Artigo de método

Triagem In Vivo Paralela da Eliminação e Ativação Gênica na Glândula Mamária do Camundongo

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma abordagem escalável de triagem intraductal CRISPR, permitindo estudos paralelos in vivo de eliminação e ativação genética na glândula mamária do camundongo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As triagens genéticas avançadas são rotineiramente empregadas para perturbar milhares de elementos genéticos de forma agrupada, com o objetivo de produzir mapas em grande escala de genótipo para fenótipo. Embora frequentemente realizado em sistemas de cultura celular, a acumulação de evidências apoia que as triagens in vivo têm o poder de revelar novas biologias que não podem ser recapituladas in vitro. No entanto, a aplicação ampla dessa abordagem tem sido limitada por dois grandes desafios: o foco predominante em perturbações de perda de função em vez da ativação gênica e os significativos obstáculos técnicos para entregar bibliotecas genéticas complexas a tecidos específicos in vivo. Para superar esses desafios, descrevemos uma estratégia simples e versátil de injeção intraductal que permite uma triagem genômica funcional eficiente e rápida na glândula mamária do camundongo, gerando dezenas de milhares de clones epiteliais discretos. Além disso, fornecemos todos os detalhes necessários para geração de bibliotecas, injeção intradutal, deconvolução de tela e análise das bibliotecas CRISPR-Knockout e Ativação para telas in vivo abrangentes. Usando essas ferramentas, que denominamos CRISPR-KOALA (Ensaio Ligado de Knockout e Ativação), identificamos novos supressores tumorais e oncogenes dentro do genoma codificante e não codificante em bibliotecas agrupadas que variam de 46 loci a um quinto do genoma. Importante destacar que essa abordagem e análise podem ser aplicadas a outros órgãos para estudar a função biológica de qualquer gene durante a homeostase ou doença.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As triagens de genômica funcional fornecem uma estrutura poderosa para interrogar a função gênica na escala1. O desenvolvimento das tecnologias de edição genética CRISPR-Cas possibilitou a perturbação sistemática de centenas a milhares de genes em paralelo, e triagens baseadas em CRISPR em linhagens celulares de mamíferos tornaram-se uma pedra angular da pesquisa moderna em biologiado câncer 2. Essas abordagens in vitro identificaram genesessenciais 3, supressorestumorais 4 e interações letaissintéticas 5 em diversos contextos de câncer. No entanto, uma limitação central é a incapacidade de capturar as complexas características biológicas dos tumores in vivo, incluindo interações com o sistema imunológico e estroma, gradientes de nutrientes e arquitetura tecidular dentro domicroambiente 2. Em consonância com essa limitação, estudos recentes demonstraram que muitos genes legítimos condutores do câncer não exercem efeitos mensuráveis in vitro, especialmente quando sua função depende de sinais microambientais ausentes na culturacelular 6,7,8,9,10.

A glândula mamária do camundongo fornece um contexto tecidular singularmente vantajoso para a triagem genômica funcional in vivo. As células epiteliais mamárias são altamente regenerativas, passam por ciclos de expansão clonal durante o ciclo estrol e são organizadas em uma rede ductal ramificada que pode ser facilmente acessada e geneticamentemanipulada 11,12,13. Essas características apoiaram décadas de análises genéticas em mosaico e experimentos de rastreamento de linhagem, estabelecendo a glândula mamária como um sistema tratável para interrogar a função gênica intrínseca das células e dependente do microambiente durante a homeostase e doençasteciduais 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Importante destacar que perturbações genéticas podem ser restritas ao compartimento epitelial, permitindo o estudo direto dos fatores específicos do epitelio para transformação, competição celular, fidelidade da linhagem e progressão tumoral em um contexto de tecido intacto.

Embora várias estratégias tenham sido desenvolvidas para entregar perturbações genéticas diretamente à glândula mamária adulta in situ, permanecem obstáculos técnicos significativos para aplicações de alto rendimento. A administração mediada por adenovírus da Cre recombinase tem sido amplamente utilizada para induzir a recombinação somática de alelos condicionais na glândula mamáriaadulta 34,35,36,37, oferecendo um meio eficiente de manipular a função gênica sem o complexo acolhimento germinativo exigido pelos modelos tradicionais de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Embora o adenovírus de alto título também possa entregar componentes CRISPR-Cas9 para células residentes em tecidos, esses vetores não se integram ao genomado hospedeiro 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 . Isso limita severamente a escala das triagens a ~10–55 genes, já que cada sítio-alvo do gRNA deve ser sequenciado individualmente usando as sondas de inversão molecular 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Além disso, os métodos atuais de entrega intraductal permitem acesso direto ao sistema mamário ductal, mas exigem exposição cirúrgica invasiva da glândulamamária 50 ou dependem do uso de seringas Hamilton comparativamente grandes, que sãoincómodas 51. Embora eficazes para entrega localizada do vírus, essas abordagens são comparativamente invasivas, tecnicamente desafiadoras e não otimizadas para a entrega escalável de bibliotecas lentivirais agrupadas. Coletivamente, esses estudos demonstram que perturbações virais in situ são viáveis, mas as ferramentas atuais não suportam as perturbações estáveis, agrupadas e recuperáveis por sequência, necessárias para o rastreamento in vivo de CRISPR de alto rendimento.

