Um Fluxo de Trabalho Econômico para Imunofluorescência Mono e Multiplex em Culturas Celulares Bidimensionais Aderentes em Lamínulas de Vidro

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho econômico para imunofluorescência mono e multiplex de culturas celulares aderentes em duas dimensões, reduzindo os custos experimentais por meio de lamínulas de vidro baratas, placas-padrão de 24 poços e condições de coloração com baixo volume que minimizam o consumo de anticorpos, ao mesmo tempo que oferece uma abordagem representativa para a localização proteica com microscopia de fluorescência convencional.

Resumo

A microscopia por imunofluorescência (IF) é uma técnica amplamente utilizada para visualizar a localização e distribuição de proteínas com resolução em nível de célula única, preservando ao mesmo tempo a morfologia celular e a organização subcelular. O objetivo deste protocolo é apresentar um fluxo de trabalho prático e econômico para coloração por imunofluorescência mono e multiplex de culturas celulares aderentes em 2D, utilizando materiais de laboratório convencionais. O método baseia-se no cultivo de células sobre lamínulas de vidro de baixo custo colocadas em placas convencionais de 24 poços, e implementa a multiplexação por meio da separação de anticorpos primários por espécie hospedeira, fluoróforos espectralmente distintos e condições de controle robustas, incluindo controles sem anticorpo primário, sem anticorpo, coloração única e controles de interferência cruzada, para garantir a interpretabilidade da IF multiplex. São utilizados passos de coloração com baixo volume para reduzir o consumo de reagentes e anticorpos, sem comprometer a qualidade do sinal. Este fluxo de trabalho dispensa a necessidade de placas ou câmaras de imagem especializadas e é compatível com microscopia de fluorescência de campo amplo ou confocal de uso rotineiro. No geral, este protocolo fornece um fluxo de trabalho de imunofluorescência acessível e prático para avaliação representativa da localização e distribuição de proteínas em culturas celulares aderentes. A adaptação a outros tipos celulares ou painéis de anticorpos requer otimização específica para o alvo, incluindo validação de anticorpos, condições de fixação e permeabilização, seleção de fluoróforos e compatibilidade com o microscópio e conjuntos de filtros.

Introdução

A microscopia por imunofluorescência (IF) é amplamente utilizada para visualizar a localização subcelular, abundância relativa e colocalização de proteínas em células fixadas, vinculando assim marcadores moleculares à morfologia celular e ao contexto subcelular^1,2. Em contraste com métodos que fornecem leituras em massa (por exemplo, imunoblotagem) ou ensaios dissociativos em nível unicelular (por exemplo, citometria de fluxo), a IF preserva a organização espacial celular e é particularmente útil para avaliar a heterogeneidade fenotípica entre células e alterações na distribuição subcelular de proteínas com resolução unicelular^3,4,5. À medida que as questões experimentais exigem cada vez mais a avaliação simultânea de múltiplos marcadores, a IF multiplex permite a detecção concorrente de dois ou mais alvos no mesmo espécime, geralmente combinando anticorpos primários produzidos em espécies hospedeiras diferentes com fluoróforos espectroscopicamente distintos⁶ (Figura 1), utilizando estratégias de detecção direta e/ou indireta (Figura 2). No entanto, a multiplexação introduz desafios técnicos importantes, especialmente a reatividade cruzada entre anticorpos e a interferência espectral, que podem comprometer a interpretação dos resultados, a menos que sejam abordados por meio de um planejamento cuidadoso do painel e condições de controle rigorosas^7,8.

O objetivo geral deste método é fornecer um fluxo de trabalho prático e de baixo custo, amplamente aplicável a anticorpos validados por imunofluorescência e otimizado para o imageamento rotineiro de culturas aderentes em 2D. A multiplexação é implementada por meio da separação por espécie do hospedeiro, fluoróforos espectralmente distintos e grupos controle que verificam os níveis de fundo e o desempenho da marcação^9,10. Ao utilizar lamínulas de vidro de 12 mm em placas-padrão de 24 poços, em vez de lâminas com câmaras especializadas, este fluxo de trabalho evita o uso de um material de consumo dedicado e mais caro, optando por materiais que são padrão na maioria dos laboratórios de cultura celular. O fluxo de trabalho também utiliza uma quantidade substancialmente menor de solução de marcação por unidade de área de crescimento (150 µL para ≈1,13 cm², ou ≈133 µL/cm²) em comparação com formatos equivalentes de lamínulas com câmara^11,12, que normalmente exigem 300–500 µL/cm², o que corresponde a uma redução de aproximadamente 2 a 4 vezes no consumo de anticorpos e reagentes por área. Assim, o protocolo permite a avaliação qualitativa da localização e co-distribuição de múltiplos alvos, utilizando microscópios de campo amplo ou confocais convencionais, juntamente com contracolorações para citoesqueleto e núcleo. Este fluxo de trabalho destina-se à imunofluorescência múltipla convencional em células fixadas, baseada na separação por espécie do hospedeiro e na distinção espectral, e não é projetado para abordagens iterativas ou multiplex de alta dimensão.

Protocolo

Este estudo não envolveu participantes humanos nem sujeitos animais. Todos os experimentos foram realizados utilizando a linhagem celular de osteossarcoma canino D17, uma linhagem celular estabelecida obtida de um banco público de células (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). Assim sendo, nenhuma aprovação ética foi necessária.

1. Manutenção da linhagem celular

1. Mantenha células aderentes em condições padrão de cultivo (37 °C, 5% CO₂, incubadora umidificada) utilizando o meio completo apropriado para a linhagem celular utilizada.
   NOTA: Como exemplo representativo, células de osteossarcoma canino D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276) são mantidas em meio mínimo essencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico, subcultivadas em 70–80% de confluência utilizando tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) e utilizadas dentro de uma faixa de passagens validada (por exemplo, passagens 5–20).
2. Confirme o status negativo para micoplasma antes dos experimentos utilizando um ensaio validado de detecção de micoplasma.

2. Preparação da placa de 24 poços e lamínulas de vidro

OBSERVAÇÃO: As superfícies dos lamínulas devem ser limpas por imersão em etanol 70% (5 min, repetido 3 vezes)×) antes da esterilização por qualquer um dos métodos descritos abaixo; após a esterilização, as lamínulas devem ser armazenadas em um recipiente fechado à temperatura ambiente até o uso.

