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Ensaio de Proteção Amikacina para Quantificação e Visualização da Invasão de Células de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71108

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3 de julho de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Neste artigo

Resumo

A resistência a antibióticos entre cepas invasivas de Escherichia coli em aderentes apresenta desafios para avaliar a invasão bacteriana usando o tradicional ensaio de proteção com gentamicina. Um método aprimorado para avaliar a invasão bacteriana quantitativamente, enumerando unidades formadoras de colônias e qualitativamente por meio da visualização das células infectadas por microscopia confocal de imunofluorescência, é descrito.

Resumo

A invasão celular epitelial é um fenótipo chave para muitos patógenos entéricos, incluindo Salmonella, Shigella e Vibrio. Um patógeno invasivo emergente é a Escherichia coli (AIEC), que está implicada na patogênese da doença inflamatória intestinal (DII). Cepas AIEC não possuem fatores de virulência comumente associados a outros patógenos invasores, tornando a identificação genética desafiadora. Como resultado, as cepas AIEC são classificadas fenotipicamente com base em sua capacidade de invadir células epiteliais usando um ensaio padrão de campo com proteção contra gentamicina. No entanto, como as cepas AIEC são frequentemente isoladas de pacientes com DII que recebem vários antibióticos como parte de seu regime de tratamento, o aumento dos isolados resistentes à gentamicina tornou esse ensaio menos confiável para a classificação AIEC. Para contornar essa questão, foi desenvolvido um ensaio alternativo de proteção baseado em amikacina para quantificar e visualizar a invasão celular AIEC. Este ensaio utiliza amikacina, um aminoglicódeo semissintético de amplo espectro que atinge efetivamente cepas resistentes a outros aminoglicosídeos, permanecendo extracelular a células hospedeiras eucarióticas. Assim, bactérias extracelulares são eliminadas durante a infecção, enquanto bactérias intracelulares são "protegidas". Isso forma a base de um ensaio quantitativo para comparar a invasividade das cepas, medida como a pontuação percentual de invasão usando unidades formadoras de colônias (UFC) recuperadas após a infecção. Este ensaio também pode ser usado como uma medida qualitativa da invasão por imunocoloração de células epiteliais infectadas e visualização dessas células por microscopia confocal. Esse método serve como uma ferramenta diagnóstica para rastrear pacientes com DII quanto à AIEC, que também pode ser aplicada a outros patógenos multirresistentes para avaliar a invasão celular, um indicador de virulência e patogenicidade.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII), que inclui doença de Crohn (DC) e colite ulcerativa, é uma condição inflamatória gastrointestinal crônica que afeta milhões de pessoas aoredor do mundo 1. Apesar do aumento da incidência global de DII, sua etiologia precisa permanece incerta, devido à complexa interação de fatores genéticos, ambientais, microbianos eimunológicos 2,3. Uma característica marcante da DII é a alteração da composição microbiana intestinal, frequentemente impulsionada por fatores ambientais, como uma dieta rica em açúcar e gordura, comum em paísesindustrializados 4,5. A microbiota dos pacientes com DII é frequentemente caracterizada por redução da diversidade microbiana, enriquecimento de Gammaproteobactérias patogênicas e esgotamento dos Firmicutesprotetores 6,7. Em pacientes com MC, Escherichia coli (E. coli) é enriquecida na microbiota intestinal, associa-se e invade a mucosa intestinal, e se correlaciona positivamente com doença ativa e grave8,9. Esse patotipo emergente de E. coli associado à CD é denominado Escherichia coli invasiva aderente (AIEC).

Os AIEC são patógenos oportunistas gram-negativos que colonizam a mucosa ileal de pacientes com CD com maior propensão do que os controlessaudáveis 10. As cepas AIEC isoladas de pacientes com CD são geneticamente diversas, frequentemente abrangendo todos os filogrupos de E. coli, incluindo tanto comensales quanto patogênicas E. coli11. Ao contrário de patógenos como Shigella e Salmonella, que dependem do uso de sistemas de secreção tipo III para facilitar a invasão das células hospedeiras, a AIEC não possui esses sistemas de virulênciaconservados 12. Portanto, nosso entendimento da virulência da AIEC depende em grande parte de seu fenótipo in vitro, caracterizado por sua capacidade de aderir e invadir células epiteliais e sobreviver dentro dosmacrófagos 10.

A invasão das células epiteliais pela AIEC é mediada por múltiplos fatores de virulência, incluindo o pilus tipo 1 e as fimbrias polares longas. FimH, localizado na ponta do pilus tipo 1, media a adesão aos resíduos de manose no receptor hospedeiro fortemente glicosilado CEACAM613. Essa ligação promove a entrada do AIEC nos enterócitos e apoia sua replicaçãointracelular 14. A AIEC também adere às células microfold (M), células epiteliais especializadas localizadas acima das manchas de Peyer por meio das interações entre suas longas fimbrias polares e a glicoproteína da proteína da superfície das células M 215,16. Essa adesão permite que o AIEC transloque entre as células M, alcance os macrófagos subjacentes e desencadeie a expressão de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, que não só promove a inflamação, mas também apoia a replicação bacteriana dentro dosmacrófagos 17,18. Esses mecanismos patogênicos são hipotetizados como perpetuando a inflamação crônica no hospedeiro, conforme observado na MC.