Para enfrentar essas limitações, nós e outros passamos a integrar vetores lentivirais, que possibilitam modificações genéticas estáveis e hereditárias. Em contraste com os sistemas de cultura celular, os tecidos in vivo impõem restrições rigorosas ao número de células perturbadas que podem ser geradas dentro de um único órgão, tornando impraticável a triagem genômica. Consequentemente, telas CRISPR in vivo exigem o design de bibliotecas direcionadas e informadas biologicamente que equilibrem cobertura com viabilidade. Além disso, a maioria dos exames CRISPR in vivo, revisados aqui2, tem focado quase exclusivamente em perturbações de perda de função lentiviral, apesar das evidências crescentes de que a ativação gênica pode revelar insights biológicos complementares e nãosobrepostos 52,53,54,55. Nós e outros já demonstramos anteriormente que integrar perturbações lentivirais do CRISPR no epitélio mamário adulto permite uma modificação genética estável e hereditária in situ, e que elas podem ser recuperadas e quantificadas a partir do DNAgenômico 36,55,56,57,58. Usando essa abordagem, realizamos triagens CRISPR in vivo agrupadas que identificaram novos fatores que impulsionam a transformaçãooncogênica 36,55, estabelecendo tanto a viabilidade quanto a relevância biológica da entrega lentiviral e do rastreamento CRISPR. No entanto, esses estudos também destacaram a necessidade de um protocolo simples, padronizado e escalável que pudesse ser amplamente adotado e estendido para incluir tanto modelos de triagem de perda quanto de ganho de função dentro da mesma glândula.

Aqui, descrevemos uma estratégia simples e versátil de injeção intraductal que permite a triagem paralela in vivo das bibliotecas de knockout e ativação do CRISPR, denominadas CRISPR-KOALA, dentro da glândula mamáriaadulta de camundongo 55. O CRISPR-KOALA emprega um RNA convencional 'single-guide' (sg)RNA (sg)' de 20-21 bp para capacidades CRISPR-KO ou um 'dead-guide' (dg)RNA (dead-guide) de 14 bp para CRISPR-A. O dgRNA guia eficientemente o Cas9 até seu local-alvo, mas impede a atividade das endonucleasesdo Cas9 59,60,61, permitindo assim o uso de um único camundongo expressando Cas9 ativo tanto para as modalidades de eliminação quanto de ativação. A introdução de dois grampos PP7 no trcr do dgRNA possibilita o recrutamento de uma transativadora de proteína derevestimento PP7 e leva à superexpressão eficiente dos genes invivo 55 (Figura 1). Ao combinar o design de biblioteca de gRNA direcionado com produção lentiviral de alto título e entrega intraductal não cirúrgica usando microcapilares de vidro, essa abordagem gera dezenas de milhares de clones epiteliais espacialmente discretos, preservando a arquitetura dos tecidos e as interações microambientais. Importante, a integração lentiviral no genoma do hospedeiro possibilita a recuperação e quantificação de gRNAs por meio de sequenciamento de alto rendimento, possibilitando triagens genômicas funcionais em vivo. Juntos, isso permite perturbações paralelas ou simultâneas (na mesma célula) CRISPR-KO e CRISPR-A dentro da mesma glândula mamária de um camundongo que expressa Cas9.

Apresentamos um protocolo detalhado passo a passo que abrange o design de bibliotecas de gRNA, produção e concentração de lentivirais, entrega intraductal, deconvolução de bibliotecas e análise de dados (Figura 1). Juntos, esse método fornece uma estrutura prática e escalável para a triagem knockout e/ou ativação in vivo do CRISPR na glândula mamária do camundongo e pode ser adaptado para estudar a função gênica durante a homeostase dos tecidos, diferentes contextos de doenças, outros tecidos e outras espécies como o rato.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais do Centro de Fenogenômica (protocolo 26-0272H).

1. Clonagem da biblioteca CRISPR

NOTA: Esta seção descreve a clonagem agrupada das bibliotecas knockout e ativação do CRISPR a partir de oligonucleotídeos sintetizados em matrizes para as espinhas dorsuais lentivirais. Nós rotineiramente geramos bibliotecas contendo até 4.000 gRNAs, que podem ser testadas com cobertura de 400X-1.000X em 8-20 camundongos. O número de gRNAs e a cobertura podem ser ajustados conforme necessário, o que afetará o número de camundongos necessários para manter o poder estatístico. Recomendamos manter uma cobertura mínima de 400X, o que pode ser suficiente para fenótipos de ganho de função fortes.

