Ensaio baseado em imunofluorescência para detecção de focos nucleares de RAD51 como marcador de reparação por recombinação homóloga em células cancerosas de ovário

Resumo

Os focos nucleares do RAD51 são um marcador da atividade de recombinação homóloga (HR). Este manuscrito descreve um método simples de imunofluorescência para detectar esses focos em células cancerígenas, possibilitando a avaliação da função da HR e apoiando a investigação pré-clínica das respostas a agentes que danificam o DNA.

Resumo

RAD51 é uma proteína central na via de recombinação homóloga (HR) e é essencial para o reparo preciso das quebras de fita dupla (DSBs) de DNA. Após a formação do DSB, a resseção final do DNA gera substratos de DNA de fita simples que facilitam o recrutamento e a montagem dos filamentos de nucleoproteína RAD51 nos locais de dano. Esse processo resulta na formação de focos nucleares discretos de RAD51, que servem como uma leitura funcional amplamente aceita da atividade de HR e um marcador substituto da proficiência em HR. Como defeitos na HR são comuns em várias malignidades, especialmente cânceres de ovário e de mama, a avaliação da formação de focos de RAD51 surgiu como uma abordagem importante para avaliar a capacidade de reparação do DNA e prever a resposta a terapias que danificam o DNA, incluindo compostos de platina e inibidores da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), cuja eficácia é fortemente influenciada pelo status de reparação da HR. Este manuscrito descreve um protocolo simples, confiável e reprodutível baseado em imunofluorescência para a detecção e quantificação dos focos nucleares RAD51 em células de câncer de ovário cultivadas. O método envolve indução de danos ao DNA por radiação ionizante (IR), seguida de fixação, imunocoloração com anticorpos contra RAD51 e γH2AX, microscopia confocal e análise quantitativa manual de focos co-localizados RAD51/γH2AX. O protocolo pode ser aplicado sob condições basais ou após perturbações genéticas e farmacológicas para determinar seus efeitos na função da HR. Resultados representativos demonstram indução robusta de focos de RAD51 em células de câncer de ovário proficientes em HR após danos ao DNA, enquanto a depleção de RAD51 reduz significativamente a formação de focos apesar de níveis comparáveis de DSBs, confirmando a especificidade do ensaio. No geral, esse protocolo oferece um ensaio funcional robusto e reprodutível para avaliar a competência em RH, com amplas aplicações em pesquisas pré-clínicas e potencialmente translacionais sobre câncer.

Introdução

Quebras de fita dupla de DNA (DSBs) estão entre as formas mais graves de dano ao DNA porque o reparo impreciso pode comprometer a estabilidade do genoma e contribuir para o desenvolvimento tumoral ou morte^{celular 1,2,3}. Para combater essas ameaças, as células empregam várias vias de reparo do DNA, incluindo a recombinação homóloga (HR), considerada o mecanismo mais preciso para reparar^{DSBs 2,4,5}. Ao contrário das vias de reparação propensas a erros, a HR utiliza uma sequência de DNA homóloga como modelo para restaurar informações genéticas no local danificado. Consequentemente, a HR funciona predominantemente durante as fases S e G2 do ciclo celular, quando cromátides irmãs estão disponíveis para servir como modelos de^{reparo 2,5}. Notavelmente, a HR é essencial para a reparação precisa dos DSBs originados de fontes endógenas, como o estresse de replicação, bem como de insultos exógenos, incluindo radiação ionizante (IR) e agentes quimioterapêuticos que danificam o DNA^2,5.

O RAD51 é um efetor central da via HR e desempenha um papel crítico na busca por homologia e na invasão de fitas durante o reparo mediado por HR dos DSBs ^2,5. Após a formação do DSB, as extremidades do DNA passam por ressecção, um processo iniciado pelo complexo MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) e fatores associados que geram saliências de DNA de fita simples de 3′. Essas regiões de fita simples são inicialmente revestidas pela proteína de replicação A (RPA), que impede a formação de estruturas secundárias e estabiliza o intermediário de ^{reparo 4,5,6}. A HR é então iniciada por meio das ações coordenadas do BRCA1, PALB2 e BRCA2, que facilitam o recrutamento e o carregamento do RAD51 sobre o DNA ressecado, deslocando o RPA e promovendo a formação dos filamentos de nucleoproteína ^{contendo RAD51 4,5,6}. Uma vez montados, esses filamentos buscam sequências homólogas de DNA dentro da cromátida irmã e catalisam a troca de fitas, facilitando assim a fiel restauração do DNA ^{danificado 4,5,6}. O acúmulo de RAD51 nos sítios DSB aparece microscopicamente como focos nucleares pontuados que podem ser detectados pela imunofluorescência 7,8,9,10. Como a formação desses focos reflete o engajamento bem-sucedido da maquinaria de RH, a análise de focos RAD51 tornou-se uma abordagem funcional amplamente utilizada para avaliar a capacidade de HR e a proficiência na reparação de DNA em^células 7,8,9,10. Importante, esse ensaio mede a capacidade das células de executar uma resposta de HR após danos ao DNA, em vez de depender apenas dos níveis de expressão de genes ou proteínas associados à HR.

