Desenvolvimento de um Protocolo de Reconstituição de Vesículas COPII Sem Células para Investigar a Classificação STING em um Sistema Baseado em Células HEK-293

Resumo

Este protocolo descreve um sistema otimizado de célula livre para reconstituir a incorporação do STING em vesículas COPII, permitindo uma análise bioquímica controlada da triagem de carga durante a exportação de RE.

Resumo

A via cGAS–STING é um componente central da imunidade inata. Após a ativação, a proteína STING residente no retículo endoplasmático (RE) é empacotada nas vesículas COPII e transportada para o aparelho de Golgi para iniciar a sinalização a jusante. Apesar da importância desse processo, os mecanismos moleculares que regem a separação do STING em vesículas COPII permanecem incompletamente compreendidos. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho otimizado para a reconstituição in vitro das vesículas COPII, a fim de facilitar a análise controlada da seleção de cargas. Um método escalável é descrito para preparar citosol de alta concentração (30–40 mg/mL) a partir de células em suspensão HEK-293F, combinado com um procedimento simples para gerar células HEK-293T semipermeáveis como fonte de membrana definida. Comparado aos sistemas tradicionais baseados em células aderentes, essa abordagem melhora a escalabilidade, reduz custos e aumenta a reprodutibilidade. Usando o STING como carga modelo, a gemação da vesícula COPII e a incorporação da carga são validadas pela análise Western blot, com uma eficiência basal de embalagem de aproximadamente 20% sob condições definidas. Esse sistema permite a manipulação controlada de parâmetros bioquímicos, incluindo a estimulação de nucleotídeos, para avaliar seus efeitos na incorporação de cargas. Esse protocolo oferece uma plataforma robusta e adaptável para investigar a triagem de cargas mediada por COPII e pode ser estendido para estudar proteínas transmembranares adicionais e fatores regulatórios envolvidos na exportação de RE.

Introdução

A via de sinalização cGAS-STING serve como um mecanismo fundamental do sistema imunológico inato, detectando DNA citosólico de fita dupla (dsDNA) para iniciar uma resposta antiviral. Ao detectar dsDNA, a enzima cGAS produz o dinucleotídeo cíclico cGAMP, que atua como um segundo mensageiro que se liga ao STING ^1,2. Crucialmente, STING reside como um dímero inativo no retículo endoplasmático (RE) sob condições de estado^{estacionário 3}. Sua ativação requer uma translocação rápida e altamente regulada do RE para o aparelho de Golgi. É no Golgi que o STING recruta e ativa as quinases a jusante TBK1 e IRF3, levando à produção de interferons tipo I e citocinas^{pró-inflamatórias 4}.

O transporte do STING é mediado por vesículas revestidas com COPII, os veículos universais para exportação de proteínas do ER⁵. A montagem do revestimento COPII — composto pelo pequeno GTPase Sar1, o complexo interno Sec23/24 e o complexo externo Sec13/31 — é responsável tanto por deformar a membrana ER em vesículas quanto por recrutar seletivamente a carga ^6,7. O Sec22b é classificado em vesículas COPII por meio de um epítopo estrutural reconhecido pelo complexo Sec23/24 do COPII⁸. Outras cargas incluem a família p24 e o marcador ERGIC ERGIC-53, ambos dependentes de um motivo diidrofóbico φC C-terminal para a classificação⁹. Em contraste, certas proteínas ancoradas no RE, como a riboforina I (RPN1), permanecem confinadas ao RE e servem como marcadores das estruturas intactas do RE, pois não são transportadas via vesículas^{COPII 10}. Consequentemente, em experimentos de reconstituição de vesículas COPII sem células, Sec22b e p24 são frequentemente considerados cargas de COPII, enquanto a riboforina serve como marcador para monitorar a contaminação por RE em preparações de vesículas. Embora a maquinaria geral do transporte do COPII seja bem caracterizada, os sinais moleculares específicos que desencadeiam o sequestro seletivo do STING ativado nessas vesículas permanecem elusivos. Compreender esses mecanismos de separação é fundamental, pois a desregulação do transporte STING está ligada a várias doenças autoimunes e autoinflamatórias, como a vasculopatia associada à STING com início na infância (SAVI) e a síndrome^{COPA 11}. No entanto, estudar esses eventos transitórios e altamente dinâmicos em células intactas continua sendo tecnicamente desafiador.