Os AIEC são definidos pelo seu fenótipo in vitro, tornando o ensaio de proteção com gentamicina indispensável para a classificação de cepas e a descoberta do fatorde virulência 8. Essa abordagem pode ser complicada por isolados resistentes à gentamicina, que podem resultar em sua classificação incorreta comoinvasores 11. Para contornar essa questão, foram testados antibióticos alternativos que matam efetivamente isolados resistentes à gentamicina sem penetrar nas membranas das células hospedeiras. Por meio dessa abordagem, a amikacina foi identificada como um substituto adequado da gentamicina, oferecendo eficácia e compatibilidade comparáveis com ensaios de invasão padrão, bem como citotoxicidade mínima, como evidenciado pela coloração com azul de tripano em estudos anteriores e validado aqui por meio de um ensaio de liberação de lactato desidrogenase (Figura Suplementar 1)11. A amikacina é um aminoglicódeo semissintético derivado da canamicina que inibe o crescimento bacteriano ao interromper a síntese deproteínas 19. A amikacina é particularmente eficaz contra bactérias gram-negativas multirresistentes, incluindo Pseudomonas, Acinetobacter e espécies 19 de Escherichia. Notavelmente, modificações estruturais na espinha dorsal da kanamicina tornam a amikacina menos suscetível às enzimas bacterianas que inativamaminoglicosídeos 19. Como resultado, a amikacina representa uma alternativa robusta à gentamicina para atacar bactérias multirresistentes em ensaios de invasão. Os protocolos a seguir descrevem como avaliar o fenótipo de invasão de E. coli usando tanto a cepa de referência NRG857c quanto isolados clínicos com o ensaio de proteção com amikacina.

Protocolo

NOTA: Este protocolo descreve um método para avaliar a capacidade de invasão de cepas AIEC em células epiteliais Caco-2. A concentração de amikacina usada neste protocolo (240 μg/mL) corresponde a 10× a concentração inibitória mínima (CMI), conforme determinada usando tiras de teste de CMI de amikacina em um painel de 32 isolados clínicos representativos da AIEC de 13 pacientes com doença inflamatóriaintestinal 11. Os pesquisadores devem determinar a CIM para seus próprios isolados AIEC antes de realizar o ensaio (veja a Tabela de Materiais), pois a suscetibilidade aos antibióticos pode variar entre os isolados. A Seção 1 detalha o ensaio de proteção contra a amikacina para quantificar a porcentagem de invasão, e a Seção 2 descreve o ensaio de proteção contra a amikacina para microscopia confocal.

1. Ensaio de Proteção Amikacina para Quantificação da Porcentagem de Invasão

  1. Revestimento de colágeno de placas de 24 poços
    1. Dilua 35,29 μL de ácido acético glacial estéril (veja Tabela de Materiais) em 30 mL de 1× PBS (veja Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Pipete 300 μL de colágeno (veja Tabela de Materiais) para o PBS de 1× com solução de ácido acético.
    3. Solução de vórtice para 10 segundos para misturar bem.
    4. Dispense 250 μL da solução de colágeno diluída em cada poço de uma placa estéril tratada por cultura de tecido de 24 poços.
      NOTA: A solução de colágeno de 30 mL é suficiente para revestir aproximadamente cinco placas de 24 poços.
    5. Incline a placa em todas as direções para garantir que a solução tenha coberto uniformemente o fundo de cada poço.
    6. Incube as placas a 37 °C por 2 horas para permitir que o colágeno adera à superfície plástica.
    7. Após a incubação, aspire a solução de colágeno de cada poço.
    8. Pipete 1 mL de 1× PBS em cada poço para lavar o colágeno residual e aspirar cada poço. Repita essa etapa mais 2 vezes (3 lavagens no total).
    9. Placas secas dentro de um armário de segurança biológica para garantir que toda a umidade visível tenha evaporado.
      NOTA: Placas podem ser usadas imediatamente para semeadura de células ou armazenadas em temperatura ambiente. Ao armazenar placas, fele o perímetro externo com parafilme estéril ou coloque-as dentro de um saco ziplock estéril.

