A eficácia diagnóstica do plasma miR-362-3p combinado com ultrassom Doppler no diagnóstico de câncer de mama

Resumo

A taxa de diagnóstico de câncer de mama é relativamente baixa. O método da tabela quádrupla foi usado para analisar o valor diagnóstico do miR-362-3p combinado com ultrassom Doppler para câncer de mama. A combinação do ultrassom Doppler com o miR-362-3p aumentou efetivamente a eficácia diagnóstica, fornecendo um método promissor para o diagnóstico do câncer de mama.

Resumo

O câncer de mama é o segundo tumor maligno mais comum no mundo, ameaçando seriamente a vida das mulheres e impondo um enorme fardo econômico. Este estudo tem como objetivo explorar o valor do miR-362-3p combinado com ultrassom Doppler no diagnóstico do câncer de mama. Um total de 182 pacientes com câncer de mama e 147 pacientes com doença benigna da mama foram incluídas neste estudo. Os níveis plasmáticos de miR-362-3p dos pacientes foram medidos usando reação em cadeia quantitativa da polimerase por fluorescência em tempo real (RT-qPCR). O teste qui-quadrado foi utilizado para analisar as diferenças nos parâmetros do ultrassom Doppler entre os dois grupos de pacientes. A curva característica do operador do receptor (ROC) foi usada para avaliar a eficácia diagnóstica do miR-362-3p, Índice de Resistência (RI) e Índice de Pulsatilidade (PI). A eficiência diagnóstica do ultrassom Doppler combinado com plasma miR-362-3p no câncer de mama foi analisada pelo método da tabela quádrupla. Os níveis de miR-362-3p foram significativamente reduzidos em pacientes com câncer de mama. Houve diferenças significativas nos parâmetros do ultrassom bidimensional. miR-362-3p, RI e PI têm valor diagnóstico para câncer de mama. O valor diagnóstico combinado dos três fatores foi maior. O ultrassom combinado com o miR-362-3p melhorou significativamente a sensibilidade, precisão e valor preditivo negativo no diagnóstico de câncer de mama. O ultrassom Doppler combinado com o miR-362-3p pode aumentar a eficiência diagnóstica do câncer de mama, o que pode fornecer uma ferramenta diagnóstica auxiliar e não invasiva para o câncer de mama.

Introdução

De acordo com as estatísticas da Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, a taxa de incidência de câncer de mama superou a do câncer de pulmão em 2020^. O câncer de mama é um tumor maligno que ocorre com frequência e é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer em mulheres^globalmente. O diagnóstico oportuno do câncer de mama é benéfico para o prognóstico das pacientes. A biópsia de tecido é o padrão ouro para diagnosticar câncer de mama. No entanto, este é um tipo de diagnóstico invasivo e não se aplica a pacientes com câncer de mama em estágio^{inicial 2}.

O ultrassom Doppler é uma técnica de imagem comumente utilizada para rastreamento de câncer de mama e diagnóstico^{auxiliar 3}. O ultrassom Doppler pode avaliar com precisão o tamanho dos nódulos, os sinais de fluxo sanguíneo e o status da metástase dos gânglios^{linfáticos 4}. O ultrassom Doppler da mama, devido às suas vantagens como ausência de radiação ionizante, segurança e não invasividade, além da capacidade de exames repetidos, tornou-se uma das técnicas de imagem mais amplamente utilizadas no rastreamento e diagnóstico do câncer^{de mama 5}. No entanto, o ultrassom Doppler tende a ser interferido pelo fundo tecidular ao detectar cânceres de mama de baixa densidade ou pequeno volume, resultando em uma queda significativa na sensibilidade diagnóstica e dificultando o atendimento às necessidades clínicas para diagnóstico^{precoce 6}. Portanto, é necessário desenvolver biomarcadores plasmáticos que possam superar as limitações da tecnologia de ultrassom Doppler. Se a combinação dos dois métodos puder aumentar a sensibilidade do diagnóstico para o câncer de mama, terá valor clínico significativo e significado prático.