Para enfrentar esses desafios, foi desenvolvido um sistema otimizado de reconstituição sem célula para analisar os requisitos moleculares da triagem de carga mediada por COPII. Embora os ensaios de gemação in vitro sejam há muito tempo um básico da biologia celular^, sua adoção generalizada é frequentemente limitada pelo alto custo e complexidade de preparar componentes de alta qualidade. Neste estudo, é introduzido um fluxo de trabalho simplificado que utiliza células em suspensão HEK-293F como fonte econômica de citossol ativo e células HEK-293T semipermeáveis como doador robusto de membrana. O fluxo de trabalho geral do sistema de reconstituição de vesículas COPII sem células é ilustrado na Figura 1. Neste sistema, o Sec22b foi usado como controle positivo para confirmar a incorporação da carga em vesículas, enquanto o RPN1 foi utilizado como controle negativo para monitorar e descartar contaminação por membrana de RE. Usando o STING como carga de prova de conceito, este estudo demonstrou que o sistema modela efetivamente aspectos bioquímicos essenciais da triagem do STING. Essa plataforma forneceu uma ferramenta versátil e escalável para identificar fatores citosólicos e sinais de membrana que governam a classificação STING, com aplicações potenciais para estudar uma ampla variedade de outras vias de transporte vesicular.

Protocolo

As linhas celulares HEK-293F (RRID: CVCL_6642) e HEK-293T (RRID: CVCL_0063) foram obtidas no Centro de Recursos Celulares do Peking Union Medical College. Ambas as linhagens celulares foram autenticadas por perfilamento de repetição curta em tandem (STR) e confirmadas como livres de contaminação por micoplasma. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Nenhum participante humano ou animal vertebrado esteve envolvido neste estudo. Portanto, não era necessária aprovação ética. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.

1. Preparação do citosol de células HEK-293F

1. Células semente HEK-293F com densidade de 1 × 10⁶ células/mL em meio de cultura mamífero definido de 100 mL, suplementado com 1% de penicilina–estreptomicina. Cultive as células em um frasco cônico de 500 mL.
2. Incube a cultura em suspensão a 37 °C com 5% de CO₂ em um incubador agitado por 60 horas.
3. Colhe as células por centrifugação a 300 × g por 5 minutos a 4 °C. Determine o número total de células usando um contador automático de células.
4. Lave o pellet celular com 50 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS). Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
5. Ressuspenda a célula em um volume igual de tampão de B88 gelada (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM de sorbitol; 150 mM de acetato de potássio; 5 mM de acetato de magnésio).
6. Lisar as células no gelo passando a suspensão por uma seringa de 5 mL equipada com agulha calibre 22 para mais de 100 movimentos.
7. Examine a lise celular por microscopia óptica. Remova detritos celulares por centrifugação a 20.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
8. Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga. Centrifuge a 100.000 × g por 1 hora a 4 °C.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que os tubos das ultracentrífugas estejam devidamente balanceados para evitar danos ao equipamento e riscos à segurança.
9. Colete o sobrenadante esclarecido. Concentre a amostra usando um dispositivo de ultrafiltração de corte molecular (MWCO) de 3 kDa a 4.000 × g a 4 °C.
10. Meça a concentração de proteína usando um ensaio de ácido bicincônico (BCA). Ajuste a concentração para 30–40 mg/mL.
    ATENÇÃO: Manuseie nitrogênio líquido com equipamentos de proteção adequados para evitar danos criogênicos.
11. Aliquota do citosol. Congele as alíquotas em nitrogênio líquido e armazene a −80 °C (Figura 2A)
    ATENÇÃO: Evite mais de dois ciclos de congelamento-descongelamento. Armazene alíquotas a −80 °C por até 6 meses.