  1. Preparação de soluções de ações de amikacina
    1. Pesar 240 mg de dissulfato de amikacina (veja a Tabela de Materiais) e transferir para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Pipete 1 mL de água estéril e solubilize a amikacina por vórtice, resultando em uma concentração final de 240 mg/mL (1000× estoque).
    3. Faça alíquotas de 20 μL da solução de amikacina e armazene a -20 °C.
      NOTA: A amikacina permanece estável em -20 °C por 6 a 12 meses. Prepare alíquotas descartáveis para minimizar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
  2. Preparação das células Caco-2
    1. Descongelando células Caco-2 de estoques congelados
      1. Prepare um meio de crescimento completo suplementando o Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, veja Tabela de Materiais) com 10% de soro fetal bovino (FBS, veja Tabela de Materiais) e 1% de solução antibiótico-antimicótica (veja Tabela de Materiais).
      2. Pré-aqueça o substrato em banho-maria a 37 °C por 30 minutos.
      3. Coloque o frasco congelado de células Caco-2 em um banho-maria a 37 °C e incube por 1–2 minutos até que as células estejam totalmente descongeladas.
      4. Retire o frasco do banho-maria e borrife o exterior do frasco com etanol 70%.
      5. Dentro de um gabinete de segurança biológica, pipetee as células em um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de meio de crescimento completo.
      6. Centrífuga as células a 500 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
      7. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de crescimento completo.
      8. Transfira as células para um frascode cultura de 2 tecidos de 75 cm (T75) contendo 10 mL de meio de crescimento completo e quente.
      9. Gire a placa 3 vezes para garantir que as células estejam distribuídas uniformemente pela parte inferior da placa.
      10. Incube as células a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam ~90% de confluência (6–7 dias).
        NOTA: A confluência é estimada por aproximação de visualização das células usando um microscópio óptico. Troque o substrato a cada 3 dias enquanto as células estão se recuperando.
    2. Semeadura das células Caco-2
      1. Meio de crescimento completo pré-aquecido e 0,25% (p/v) de tripsina-EDTA (veja Tabela de Materiais) em banho-maria a 37 °C.
      2. Quando as células Caco-2 atingirem ~90% de confluência, aspire o meio de cultura celular e adicione 2 mL de tripsina-EDTA. Incline o frasco para permitir que a solução de tripsina cubra toda a superfície inferior do frasco para garantir que todos os vestígios de FBS sejam desativados.
      3. Aspire a solução de tripsina-EDTA e adicione 3 mL de tripsina-EDTA. Incube as células a 37 °C com 5% de CO2 por 5 a 15 minutos. Visualize as células usando um microscópio óptico em vários momentos durante o período de incubação para observar o arredondamento celular, indicando que as células se desprenderam.
        NOTA: Evite bater na lateral do frasco para facilitar o descolamento celular, pois isso pode causar aglomeração de células.
      4. Pipete 6 mL de meio de crescimento completo para desativar a solução de tripsina-EDTA e misture pipeteando suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células.
      5. Pipete as células em um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 500 × g por 5 minutos para fazer as células de pellet.
      6. Aspire o meio e ressuspenda as células em 3 mL de meio de crescimento completo.
      7. Transfira 10 μL das células Caco-2 suspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 10 μL de corante azul de Trypan (veja a Tabela de Materiais) ao tubo da microcentrífuga de 1,5 mL e misture pipetando para cima e para baixo várias vezes.
      8. Pipete 10 μL da mistura azul Caco-2/Trypan para uma lâmina contadora de células (veja Tabela de Materiais). Enumere o número de células vivas para calcular a viabilidade celular.
        NOTA: Ao enumerar o número de células Caco-2 presentes, considere apenas o número de células vivas, não o número total de células para semeamento.
      9. Sementes células Caco-2 em uma placa de 24 poços ou em um frasco T75.
      10. Para uma placa de 24 poços, siga os passos abaixo:
        1. Seme as células Caco-2 em concentração de 1 x 105 células/mL usando a equação abaixo:
          [(1 × 105 células) (Número de poços que semeam + 2)] / [Concentração viável de células (células/mL)] = células (mL)
        2. Remova o volume de células calculado acima das células Caco-2 suspensas no passo 3.2.6 para um tubo cônico de 15 mL. Calcule o volume do meio de crescimento completo a ser adicionado às células usando a equação abaixo:
          (Número de poços semeando + 2 poços) - células (mL) = meio (mL)
          NOTA: Os "poços +2" no cálculo servem para considerar o erro de pipeteamento.
        3. Pipete o volume de meio calculado acima na cônica de 15 mL contendo as células Caco-2 e misture pipeteando várias vezes.
        4. Pipete 1 mL de células Caco-2 em meio de crescimento completo (concentração final 1 x 105 células/mL) em cada poço da placa de 24 poços revestida com colágeno.
        5. Incubar a placa a 37 °C com 5% deCO2 até que as células atinjam ~90% de confluência (3–4 dias).
      11. Para um frasco T75, siga os passos abaixo:
        1. Transfira 7,5 x 105 células viáveis para um frasco T75 usando a seguinte equação:
          [(7,5 × 105 células)] / [concentração viável de contagem celular (células/mL)] = células (mL)
          NOTA: O número de células viáveis a serem adicionadas ao frasco T75 foi determinado com base nas diretrizes do ATCC para cultura de células Caco-2.
        2. Remova o volume de células calculado acima e transfira para um frasco T75. Calcule o volume do meio de crescimento completo a ser adicionado às células usando a equação abaixo:
          15 mL - volume de células adicionadas ao frasco = meio (mL)
        3. Pipete o volume de mídia calculado acima para o frasco T75.
        4. Gire a placa suavemente várias vezes para dispersar uniformemente as células pelo fundo do frasco. Incube a 37 °C com 5% deCO2 até que as células atinjam ~90% de confluência (3–4 dias).
  3. Ensaio de Proteção Amikacin
    NOTA: Certifique-se de que todo o meio de cultura celular esteja pré-aquecido a 37 °C antes do início do experimento.
    1. Preparação de bactérias
      1. Usando um bastão de madeira estéril ou uma ponta de pipeta estéril, raspe suavemente as bactérias de um glicerol bacteriano congelado armazenado a -80 °C e faça liscas em uma placa de ágar LB para colônias individuais. Incube a placa a 37 °C durante a noite.