  1. Guia no design de bibliotecas de RNA
    1. Compile uma lista de todos os genes de camundongos a serem triados dentro de um único experimento para design posterior de bibliotecas CRISPR, mantendo listas de alvos separadas para as bibliotecas CRISPR knockout (CRISPR-KO) e ativação CRISPR (CRISPR-A).
      NOTA: AS BIBLIOTECAS CRISPR-KO e CRISPR-A são geradas separadamente e podem ser combinadas na fase de transdução lentiviral para triagem simultânea.
    2. Para bibliotecas CRISPR-KO, selecione de quatro a cinco RNAs guia simples (sgRNAs) por gene usando algoritmos de predição de alta pontuação, como CRISPick62,63, CHOPCHOP64 ou VBC Score65.
      NOTA: O Escore VBC apresenta eficácia muito alta e atividade no alvo66. Independentemente da ferramenta, priorize guias com alta atividade prevista no alvo, potencial mínimo de off-target e exons codificadores de alvo.
    3. Para bibliotecas CRISPR-A, selecione de oito a dez guias por gene usando CRISPick62,63 ou CHOPCHOP64. Para ferramentas que permitem comprimentos de guia especificados pelo usuário (como o CHOPCHOP), defina o comprimento do guia para 14 bp antes da geração do guia. Se usar uma ferramenta que gera apenas 20 bp guias, converta essas sequências em RNAs dead-guide (dgRNAs) mantendo a sequência de 14 bp imediatamente a 5' do motivo adjacente ao protoespaçador, que direciona as regiões promotoras dos genes.
      NOTA: os dgRNAs são sequências guias truncadas projetadas para permitir a ativação transcricional baseada em CRISPR com aproximadamente 50-85% da eficácia dos sgRNAs de comprimentototal 55, sem induzir a clivagemdo DNA 59,60,61.
    4. Agrupar todos os sgRNAs ou dgRNAs correspondentes a um único experimento em listas separadas para permitir clonagem uniforme, produção viral e triagem in vivo .
      NOTA: sgRNA e dgRNAs a serem rastreados juntos serão agrupados após a produção viral.
    5. Gerar bibliotecas de controle negativo agrupadas para triagens CRISPR-KO e CRISPR-A, incluindo sequências de gRNA não direcionadas55,67 e não génicas68, conforme descrito anteriormente, para controlar efeitos de fundo independentes de perturbação ou ativação gênica.
      NOTA: Se desejado, bibliotecas separadas de gRNAs não alvo e não gênicos podem ser criadas para criar duas bibliotecas independentes de controle negativo.
  2. Projeto e amplificação de pools de oligonucleotídeos
    1. Projete oligonucleotídeos agrupados de modo que cada gRNA contenha a sequência de direcionamento, sobressalentes enzimáticos de restrição compatíveis com a espinha dorsal lentiviral de destino e sequências de primers específicas da biblioteca para permitir amplificação seletiva a partir de um conjunto complexo de oligonucleotídeos (Figura 1, Tabela 1).
    2. Atribua um par único de primers a cada biblioteca de gRNA para permitir a amplificação independente de bibliotecas individuais a partir de um pool compartilhado de oligonucleotídeos. Pares únicos de primers estão listados na Tabela 1.
    3. Ordene bibliotecas de oligonucleotídeos agrupados de uma plataforma comercial de síntese de arrays, garantindo representação equimolar de todos os gRNAs dentro de cada pool.
    4. Amplifique as bibliotecas individuais de gRNA a partir do molde de oligonucleotídeos agrupados usando primers específicos da biblioteca na mistura de reação seguinte. A reação pode ser modificada para aderir à composição recomendada da polimerase específica. Prepare três reações com um molde de oligonucleotídeo agrupado e uma reação de controle negativo sem moleque.
      Molde de oligonucleotídeo em pool de 4 ng
      2,5 μL 10 μM Primer específico para biblioteca para frente
      2,5 μL 10 μM Primer reverso específico para biblioteca
      10 μL 5x Buffer de reação
      0,5 μL DNA polimerase de alta fidelidade
      X μL Água livre de nuclease
