vidro no sonicador de banho-maria para maximizar a agitação. Lipídios ressuspensos podem ser armazenados a -20 °C. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado por até 1 mês.
    3. Aliquota a suspensão do lipossomo em porções de 200 μL e armazene a -20 °C.
  2. Extrusão de lipossomos
    1. Descongele uma alíquota de lipossomo de 200 μL em banho-maria em temperatura ambiente e dilua com 800 μL de tampão A até um volume final de 1 mL.
    2. Submeta os lipossomos a três ciclos de congelamento-descongelamento alternando entre nitrogênio líquido e banho-maria em temperatura ambiente.
    3. Enxágue as seringas, dois suportes de filtro e uma membrana de policarbonato de 200 nm com buffer A. Monte o mini-extrusor e extruda os lipossomos 20 vezes.
      NOTA: A suspensão de lipossomos deve parecer transparente após a extrusão.
    4. Divida a suspensão extrudada de lipossomos de 1 mL em três tubos (330 μL por tubo) e dilua cada um com 600 μL de buffer A.
  3. Titulação por inchaço do Triton X-100
    NOTA: O Triton X-100 é um detergente de baixa concentração crítica de micelas (CMC), e tem se mostrado mais bem-sucedido em muitoscasos 21
    ATENÇÃO: O Triton X-100 é um produto químico perigoso, causando principalmente danos severos nos olhos, irritação da pele e efeitos nocivos se ingerido. Equipamentos de proteção adequados (luvas, proteção ocular) são necessários durante o manuseio.
    1. Prepare o Triton X-100 a 10% (v/v) misturando 100 μL de Triton X-100 com água ultrapura de 900 μL, e incubando-o em um shaker para dissolver completamente o Triton X-100.
    2. Meça a absorção de lipossomos a 540 nm (A₅₄₀) usando um espectrofotômetro.
    3. Adicione 5 μL aliquotas de 10% Triton X-100 sequencialmente, misturando suavemente após cada adição, e meça A₅₄₀. Continue adicionando Triton X-100 até que A₅₄₀ atinja um máximo, depois adicione Triton X-100 mais 4–5 vezes até que a absorvância diminua para aproximadamente 60% do valor máximo.
    4. Com base na curva de titulação, inche-se os lipossomos adicionando 35 μL de 10% de Triton X-100 e incuba-se em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave.
  4. Reconstituição de FtsH/LapB em lipossomos
    1. Expresse e purifique as proteínas FtsH e LapB conforme descritoanteriormente 18.
    2. Lave ~2 g de um adsorvente de poliestireno não polar (por exemplo, Bio-Beads SM-2) uma vez com 10 volumes de metanol, outra com 10 volumes de etanol e dez vezes com 10 volumes de água ultrapura. Armazene o adsorvente lavado no buffer A a 4 °C.
    3. Para cada tubo de lipossomos inchados do Triton X-100, adicione 3 μL de 500 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 22,5 μg de FtsH e 22,5 μg de LapB. Ajuste o volume total para 1 mL com o buffer A e incube em RT por 1 hora com agitação suave.
      NOTA: Razões proteína-lipídios de 1:20 a 1:200 (peso/peso) foram rotineiramente usadas durante a reconstituição dos proteolipossomos21. Aqui, é usada uma proporção de 1:100.
    4. Remova o detergente por incubação sequencial com adsorvente de poliestireno não polar: 40 mg em RT por 0,5 h, seguido por 40 mg em RT por 1 h, depois 40 mg a 4 °C durante a noite e, por fim, 40 mg a 4 °C por 1 h.
    5. Centrifuge brevemente para pelletar o adsorvente de poliestireno não polar a 4 °C (400 × g por 3 segundos). Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga. Lave o adsorvente de poliestireno não polar com 1 mL de buffer A e combine a lavagem com o sobrenadante. Adicione buffer adicional A a um volume final de ~6 mL.
      NOTA: Para segurança, tubos de ultracentrífuga devem conter pelo menos 6 mL de líquido.
    6. Equilibre os tubos e a ultracentrífuga a 250.000 × g a 4 °C por 45 minutos em um rotor de ângulo fixo (por exemplo, MLA-80) para pellet de proteolipossomos.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de proteolipossomo em 70 μL de tampão A suplementado com 1 mM de TCEP.
      NOTA: O volume final dos proteolipossomos é aproximadamente 100 μL.
    8. Congele rapidamente os proteolipossomos em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
      NOTA: Neste ponto, o protocolo pode ser pausado por até 1 mês.
  5. Análise SDS-PAGE de proteolipossomos
    1. Misture os proteolipossomos cuidadosamente e combine 5 μL da amostra com 5 μL de buffer de carga de 2× SDS (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5% SDS, 20% glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 200 mM DTT).
    2. Carregue amostras de proteolipossomos junto com 525 ng de FtsH (correspondentes a 0,06 μM de Hexâmero FtsH em 20 μL) em um gel SDS-PAGE de 4–20%.
    3. Tinga o gel com CBB.
    4. Escaneie o gel e quantifique a intensidade da banda de FtsH para cada amostra. Calcule o volume da suspensão de proteolipossomos equivalente a 525 ng de FtsH.