      2. Usando um bastão de madeira estéril ou uma ponta de pipeta estéril, pegue uma colônia única da placa de ágar e inocule em 3 mL de caldo LB. Incube a cultura a 37 °C com agitação a 200 rpm durante a noite.
      3. Realize uma diluição 1:10 da cultura durante a noite em caldo de 1 mL LB e meça a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura usando um espectrofotômetro.
    2. Cálculo da multiplicidade de infecção (MOI)
      1. Transfira 100 μL da cultura durante a noite para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuge a 6000 × g por 10 minutos a 4 °C.
      2. Aspire o sobrenadante cuidadosamente para não perturbar a célula. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio sérico e livre de antibióticos antimicóticos.
        NOTA: Esta é uma diluição 1:10 da cultura bacteriana durante a noite. Para o cálculo do MOI, use o valor bruto OD600 calculado para a cultura diluída durante a noite no passo 4.1.3, não o valor OD600 corrigido para o fator de diluição.
      3. Calcule o volume de suspensão bacteriana a ser adicionado a partir do passo 4.2.2 para infectar células Caco-2 com um MOI de 10 usando o seguinte cálculo:
        [1 unidade de OD/2,4 × 109 bactérias] × [10 bactérias/célula] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = volume (uL)
        NOTA: Registre cuidadosamente o volume calculado para cada amostra, pois esse valor será usado posteriormente para calcular o CFU/mL do inoculo. Esse volume de suspensão bacteriana é apenas para 1 poço dentro da placa de 24 poços.
      4. Prepare o meio de infecção transferindo o volume calculado da suspensão bacteriana do passo 4.2.3 para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de substrato sérico e livre de antibióticos antimicos. Misture suavemente, pipetando várias vezes.
    3. Infecção por células Caco-2
      1. Remova a placa de 24 poços contendo as monocamadas celulares Caco-2 da incubadora e aspire o meio completo.
      2. Pipete 1 mL de substrato sérico e livre de antibióticos antimicoóticos para cada poço e aspire para remover vestígios de meio contendo sérum. Repita essa etapa mais uma vez (2 lavagens no total).
        NOTA: Reduza a pressão do vácuo ao aspirar para evitar perturbar a monocamada da célula.
      3. Pipete 1 mL do meio infectável do passo 4.2.4 para cada poço da placa de 24 poços contendo as células Caco-2.
      4. Centrifuge a placa de 24 poços a 500 × g por 15 minutos em temperatura ambiente para sincronizar o contato bacteriano com as células epiteliais.
      5. Incube a placa de 24 poços a 37 °C com 5% de CO2 por 3 horas para permitir a invasão bacteriana.
      6. Durante o período de incubação, determine-se a CFU/mL da cultura diluída durante a noite a partir da etapa 4.2.2, realizando diluições seriadas de 10 vezes em PBS estéril de 1× usando uma placa de 96 poços.
        1. Para preparar cada diluição, transfira 200 μL da cultura diluída durante a noite da etapa 4.2.2 para o primeiro poço da placa.
        2. Pipete 20 μL da cultura para a próxima linha, que contém 180 μL de 1× PBS. Misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Repita até que as diluições atinjam 10-6 usando uma ponta de pipeta nova para transferência a cada vez.
        3. A placa 10 μL de diluições pontuais em triplicado das 10-2 a 10-6 diluições em placas de ágar LB. Deixe as manchas serem absorvidas pelo ágar sob a chama.
        4. Incube as placas durante a noite a 27–30 °C para evitar o crescimento excessivo das colônias e garantir colônias individuais claras e separadas.
          NOTA: O placagem pontual em triplicado melhora a precisão da quantificação e permite a detecção em uma faixa de concentrações bacterianas. Temperatura de incubação mais baixa desacelera o crescimento bacteriano, permitindo uma estimativa mais precisa da CFU a partir de amostras de alta concentração.
      7. Prepare substrato contendo antibióticos adicionando 240 μg/mL de amikacina ao sérum pré-aquecido e ao meio livre de antibióticos antimicóticos.
      8. Após a infecção de 3 h ser concluída, aspire o meio das monocamadas das células Caco-2. Adicione 1 mL de soro e substrato livre de antibióticos antimicos a cada poço. Repita essa etapa mais uma vez (2 lavagens no total).
      9. Pipete 1 mL de meio contendo amikacina de 240 μg/mL em cada poço e incube a 37 °C com 5% deCO2 por 1 hora para eliminar bactérias extracelulares.
      10. Aspire o meio de cada poço e adicione 1 mL de 1× PBS para eliminar as bactérias aderentes mortas pela amikacina. Repita essa etapa mais uma vez (2 lavagens no total).
      11. Pipeta 200 μL de 1% Triton-X-100 (ver Tabela de Materiais) diluída em 1× PBS em cada poço. Incube em um agitador orbital a 90 rpm por 10 minutos para lisar células epiteliais.
      12. Destacam as células da placa de 24 poços pipetando para cima e para baixo aproximadamente 30 vezes por poço.
        NOTA: Como revestir as placas com colágeno melhora a adesão celular, é importante garantir que a monocamada tenha se soltado da placa. Isso pode ser confirmado visualmente comparando um poço lisado em relação a um poço não lisado e um poço sem células Caco-2, que parecerá claro.
      13. Realize diluições seriadas 10 vezes dos lisados celulares em uma placa de 96 poços usando 1× PBS.
        NOTA: Realize diluições seriadas até a diluição 10-3 .
      14. Placa 10 μL de diluições pontuais em triplicada, variando das não diluídas a 10-3 diluções, sobre placas de ágar LB. Deixe as manchas serem absorvidas pelo ágar sob a chama. Incube as placas durante a noite a 27–30 °C para evitar o crescimento excessivo das colônias e garantir colônias individuais claras e separadas.
    4. Contagem de colônias e cálculo percentual de invasão
      1. Após a incubação durante a noite, conte o número de colônias em cada diluição pontual da cultura diluída durante a noite e do lisado recuperado. Selecione uma diluição em que cada ponto contenha mais de 7 colônias isoladas. Use a mesma diluição entre os triplicados para calcular um número médio de colônias bacterianas retiradas para essa diluição.
        NOTA: Conte diluições localizadas contendo colônias isoladas bem isoladas e evite contar diluições que contenham colônias em contato.
      2. Calcule a CFU/mL do inóculo, a CFU/mL recuperada e a invasão percentual usando as seguintes equações abaixo:
        UFC do inóculo (CFU/mL):
        Inóculo da UFC = (número médio de colônias) (fator de diluição) (volume do meio infectável (μL) x 100
        CFU recuperado (CFU/mL):
        CFU recuperado = (número médio de colônias)(fator de diluição) x 100
        Percentual de Invasão (%):
        Invasão (%) = [(UFCrecuperada)/(inoculo da UFC)] × 100