1. Coloque lamínulas de vidro redondas limpas de 12 mm em uma placa de Petri de vidro (ou suporte para lamínulas) e autoclave. Autoclave também um par de pinças metálicas de ponta fina.
2. Alternativa: Limpe as lamínulas e as pinças com etanol 70%, deixe secar ao ar e descontamine a superfície por exposição à luz ultravioleta (UV) (30 min) dentro de uma cabine de segurança biológica antes do uso. Armazene as lamínulas esterilizadas em um recipiente fechado à temperatura ambiente até o uso.
3. Dentro de uma cabine de segurança biológica, utilize as pinças estéreis para transferir uma lamínula estéril para cada poço designado para os grupos experimentais em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
4. Opcional: recubra as lamínulas com revestimentos que promovam adesão seguindo as instruções do fabricante ou as diretrizes laboratoriais estabelecidas, caso necessário para o tipo celular utilizado.
   NOTA: As opções de revestimento (poli-L-lisina, colágeno I ou fibronectina) e suas concentrações de trabalho estão listadas na Tabela de Materiais. Para a maioria das linhagens celulares aderentes cultivadas em vidro, lamínulas esterilizadas sem revestimento são suficientes; os componentes do revestimento podem ser antigênicos, portanto, o revestimento escolhido não deve apresentar reação cruzada com quaisquer anticorpos no painel.
5. Se as lamínulas foram revestidas, aspire a solução em excesso, lave uma vez com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), e deixe as lamínulas secarem ao ar dentro da cabine de segurança biológica antes da semeadura celular.

3. Grupos experimentais

1. Inclua um painel de controles apropriado ao delineamento multiplex.
   NOTA: Um controle sem anticorpo (sem anticorpo primário nem secundário) revela a autofluorescência intrínseca, e um controle sem primário (coquetel de anticorpos secundários sem qualquer primário) avalia a ligação não específica do secundário e o fundo em todos os canais simultaneamente; como este protocolo utiliza exclusivamente anticorpos secundários espectralmente distintos, esse único controle avalia cada secundário independentemente dentro do seu canal respectivo, cumprindo a mesma função de um controle individual por fluoróforo. Controles com coloração única, nos quais cada par primário–secundário é aplicado individualmente, validam o desempenho de cada anticorpo antes da combinação multiplex e, por comparação com a condição multiplex, permitem avaliar a interferência espectral entre cada par de fluoróforos. Sempre que possível, deve-se utilizar um controle positivo que expresse o antígeno-alvo para confirmar o desempenho do ensaio.

4. Plaqueamento (semear) de células em lamínulas

1. Em uma cabine de segurança biológica, desprenda as células utilizando tripsina (ou outro método de dissociação apropriado), neutralize e ressuspenda-as em meio de cultura completo.
2. Conte as células utilizando um contador celular automatizado ou um hemocitômetro.
3. Dilua as células para 6 × 10⁴–1 × 10⁵ células/mL.
4. Adicione 0,5 mL de suspensão celular por poço (final: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ células/poço).
   NOTA: Se necessário, uma ponteira estéril pode ser usada para garantir suavemente que a lamínula fique plana no fundo do poço, evitando arranhões.
5. Incube as células em condições padrão (37 °C, 5% CO₂) até que as células adiram e alcancem a confluência desejada ou o ponto temporal experimental seja atingido.

5. Tratamento celular (opcional)

1. Selecione o momento do tratamento de acordo com o delineamento experimental. O tratamento pode incluir terapia farmacológica, estimulação com citocinas, manipulação genética para induzir ou silenciar a expressão do gene alvo, ou outras intervenções experimentais, conforme aplicável.
2. Identifique as cavidades para diferenciar os grupos controle e tratados.
3. Incube pelos períodos de tempo necessários; evite a superconfluência, pois o crescimento excessivo aumenta o fundo e compromete a morfologia.
   NOTA: As células devem estar aderidas à lamínula antes da fixação, a menos que o delineamento exija fixação imediatamente após a semeadura.
4. Para alvos secretados rapidamente (por exemplo, citocinas), adicione brefeldina A (BFA) ao meio de cultura numa concentração final de 1–10 µg/mL (comumente 5 µg/mL) e incube por 4–6 h a 37 °C, 5% CO₂ antes da fixação.
5. Remova o meio contendo BFA e prossiga imediatamente para a Fixação.

6. Coloração por imunofluorescência

OBSERVAÇÃO: A partir da fixação, a técnica estéril não é necessária; a coloração pode ser realizada na bancada, utilizando uma cabine de exaustão sempre que um reagente com AVISO for manipulado. As amostras não devem secar em nenhum momento; ao aspirar, deixa-se uma fina película do tampão, e a próxima solução é adicionada imediatamente.