Defeitos na HR são frequentemente observados no câncer, especialmente em tumores que apresentam alterações nos parálogos BRCA1, BRCA2, RAD51 ou outros genes envolvidos na HR, e são especialmente prevalentes em cânceres de ovário e mama 4,11,12,13,14. A deficiência de HR tem importantes implicações terapêuticas, pois confere sensibilidade aumentada a agentes que prejudicam o DNA, como a terapia com platina, e aos inibidores da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) por meio do princípio da letalidade^sintética 4,11,12,13,14,15 . Consequentemente, ensaios funcionais confiáveis para avaliar a atividade de RH são críticos tanto para estudos mecanicistas quanto para pesquisa translacional.

Este protocolo descreve um ensaio baseado em imunofluorescência para a detecção e quantificação de focos nucleares de RAD51 após danos ao DNA em células de câncer de ovário. O fluxo de trabalho envolve a indução de DSBs de DNA usando infravermelho, seguida pela detecção imunofluorescente de RAD51 e γH2AX e quantificação de focos nucleares co-localizados por microscopia confocal. O protocolo é demonstrado usando células OVCAR-8 proficientes em HR e células ABT^R2 resistentes ao inibidor de PARP adquiridas, além de fornecer uma abordagem funcional reprodutível para avaliar a atividade da HR após a formação do DSB. Embora a análise de focos RAD51 seja amplamente utilizada como medida funcional da atividade de HR, os métodos disponíveis frequentemente focam em ambientes experimentais específicos e frequentemente carecem de orientações detalhadas sobre a integração da indução controlada de danos ao DNA, confirmação da formação de DBS de DNA, controles de validação de ensaios e quantificação padronizada baseada em imagem. Além disso, abordagens alternativas para avaliar a função da HR, incluindo ensaios genômicos de cicatrizes, assinaturas mutacionais e análises de expressão gênica ou proteica, fornecem medidas indiretas do status da HR e não avaliam diretamente a capacidade celular de recrutar RAD51 para locais de dano ao DNA. Ensaios baseados em repórter, como o DR-GFP, oferecem medições diretas da atividade da HR, mas exigem engenharia genética estável e não são facilmente aplicáveis a muitos modelos experimentais. Portanto, o fluxo de trabalho descrito aqui combina danos ao DNA induzidos por IR com coloração dual de imunofluorescência RAD51/γH2AX para verificar simultaneamente a formação de DSB e quantificar o recrutamento de RAD51 para cromatina danificada. Essa abordagem oferece um método prático, biologicamente relevante e amplamente aplicável para avaliação funcional direta da competência em RH em células cancerígenas cultivadas, incorporando controles de ensaio, etapas de validação e procedimentos padronizados de quantificação de focos.

Protocolo

Todos os materiais e reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais, incluindo informações do fabricante, números de catálogo e diluições de anticorpos. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1.

NOTA: As linhas celulares de câncer de ovário OVCAR-8 e ABT^R2 são usadas neste protocolo e já foram descritas^{anteriormente} 15,16,17,18,19,20. As células OVCAR-8 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Larry Karnitz (Mayo Clinic), que as recebeu originalmente do Dr. Dominic Scudiero (Instituto Nacional do Câncer, NIH). As células^{ABT R2}foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic⁾²⁰. ^{ABT R}2 é um derivado resistente a PARPi do BRCA2.- mutação da linhagem celular de câncer de ovário PEO1 que adquiriu resistência por meio da restauração da expressão de BRCA2. Como a restauração do BRCA2 restabeleceu a carga do RAD51 e a atividade de HR, as células^{ABT R}2 servem como um modelo representativo proficiente em HR. A identidade da linhagem celular foi verificada com base na proveniência da fonte e nas características estabelecidas relatadas na^literatura 15,16,17,18,19,20. Experimentos foram realizados usando células de baixa passagem (passagens 3–12) mantidas em cultura por no máximo 1 mês após o descongelamento. As linhagens celulares eram rotineiramente testadas para contaminação por micoplasma a cada 6 meses usando um kit de detecção de micoplasma, e todas as culturas usadas neste estudo foram confirmadas como livres de micoplasma.

ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e deve ser preparado e manuseado em uma exaustão química certificada, enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado. Linhagens celulares de origem humana devem ser manuseadas de acordo com procedimentos institucionais de biossegurança, utilizando práticas adequadas de contenção. Triton X-100, suporte de montagem e esmalte devem ser manuseados de acordo com as recomendações de segurança do fabricante. A IR deve ser administrada apenas por pessoal treinado e de acordo com as políticas institucionais de segurança radiológica. Descartar resíduos químicos, biológicos e associados à radiação de acordo com os requisitos institucionais e regulatórios locais.

1. Cultura celular e manutenção

1. Células de cultura no meio de crescimento Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 suplementadas com 8% de soro fetal bovino em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: Essas condições de cultura são consistentes com as usadas em nossos estudos anteriores das células OVCAR-8 e ABT^R215,16,17,18,19. Nessas condições, ambas as linhagens celulares apresentam crescimento robusto e fenótipos de resposta ao dano ao DNA reproduzíveis.
2. Se desejado, realizar perturbações (por exemplo, knockdown/knockout gênico), seguindo condições experimentais^{otimizadas 15,17}.
   NOTA: Neste protocolo, a redução mediada por siRNA do RAD51 é fornecida como um exemplo representativo de perturbação gênica antes da análise de imunofluorescência.
   1. Prepare 5 × 10⁶ células em meio RPMI-1640 de 180 μL suplementado com soro fetal bovino a 8%.
   2. Adicione 20 μL de solução de siRNA de 20 μM (2 μM de siRNA por transfecção) e misture suavemente.
      NOTA: Use os seguintes siRNAs: SiRNA de controle não direcionado da luciferase (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; SIRNA RAD51 (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Todos os siRNAs foram adquiridos da Horizon Discovery.
   3. Transfira a suspensão da célula para uma cubeta de eletroporação de 4 mm.
   4. Eletroporar células usando um eletroporador BTX ECM 830 com dois pulsos de 10 ms a 280 V.
   5. Transfira as células para o meio de crescimento completo e incube sob condições padrão de cultura em um recipiente de 10 cm por 24 horas.
   6. Repita a eletroporação do siRNA usando as mesmas condições descritas nos Passos 1.2.1–1.2.4.
   7. Incubar as células sob condições padrão de cultura em um prato de 15 cm por mais 48 horas.
   8. Semeie uma parte das células para o ensaio de imunofluorescência conforme descrito na Etapa 2. Reserve as células restantes para validação do knockdown do RAD51 por imunobloting.
   9. Valide o knockdown do RAD51 por imunoblotting
      1. Células de lisa em tampão de lise gelada contendo 50 mM de HEPES (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 10 mM de NaF, 30 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de Na₃VO₄, 10 mM de β-glicerofosfato e coquetel inibidor de protease (1 comprimido por tampão de lise de 10 mL).
      2. Clarifique os lisados por centrifugação a 18.800 × g . por 5 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo novo de microcentrífuga e determine a concentração de proteínas usando um ensaio proteico apropriado.
      3. Misture uma quantidade adequada de lisado de proteína com 4× tampão de amostra de Laemmli para alcançar uma concentração final de 1×.
      4. Adicione β-mercaptoetanol a uma concentração final de 20% e aqueça as amostras a 95 °C por 12 minutos antes do SDS-PAGE.
      5. Separe quantidades iguais de proteína por SDS-PAGE e transfira proteínas para uma membrana apropriada para análise de imunoblot.
      6. Bloqueie a membrana com leite a 5% por 30 minutos em temperatura ambiente, agitando-o.
      7. Lave a membrana três vezes (5 min cada) com 1× soro trô-tamponado com tween 20 (TBST) em temperatura ambiente, agitando.
      8. Incubar a membrana com anticorpo policlonal anti-RAD51 de coelho (diluição 1:1.000) ou anticorpo anti-ACTIN (diluição 1:1000) a 4 °C por 16–18 horas com agitação.
      9. Lave a membrana com 1× TBST (5 min cada) em temperatura ambiente, agitando.
      10. Incube a membrana com anticorpo secundário anti-coelho ou anti-camundongo conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (diluição 1:10.000) por 1 hora em temperatura ambiente com agitação.
      11. Lave a membrana com 1× TBST (5 min cada) em temperatura ambiente com agitação, detecte bandas imunorreativas usando um método adequado de detecção de quimiluminescência e confirme a depleção de RAD51 em relação às células transfectadas com o siRNA controle não direcionado.