2. Ensaio de Proteção com Amikacina para Microscopia Confocal

  1. Preparação de coberturas estéreis revestidas de poli-L-lisina
    1. Em um armário de segurança biológica, use pinças estéreis para colocar mantas cobertas revestidas com poli-L-lisina (veja Tabela de Materiais) sobre um papel toalha embebido em 70% de etanol.
    2. Borrife ambos os slides das mantas com 70% de etanol, usando pinças estériles para virar a capa para cada lado.
    3. Deixe as coberturas secarem sob luz UV no armário de segurança biológica até secar completamente.
  2. Semeadura de células Caco-2 em uma placa de 6 poços
    1. Em um armário de segurança biológica, coloque 1 cobertura revestida com poli-L-lisina em cada poço de uma placa de 6 poços.
    2. Repita os passos 3.2.1–3.2.8 da seção "Semeadura das células Caco-2".
    3. Seme as células Caco-2 em concentração de 1 x 105 células/mL em uma placa de 6 poços usando a equação abaixo:
      [(1 × 105 células) (Número de poços que semeiam + 2)] / [Concentração viável de células (células/mL)] × 2 = células (mL)
      NOTA: Esse valor é multiplicado por 2 para considerar a adição de 2 mL de meio por poço ao usar uma placa de 6 poços.
    4. Remova o volume de células calculado acima em um tubo cônico de 15 mL. Calcule o volume do meio de crescimento completo a ser adicionado às células usando a equação abaixo:
       (Número de poços que semeiam + 2 poços) x 2 - células (mL) = meio (mL)
    5. Pipete o volume de meio calculado acima na cônica de 15 mL contendo as células Caco-2 e misture pipeteando várias vezes.
    6. Adicione 2 mL de células Caco-2 em meio de crescimento completo a cada poço da placa de 6 poços (concentração final 1 × 10células de 5 poços/mL).
    7. Incube a placa a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam ~90% de confluência (2–3 dias).
  3. Ensaio de proteção com amikacina
    1. Realize o ensaio de proteção contra a amikacina conforme escrito na Seção 1, Etapas 4.1-4.3.10
  4. Coloração por imunofluorescência
    1. Fixação e permeabilização das células Caco-2
      1. Fixe as células adicionando 1 mL de paraformaldeído a 4% diluído em 1X PBS (veja Tabela de Materiais) a cada poço. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
      2. Aspire cada poço e adicione 1 mL de 1× PBS às células de lavagem. Repita essa etapa mais 2 vezes (3 lavagens no total).
        NOTA: As células podem ser armazenadas por vários dias em 1X PBS a 4 °C.
      3. Adicione 1 mL de 0,1% de Triton-X-100 a cada poço e incube por 10 minutos em temperatura ambiente para permeabilizar as células.
      4. Aspire a solução de Triton-X-100 e adicione 1 mL de 1× PBS a cada poço. Incube as células com 1× PBS por 5 minutos. Repita essa etapa mais 2 vezes (3 lavagens no total).
    2. Bloqueio e coloração por anticorpos
      1. Para evitar a ligação inespecífica de anticorpos, prepare uma solução bloqueante usando albumina sérica bovina (BSA) a 1%, 22,52 mg/mL de glicina em 1× PBS + 0,1% Tween20 (veja a Tabela de Materiais).
      2. Adicione 1 mL de solução bloqueante a cada poço e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
        NOTA: O passo de bloqueio também pode ser feito a 4 °C por 16 horas.
      3. Aspire solução bloqueante e incube células com anticorpo primário anti-Rabbit E. coli (veja Tabela de Materiais) diluído (diluição recomendada 1:500) em solução bloqueante por 1 hora em temperatura ambiente.
        NOTA: A incubação com o anticorpo primário também pode ser feita a 4 °C por 16 horas.
      4. Aspire a solução primária de anticorpos e adicione 1 mL de 1× PBS + 0,1% Tween20. Incube as células em 1× PBS + 0,1% Tween20 por 5 minutos. Repita essa etapa mais 2 vezes (3 lavagens no total).
      5. Incubar células com anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor 488 (ver Tabela de Materiais) diluído (diluição recomendada 1:1000) em solução bloqueante por 1 hora em temperatura ambiente. Envolva a placa em papel alumínio para proteger o fluoróforo da luz.
      6. Aspire a solução secundária de anticorpos e adicione 1 mL de 1× PBS + 0,1% Tween20. Incube as células em 1× PBS + 0,1% Tween20 por 5 minutos. Repita essa etapa mais 2 vezes (3 lavagens no total).
    3. Contra-pintura e montagem do revestimento
      1. Para colorir o DNA do hospedeiro e das bactérias e a actina, prepare uma diluição combinada usando 10 mg/mL de Hoechst (diluição recomendada 1:2000, veja Tabela de Materiais) e Rodamina-faloidina (diluição recomendada 1:1000, veja Tabela de Materiais) em 1× PBS.
      2. Adicione 1 mL de solução de corante em cada poço e incube por 10 minutos.
      3. Remova a solução do corante e adicione 1 mL de 1× PBS a cada poço. Repita essa etapa mais uma vez (2 lavagens no total).
      4. Adicione 1 mL de 1× PBS e deixe as células submersas na solução.
      5. Coloque uma gota de meio de montagem (veja Tabela de Materiais) no slide rotulado.
      6. Levante cuidadosamente a cobertura da placa de 6 poços usando uma agulha dobrada e inverta a cobertura para que o lado contendo as células fique voltado para a lâmina que contém o meio de montagem.
      7. Coloque a cobertura sobre o suporte de fixação. Certifique-se de que o suporte de montagem esteja distribuído uniformemente por todo o revestimento.
      8. Incube as lâminas montadas em temperatura ambiente durante a noite, no escuro.
      9. Sele as bordas da capa de cobertura usando esmalte transparente e guarde os slides a 4 °C em uma caixa de slides.
      10. Imagine as amostras montadas usando os canais apropriados que correspondem aos corantes/fluoróforos usados em um microscópio confocal.