1. Fixação (escolha uma):
   NOTA: O fixador é selecionado de acordo com a localização do alvo e a sensibilidade do epítopo (ver Discussão): Paraformaldeído (PFA) (formaldeído preparado a partir de paraformaldeído) é adequado para a maioria dos alvos e é compatível com a faloidina; o metanol pode auxiliar em certos epítopos nucleares/fosfo-epítopos, mas prejudica a coloração da F-actina.
   1. Fixação com PFA (recomendada para a maioria dos alvos):
      1. Aspire o meio e lave suavemente uma vez com solução salina tamponada com Tris (TBS) (0,5 mL/poço).
      2. Adicione PFA a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) (0,5 mL/poço) e incube por 10 min à temperatura ambiente (≈25 °C).
      3. Aspire o PFA e lave 3× com TBS (aspirando prontamente; não deixe os poços secarem).
         NOTA: CUIDADO: O PFA é tóxico e potencial carcinogênico. Manipule soluções de PFA em capela química certificada, usando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas e proteção ocular). Evite inalação e contato com a pele, e descarte os resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
2. Alternativamente, fixação com metanol (útil para alguns antígenos nucleares e certos fosfo-epítopos):
   1. Resfrie previamente o metanol a 100% até −20 °C.
   2. Adicione metanol gelado diretamente às células (0,5 mL/poço) e incube por 5 min a −20 °C.
   3. Lave 3× com TBS (aspirando prontamente; não deixe os poços secarem).
      NOTA: Após a fixação com metanol, uma permeabilização adicional pode ser desnecessária e deve ser otimizada por anticorpo/epítopo. A fixação com metanol pode danificar epítopos de membrana e prejudicar a coloração da F-actina com faloidina conjugada a fluoróforo. CUIDADO: O metanol é tóxico, volátil e altamente inflamável. Manipule em área bem ventilada ou em capela química; use equipamentos de proteção individual apropriados; e mantenha afastado de chamas abertas e fontes de calor. PONTO OPCIONAL DE PARADA: Após a fixação, armazene as amostras a 4 °C em PBS contendo uma baixa concentração de fixador (por exemplo, PBS + 0,1% PFA) por até uma semana; valide o tempo de armazenamento para cada antígeno.
3. Neutralização de aldeídos (Opcional)
   1. Incube com 50 mM de glicina em TBS (0,5 mL/poço) por 5 min à temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Lave 3× com TBS + 0,05% de polissorvato 20.
      NOTA: A glicina neutraliza os grupos aldeído livres remanescentes após a fixação com PFA, reduzindo a autofluorescência relacionada à fixação e melhorando a especificidade da coloração com anticorpos.
4. Permeabilização
   1. Se o alvo forem proteínas de membrana, pule a permeabilização e prossiga para o passo 6.5.1.
   2. Se o alvo forem proteínas intracelulares ou nucleares, permeabilize com detergente não iônico a 0,1–0,3% em TBS (0,5 mL/poço) por 5–10 min à temperatura ambiente (≈25 °C).
   3. Lave 3× com TBS + 0,05% de polissorvato 20 (TBST).
      NOTA: A concentração e o tempo de uso do detergente não iônico etoxilado de octilfenol são otimizados conforme o alvo; a adequação é avaliada pela presença de sinal no compartimento correto, morfologia preservada, F-actina bem definida e fundo baixo (ver Discussão). Se a saponina for utilizada, ela deve ser mantida em todos os tampões subsequentes de lavagem e de anticorpos. CUIDADO: O detergente não iônico etoxilado de octilfenol é prejudicial se inalado ou em contato com a pele e pode causar irritação ocular. Manipule com luvas e evite a formação de aerossóis.
5. Bloqueio
   1. Adicione 0,5 mL/poço de solução de bloqueio (5% de albumina sérica bovina (BSA) em TBS) e incube por 30 min à temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Aspire o tampão de bloqueio.
   3. Prossiga diretamente para a incubação com anticorpo primário (não lave).
6. Incubação com anticorpo primário
   NOTA: As diluições dos anticorpos primários e secundários são determinadas empiricamente por titulação (ver Discussão).
   1. Prepare painéis de anticorpos primários simples ou multiplex em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de polissorvato 20 e 1% de BSA (TBST-BSA 1%), utilizando concentrações de anticorpos pré-otimizadas para cada alvo.
   2. Para imunofluorescência multiplex, combine todos os anticorpos primários não conjugados direcionados contra antígenos distintos de espécies hospedeiras diferentes (por exemplo, anti-interferon-β de camundongo (IFN-β) + anti-p14ARF de coelho + anti-actina de cabra) em um único coquetel de anticorpos.
   3. Adicione 150 µL por poço, garantindo que toda a lamínula esteja completamente coberta pela solução de anticorpos.
      NOTA: Para evitar evaporação em volumes baixos, a placa é incubada em câmara umidificada (por exemplo, uma caixa selada com papel umedecido).
   4. Incube por 1,5 h à temperatura ambiente (≈25 °C) ou 12–16 h a 4 °C.
   5. Lave 3× com TBST por 3 min cada à temperatura ambiente (≈25 °C), aspirando prontamente após cada lavagem.
7. Incubação com anticorpo secundário (e primários diretamente conjugados, quando aplicável)
   NOTA: A partir deste passo, as amostras devem ser mantidas protegidas da luz para evitar o desbotamento por fotodegradação. Fluoróforos espectralmente distintos são utilizados nos anticorpos secundários e em quaisquer primários diretamente conjugados para minimizar a interferência cruzada, e anticorpos secundários altamente adsorvidos por espécie específica são usados para minimizar a ligação a anticorpos primários não cognatos. O planejamento do painel de fluoróforos, incluindo marcadores nucleares e do citoesqueleto, e a compatibilidade com excitação/emissão do microscópio são abordados na Discussão.
   1. Dilua os anticorpos secundários na solução TBST-BSA 1% utilizando concentrações pré-otimizadas. Para detecção multiplex, combine todos os anticorpos secundários correspondentes às espécies hospedeiras dos anticorpos primários utilizados (um secundário por espécie hospedeira) em um único coquetel.
   2. Adicione 150 µL por poço, garantindo que toda a lamínula esteja completamente coberta.
   3. Incube por 1 h à temperatura ambiente (≈25 °C).
      NOTA: Se o painel incluir um ou mais anticorpos primários diretamente conjugados, adicione-os junto com o coquetel de anticorpos secundários e prolongue a incubação para 1,5 h à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
   4. Lave 3× com TBST por 3 min cada à temperatura ambiente (≈25 °C), aspirando prontamente após cada lavagem.

7. Coloração de contraste nuclear e coloração de f-actina

1. Adicione a coloração nuclear Hoechst 33342 (1:5000) diluída em TBS e incube por 15 min à temperatura ambiente (≈25 °C), protegido da luz. Se o F-actina for marcado com faloidina em vez de um anticorpo anti-actina, inclua faloidina (1:400) na mesma solução.
2. Lavar 3 vezes× com TBST, aspirando rapidamente após cada lavagem (não deixe os poços secarem).
3. Adicione 0,5 mL de TBS a cada poço para manter as lamínulas submersas até a recuperação/montagem.

8. Recuperação do lamínula e montagem da lâmina

1. Enquanto as lamínulas permanecerem submersas em TBS, insira a ponta de uma agulha fina ou bisturi sob a borda da lamínula e levante-a suavemente até que um lado fique parcialmente elevado. Usando pinças finas, segure a lamínula e remova-a do poço.
   NOTA: Remover uma lamínula quando ela não estiver submersa pode fazê-la aderir firmemente ao fundo do poço devido à tensão superficial, aumentando o risco de quebra.
2. Mantendo a lamínula com pinças, remova cuidadosamente o excesso de TBS das bordas usando um aspirador de vácuo ou papel absorvente. Evite tocar a superfície coberta por células.
   NOTA: Deve-se evitar líquido residual em excesso, pois pode diluir o meio de montagem e comprometer a nitidez e o contraste da imagem.
3. Posicione a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro limpa contendo uma pequena gota (≈3 µL) de meio de montagem.
   NOTA: Pode-se usar um meio antidesvanecimento comercial autopolimerizável ou um meio caseiro à base de glicerol a 80%/solução salina tamponada com fosfato (PBS); montagens à base de glicerol são seladas com esmalte incolor, e meios sem corante nuclear são escolhidos após contra-coloração. Os limites de armazenamento e orientações sobre a estabilidade de fluoróforos são fornecidos na Discussão.
4. Deixe as lâminas curarem na posição horizontal por ≈24 h, protegidas da luz, antes da aquisição de imagens.