      50 μL Volume total
    5. Realize amplificação por PCR usando as seguintes condições de ciclo, ajustando a temperatura de recozimento com base na temperatura de fusão específica do primer da biblioteca:
      1 ciclo de 98 °C por 30 s
      18 ciclos de 98 °C por 10 s, 62–65 °C por 20 s e 72 °C por 3 s
      1 ciclo de 72 °C por 5 minutos
      NOTA: Não exceda 18–19 ciclos de amplificação para preservar a representação igual do gRNA dentro da biblioteca.
    6. Resolver os produtos PCR em um gel de agarose a 2,5% a 120 V por aproximadamente 45 minutos e retirar a faixa correspondente ao tamanho esperado do inserto de gRNA (aproximadamente 100 pb, dependendo do design do primer; Figura 2A).
    7. Purifique os produtos de PCR usando um kit de extração em gel e elute em 20 μL de água ultrapura durante a etapa final da elução.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) Inserções de gRNA purificadas podem ser armazenadas a -20 °C antes da clonagem.
  3. Preparação e digestão das espinhas dorsuais lentivirais
    1. Prepare plasmídeos de espinha dorsal lentiviral contendo uma sequência de empacador removível para clonagem de inserções de gRNA. Para bibliotecas in vivo CRISPR-KO e CRISPR-A, use pLKO-Cre (Plasmídeo Addgene #158032 ou 256774) e pXPR502-PPH-Cre (Plasmídeo Addgene #256776), respectivamente.
    2. Digere 5–10 μg de DNA da espinha dorsal lentiviral em um volume total de reação de 200 μL usando a enzima de restrição e o tampão apropriados. Use Esp3I para a espinha dorsal pLKO-Cre CRISPR-KO e SapI para a espinha dorsal pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      Plasmídeo de espinha dorsal de 5–10 μg
      20 μL 10x Buffer enzimático
      Enzima de restrição de 5 μL
      X μL Água livre de nuclease
      200 μL Volume total
    3. Incubar reações digestivas por 2–3 horas a 37 °C.
    4. Adicione 2 μL de fosfatase alcalina recombinante a cada reação digestiva e incube por 1 hora a 37 °C para desfosforilar a espinha dorsal digerida.
    5. Resolva os produtos digeridos em um gel de agarose a 1% e retire a faixa correspondente à espinha dorsal linearizada (Figuras 2B,C)
      NOTA: Para ambas as espinhas dorsales, o fragmento do empacador é visível como uma banda distinta em aproximadamente 2000-2500 bp, dependendo do vetor.
    6. Purifique o DNA da coluna dorsal excisado usando um kit de extração em gel e elute em um volume mínimo de água ultrapura para manter alta concentração de DNA (tipicamente 20 μL).
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) As espinhas dorsais purificadas e digeridas podem ser armazenadas a -20 °C antes da ligadura.
  4. Digestão e ligação de bibliotecas de gRNA
    1. Configure reações de digestão-ligadura all-in-one usando 750 ng de DNA lentiviral purificado, 43 ng de DNA inserido na biblioteca gRNA, 3 μL de enzima de restrição, 7,5 μL de ligase de DNA T4, 15 μL de 10 mM de ATP e a quantidade apropriada de tampão de reação e água destilada estéril para alcançar um volume total de reação de 150 μL.
      NOTA: Use a mesma enzima de restrição que foi inicialmente usada na etapa de digestão da espinha dorsal plasmídea. Uma proporção de 750 ng de espinha dorsal lentiviral purificada para 43 ng de DNA inserido da biblioteca gera uma proporção aproximada de vetor para molar de inserção de 1:7 quando as espinhas dorsal recomendadas são usadas.
    2. Divida cada mistura de ligação em três alíquotas iguais para aumentar a eficiência da transformação e a complexidade da biblioteca.
    3. Prepare uma única reação de controle negativa contendo DNA da espinha dorsal, mas sem inserções de gRNA, para avaliar a ligação de fundo.
    4. Incubar reações digestivas-ligaduras durante a noite a 30 °C.