Resultados

Para avaliar a eficácia do tratamento com amikacina na eliminação de bactérias extracelulares e visualizar a invasão intracelular, realizamos experimentos de infecção usando monocamadas de células Caco-2. Como mostrado na Figura 1, o tratamento com gentamicina ou amikacina após infecção por E. coli NRG857c (controle positivo) ou E. coli DH5α (controle negativo) resultou em perfis de invasão semelhantes. Esses achados indicam que a amikacina é tão eficaz quanto a gentamicina na eliminação de bactérias extracelulares e reflete com precisão a carga bacteriana intracelular, apoiando seu uso como antibiótico alternativo para ensaios de invasão. Uma faixa de recuperação de ~4-10% de recuperação de NRG857c e <1% para E. coli DH5α é considerada aceitável para interpretação precisa dos fenótipos de invasão em relação a cepas mutantes ou outros isolados clínicos, consistente com observaçõesanteriores 11. Se as pontuações percentuais de invasão dos controles positivo e negativo estiverem fora dessa faixa de recuperação esperada, os resultados devem ser interpretados com cautela e o ensaio deve ser repetido.

Para demonstrar que a amikacina pode atingir efetivamente isolados clínicos resistentes à gentamicina de E. coli, foram realizados ensaios paralelos de proteção com gentamicina e amikacina, e os perfis de invasão dos isolados foram examinados. Como mostrado na Figura 2, o tratamento de isolados resistentes à gentamicina com gentamicina resultou em valores de recuperação altamente variáveis, variando de 21,52% a 2788,50%. Em contraste, o tratamento com amikacina reduziu drasticamente a recuperação em todos os isolados, destacando sua eficácia e permitindo medições de invasão mais precisas e confiáveis.

Por fim, para avaliar o fenótipo intracelular da AIEC durante a invasão, as células Caco-2 foram infectadas com E. coli NRG857c. A Figura 3 mostra uma imagem representativa de uma célula Caco-2 infectada com bactérias (verde) coloridas por imunofluorescência, actina hospedeira (vermelho) e DNA (azul) visualizadas por contracoloração com rodamina-faloidina e Hoechst, respectivamente. Às 4 horas após a infecção, observa-se NRG857c replicando-se no citoplasma, localizando-se próximo ao núcleo e dentro dos limites da actina, o que confirma a natureza intracelular dessas bactérias.