Resultados

Este protocolo permite a coloração imunofluorescente mono e multiplex de células tumorais caninas aderentes cultivadas em lamínulas de vidro, permitindo a visualização simultânea de marcadores nucleares, citoplasmáticos e do citoesqueleto, preservando ao mesmo tempo a morfologia celular. Os resultados representativos são ilustrados na Figura 3.

Em experimentos bem-sucedidos, células de osteossarcoma canino D17 modificadas geneticamente para expressar p14ARF canino e IFN-β canino (Seção 5.1) exibiram sinais fluorescentes fortes e espacialmente apropriados, com baixo fundo e mínima coloração inespecífica. Para as células que expressavam p14ARF (Figura 3A), a imunofluorescência revelou uma localização predominantemente nuclear, compatível com a distribuição subcelular conhecida da p14ARF. O uso de detergente não iônico octylfenol etoxilado a 0,3 % para permeabilização permitiu o acesso eficiente dos anticorpos aos epítopos nucleares, preservando ao mesmo tempo a morfologia nuclear e a integridade do citoesqueleto, conforme confirmado pela coloração nuclear de contraste nítida e estruturas de actina visualizadas com um anticorpo anti-actina (fluoróforo emissor de luz laranja).

Para células que expressam IFN-β (Figura 3A), um sinal citoplasmático foi observado após a incubação com BFA para bloquear a secreção de proteínas, permitindo o acúmulo intracelular e a detecção dessa citocina solúvel. Nessas condições, uma permeabilização mais branda foi suficiente para permitir a penetração do anticorpo sem extração excessiva do conteúdo citoplasmático. A coloração bem-sucedida foi caracterizada por fluorescência citoplasmática pontuada a difusa, mínima interferência nuclear e arquitetura de actina preservada.

Foram observados resultados subótimos quando parâmetros-chave não foram adequadamente otimizados. A permeabilização insuficiente resultou em sinal nuclear fraco ou ausente de p14ARF, como mostrado na condição sem permeabilização (0% de detergente não iônico etoxilato de octilfenol; Figura 3B e Figura Suplementar 1). Por outro lado, a permeabilização excessiva (≥0,5% de detergente não iônico etoxilato de octilfenol ou tempos prolongados de incubação) pode levar à perda parcial da marcação do citoesqueleto, aumento da fluorescência de fundo e comprometimento da morfologia celular. Em experimentos com proteínas secretadas rapidamente (por exemplo, IFN-β), a omissão de BFA frequentemente produziu um sinal intracelular mais fraco, refletindo a rápida secreção e não uma falha no protocolo.

Os controles de marcação única (Supplementary Figure 2) mostraram sinal apenas no canal correspondente a cada alvo, o que apoia a especificidade da marcação por imunofluorescência observada. As condições de controle negativo, incluindo controles sem anticorpo primário e sem anticorpo (Supplementary Figure 2), exibiram marcação nuclear esperada, com sinal desprezível nos canais dependentes de anticorpo, indicando baixa autofluorescência e ligação inespecífica mínima do anticorpo secundário.

Em conjunto, esses resultados representativos demonstram que o protocolo permite a detecção de proteínas com localizações subcelulares distintas quando a fixação, a intensidade da permeabilização e estratégias específicas dependentes do alvo (por exemplo, bloqueio da secreção) são ajustadas à biologia do alvo. Uma otimização adequada resulta em fluorescência intensa e específica com baixo fundo e morfologia celular preservada, enquanto condições não ideais levam a sinais mais fracos ou mais ruidosos e a estrutura celular alterada.