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de RNA não codificantes com comprimento de aproximadamente 20 a 24 nucleotídeos ^7,8. Uma das características dos miRNAs é o alto grau de conservação durante o processo evolutivo. Os miRNAs têm uma ampla distribuição tecidicular, que não só é expressa especificamente em várias células de tecido humano, mas também podem existir de forma estável em múltiplos fluidos corporais, como sangue e^{saliva 9}. Essas características de distribuição proporcionam vantagens para o desenvolvimento de marcadores diagnósticos não invasivos. Funcionalmente, os miRNAs degradam o mRNA por ligação complementar às 3' Regiões Não Traduzidas (UTR)^10,11, participando de uma série de processos patológicos e fisiológicos-chave, como respostas inflamatórias celulares, estresse oxidativo, apoptose e proliferação e^{diferenciação 12}. Um grande número de estudos confirmou que as alterações anormais nos perfis de expressão dos miRNAs estavam intimamente relacionadas à ocorrência e ao desenvolvimento do câncer de mama^13,14. A desregulação da expressão de miRNA pode promover a transformação maligna das células epiteliais mamárias ao regular as redes de expressão de oncogenes ou genes supressores de tumores. MiR-362-3p é um fator típico que inibe a progressão tumoral. Diversos relatos mostraram que o miR-362-3p inibiu a progressão do câncer de mama 15,16,17. Assiri et al. relataram que baixa expressão de miR-362-3p esteve intimamente associada a um prognóstico ruim e uma sobrevivência geral mais curta em pacientes com câncer^{de mama 15}. Mecanisticamente, o miR-362-3p exerceu efeito antitumoral no câncer de mama ao direcionar a helicase DEAD-box 5 (DDX5) para promover a proliferação, invasão e migração de células^{cancerígenas 16}. Além disso, a equipe liderada por Kang também descobriu que o miR-362-3p foi significativamente reduzido nos tecidos do câncer de mama, e a regulação direcionada da expressão do miR-362-3p pode servir como uma nova estratégia terapêutica potencial para o manejo do câncer^{de mama.} No entanto, não há relatos sobre se o miR-362-3p pode servir como marcador diagnóstico precoce para câncer de mama.

Este estudo mediu o nível de expressão do miR-362-3p no plasma e, simultaneamente, analisou os parâmetros centrais da imagem do ultrassom Doppler em pacientes com câncer de mama. O estudo explorou minuciosamente o valor combinado de aplicação dos níveis de expressão plasmática de miR-362-3p e dos parâmetros da imagem do ultrassom Doppler, demonstrando claramente a eficácia dessa abordagem diagnóstica combinada na triagem do câncer de mama e no diagnóstico diferencial entre doenças benignas e malignas da mama.

Protocolo

Esse estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Segunda Universidade de Medicina de Shandong, Escola de Medicina Clínica, Universidade de Medicina Secundária de Shandong (número de aprovação: wyfy-2023-ky-124). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Sujeitos experimentais

O cálculo do tamanho da amostra foi realizado usando o software G*Power 3.1 baseado em um teste t de amostra independente. Um tamanho médio de efeito (d de Cohen = 0,5, amplamente utilizado em estudos observacionais clínicos), teste bilateral, α = 0,05 e potência (1 − β) = 0,95 foram definidos. O cálculo indicou que pelo menos 105 participantes eram necessários por grupo. Por fim, foram incluídas 182 pacientes com câncer de mama e 147 pacientes com lesões benignas na mama, e o tamanho real da amostra de ambos os grupos superou em muito o tamanho mínimo exigido, garantindo poder estatístico suficiente para apoiar as conclusões do estudo e controlar o risco de erro tipo II dentro de uma faixa aceitável. Todos os participantes foram inscritos de forma estrita e consecutiva de acordo com critérios unificados de inclusão e exclusão.

De 2023 a 2024, todos os pacientes foram matriculados no Hospital Afiliado da Segunda Universidade de Medicina de Shandong, Faculdade de Medicina Clínica, Universidade de Medicina Secundária de Shandong. Lesões benignas: Lesões não malignas foram confirmadas por patologia. Câncer de mama: tumores malignos foram confirmados por patologia. Amostras de sangue venoso foram coletadas de todos os participantes após jejum noturno. As amostras venosas de sangue foram anticoaguladas e centrifugadas para separar o plasma, cumprindo rigorosamente os procedimentos padrão, e então transferidas para −80 °C para armazenamento a longo prazo, que posteriormente foi usado para extração de miRNA. Todas as amostras de plasma foram estritamente limitadas a no máximo dois ciclos de congelamento-descongelamento antes da extração de RNA para evitar a degradação do miRNA. Todos os pacientes foram totalmente informados sobre o protocolo do estudo e forneceram voluntariamente consentimento informado por escrito antes da inscrição.

Critérios de inclusão para pacientes com câncer de mama: (1) Pacientes com câncer primário de mama patologicamente confirmado. (2) Nenhum tratamento cirúrgico antes da matrícula. (3) Não recebeu tratamento de radioterapia ou quimioterapia antes da coleta da amostra.

Critérios de inclusão para pacientes com doença benigna da mama: (1) Lesões benignas na mama patologicamente confirmadas. (2) Sem quaisquer outros tumores malignos sistêmicos ou lesões pré-cancerosas. (3) Não grávida e não lactante. (4) Nenhuma infecção aguda grave ou doença inflamatória crônica.