figure-results-1
Figura 1: A adição de gentamicina ou amikacina às células Caco-2 infectadas com a cepa AIEC NRG857c resulta em perfis de invasão comparáveis. As monocamadas de células Caco-2 foram infectadas com a cepa AIEC NRG857c e E. coli DH5α com um MOI de 10. Após 3 horas de infecção, as células foram tratadas por 1 hora com gentamicina (100 μg/mL) ou amikacina (240 μg/mL) para eliminar bactérias extracelulares. As células foram então lisadas com 1% de Triton-X-100, e os homogenados foram diluídos serialmente e placados em ágar LB para enumeração da CFU. A invasão foi expressa como a porcentagem de bactérias recuperadas em relação ao inóculo inicial. Os dados representam três experimentos independentes (n = 3); barras de erro indicam desvio padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: A amikacina atinge efetivamente cepas resistentes à gentamicina de E. coli . Monocamadas de células Caco-2 foram infectadas com cepas de E. coli isoladas de pacientes com DII com um MOI de 10. Após 3 horas de infecção, as células foram tratadas por 1 hora com gentamicina (100 μg/mL) ou amikacina (240 μg/mL) para eliminar bactérias extracelulares. As células foram então lisadas com 1% de Triton-X-100, e os homogenados foram diluídos serialmente e placados em ágar LB para enumeração da CFU. A invasão foi expressa como a porcentagem de bactérias recuperadas em relação ao inóculo inicial. Os dados representam três experimentos independentes (n = 3); barras de erro indicam desvio padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Visualização da invasão de células epiteliais por E. coli. Micrografias confocais representativas de células Caco-2 infectaram E. coli NRG857c. Células Caco-2 foram infectadas por 3 horas, seguidas por incubação de 1 hora com amikacina (240 μg/mL). A actina hospedeira foi corada com rodamina-Falodin (vermelho), e o DNA hospedeiro e bacteriano foi corado com Hoechst (azul). E. coli (verde) foi detectada usando um anticorpo primário anti-coelho E. coli e um anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor 488 para cabra. As imagens foram obtidas em um objetivo de 63× com zoom de 3× usando um microscópio confocal Leica. Barras de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Fluxograma do estudo. (A)As cepas AIEC foram cultivadas durante a noite, lavadas e adicionadas às camadas monocamadas Caco-2 com um MOI de 10. Após 3 horas de infecção e 1 hora de tratamento com amikacina, bactérias intracelulares foram recuperadas e quantificadas por diluições seriadas em placas triplicadas. (B) As monocamadas infectadas foram fixadas, coradas com anticorpos e imagens usando microscopia de fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: O tratamento com amikacina resulta em citotoxicidade mínima nas células epiteliais. As células Caco-2 foram tratadas com gentamicina (100 μg/mL) ou amikacina (240 μg/mL) por 1 hora. A citotoxicidade foi determinada medindo a lactato desidrogenase liberada no meio de cultura. Barras de erro indicam desvio padrão da média (n = 3). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O ensaio de proteção com a amikacina é uma abordagem modificada para avaliar a invasão de E. coli em células epiteliais. Várias etapas são críticas para o sucesso deste ensaio, incluindo o revestimento de colágeno nas placas, a manutenção da integridade da monocamada e a lise celular eficiente. As células Caco-2 são uma linhagem celular aderente que pode se fixar a plástico tratado em cultura de tecido e formarmonocamadas 20. No entanto, durante a infecção, o uso de meios sem soro e lavagens repetidas podem influenciar o descolamento celular, levando a uma sub-representação da invasãobacteriana 21. Para solucionar isso, revestir placas com componentes da matriz extracelular, como o colágeno tipo IV, pode promover a fixação celular e a formação de uma camada monocamada estável e confluente durante a infecção21. Isso é importante, pois a cepa AIEC LF82 demonstrou interromper junções apertadas durante a invasão, e a formação incompleta de uma monocamada pode contornar essa etapa, levando a resultadosenviesados 22. Por fim, a lise celular eficiente é outro passo fundamental que afeta a recuperação bacteriana, já que a lise incompleta pode mascarar a invasividade, confundindo os resultados doensaio 23. Para contornar isso, é importante ressuspender completamente o lisado celular após a incubação com Triton-X-100.

Além dos desafios técnicos que podem contribuir para a variabilidade do ensaio de invasão, a porcentagem de inóculo recuperado após a infecção para a cepa AIEC LF82 tem variado entre 0,61 e 17,25%8. Essa variabilidade pode ser influenciada pela ausência de certos sinais ambientais, como sais biliares, mucina e outros metabólitos intestinais neste ensaio in vitro, que são conhecidos por contribuir para a virulênciaAIEC 24,25,26. Especificamente, foi demonstrado que sais biliares induzem a expressão de fimbrias polares longas, que aumentam a ligação e translocação da AIEC entre as célulasM 27. Outros patógenos gastrointestinais, como Vibrio e Shigella, são conhecidos por regular seus sistemas de secreção tipo III em resposta à bile para mediar a invasão das células epiteliais28,29. Subcultivar com sais biliares para induzir a expressão do fator de virulência é padrão nos protocolos de proteção contra gentamicina para outros patógenos, e o crescimento da AIEC com esses sinais ambientais pode estabilizar a invasão e gerar perfis maisconsistentes 30,31.