Figura 1: Fluxograma geral do protocolo de imunofluorescência mono e multiplex. Principais etapas, desde a manutenção do cultivo celular até a aquisição de imagens, incluindo os dois pontos de decisão que exigem seleção dependente do alvo: método de fixação (PFA versus metanol) e permeabilização (com base na localização subcelular do alvo). O tratamento experimental opcional, incluindo a pré-incubação com brefeldina A (BFA) para alvos rapidamente secretados, é indicado como um desvio anterior à fixação. Etapas opcionais não mostradas para maior clareza (por exemplo, bloqueio de aldeídos) são descritas no Protocolo completo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação esquemática de estratégias de detecção por fluorescência baseadas em anticorpos. A detecção direta utiliza anticorpos primários conjugados a fluoróforos, enquanto a detecção indireta utiliza anticorpos primários não conjugados combinados com anticorpos secundários conjugados a fluoróforos, que é a estratégia adotada ao longo deste protocolo. Para aplicações multiplex, a detecção indireta exige anticorpos primários não conjugados produzidos em espécies hospedeiras diferentes, permitindo que cada anticorpo secundário reconheça seletivamente seu anticorpo primário correspondente sem reatividade cruzada. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imunofluorescência multiplex de células de osteossarcoma canino D17. Células D17 (5 × 10⁴) foram semeadas em lamínulas de vidro em placas de 24 poços e fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min a 25 °C. As células foram submetidas à imunofluorescência multiplex utilizando anticorpos primários anti-p14ARF (1:200; fluoróforos emissivos verdes), anti-actina (1:200; fluoróforos emissivos laranja) e anti-interferon-β (IFN-β) (1:200; fluoróforos emissivos no infravermelho distante), com anticorpos secundários correspondentes na diluição de 1:500. Os núcleos foram contra-estainados. Antes da detecção de IFN-β, as células foram tratadas com BFA (5 µg/mL, 4 h) para bloquear a secreção de proteínas. (A) As células foram permeabilizadas com detergente não iônico a 0,3% por 10 min a 25 °C. (B) Células processadas sem permeabilização (0% de detergente não iônico). Imagens representativas de 2 réplicas biológicas independentes, cada uma realizada em 2 réplicas técnicas. Apenas os canais mesclados são mostrados nesta figura; os canais individuais estão disponíveis na Figura Suplementar 1. Diferenças na marcação são observáveis entre as condições, particularmente para p14ARF (A; setas), um alvo intranuclear, cujo sinal estava ausente no grupo não permeabilizado (B). Os painéis A e B foram adquiridos e processados utilizando configurações idênticas (Tabela Suplementar 1). Controles negativos e de coloração simples correspondentes a este painel são mostrados na Figura Suplementar 2. Barra de escala: 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Canais individuais de fluorescência correspondentes à Figura 3, organizados por marcador com amostras permeabilizadas (coluna esquerda) e não permeabilizadas (coluna direita). Condições mostradas lado a lado: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; fluoróforos emissivos de luz verde), actina (E, F; fluoróforo emissivo de luz laranja) e IFN-β (G, H; fluoróforos emissivos de luz vermelha distante), juntamente com os respectivos painéis mesclados (I, J), correspondentes às Figuras 3A e 3B, respectivamente. As setas indicam marcação representativa nuclear de p14ARF; as elipses indicam marcação representativa de actina (E) e IFN-β (G), respectivamente. A perda do sinal nuclear de p14ARF, juntamente com marcação subótima de IFN-β e actina, é evidente nas condições não permeabilizadas. O sinal residual observado em (D; asterisco) reflete interferência espectral proveniente de fluoróforos coexistentes, confirmada pela ausência desse sinal nos controles de coloração única e apenas com anticorpo secundário correspondentes (Figura Suplementar 2). Barra de escala: 100 µm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Controles combinados de imunofluorescência correspondentes ao painel multiplex da Figura 3. Para cada grupo controle, os canais individuais (Hoechst 33342, fluoróforos emissores de verde, fluoróforo emissor de laranja e fluoróforos emissores de vermelho distante) são mostrados ao lado da sobreposição (quinta coluna).A–EControle sem anticorpo: células processadas sem anticorpos primários ou secundários.F–JControle somente com anticorpo secundário: células incubadas com o coquetel de anticorpos secundários na ausência de anticorpos primários.K–O) controle de coloração simples para p14ARF (fluoróforos com emissão verde).P–T) Controle com coloração simples de actina (fluoróforo emissor de laranja). (U–Y) IFN-β controle de coloração única (fluoróforos emissores na faixa do infravermelho distante). As configurações de aquisição e processamento foram idênticas às utilizadas na Figura 3 (Tabela Suplementar 1). Barra de escala: 100 µm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Especificações dos cubos de filtro de fluorescência e ordem de aquisição. As imagens foram adquiridas sequencialmente em um microscópio invertido de fluorescência de campo amplo (objetiva 40×/0,80) utilizando os cubos de filtro listados abaixo, na ordem indicada, para todos os campos de imagem apresentados na Figura 3, na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2. As imagens foram adquiridas como planos ópticos únicos (sem empilhamento z).A intensidade de excitação foi ajustada usando o controle de intensidade de fluorescência nos níveis indicados, com o diafragma do campo de luz incidente mantido na posição 6 para todos os canais. As configurações da câmera (digitalização de 8 bits, formato 3072×2048, gama 1,0) e um ajuste fixo de nitidez digital foram idênticos para todos os canais e painéis, incluindo as imagens de controle na Figura Suplementar 2. Um único ajuste linear de brilho/contraste foi aplicado de forma idêntica a todos os canais e painéis para exibição. As imagens foram exportadas como TIFF. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Guia de solução de problemas para questões técnicas comuns no fluxo de trabalho de imunofluorescência. Problemas comuns, causas prováveis e ações corretivas ao longo do protocolo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Várias etapas são fundamentais para o desempenho consistente deste fluxo de trabalho de imunofluorescência baseado em lamínulas. Todos os procedimentos são realizados no ambiente confinado de um poço de cultura de 24 poços, o que simplifica o manuseio, limita a manipulação da amostra e permite a cobertura completa da lamínula com baixos volumes de reagentes, reduzindo assim o consumo de anticorpos por experimento. Como essas soluções de baixo volume são propensas à evaporação, as incubações devem ser realizadas preferencialmente em câmara umidificada, e as amostras nunca devem secar: mesmo uma breve secagem aumenta a fluorescência de fundo e degrada a morfologia celular. Ao aspirar, uma fina película de tampão é deixada sobre a lamínula, e a próxima solução é adicionada imediatamente.

A densidade adequada de semeadura celular e a confluência controlada no momento da fixação são essenciais para limitar o fundo e preservar a morfologia, pois o crescimento excessivo aumenta o sinal de fundo e compromete a arquitetura celular. O controle preciso do tempo e da temperatura de incubação também é necessário em todas as etapas, já que ambos influenciam a eficiência da fixação, ligação do anticorpo e sinal de fundo^5,13. Quando as condições ambientais variam, o uso de uma incubadora com controle de temperatura ou forno seco ajustado para 25 °C, combinado com um tempo de incubação consistente entre as réplicas, melhora a reprodutibilidade.

A fixação é o primeiro passo decisivo, pois determina a preservação do antígeno e da arquitetura celular⁵, e o fixador é escolhido de acordo com a localização do alvo e a sensibilidade do epítopo. O PFA é recomendado para a maioria dos alvos associados à membrana, citoplasmáticos, nucleares e citoesqueléticos, pois preserva a arquitetura, mantém a distribuição dos antígenos e é compatível com a coloração de F-actina baseada em faloidina. O metanol pode ser preferido para certos antígenos nucleares mal detectados após fixação por ligação cruzada, particularmente epítopos fosforilados ou epítopos sensíveis a aldeídos, mas ele rompe a integridade da membrana, extrai proteínas solúveis e prejudica a coloração com faloidina/F-actina; a compatibilidade deve ser validada para cada alvo ^13,14,15,16. Para citocinas solúveis e outras proteínas secretadas rapidamente, a fixação com PFA combinada com o pré-tratamento com BFA retém o sinal intracelular antes da fixação: o BFA bloqueia o transporte de proteínas do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi, promovendo o acúmulo intracelular de proteínas secretadas e permitindo sua detecção por imunofluorescência. Quando alvos com requisitos conflitantes de fixação precisam ser detectados simultaneamente, é necessária uma otimização empírica. O glioxal, um dialdeído pequeno, tem sido relatado como uma alternativa ao PFA, com ligação cruzada mais rápida, melhor preservação de antígenos e compatibilidade com imunofluorescência e microscopia de super-resolução; não temos experiência direta com a fixação com glioxal e a apresentamos como uma opção apoiada pela literatura^17,18.