Critérios de exclusão para pacientes com câncer de mama e lesões benignas na mama: (1) Infecção mamária grave ou doença crítica aguda. (2) Disfunção grave do fígado ou rin, ou doença autoimune. (3) Pacientes que receberam terapia hormonal em até 6 meses.

2. Exame Doppler por ultrassom

As mamas bilaterais das pacientes foram examinadas minuciosamente em quatro quadrantes usando ultrassom Doppler. A ultrassonografia bidimensional foi usada para registrar as características da lesão, incluindo limites, formato, eco interno, ondas posteriores do eco e razão de aspecto da lesão. Imagens de fluxo Doppler coloridas foram aplicadas para avaliar os parâmetros do fluxo sanguíneo da lesão, incluindo índice de resistência (RI), índice de pulsatilidade (PI) e velocidade máxima do fluxo sanguíneo (V_max). Os sinais de fluxo sanguíneo foram classificados de acordo com um sistema de classificação previamente^{relatado 18}: Grau 0: Sem sinal de fluxo sanguíneo; Grau I: sinal de fluxo sanguíneo mínimo; Grau II: O comprimento do sinal de fluxo sanguíneo excede metade do diâmetro da lesão; Grau III: Sinal de fluxo sanguíneo abundante.

3. Definição positiva para diagnóstico por ultrassom de câncer de mama

Esses incluíam (1) Limites ambíguos; (2) Forma irregular; (3) Eco interno irregular; (4) Eco traseiro enfraquecido; (5) Proporção de aspecto >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Taxa máxima de fluxo sanguíneo (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Sinal de fluxo sanguíneo ≥ grau II. Qualquer lesão que atenda a qualquer um dos critérios suspeitos acima é classificada como positiva em ultrassom, enquanto aquelas sem características suspeitas são classificadas como negativas para ultrassom.

4. Reação em cadeia quantitativa da polimerase por fluorescência em tempo real (RT-qPCR)

MiRNAs plasmáticos foram extraídos usando um kit especializado de extração de miRNA. As amostras de RNA extraídas com sucesso foram usadas para sintetizar cDNA usando kits especializados de transcrição reversa de miRNA. Condições da reação de transcrição reversa para miR-362-3p: O volume total dessa reação foi de 20 μL. O procedimento da reação PCR foi o seguinte: (1) A mistura foi incubada a 37 °C por 15 minutos, (2) A reação de transcrição reversa foi realizada por 50 minutos a 42 °C, (3) A enzima foi inativada por 5 minutos a 95 °C. O produto era armazenado a 4 °C. As condições da reação qPCR: O volume total do sistema de reação foi de 20 μL. As condições de amplificação foram realizadas da seguinte forma: (1) O cDNA foi pré-desnaturado e a DNA polimerase foi ativada a 95 °C por 2 minutos. (2) As fitas de DNA recoçam e se estendem por 30 s a 60 °C. Os dois passos acima foram realizados por um total de 40 ciclos. A expressão relativa do gene foi calculada pela fórmula 2^-(ΔΔCt). A expressão relativa do miR-362-3p foi calibrada por U6. Para justificar o uso de U6 como controle endógeno, a estabilidade de U6 foi avaliada usando o algoritmo BestKeeper na coorte plasmática. O coeficiente de variação (CV) dos valores de U6 Ct em todas as amostras foi inferior a 2%, indicando alta estabilidade de expressão. Portanto, U6 foi validado e selecionado como gene de referência para a normalização da expressão de miR-362-3p no presente estudo. A sequência a jusante dos primers foi fornecida pelo kit. As sequências de primers eram as seguintes:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATATA.

5. Curva de Característica de Operação do Receptor (ROC)

O índice de Youden foi usado para determinar o valor de corte ótimo para miR-362-3p no diagnóstico do câncer de mama, calculando os valores de sensibilidade e especificidade da curva ROC. O modelo diagnóstico combinado foi construído usando regressão logística binária no SPSS, com miR-362-3p, RI e PI inseridos como variáveis independentes. Variáveis foram incluídas pelo método Enter para gerar o valor de probabilidade previsto do diagnóstico combinado para cada sujeito. A fórmula para a probabilidade de predição (PRE): . As curvas ROC foram traçadas com base no PRE. O teste Delong foi usado para comparar as diferenças nos valores de Área Sob a Curva (AUC) entre diferentes curvas ROC.