3. Degradação in vitro de LpxC–Atto488

  1. Realizar ensaios de degradação in vitro em uma reação de 20 μL contendo proteolipossomos FtsH/LapB (correspondentes a 0,06 μM FtsH) e 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 em tampão de degradação (50 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM Mg-acetato, 5 mM ATP, 25 μM Zn-acetato, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-mercaptoetanol).
  2. Para a medição de cada concentração de substrato, prepare uma reação de 70 μL.
    1. Pegue uma fração de 20 μL e tempere imediatamente com 48 μL de ácido tricloroacético (TCA) a 5% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (0 min). Pegue a segunda e a terceira frações e tempere-as em 10 e 20 minutos, respectivamente.
    2. Paralelamente, prepare reações de controle correspondentes sem proteolipossomos para subtração de fundo.
      NOTA: São recomendadas três medições replicadas para obter resultados confiáveis.
      Minimize a exposição à luz ao manusear LpxC–Atto488.
      ATENÇÃO: O TCA é um produto químico altamente corrosivo que causa queimaduras graves na pele, danos permanentes nos olhos e irritação respiratória intensa ao ser inalado. Manuseie com equipamentos de proteção adequados (luvas, proteção para os olhos, máscara).
  3. Incube amostras a 37 °C por 30 minutos para precipitar proteínas, depois centrifuge a 18.800 × g em temperatura ambiente por 20 minutos.
  4. Neutralize as amostras transferindo 50 μL de sobrenadante para um tubo contendo 60 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8,8. Misture bem e transfira 100 μL para uma placa preta de 96 poços. Mede a fluorescência usando um leitor de placas com excitação a 498 nm e emissão a 520 nm.

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Resultados

Para melhorar a sensibilidade do ensaio de degradação in vitro , o substrato LpxC foi marcado com o corante fluorescente Atto488. O grupo éster succinimidila de Atto488 reage eficientemente com os grupos aminos primários de LpxC sob condições levemente alcalinas. Como o tampão Tris contém aminas primárias que interferem nessa reação, o LpxC purificado em tampão Tris foi trocado por tampão fosfato por filtração em gel antes da rotulação. Para a reação de marcação, foi usada uma r...

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Discussão

O primeiro passo crítico desse protocolo é a rotulagem Atto488 do LpxC. Uma marcagem moderada é fundamental para medir com precisão a atividade de degradação in vitro . Com base em nossos experimentos de otimização, uma razão molar de LpxC para Atto488 entre 9:1 e 3:1 é a ideal. O excesso de Atto488 resulta em superrotulagem, o que provavelmente perturba o estado nativo do LpxC. Nessas condições, a diferença na degradação de LpxC–Atto488 apenas por FtsH versus FtsH/LapB é signif...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Todas as pesquisas foram realizadas na Universidade de Yale. O W.M. é apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais sob os números de prêmio R01GM137068 e RM1GM149406, e pela Fundação Familiar Richard e Susan Smith por meio do Prêmio Odyssey.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEFeito em casa
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Adsorvente de poliestireno apolar 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Rotor de ângulo fixo 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944Coluna de filtração em gel de alta resolução 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Referências

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Protease FtsHAdaptador LapBReconstituição em ProteolipossomosProtease AAA+Ensaio de FluorescênciaHomeostase ProteicaAnálise Cinética

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