Após a fixação, a permeabilização apropriada permite o acesso de anticorpos a epítopos intracelulares e nucleares, mantendo a integridade estrutural⁵. A permeabilização insuficiente geralmente resulta em sinal fraco ou ausente, apesar da morfologia intacta, indicando acesso restrito dos anticorpos, enquanto a permeabilização excessiva extrai proteínas solúveis, rompe membranas, causa perda da marcação do citoesqueleto e aumenta o fundo. Portanto, o tipo, a concentração e o tempo de incubação do detergente são otimizados conforme o alvo. A permeabilização adequada pode ser avaliada por quatro critérios: (i) sinal específico no compartimento subcelular esperado; (ii) morfologia preservada, com limites nucleares e citoplasmáticos intactos, resolvidos por Hoechst 33342 e faloidina, respectivamente; (iii) marcação bem definida de F-actina, já que um sinal difuso ou perdido do citoesqueleto indica superpermeabilização; e (iv) fundo baixo em controles negativos. Caso esses critérios não sejam atendidos, a concentração do detergente não iônico octylphenol ethoxylate e/ou o tempo de incubação são ajustados empiricamente. Quando antígenos associados à membrana e intracelulares são combinados em um único painel, condições mais brandas (menor concentração de detergente, tempo de incubação mais curto) preservam os epítopos de membrana ao mesmo tempo que permitem acesso intracelular, sendo útil um curso temporal iniciado em 5 min e aumentado progressivamente. Se a saponina for utilizada, ela deve ser mantida em todos os tampões subsequentes de anticorpos e lavagens, pois seu efeito permeabilizante é reversível.

As concentrações de anticorpos são determinadas empiricamente por titulação, e não adotadas a partir de recomendações genéricas. Uma abordagem prática consiste em uma série de diluições seriadas abrangendo pelo menos 3–4 concentrações acima e abaixo da diluição sugerida pelo fabricante (por exemplo, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400 para uma diluição recomendada de 1:200), aplicadas a lamínulas em replicatas sob condições idênticas. Cada diluição é avaliada quanto à intensidade do sinal específico no compartimento esperado; à razão sinal-ruído, comparando amostras coradas com o controle correspondente sem anticorpo primário e o ruído de fundo do anticorpo secundário com o controle sem anticorpo; e à preservação da morfologia. A menor concentração que fornece um sinal forte e específico com ruído de fundo mínimo é selecionada. Ruídos de fundo persistentemente altos geralmente são reduzidos por meio de nova titulação, bloqueio prolongado ou aumento da rigidez das lavagens, enquanto um sinal fraco pode refletir fixação excessiva, concentração subótima do anticorpo, falha do anticorpo primário em reconhecer seu epítopo-alvo, incompatibilidade entre o anticorpo secundário e a espécie hospedeira do primário (por exemplo, um anticorpo secundário anti-coelho aplicado a um primário de origem murina), ou perda do sinal do fluoróforo devido à degradação do anticorpo secundário causada por vencimento ou armazenamento inadequado, especialmente exposições repetidas à luz. Se não houver sinal em nenhuma das diluições, vale a pena prolongar a incubação com o anticorpo primário ou mudar para incubação noturna a 4 °C, confirmar a expressão do antígeno na linhagem celular, verificar a compatibilidade do anticorpo com as condições de fixação e permeabilização, checar o lote, armazenamento e validade dos anticorpos primário e secundário, confirmar se o microscópio possui filtros de excitação e emissão apropriados para o fluoróforo e, caso o problema persista, testar um clone alternativo. Ao preparar as soluções de trabalho, o volume necessário da mistura é o número de poços multiplicado por 150 µL, mais cerca de 10% de excesso para compensar perdas por pipetagem; o volume do estoque de cada anticorpo equivale a esse total dividido pelo seu fator de diluição (por exemplo, 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL para uma diluição 1:200), completando-se o volume com TBST–BSA a 1%. O mesmo cálculo se aplica à mistura de anticorpos secundários, substituindo-se o fator de diluição correspondente.

O desempenho da multiplexação depende fundamentalmente do design do painel de fluoróforos. Os fluoróforos atribuídos aos alvos primários, à contra-coloração nuclear e ao marcador do citoesqueleto devem ser coordenados para evitar sobreposição espectral ou duplicação de sinal, e o sistema de imagem deve permitir a excitação e detecção de cada fluoróforo selecionado^9,10; as faixas de excitação e emissão para cada cubo de filtro são fornecidas na Tabela Suplementar 1, permitindo a comparação direta da compatibilidade espectral entre os fluoróforos do painel. Recomenda-se aos usuários que adaptarem este painel a outros fluoróforos que escolham combinações com sobreposição mínima entre canais adjacentes, sempre que possível, e que verifiquem a ausência de diafonias em controles com coloração única antes de combinar os alvos, conforme realizado aqui. Sinal residual atribuível a fluoróforos coexistentes foi observado em todos os canais adquiridos no painel de multiplexação (Figura Suplementar 1), mas não foi detectado nos controles correspondentes de coloração única e apenas com anticorpos secundários (Figura Suplementar 2), indicando diafonia espectral decorrente dos conjuntos de filtros de banda larga utilizados na aquisição em campo amplo (potencialmente reduzível com excitação a laser em microscopia confocal). Dada a separação espacial entre a localização nucleolar da p14ARF e a distribuição filamentosa/citoplasmática da actina e do IFN-β, essa diafonia não compromete a interpretação da localização da p14ARF no painel de multiplexação. Este fluxo de trabalho baseia-se na multiplexação convencional baseada em fluoróforos, na qual o número de alvos simultaneamente distinguíveis é limitado pelas espécies hospedeiras dos anticorpos disponíveis e pelos fluoróforos espectroscopicamente distintos. Multiplexações de ordem superior podem ser alcançadas por meio de imunofluorescência cíclica ou imagem espectral, que permitem coloração/branqueamento iterativo ou separação linear de fluoróforos sobrepostos, respectivamente, mas exigem equipamentos e softwares especializados não abordados aqui^19,20.