2. Semeadura de células

1. Quando as células atingem a fase de crescimento logarítmico (aproximadamente 70–80% de confluência), aspire o meio de cultura e lave suavemente as células uma vez com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) para remover o soro residual.
2. Adicione solução suficiente de tripsina–EDTA a 0,25% para cobrir a monocamada celular (por exemplo, 1–2 mL por frasco T175) e incube a 37 °C por 2–5 minutos, monitorando o destacamento celular ao microscópio.
3. Uma vez que as células se separarem, neutralize imediatamente a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultivo completo contendo FBS.
4. Colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL
5. Determine a viabilidade e concentração celular usando exclusão de azul de tripano e um hemocitômetro ou contador celular automático antes da semeadura.
6. Prepare uma suspensão unicelular em meio de crescimento completo a uma concentração de 4 × 10⁴ células/mL.
7. Semente 200 μL da suspensão da célula em cada poço de uma lâmina de câmara de vidro de 8 poços para alcançar uma densidade final de 8.000 células por poço.
8. Incube as lâminas da câmara por 24 horas a 37 °C com 5% de CO₂ para permitir a fixação celular.
   NOTA: O número de células para semente pode variar dependendo do tipo celular. Prepare uma suspensão de célula em excesso suficiente para pelo menos um poço adicional para compensar a variabilidade da pipeteação. Semeie cada condição em duplicado ou mais para garantir a reprodutibilidade. Se se deseja modulação farmacológica da HR, as células devem ser tratadas após a fixação durante a noite (12–16 h após a semeadura). A densidade de semeadura deve ser ajustada conforme necessário para garantir que as células atinjam a confluência adequada no momento do tratamento e da análise a jusante, levando em conta os efeitos esperados do agente farmacológico na proliferação ou viabilidade celular. Como a HR ocorre predominantemente durante as fases S e G2 do ciclo celular, mantenha as culturas em crescimento logarítmico e evite a superconfluência. Para experimentos envolvendo tratamentos que possam alterar a progressão do ciclo celular, a incorporação de EdU, análise do conteúdo de DNA ou outras medições do ciclo celular podem ser realizadas para facilitar a interpretação dos resultados dos focos RAD51. Incluir controles não tratados (–IR) e irradiados (+IR) em cada experimento para estabelecer a formação de focos basais e induzidos por danos ao DNA de RAD51, respectivamente. Ao realizar perturbações mediadas por siRNA, inclua siRNA de controle não direcionado (por exemplo, siLUC) e condições específicas de siRNA do alvo (por exemplo,si RAD51). Controles sem anticorpos primários e sem anticorpos secundários são recomendados durante a otimização de anticorpos para avaliar coloração inespecífica e fluorescência de fundo.

3. Indução de danos ao DNA por RI

1. As células expostas nas lâminas da câmara para IR em uma dose de 6 Gy²¹ induzem DSBs de DNA.
2. Imediatamente retorne as lâminas a uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Incube as células por 6 horas após a intervenção pós-intervenção.
   NOTA: O IR foi entregue usando um irradiador biológico RS-2000 operado a 160 kV e 25,0 mA (posição de prateleira 5). As células foram irradiadas em temperatura ambiente com uma única dose de 6 Gy (aproximadamente 4,8 Gy/min) e imediatamente retornaram a uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ para recuperação. O irradiador era rotineiramente calibrado de acordo com as recomendações do fabricante, e todos os procedimentos eram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de segurança radiológica. A incubação pós-RI de 6 horas já foi estabelecida^{em 15, 17, 22.} O momento ideal pode variar entre os tipos celulares e deve ser otimizado para cada linhagem celular.