    5. Na manhã seguinte, adicione 1 μL da enzima de restrição apropriada a cada alíquota de reação e incube por 1 hora a 37 °C para conduzir à conclusão da digestão da cola dorsal.
    6. Adicione 2 μL de 10 mM de ATP e 2 μL de ligase de DNA T4 a cada reação e incube a 25 °C por 2–3 horas para completar a ligação.
    7. Agrupe as três reações individuais de digestão-ligação por biblioteca, purifique as reações usando um método de limpeza de oligonucleotídeos em coluna e elude cada uma em 21 μL de água destilada ultrapura e estéril. Elute a única reação de controle negativo purificada em 7 μL de água destilada estéril ultrapura.
      NOTA: Não elude produtos de ligadura em tampões contendo sal ou EDTA, pois eles reduzem significativamente a eficiência de eletroporação bacteriana. (PONTO DE PAUSA) Produtos de ligadura purificados podem ser armazenados a -20 °C antes da eletroporação.
  5. Eletroporação e expansão da biblioteca
    1. Antes de resfriar cuvetas de eletroporação de 0,1 cm, tubos de microcentrífuga contendo 2 μL alíquotas de produtos de ligadura purificados e tubos de cultura de polipropileno de fundo arredondado de 14 mL sobre gelo por pelo menos 20 minutos antes da eletroporação.
    2. Descongele células bacterianas eletrocompetentes em gelo e misture suavemente 25 μL de células com 2 μL de produto de ligadura purificado no tubo pré-resfriado da microcentrífuga por pipeteamento.
    3. Transfira a mistura célula-DNA para uma cuveta de eletroporação pré-resfriada de 0,1 cm e eletropore a 1,8 kV, 25 μF e 200–600 Ω.
      NOTA: Uma eletroporação bem-sucedida normalmente gera uma constante de tempo entre 4,6 ms e 4,9 ms.
    4. Adicione imediatamente 1 mL de meio de recuperação pré-aquecido a 37 °C fornecido com as células eletrocompetentes à cuvetta, ressuspenda suavemente as células e transfira a suspensão para um tubo de polipropileno de fundo arredondado de 14 mL.
    5. Incube as células recuperadas a 30 °C enquanto agita a 180 rpm por 90 minutos.
    6. A placa 10 μL das células recuperadas diluída em 90 μL de caldo LB sobre placas de LB-agar contendo ampicilina e incubada durante a noite a 30 °C para avaliar a eficiência da transformação e a ligação de fundo.
      NOTA: A clonagem bem-sucedida deve resultar em centenas de colônias na placa com inserto e poucas (> 30) colônias na placa de controle negativa apenas da espinha dorsal (Figura 3).
    7. Valide ainda mais a biblioteca escolhendo ~10 colônias para miniprep e sequenciamento Sanger do promotor U6. Bibliotecas clonadas com sucesso terão < 90% dos minipreps contendo sequenciamento claro de um gRNA, sem guias repetidas entre os 10 minipreps. Além disso, a enzima de restrição digere os minipreps e a biblioteca de plasmídeos agrupados (passo 1.5.10) e executa um gel de agarose para verificar o tamanho das bandas e garantir que os construtos lentivirais não tenham sofrido recombinação aberrante.
      NOTA: A representação da biblioteca pode ser avaliada comparando a contagem de colônias de placas de diluição com o número total de gRNAs na biblioteca, mirando uma cobertura de 1.000 vezes. Múltiplas diluições seriadas podem ser usadas para auxiliar nesse cálculo.
    8. Se a eficiência da transformação for suficiente, placar as células recuperadas restantes em placas LB-agar de 15 cm contendo o antibiótico apropriado e incubar durante a noite a 30 °C para gerar um gramado denso de colônias.
      NOTA: Placar 100 μL de células recuperadas em cada uma das dez placas de ágar de 15 cm LB para recuperar colônias suficientes.
    9. No dia seguinte, use um raspador de células para raspar colônias bacterianas em 500 mL de caldo LB com ampicilina para gerar uma única cultura bacteriana representando a biblioteca de gRNA clonada.
    10. Expanda a cultura bacteriana acumulada a 30 °C com agitação por aproximadamente 3 h e isole o DNA plasmídico usando um kit maxiprep.