O meio de montagem afeta tanto a qualidade da imagem quanto a durabilidade do sinal. Pode-se usar um meio antifadente comercial de cura automática ou, como alternativa caseira, glicerol a 80% em PBS (sem antifadente, sem cura automática); os preparados caseiros à base de glicerol são selados com esmalte incolor para evitar secagem e movimentação da lamínula, e meios sem corantes nucleares são escolhidos quando já foi realizada a contracoloração nuclear. As imagens devem ser adquiridas o mais rapidamente possível após a cura. Quando a aquisição imediata não for possível, lâminas curadas podem ser armazenadas em caixa escura a 4 °C por 2–4 semanas ou a −20 °C por até 6 meses, lembrando que fluoróforos altamente fotolábeis (por exemplo, fluoróforos emissivos na faixa verde) perdem sinal ao longo do tempo mesmo sob condições ideais de armazenamento. Meios comerciais antifadentes aumentam substancialmente a estabilidade dos fluoróforos em comparação com meios caseiros à base de glicerol; quando estes últimos forem utilizados, recomenda-se fortemente a aquisição dentro de 24–48 h. O esmalte incolor é compatível com a maioria dos fluoróforos e não afeta significativamente a preservação do sinal, desde que se permita pelo menos 30 min de cura no escuro antes do armazenamento.

A partir do passo de fixação, a técnica estéril não é mais necessária, e a coloração pode ser realizada na bancada, reservando uma capela de exaustão química certificada para qualquer reagente rotulado como CUIDADO. Linhagens celulares tumorais derivadas, como D17, são manipuladas de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança para materiais do grupo de risco 1 ou 2, conforme aplicável. Todos os materiais que entram em contato com células cultivadas, lamínulas, ponteiras, meio e resíduos líquidos são descontaminados antes da eliminação: os resíduos líquidos são inativados com hipoclorito de sódio até uma concentração final de 10% por pelo menos 30 minutos, e os resíduos sólidos são descartados em recipientes apropriados para resíduos biológicos. Resíduos químicos contendo PFA, metanol ou detergente não iônico etoxilado de octilfenol são segregados e descartados de acordo com as regulamentações institucionais de segurança química.

Embora concebido para ser amplamente útil, este fluxo de trabalho deve ser considerado mais adequado para adaptações dependentes do alvo do que como um procedimento rígido e universal; sua aplicação bem-sucedida depende do entendimento do pesquisador quanto à localização, solubilidade, acessibilidade do epítopo e sensibilidade à fixação e permeabilização de cada antígeno. Deve-se enfatizar duas limitações. Primeiramente, a avaliação da coloração aqui apresentada é qualitativa, baseando-se na comparação com controles negativos e na localização subcelular esperada, ao invés de uma quantificação formal de sinal em relação ao fundo; portanto, a consistência relatada aqui reflete coloração qualitativa reprodutível entre lâminas replicadas e condições de controle, e não um desempenho validado quantitativamente. Um guia consolidado de solução de problemas, que resume problemas comuns, causas prováveis e ações corretivas, está disponível na Tabela Suplementar 2. Laboratórios que necessitem de leituras quantitativas podem utilizar softwares de análise de imagens de código aberto para medição da intensidade média, subtração do fundo, quantificação baseada em Região de Interesse (ROI) e perfilhamento de intensidade²¹. Em segundo lugar, os dados representativos foram obtidos a partir de uma única linhagem tumoral canina aderente (D17), de modo que a extensão a outros tipos celulares, espécies ou combinações de antígenos exigirá reotimização específica para cada alvo em relação às condições de fixação, permeabilização e anticorpos.