Outra limitação desse ensaio é que a invasão bacteriana é avaliada em um único ponto temporal, o que, embora padrão em campo, provavelmente simplifica demais o processode invasão 12. A invasão bacteriana é um processo dinâmico que envolve aderência, internalização, replicação intracelular e fuga da célulahospedeira 32. Como genes novos que contribuem para a invasão da AIEC têm sido difíceis de identificar, o uso de um único ensaio de ponto temporal pode sub-representar o número de genes que contribuem para esseprocesso 12. Portanto, ensaios de invasão por curso temporal têm sido usados para avaliar como genes específicos contribuem para a invasão e para estudar a replicação do AIEC em células I-407 e Hep-2 8,33. Embora o uso de um ensaio de invasão temporal seja valioso para caracterizar a contribuição de genes individuais para a invasão, ele é trabalhoso intensivo, especialmente na triagem de muitos isolados clínicos. Por essa razão, um único ponto de tempo é usado para avaliar a invasão.

Além disso, o estilo de vida intracelular da AIEC não foi muito bem caracterizado. A maioria dos estudos utiliza a invasão percentual como leitura principal para detectar mudanças na UFC de vários mutantes de deleção do fatorde virulência 14,34. A visualização das células hospedeiras infectadas pode fornecer insights únicos sobre a biologia do AIEC que são perdidos ao usar apenas a enumeração daCFU 35. Portanto, para avaliar de forma abrangente o papel de diferentes genes na invasão celular, a realização de microscopia de imunofluorescência das células infectadas deve ser realizada em conjunto com a enumeração de UFC. Isso é importante, pois pode levar à identificação de genes que atuam na sobrevivência endossômica e na fuga, que têm como alvo o citoesqueleto do hospedeiro ou que apresentam diferenças na carga bacteriana por célula, o que pode ser ignorado apenas com a recuperação da UFC. É importante notar que o uso do protocolo de coloração por imunofluorescência descrito aqui para detectar bactérias intracelulares não distingue entre bactérias verdadeiramente internalizadas e aquelas aderidas à superfície celular. Uma abordagem de coloração diferencial, na qual bactérias extracelulares são marcadas com um anticorpo secundário distinto antes da permeabilização e bactérias intracelulares são coloridas após a permeabilização, abordaria essa limitação e poderia ser implementada em estudos futuros para distinguir essas populações de forma maisdefinitiva 36.

A importância desse método reside principalmente na capacidade de rastrear isolados de E. coli multirresistente a medicamentos em pacientes com DII que passam por diversos tratamentosantibióticos 11. A gentamicina é usada para tratar pacientes com DII de início precoce e pode ser administrada para tratar outras infecçõesbacterianas 37. O surgimento de isolados resistentes à gentamicina impediria o uso do ensaio padrão, tornando a amikacina uma alternativa maisconfiável 11. O uso dos protocolos descritos neste artigo permitirá uma caracterização mais completa da biologia da infecção AIEC e ajudará a identificar novos genes que podem contribuir para a invasão. Esses métodos são importantes no contexto da patogênese bacteriana e da pesquisa em interação hospedeiro-patógeno, pois permitem a descoberta de novos fatores de virulência, a caracterização do ciclo de vida intracelular bacteriano e a investigação das vias do hospedeiro direcionadas durante a infecção. Além disso, são amplamente aplicáveis para o estudo de outros patógenos invasores usando modelos celulares epiteliais in vitro .

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Iniciativa de Patogênios Emergentes do Instituto Médico Howard Hughes (K.O., J.N.), subvenção da Fundação Welch 1-561 (K.O.), Fundação Once Upon a Time (K.O.), bolsa NIH R35 GM134945 (K.O.), bolsa NIH NIDDK K08-DK-123316 (J.N.), Prêmios Burroughs Wellcome Fund para Carreira para Cientistas Médicos - 1020904 (J.N.) e NIH T32 AI007520 (S.F.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
75 cm2 Frasco de cultura de tecidoFisher Scientific FB012937
Amicacina disulfato Research Products International A20540-25.0
Antibiótico-Antimíótico (100x)Gibco15240062
Anticorpo anti-E.coliAbcamab137967
Placas de micropoços BioLite - 6 poçosFisher Scientific 12-556-004
Álbumina sérica bovinaSigma-AldrichA7906
Colágeno I, cauda de rato, 100 mgCorning354236
Lâmina de câmara de contagem celular CountessInvitrogenC10312
DMEM, alta glicoseGibco11965118
Soro fetal bovinoCorning35-011-CV
Ácido acético glacialSigma-AldrichA6283
Glicina ultrapuraUSBiologicalG8165
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H + L) cruzado, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, trihidrocloreto trihidratadoInvitrogenH3570
Liofilchem MTS amicacina [AK] 0,016-256 µg/mLFisher Scientific 22-777-704Fitas de Teste MIC de Amicacina
Solução de paraformaldeído, 4% em PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Lâminas de vidro alemão revestidas com poli-L-lisina estéril para cultura celularNeuvitroNC1327375
Montante antifade ProLong gold InvitrogenP36934
Rhodamina-FalidinaInvitrogenR415Vermelho-laranja 540/565 nm
Placas de cultura de tecido estéreis tratadas na superfícieFisher Scientific FB012929Placas de 24 poços
Triton X-100 (Eletroforese)Fisher Scientific BP151-100
Azul de TripanoInvitrogenT10282
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelhoGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

Referências

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