2. Preparação de células HEK-293T semipermeabilizadas

1. Células HEK-293T de placa expressando STING humano de comprimento total com densidade de 3 × 10⁶ células por recipiente de 15 cm em 15 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
2. Colhe as células com aproximadamente 60% de confluência.
3. Aspire o meio e lave as células duas vezes com 10 mL PBS gelado.
4. Adicione 2 mL de 0,25% de tripsina–EDTA. Incube em temperatura ambiente por 2–3 minutos para separar as células.
5. Adicione 200 μL de inibidor de tripsina de soja (1 mg/mL) para interromper a tripsinização. Ressuspenda as células em 10 mL de tampão KHM gelado (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM de acetato de potássio; 2 mM de acetato de magnésio).
6. Faça as células por centrifugação a 250 × g por 3 minutos. Descarte o supernadante.
   ATENÇÃO: Digitonina é tóxica. Manuse-a em uma exaustão com o equipamento de proteção individual adequado.
7. Resuspenda as células em um tampão KHM gelado de 6 mL. Adicione 6 μL de solução de estoque de digitonina (40 mg/mL em DMSO).
8. Misture suavemente por inversão. Incube no gelo por 5 minutos.
9. Adicione 8 mL de tampão KHM para diluir a digitonina. Centrifuge a 250 × g por 3 minutos para coletar células permeabilizadas.
10. Ressuspenda o pellet em 14 mL de tampão HEPES gelado (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM de acetato de potássio). Incube no gelo por 10 minutos.
11. Centrifuge a 250 × g por 3 minutos. Ressuspenda o pellet em 1 mL de KHM· gelado Buffer de Cl (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Centrífuga a 10.000 × g por 15 segundos. Descarte o supernadante.
13. Resuspenda o pellet em 50 μL KHM· Buffer de cl. Meça a concentração de proteína usando um ensaio de BCA e ajuste para 5–7 mg/mL.

3. Experimento de reconstituição de vesículas COPII sem células.

1. Prepare todos os reagentes listados na Tabela de Materiais. Aliquota e armazene a −80 °C.
2. Prepare uma mistura de reação de 50 μL contendo 110 mM de KCl, 20 mM de HEPES (pH 7,2), 2 mM de MgCl₂, coquetel inibidor de protease (1×), 0,2 mM de GTP e um sistema de regeneração de ATP (40 mM de fosfato de creatina, 0,2 mg/mL de fosfocinase de creatina, 1 mM de ATP).
3. Adicione cGAMP a uma concentração final de 10 μM. Incube a reação em temperatura ambiente por 15 minutos.
4. Adicione 50 μg de células HEK-293T semipermeabilizadas. Misture suavemente.
5. Adicione 80 μg de citosol HEK-293F para iniciar a formação da vesícula. Incube a 37 °C por 45 minutos.
6. Coloque a reação no gelo para terminar a brotação. Centrifuge a 12.000 × g por 20 minutos a 4 °C.
7. Colete as vesículas que contêm o sobrenadante. Conserve o pellet contendo organelos.
8. Ultracentrífuga o sobrenadante a 100.000 × g por 1 hora a 4 °C. Resuspenda o pellet de vesícula em um tampão de carga proteica de 30 μL.
9. Aqueça as amostras a 95 °C por 5 minutos. Centrifuge a 20.000 × g por 5 minutos para remover os precipitados.
10. Realize SDS-PAGE e transfira proteínas para as membranas do PVDF. Faça uma sonda com anticorpos contra o Sec22b, STING e RPN1.

Resultados

Durante a preparação do citosol de células HEK-293F, dois parâmetros foram avaliados para avaliar a qualidade do citossol. Células HEK-293F foram cultivadas em alta densidade, produzindo extratos citosólicos com altas concentrações de proteínas. Além disso, a extensão da disrupção celular após a lise baseada em seringa foi avaliada por microscopia óptica, confirmando a lise celular eficiente sob as condições aplicadas (Figura 2B).