4. Fixação e permeabilização

1. Aspire cuidadosamente o meio de cultivo dos poços sem perturbar as células.
2. Fixe as células usando paraformaldeído 3% recém-preparado em 1× PBS por 12 minutos em temperatura ambiente.
3. Aspire suavemente o fixador e lave os poços três vezes com 500 μL de 1× PBS por poço.
4. Permeabiliza células com 0,2% de Triton X-100 em 1× PBS por 12 minutos em temperatura ambiente.
5. Lave os poços três vezes com 1× PBS.
   NOTA: Realize etapas de fixação, permeabilização e lavagem suavemente, adicionando e removendo soluções ao longo da parede de cada poço para minimizar o descolamento celular. A menos que indicue o contrário, use 500 μL de 1× PBS por lavagem.

5. Bloqueio

1. Prepare uma solução bloqueante dissolvendo 5% (v) de albumina sérica bovina (BSA) em 1× PBS.
2. Incube as células em solução bloqueante por 60 minutos em temperatura ambiente para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos.

6. Incubação primária de anticorpos

1. Remova a solução bloqueante e lave as células três vezes com 1× PBS.
2. Prepare anticorpos primários nas diluções apropriadas na solução bloqueante. Anticorpos anti-RAD51 policlonal de coelho (1:1000) e anti-fosfo-histona monoclonal de camundongo (γH2AX) (1:1000) são utilizados, com γH2AX servindo como marcador para os DSBs^23,24.
3. Adicione 100 μL de solução primária diluída de anticorpos em cada poço.
4. Incube as lâminas em temperatura ambiente por 16–18 horas em uma câmara umidificada para evitar a evaporação.
   NOTA: Os dois anticorpos primários podem ser combinados na mesma solução para coloração simultânea.

7. Incubação secundária de anticorpos

1. Prepare anticorpos secundários em diluições apropriadas na solução bloqueante. O IgG anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (1:350) é usado para detectar RAD51, e IgG anti-camundongo conjugado com Alexa Fluor 594 (1:350) é usado para detectar γH2AX.
2. Aspire a solução primária de anticorpos e lave as células três vezes com 1× PBS.
3. Adicione 100 μL de solução secundária diluída de anticorpos em cada poço.
4. Incube lâminas por 1 hora em temperatura ambiente, no escuro.
   NOTA: Os dois anticorpos secundários podem ser combinados para detecção simultânea. A partir desta seção, realize todas as etapas em um espaço protegido contra luz para minimizar o fotobranqueamento.

8. Contracoloração e montagem nuclear

1. Prepare a solução de Hoechst 33342 em diluição 1:1.000 em 1× PBS para colorir núcleos.
2. Aspire a solução secundária de anticorpos e lave as células uma vez com 1× PBS.
3. Incube células com solução diluída de Hoechst 33342 por 90 segundos em temperatura ambiente.
4. Aspire a solução Hoechst 33342 e lave as células três vezes com 1× PBS.
5. Remova o PBS de 1× e desconecte a câmara superior das lâminas de vidro, adicionando cerca de 25 μL de antidesfaçante em cada poço.
6. Coloque lâminas de vidro sobre as células montadas, garantindo contato uniforme com o suporte.
7. Remova as bolhas de ar com cuidado e fele as bordas com esmalte.
   NOTA: A contracoloração nuclear fornece uma referência para núcleos, facilitando a localização e quantificação precisas dos focos nucleares RAD51 e γH2AX.

9. Imagem e quantificação dos focos RAD51 em DSBs

1. Imagem desliza imediatamente ou armazenada a 4 °C em uma caixa de slides no escuro até a análise.
   NOTA: Para minimizar a possível degradação do sinal e o fotobranqueamento, adquira imagens o mais rápido possível, de preferência dentro de 1 semana após a montagem.
2. Adquira imagens usando um microscópio confocal com linhas de laser e conjuntos de filtros apropriados: Hoechst 33342 (405 nm) para núcleos, Alexa Fluor 488 (488 nm) para RAD51 e Alexa Fluor 594 (561/594 nm) para γH2AX.
3. Realize imagens confocais usando uma objetiva de alta ampliação adequada para resolver estruturas subcelulares.
4. Quantifique manualmente os focos do RAD51 contando focos nucleares discretos que co-localizam com γH2AX; exclua focos não co-localizados com γH2AX.
   NOTA: Valide o desempenho dos anticorpos antes da análise quantitativa, confirmando focos nucleares induzidos por RAD51 e γH2AX induzidos por RI em células controle e sinal reduzido de RAD51 após o tratamento com siRNA RAD51. Quantificar apenas focos nucleares discretos de RAD51 que co-localizam com γH2AX em núcleos com morfologia intacta e padrões claros de coloração; excluem coloração difusa ou não nuclear, sinais RAD51 não colocalizados, células sobrepostas ou multinucleadas, células mitóticas e células apoptóticas. Mantenha configurações de imagem idênticas em cada experimento e aplique critérios manuais de pontuação consistentes em todas as condições. Analise ~50 núcleos por condição a partir de múltiplos campos de visão para cada réplica biológica e realize pelo menos três réplicas biológicas independentes. Informe o número de focos co-localizados RAD51/γH2AX por núcleo usando uma análise estatística apropriada.