2. Produção de lentivais para triagem in vivo

NOTA: Para parto intraductal e triagem agrupada in vivo , preparações lentivirais devem ser concentradas para alcançar títulos altos (idealmente entre 1 x 108 pfu/mL e 1 x 109 pfu/mL) para garantir a transdução eficiente das células epiteliais mamárias. O protocolo a seguir descreve a produção de lentiviral de alto título, otimizada para uso in vivo .

  1. Preparação de células produtoras de lentivirais
    1. Manter HEK293TN células no meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementadas com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina-estreptomicina, e cultivar células a 37 °C com 5% de CO2.
    2. As células de passagem a cada 2–3 dias para manter o crescimento logarítmico e garantir que as células não excedam 90% de confluência. Use células nas passagens <20 para produção viral ideal.
    3. Um dia antes da transfecção, revestir as placas de cultura de tecido de 15 cm com poli-L-lisina (0,02 mg/mL) por 1 hora em temperatura ambiente. Prepare nove pratos para um lote de preparação viral.
    4. Remova a solução de poli-L-lisina e lave as placas duas vezes com soro salino tamponado com fosfato.
    5. Semeie 1,1 x10 7 HEK293TN células em cada uma das nove placas de cultura de tecido de 15 cm revestidas com poli-L-lisina, garantindo que as células atinjam ~90% de confluência no momento da transfecção.
      NOTA: Para aplicações que não exigem títulos virais máximos, a produção de lentiviral pode ser reduzida para menos placas (por exemplo, três ou seis placas) com rendimentos proporcionalmente reduzidos. Reduza a escala dos reagentes (DNA plasmídico, PEI e DMEM) para a transfecção conforme necessário.
  2. Transfecção lentiviral à base de PEI
    1. Prepare DNA plasmídico para produção lentiviral usando um sistema de três plasmídeos composto por 95 μg do plasmídeo da biblioteca de gRNA, 95 μg do plasmídeo de embalagem psPAX2 (Plasmídeo Addgene #12260) e 65 μg do plasmídeo envolvente VSV-G pMD2.G (Plasmídeo Addgene #12259).
    2. Combine os três plasmídeos para produção lentiviral em 10,8 mL de DMEM sem soro e misture cuidadosamente por vortex por aproximadamente 10 segundos.
    3. Adicione 366 μL de 1 mg/mL de polietilenimina (PEI) gota a gota à solução de DNA diluído, misture cuidadosamente por vortex por aproximadamente 10 s e incube os complexos DNA-PEI em temperatura ambiente por 10–30 min.
    4. Durante a formação do complexo, aspire o meio de cultivo das placas HEK293TN e adicione 14 mL de DMEM sem soro.
      NOTA: O soro fetal bovino pode inibir a absorção de plasmídeos pelas células.
    5. Distribua 1,2 mL do complexo DNA-PEI por gota por toda a placa e rocha para garantir uma distribuição uniforme.
    6. Incubar células a 37 °C com 5% deCO2 por 6–8 horas.
    7. Substitua o meio de cada placa por 20 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% de soro fetal bovino (sem 1% de penicilina-estreptomicina) e continue cultivando as células a 37 °C com 5% deCO2.
      NOTA: A transfecção durante a noite não é recomendada, pois a exposição prolongada ao PEI e a falta de soro reduzem a produção viral.
  3. Colheita viral e ultracentrifugação
    1. Prepare 200 mL de uma solução de almofada de sacarose combinando 40 g de sacarose, 11,7 g de cloreto de sódio, 4 mL de 1 M HEPES (pH 7,4) e 1 mL de 0,5 M EDTA (pH 7,9) em um volume apropriado de água destilada estéril e filtre-esterilize através de uma unidade de filtração de polietersulfona de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm. Essa solução pode ser armazenada a 4 °C por vários meses.
    2. Colete o sobrenadante lentiviral 48–72 horas após a transfecção.
    3. Passe 10 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino através da unidade de filtração de polietersulfona de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm. Descarte o fluxo de fluxo. Coloque o sobrenadante no filtro e aplique o vácuo.
      NOTA: Se a concentração não puder ser realizada imediatamente, armazene o supernadante viral clarificado a 4 °C durante a noite.
    4. Adicione 30 mL de sobrenadante viral clarificado a um tubo de ultracentrífuga.
    5. Coloque lentamente o sobrenadante viral clarificado com 4 mL de solução de almofada de sacarose.
    6. Coloque o tubo da ultracentrífuga em um adaptador compatível para um rotor de balde oscilante e equilibre os tubos com precisão.
    7. Centrifuge os tubos a 104.000 × g por pelo menos 2 horas a 4 °C.