Em resumo, este protocolo fornece um fluxo de trabalho flexível e econômico para imunofluorescência mono e multiplex em culturas aderentes em 2D, combinando baixo consumo de reagentes com desempenho de coloração consistente em equipamentos laboratoriais padrão, ao mesmo tempo que permite adaptação informada e dependente do alvo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de tecidos de 24 poços	Corning	3524	Seeding e coloração em lamínulas
Antibiótico-antimicótico	Gibco	15240062	Utilizado para prevenir contaminação bacteriana e fúngica em culturas celulares.
Solução diluente de anticorpos (TBST-BSA 1%)	Preparado in loco	—	Para 10 mL: 2 mL da solução bloqueadora de BSA a 5% + 5 µL de Tween-20 + 7,995 mL de TBS 1x (solução de trabalho) até volume final de 10 mL (final: 1% BSA, 0,05% Tween-20 em TBS; pH 7,6). Preparar fresco; se armazenado, manter a 4 °C protegido contra contaminação e usar dentro de 1 semana.
Solução bloqueadora	Preparado in loco	—	Para 10 mL: 0,5 g de BSA dissolvidos em 10 mL de TBS 1x (1 mL de estoque TBS 10x + 9 mL de água destilada); pH 7,6. Incubar por 30 min a 25 °C; preparar fresco.
(BSA 5% em TBS)
Brefeldina A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; pré-tratamento por 4 h para bloquear a secreção de proteínas antes da detecção de citocinas.
BSA (albumina sérica bovina)	Sigma-Aldrich	A7906	5% em TBS para bloqueio; 1% em TBS + 0,05% Tween-20 para diluição de anticorpos.
Reagente à base de colágeno (revestimento de lamínulas, opcional)	Corning	354231	Colágeno tipo I derivado de derme bovina; diluído a 50 µg/mL em HCl 0,01 N; aplicado em 5–10 µg/cm² (≈100 µL/poço); incubar por 1 h à temperatura ambiente (≈25°C); aspirar e lavar com PBS antes do seeding celular.
Lamínulas de vidro, redondas, 12 mm	Knittel Glass	100013	Substrato para cultura e coloração de células aderentes.
Linhagem celular D17 de osteossarcoma canino	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Modelo celular representativo; mantido em DMEM suplementado com 10% de FBS e antibiótico-antimicótico; manter a 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
Água desionizada/destilada	Preparado in loco	—	Preparação de tampões.
DMEM (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco)	Gibco	12100-046	Meio completo para cultura celular.
Etanol	Supelco	1.00983	Descontaminação de lamínulas/pinzetas.
Soro bovino fetal	Sigma-Aldrich	F7524	Suplemento no meio de cultura celular.
(FBS)
Fibronectina	Gibco	33016015	Glicoproteína da matriz extracelular; diluída a 0,0125 mg/mL no meio de cultura celular; aplicada em 100 µL/poço e incubada por 1 h à temperatura ambiente (≈25°C) antes do seeding celular.
Pinças metálicas de ponta fina	Vários	—	Manuseio de lamínulas.
Microscópio de fluorescência	Leica Microsystems	DMi8	Microscópio de fluorescência de campo amplo DMi8 (Leica Microsystems), objetiva HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY; compatível com fluoróforos no painel (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Lâminas de microscopia de vidro	Bioslide	—	Montagem de lamínulas coradas para imagem.
Placa de Petri de vidro ou porta-lamínulas	Vários	—	Esterilização em autoclave/armazenamento de lamínulas.
Glicina	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Para 10 mL de solução 50 mM: 37,5 mg de glicina dissolvidos em 10 mL de TBS 1x; pH 7,6. Incubar por 5 min a 25 °C; etapa opcional de bloqueio de aldeídos após fixação, antes da permeabilização; preparar fresco.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Para solução de trabalho de 10 mL: diluir o estoque 1:5000 em TBS. Contracoloração nuclear; incubar protegido da luz; preparar fresco.
Câmara umidificada	Vários/Preparado in loco	—	Para incubação com anticorpos; pode ser montada alternativamente a partir de uma caixa plástica vedada com papel absorvente umedecido.
ImageJ	Código aberto (NIH)	—	Utilizado para análise de imagens após aquisição.
Software de aquisição de imagens	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Utilizado para aquisição de imagens no Leica DMi8.
Metanol	Merck	1.06009	Fixação alternativa (antígenos nucleares/epítopos fosforilados); pré-resfriado a −20 °C, incubação de 5 min; pode prejudicar a coloração com faloídeína/F-actina.
Meio de montagem	Sigma-Aldrich	G2289	Para 10 mL: 8 mL de glicerol + 2 mL de PBS, pH 7,6, misturar bem. Não possui propriedades antifade e não endurece sozinho. Selar as bordas da lamínula com esmalte para evitar secagem/deslocamento, armazenar as lâminas a 4 °C protegidas da luz e realizar a imagem rapidamente para minimizar o desbotamento fotônico.
(Baseado em glicerol)
Meio de montagem (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Contém reagentes antifade e endurece (cura) em ~24 h à temperatura ambiente, protegido da luz, formando um montante permanente (sem necessidade de selagem com esmalte). Armazenar as lâminas a 2–8 °C, protegidas da luz até a imagem.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Componente iônico do tampão TBS; mantém a osmolaridade fisiológica para preservar a morfologia celular e tecidual durante as etapas de lavagem e incubação com anticorpos.
Agulha (fina, ex.: 25–27G)	Vários	—	Utilizada como alavanca para levantar/descolar suavemente a lamínula do fundo do poço sem danificar a monocamada celular.
Paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Para 10 mL: 0,4 g de paraformaldeído em pó dissolvidos em 8 mL de PBS, aquecidos a 60–65 °C com algumas gotas de NaOH 1N até ficar transparente, resfriar, ajustar o pH para 7,4 e completar para 10 mL com PBS; filtrar através de filtro de 0,2 µm antes do uso. Preparar fresco ou fracionar e armazenar a −20 °C, evitando ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Faloídeína conjugada a fluoróforo	Invitrogen	Dependendo do fluoróforo escolhido	Para solução de trabalho de 10 mL: diluir o estoque 1:400 em TBS, pH 7,6, conforme instruções do fabricante. Marcador alternativo do citoesqueleto/F-actina; preparar fresco, protegido da luz.
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Tampão fosfato isotônico (pH 7,4); mantém a osmolaridade fisiológica para preservar a morfologia celular durante as etapas de fixação e lavagem.
(PBS)
Polilisina (revestimento de lamínulas, opcional)	Sigma-Aldrich	P8920	Reagente sintético policatiônico que melhora a adesão celular eletrostática; usado a 0,1 mg/mL em água destilada; volume suficiente para cobrir a superfície da lamínula; incubar por 30 min a 25 °C antes do seeding celular.
Anticorpo primário, anti-actina (hospedeiro caprino)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anticorpo anti-actina; policlonal, não conjugado, detectado com anticorpo secundário anti-cabra. Usado em diluição de trabalho 1:200.
Anticorpo primário, anti-IFN-β (hospedeiro murino)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anticorpo anti-IFN-β; policlonal, não conjugado, detectado com anticorpo secundário anti-murino. Usado em diluição de trabalho 1:200.
Anticorpo primário, anti-p14ARF (hospedeiro coelhístico)	Calbiochem	PC409	Anticorpo anti-p14ARF; policlonal, não conjugado, detectado com anticorpo secundário anti-coelho. Este produto foi descontinuado, um novo anticorpo precisará ser validado se o trabalho com este alvo for planejado. Usado em diluição de trabalho 1:200.
Anticorpo secundário, anti-coelho, conjugado com Alexa Fluor 488	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Anticorpo anti-coelho conjugado com AF488. Usado em diluição de trabalho 1:500.
Anticorpo secundário, anti-cabra, conjugado com Alexa Fluor 555	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Anticorpo anti-cabra conjugado com AF555. Usado em diluição de trabalho 1:500.
Anticorpo secundário, anti-murino, conjugado com Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Anticorpo anti-murino conjugado com AF647. Usado em diluição de trabalho 1:500.
Solução salina tamponada com Tris (TBS), estoque 10x	Preparado in loco	—	Para 100 mL: dissolver 6,06 g de Tris base e 8,77 g de NaCl em 80 mL de água destilada; ajustar o pH para 7,6 com HCl concentrado; completar para volume final de 100 mL; autoclavar. Diluir 1:10 em água destilada para solução de trabalho (TBS 1x) (final: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6); armazenar à temperatura ambiente ou a 4 °C por até 3 meses.
TBST (TBS + 0,05% Tween-20)	Preparado in loco	—	Para 10 mL: 1 mL de estoque TBS 10x + 8,995 mL de água destilada + 5 µL de Tween-20 (0,05% v/v); pH 7,6. Tampão de lavagem entre as etapas de coloração; preparar fresco, usar em ~1 semana a 4 °C.
Tris Base	Sigma-Aldrich	252859	Agente tamponante usado para preparar a solução estoque de TBS; mantém a estabilidade de pH na faixa fisiológica (pH 7,6) para tampões de lavagem e diluição em imunofluorescência.
Triton X-100 (detergente não iônico etoxilado de octilfenol)	Sigma-Aldrich	X100	Para 10 mL: 10 µL de Triton X-100 em 9,99 mL de TBS 1x para TX100 0,1%; 30 µL em 9,97 mL de TBS 1x para TX100 0,3% (dependente do alvo; alvos nucleares requerem concentrações mais altas).
Tripsina-EDTA	Gibco	25200056	Utilizado para desanexação celular.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Utilizado em TBS para tampão de lavagem (TBST) e diluição de anticorpos (TBST-BSA 1%).