6. Definição dos parâmetros de desfecho

O principal parâmetro de desfecho foi a eficácia diagnóstica geral do modelo combinado de plasma miR-362-3p e ultrassom Doppler para câncer de mama, tendo o diagnóstico patológico como padrão ouro. Os parâmetros de desfecho secundário incluíram o desempenho diagnóstico do ultrassom Doppler isolado e do plasma miR-362-3p isolado.

7. Estatísticas de dados

Os níveis de expressão do miR-362-3p e das curvas ROC dos dois grupos de pacientes foram analisados usando softwares estatísticos e gráficos. O teste t foi usado para comparar as diferenças nas variáveis contínuas entre os dois grupos. O teste qui-quadrado e o método da tabela quádrupla foram analisados usando SPSS 26.0. O teste qui-quadrado foi usado para avaliar as diferenças estatísticas de variáveis categóricas; a combinação de dois índices (miR-362-3p + ultrassom Doppler) foi considerada a análise primária, representando uma conclusão diagnóstica qualitativa rotineira na prática clínica; se houvesse características suspeitas derivadas da classificação do Sistema de Relato e Dados de Imagem Mamária (BI-RADS), a lesão foi definida como positiva; o método da tabela quádrupla foi usado para calcular a especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e precisão do diagnóstico combinado do ultrassom Doppler e do miR-362-3p. Os resultados diagnósticos entre o ultrassom Doppler e o miR-362-3p incluíram verdadeiro positivo (a), falso positivo (b), falso negativo (c) e verdadeiro negativo (d). Fórmula de cálculo: Sensibilidade = a / (a + c); Especificidade = d / (d + b); Valor Preditivo Positivo = a / (a + b); Valor Preditivo Negativo = d / (d + c); Precisão = (a + d) / (a + b + c + d). Os três métodos diagnósticos (miR-362-3p, ultrassom e diagnóstico combinado) foram realizados utilizando o teste Pearson χ² para tabelas de contingência R×C. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O nível de miR-362-3p foi significativamente reduzido em pacientes com câncer de mama

Foram comparadas as informações clínicas de base e as características patológicas clínicas de 182 pacientes com câncer de mama e 147 pacientes com lesões benignas de mama. Os dados detalhados foram resumidos na Tabela 1. A RT-qPCR foi usada para medir os níveis plasmáticos de miR-362-3p em dois grupos de pacientes. Os resultados mostraram que...

Discussão

O câncer de mama é um dos tipos mais comuns de tumores malignos, tornando-se uma grande questão de saúde pública que ameaça a saúde humana^19,20. As altas taxas de incidência e mortalidade não apenas causam traumas psicológicos severos às famílias dos pacientes, mas também causam um enorme fardo para a sociedade e a economia. A maioria das pacientes com câncer de mama já havia apresentado invasão local ou metástase distante no mom...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	EUA	367861	Para coleta de sangue venoso e preparação de plasma para análise de miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência de 6 canais de 96 poços, usando condução de fibra óptica e imagem CCD fria, com coleta de fluorescência síncrona em cada poço sem atraso. O intervalo dinâmico atinge 10 ordens de grandeza e é compatível com qPCR convencional e análise de curva de fusão de alta resolução (HRM). O software suporta exportação no formato RDML, é compatível com testes de pesquisa e clínicos e é comumente usado em experimentos como quantificação de expressão gênica, tipagem de SNP e análise de metilação.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Xangai, China	KG0811	Usado para preparar e realizar reações qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Usado para armazenamento de amostras, preparação de reagentes e centrifugação durante a extração de miRNA e transcrição reversa.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Pequim, China	DP501	Para isolamento e purificação de RNA total, incluindo miRNA, de amostras de plasma humano, usando tecnologia baseada em coluna de rotação.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Pequim, China	KR211	Para a transcrição reversa de miRNA purificado em cDNA de primeira fita por meio do método de poli(A) tailing.
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Pequim, China	FP411	Para detecção de PCR em tempo real quantitativa de miRNA usando química baseada em SYBR Green I.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Alemanha	4729692001	Usado para ensaios de PCR em tempo real quantitativos no instrumento Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	Proba de matriz linear de alta frequência, com faixa de frequência de 5–14 MHz, especialmente projetada para o exame de órgãos superficiais, como mama e tireoide. Possui alta resolução e excelente contraste de tecido e suporta elastografia e varredura automática de volume da mama.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	O sistema de diagnóstico por ultrassom Doppler colorido suporta funções de imagem 3D/4D em tempo real e imagem de elasticidade, e é amplamente utilizado em vários departamentos, como abdome, cardiovascular, ginecologia e obstetrícia e mama.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	Instrumento de PCR gradiente de 96 canais, Suporta otimização de temperatura gradiente; tem alta precisão de controle de temperatura; usado para síntese de cDNA e amplificação de PCR convencional.