      NOTA: Um rotor oscilante de balde, como o rotor Beckman JS24.38, é necessário para pelletar corretamente o vírus através da almofada de sacarose.
    8. Decante cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a bola viral, que pode aparecer como um filme branco ou translúcido no fundo do tubo.
    9. Deixe os tubos secarem ao ar por pelo menos 10 minutos e use um lenço de laboratório para remover o máximo possível de líquido residual dentro do tubo sem perturbar o pellet.
      NOTA: A secagem adequada do tubo é fundamental para alcançar altas concentrações virais, pois reduz o volume final de recuperação.
    10. Ressuspenda pellets virais em 20 μL de soro salino tamponado com fosfato frio e pipete cuidadosamente para cima e para baixo, evitando bolhas de ar.
    11. Incube os tubos no gelo por 2 horas com agitação suave para ressuspender completamente os pellets virais.
    12. Transfira o vírus concentrado para um tubo de microfúgio limpo e clarifique a solução por centrifugação a 2.000 × g por 5 minutos a 4 °C.
      NOTA: Essa rotação remove detritos e partículas residuais que entupem a agulha da injeção durante a cirurgia.
    13. Aliquota o vírus concentrado em volumes descartáveis para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos e armazenar a -80 °C.
  4. Titulação lentiviral usando fibroblastos embrionários de camundongos LSL-tdTomato mouse (MEFs)
    1. Placar 100.000 MEFs LSL-tdTomato (derivados de Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) em uma placa de 6 poços um dia antes da infecção em DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina, e cultive as células a 37 °C com 5% de CO2. Coloque um poço extra para contar células.
      NOTA: LSL-tdTomato MEFs atuam como repórteres para Cre dentro do lentivírus. Qualquer sistema de repórter adequado para titulação viral de outras espinhas dorsal pode ser utilizado.
    2. No dia seguinte, conte o número de MEFs LSL-tdTomato de um poço extra para quantificar o número de células presentes no momento da infecção.
    3. Preparar diluições seriadas de lentivírus concentrado que codifica Cre recombinase em um total de 2 mL do meio Eagle modificado de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino. Geralmente, 0,4 μL, 0,1 μL e 0,025 μL de vírus concentrado produzem uma faixa linear dinâmica limpa (Figura 4A–D).
    4. Adicione 2 mL de diluições virais a cada poço de MEFs LSL-tdTomato e adicione 2 μL de 10 mg/mL de polibreno a cada um.
    5. Infecte os MEFs girando a 400 × g por 90 minutos a 37 °C.
    6. Substituir o meio viral por 2 mL de DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina-estreptomicina, e cultivar as células a 37 °C com 5% deCO-2 por 48–72 horas.
    7. Quantifique as células td-Tomate-positivas por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo para determinar a fração de células infectadas a cada diluição.
    8. Calcule o título funcional com base na fração de células infectadas e no número de células presentes no momento da infecção.
      NOTA: os vírus CRISPR-KO e CRISPR-A são produzidos, concentrados e titulados separadamente. Títulos funcionais determinados usando MEFs LSL-tdTomato são usados para misturar vírus CRISPR-KO e CRISPR-A em uma proporção definida antes da injeção intradutal.
  5. Avaliação de qualidade das bibliotecas de plasmídeos e lentivírus
    1. Para garantir que as bibliotecas de gRNAs sejam clonadas com profundidade/cobertura suficiente e que todos os gRNAs sejam mantidos durante a clonagem e produção do vírus, é altamente recomendado sequenciar o pool de plasmídeos, bem como os MEFs transdutos.
    2. Para avaliar a cobertura lentiviral, transfecte MEFs com lentivírus com >1000× de cobertura baseada no título viral calculado. Não é necessário garantir uma única infecção celular durante essa etapa.
    3. Após 48–72 horas, desprenda as células usando tripsina ou um raspador de células e faça pellets nas células. Extraia o DNA usando um kit comercial de extração de gDNA.
    4. Sequência de 1 μg de plasmídeo e 3 μg de DNA MEF extraído usando o protocolo descrito na Seção 5. Sequenciamento profundo de 5 milhões de leituras é suficiente para a maioria das bibliotecas personalizadas com <5000 gRNAs.
      NOTA: Uma forte correlação (R2> 0,6) entre as leituras do pool de plasmídeos e a representação relativamente igual dos guias (>70% dos guias dentro de 1 log-decade) sem guias individuais dominando a contagem de bibliotecas indica boa qualidade (Figura 4E).