Discussão

A reconstituição de reações bioquímicas essenciais in vitro lançou as bases para sistemas livres de células, que foram fundamentais em inúmeras descobertas marcantes. Incluem a identificação do cGAS como sensor de DNA^{citosólico 14,15}, a elucidação do papel do citocromo c na apoptose e a descoberta da primeira desmetilase de histonas, JHDM1^16,17. Essas abordagens ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas estéreis de 5 mL	WEGO	V526273	Usado para lise celular mecânica
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM de estoque em água, pH 7,3, armazenado em − 80 e graus; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Usado para criar ilustrações conceituais e diagramas esquemáticos
Sistema de regeneração ATP (10 vezes)	—	—	Mistura regeneradora de energia contendo fosfato de creatina, cinase de creatina e ATP
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher	23227	Ensaio proteico colorimétrico
BioRender	BioRender	SCR_018361	Usado para criar ilustrações conceituais e diagramas esquemáticos
BSA	Biorigem	BN20815	Reagente bloqueador
Incubadora de agitação de dióxido de carbono	ZhiChu	ZCZY-CS8	Mantém temperatura, CO2 e agitação para cultura em suspensão
Incubadora CO2	Thermo Fisher	3110	Mantém temperatura e CO2 para cultura aderente
Microscópio convencional	Olympus	CX43	Usado para avaliar a lise celular e a morfologia
Creatina quinase	Roche	CKRO	20 mg/mL de estoque em buffer, armazenado em e com menos 80 e graus; C
Fosfato de creatina	Roche	CRPHO-RO	Componente do sistema de regeneração ATP
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5810R	Usado para centrifugação em baixa velocidade
Digitonina	Sigma	D5628	Estoque de 40 mg/mL em DMSO, armazenado em − 20 & deg; C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Meio de crescimento para células HEK-293T
D-Sorbitol	Sangon	A100691	Solução de estoque de 1 M em água, armazenada a 4 graus; C
Reagente de detecção ECL	Biorigem	BN16009	Substrato quimioluminescente
Tanque de eletroforese	Bio-Rad	1658001	Aparelho para SDS-PAGE
Soro fetal bovino (FBS)	Corning	35-015-CV	Suplemento sérico
Rotor de ângulo fixo (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotor para ultracentrifugação
Células FreeStyle 293-F	Thermo Fisher	R79007	Usado para preparação de citossols
IgG anti-camundongo (H+L)	Invitrogen	31430	Anticorpo secundário conjugado com HRP
IgG anti-coelho de cabras (H+L)	Invitrogen	31460	Anticorpo secundário conjugado com HRP
GraphPad Prisma	GraphPad Software	SCR_002798	Usado para realizar análises estatísticas (ANOVA unidirecional) e gerar o gráfico de barras quantitativo na Figura 4D.
Guanosina 5′-trifosfato (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM de estoque em água, pH 7,3, armazenado em − 80 e graus; C
Células HEK-293T expressando STING humano	—	—	Gerado internamente; Usado como fonte de membrana
Buffer HEPES (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Componente tampão para preparação da solução
Sistema de imagem	Bio-Rad	12003153	Usado para detecção de sinais
Tetrahidrato de acetato de magnésio	Pesquisa Hampton	HR2-561	Componente tampão para preparação do B88
Cloreto de magnésio hexahidratado	Pesquisa Hampton	HR2-559	Componente buffer
Microcentrífuga	Eppendorf	5420R	Usado para centrifugação em velocidade média
Microcentrífuga	Eppendorf	5420	Usado para centrifugação rotineira
Espectrofotômetro NanoDrop	Thermo Fisher	840-317400	Uso para quantificação de proteínas
OPM-CD Trans293 médio	OPM	P82019	Meio sem soro para a cultura de suspensão HEK-293F
Penicilina– Estreptomicina (100 vezes)	Servicebio	G4003	Suplemento antibiótico para cultura celular
Fenilmetil sulfonil fluoreto (PMSF)	Sangon	A610425	Inibidor de protease
Inibidores de fosfatase	Cabo de laboratório	C0104	Prevenir a desfosforilação de proteínas
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Servicebio	G4202	Buffer para lavagem de células
Acetato de potássio	Sigma	236497	Solução de estoque de 1 M em água, armazenada a 4 graus; C
Fonte de alimentação	Bio-Rad	1645052	Fornece tensão para eletroforese
Cocktail inibidor de protease, livre de EDTA	Roche	4693132001	Mistura de inibidores de protease de amplo espectro
Membrana PVDF	Millipore	ISEQ00010	Membrana para Western blot
Anticorpo RPN1 (mab de coelho)	Abcam	ab197888	Marcador ER
Gel SDS-PAGE (4– 20%)	—	—	Usado para separação de proteínas
SDS-PAGE carregador de buffer (5×)	Solarbio	P1040	Buffer de preparação de amostras de proteína
Anticorpo Sec22b (mab de coelho)	Abcam	ab181076	Marcador de carga COPII
Inibidor de tripsina de soja (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL de estoque em PBS, armazenado em − 20 & deg; C
Anticorpo para destrada (mab de coelho)	CST	13647	Anticorpo primário
Buffer TBST	Servicebio	G0004	Buffer de lavagem para imunoblotting
Ciclador térmico	Bio-Rad	186-1096	Usado para aquecimento e incubação
Banho metálico termostatário	DLAB	5062102100	Mantém temperatura constante
Célula de transferência	Bio-Rad	1703930	Usado para transferência de proteínas
Tripsina-EDTA (0,25%)	Servicebio	G4011	Usado para descolamento celular
Ultracentrífuga	Thermo Fisher	75000100	Usado para centrifugação em alta velocidade
Tubos ultracentrífugas (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Válvulas compatíveis com ultracentrifugação
Tubo de ultrafiltração (MWCO de 4 mL, 10 kDa)	Millipore	UFC8010	Usado para concentração de citossols