10. Análise estatística

1. Quantifique focos co-localizados RAD51/γH2AX a partir de aproximadamente 50 núcleos por condição.
2. Apresente os dados como média ± SD de pelo menos três réplicas biológicas independentes.
3. Realizar comparações estatísticas usando um teste estatístico apropriado (por exemplo, um teste t de Student bidirecionado sem pareamento para comparações em dois grupos ou uma ANOVA unidirecional para comparações entre múltiplos grupos)
4. Considere a p. < 0,05 estatisticamente significativa.
5. Realize análises estatísticas e geração de grafos usando o GraphPad Prism (versão 10.6.1).

Resultados

O RI induz a formação de focos de RAD51 em DSBs de DNA em células OVCAR-8
Para avaliar funcionalmente a atividade da HR, a formação dos focos RAD51 foi examinada em células de câncer de ovário OVCAR-8 proficientes em HR após a indução de DSBs de DNA por RI. Para estabelecer a especificidade do ensaio e confirmar que os focos observados representam eventos de HR genuínos dependentes de RAD51, as células foram transfetadas com siRNA de luciferase controle não d...

Discussão

A detecção baseada em imunofluorescência dos focos nucleares de RAD51 descrita aqui fornece uma abordagem confiável e funcional para avaliar a atividade da HR em células de câncer de ovário cultivadas. Ao contrário das análises genômicas ou transcriptômicas que inferem o status de HR indiretamente, a formação dos focos de RAD51 reflete diretamente a capacidade da célula de recrutar e montar a maquinaria central de HR nos locais dos DSBs de DNA. Assim, este ensaio serve como uma leitura s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Gel de resolução para SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Gel de empilhamento para SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Usado para desprender células aderentes durante o passageamento de rotina e antes da semeadura de células.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Diluíção para 1× e usado para etapas de lavagem, solução de bloqueio, diluições de anticorpos, fixação e permeabilização.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Corrida para a amostra de proteína no gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Transferir a proteína do gel para a membrana
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Para SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	linhas celulares de câncer de ovário resistentes a PARPi adquiridas
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Home-made	NA	Buffer de lise celular
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Biologia molecular como um catalisador de polimerização para géis, um agente oxidante usado como iniciador de radicais livres
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Anticorpo primário usado para detectar focos de γH2AX. Usado em diluição 1:1000
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Anticorpo primário usado para detectar focos nucleares de RAD51 como um marcador de atividade de recombinação homóloga. Usado em diluição 1:1000
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Usado para preparar solução de bloqueio (5% BSA em PBS) para reduzir a ligação não específica de anticorpos durante o tingimento imunofluorescente.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Sistema de imagem
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Imagem imunofluorescente, análise de focos de γH2AX, quantificação de focos de RAD51, co-localização de proteínas e aquisição de imagens 3D
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Contador de células automatizado
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Colocados sobre amostras montadas para proteger células tingidas e permitir a imagem de alta resolução.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Sistema de eletroporação adequado para aplicações de entrega de genes em células de mamíferos
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Adicionados ao RPMI-1640 (como 8%) para suportar o crescimento e a viabilidade celular.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Anticorpo secundário usado para detectar o anticorpo primário γH2AX. Usado em diluição 1:350
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Anticorpo secundário usado para detectar o anticorpo primário RAD51. Usado em diluição 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	Análise estatística, geração de gráficos e visualização de dados.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	Buffer de manutenção do PH na faixa de pH 7,2-7,6
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	Foi usado para coloração nuclear
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Anticorpo secundário usado para detectar o anticorpo primário de camundongo (β-actina) no Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Anticorpo secundário usado para detectar o anticorpo primário de coelho (RAD51) no Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Reagente de bloqueio
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Buffer de amostra
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Usado para confirmar rotineiramente que as culturas celulares estão livres de contaminação por micoplasma.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Home-made	NA	Gel de resolução para SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	Anticorpo primário usado para detectar β-actin