3. Injeção lentiviral intraductal na glândula mamária do camundongo

  1. Diluição de agulha e vírus
    1. Puxe agulhas microcapilares de vidro usando um puxador de micropipeta para gerar capilares de ponta fina adequados para injeção intraductal de volumes de 9–10 μL. Use um par de pinças finas para quebrar a ponta da agulha.
      NOTA: A localização ideal cria um tamanho de agulha grande o suficiente para ser carregado com líquido, mas fino o bastante para caber facilmente na abertura do mamilo.
    2. Diluir preparações lentivirais até uma concentração final de 1 × 107 pfu/mL em soro salino estéril tamponado com fosfato, suplementado com 0,05% (p/v) de corante Fast Green FCF.
    3. Se for misturar vírus CRISPR-KO e CRISPR-A para triá-los dentro do mesmo conjunto complexo, ajuste as duas bibliotecas para um título viral igual com soro salino estéril tamponado com fosfato e misture em uma proporção para garantir uma representação igual dos gRNAs em ambas as bibliotecas.
  2. Preparação de camundongos para injeção intradutal
    1. Anestesie uma camundonga adulta (8–20 semanas de idade) com menos de 4% de isoflurano com 1 L/min de oxigênio e aplique lubrificante oftálmico estéril em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante o procedimento.
      NOTA: A injeção intraductal é um procedimento não invasivo e não requer analgesia. Use camundongos Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 ou Rosa-LSL-tdTomato para esses experimentos.
    2. Prenda o rato em posição supina sobre uma almofada térmica coberta, ajustada para baixa para manter a temperatura corporal e mantenha a anestesia usando isoflurano a 2% com 1 L/min de oxigênio via nariz durante todo o procedimento.
    3. Remova o pelo ao redor do terceiro mamilo torácico e do quarto abdominais usando creme depilatório aplicado com cotonete estéril em uma área circular de aproximadamente 0,5 cm de raio por 10–15 segundos. Remova imediatamente o creme com gaze estéril e água estéril para evitar irritação na pele.
      NOTA: A terceira e a quarta glândulas mamárias são rotineiramente as mais fáceis de injetar. Alternativamente, a segunda e a quinta glândulas podem ser preparadas para injeção da mesma forma.
    4. Desinfete a pele ao redor de cada mamilo aplicando uma cotonete sequencial com álcool isopropílico 70% e iodo, utilizando gaze estéril.
    5. Coloque o rato sob um microscópio dissecador dentro de um gabinete de biossegurança para permitir uma visualização clara dos mamilos.
    6. Usando pinças finas limpas com 70% de etanol, remova delicadamente qualquer pele morta que cobra o mamilo para expor a abertura ductal.
      NOTA: Essa camada queratinizada morta é frouxamente presa e pode obstruir a entrada da agulha. A remoção não deve danificar a pele viável ou o tecido subjacente.
  3. Injeção intradutal
    1. Carregue 8 μL do vírus diluído em um microcapilar de vidro puxado.
    2. Segure a área do mamilo com uma pinça fina e insira delicadamente a ponta da agulha na abertura do mamilo (Figura 5A). Uma agulha posicionada adequadamente entrará no duto com resistência mínima. Dispense lentamente a suspensão viral no ducto mamário ao longo de 5 a 10 segundos.
      NOTA: 8 μL de um lentivírus de 1 × 10 pfu/mL de 7 pfu/mL proporcionarão aproximadamente 30% de infectividade das células epiteliais mamárias luminais e 5% de infetividade das células epiteliais mamárias basais, com infecção negligenciável (< 0,5%) do estroma36. O título viral pode ser ajustado para alcançar uma infectividade maior ou menor.
    3. Monitore a disseminação do corante Fast Green durante a injeção através do microscópio dissecante. Confirme a entrega intradutal bem-sucedida observando a dispersão do corante ao longo da rede ductal sob a pele (Figura 5B).
    4. Identifique injeções fracassadas agrupando o corante dentro da almofada de gordura mamária adjacente ao mamilo, em vez de ao longo da árvore ductal (Figura 5C).
    5. Repita o procedimento de injeção para a terceira glândula torácica e a quarta glândula mamária abdominal em ambos os lados, injetando um total de quatro glândulas por camundongo.
      NOTA: Com a experiência, o parto intraductal bem-sucedido é alcançado em >95% das injeções. Injeções fracassadas confinadas à almofada adiposa não estão associadas a efeitos adversos, e as glândulas restantes ainda podem ser usadas. Validações adicionais das injeções podem ser realizadas por imunohistoquímica e citometria de fluxo (Figuras 5D,E).
    6. Interrompa a anestesia e transfira o rato para uma gaiola de recuperação limpa.
    7. Monitore o camundongo até que ele esteja totalmente ambulatório e retorne-o ao alojamento de biossegurança designado assim que o comportamento normal for observado.
    8. Três dias após a injeção, faça uma troca completa da gaiola, descartando qualquer alojamento e cama como resíduos virais, e transfira o camundongo para uma gaiola limpa que possa ser devolvida ao alojamento padrão.

4. Isolamento genômico de DNA de glândulas mamárias e tumores

NOTA: Eutanasie camundongos por exposição aoCO2 ou overdose de anestésicos seguidos por luxação cervical, de acordo com as diretrizes de cuidado animal. Colhe glândulas mamárias ou tumores mamários nos momentos desejados ou no desfecho humano conforme as diretrizes regulatórias. Células infectadas foram colhidas tão cedo quanto 48 h após a infecçãolentiviral 36,55 ou até 5+ meses após a injeção em camundongosselvagens 36, ou >24 meses em fundos oncogênicos55. Os passos a seguir devem ser feitos em um espaço limpo com DNA Erase e com equipamentos livres de plasmídeos contendo cassetes sgRNA/dgRNA. Mesmo quantidades traços de DNA plasmídico são suficientes para resultar na contaminação de amostras de tecido, e subsequentes PCRs de sequenciamento profundo e controles negativos (sem tecido) devem ser realizados para garantir preparações limpas.

  1. Dissociação de tecidos
    1. Para glândulas mamárias, digera cada glândula mamária em 2 mL de meio completo Epicult-B (Mouse) suplementado com 0,2 mL de colagnase/hialuronidase suave em um tubo cônico de 15 mL e incube durante a noite a 37 °C.
    2. Pellet dissociou células a 450 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
    3. Transfira cuidadosamente a camada superior de gordura usando uma ponta de pipeta revestida com albumina sérica bovina para um novo tubo cônico de 15 mL e descarte o sobrenadante restante.
      NOTA: A camada gordurosa superior neste passo frequentemente contém organoides epiteliais residuais que não foram separados e permanecem associados ao tecido adiposo. Processar essa fração em um tubo separado aumenta muito a recuperação das células epiteliais.
    4. Lave tanto a fração gordurosa quanto o pellet celular uma vez com 5 mL de soro salino tamponado com fosfato, centrifuge a 450 × g por 5 minutos em temperatura ambiente e descarte os supernadantes.
    5. Combine a fração graxa lavada e o pellet celular da mesma glândula mamária em um único tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de soro salino tamponado com fosfato.
    6. Faça pellets no material combinado a 450 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
    7. Para tumores mamários, triture o tecido em pequenos pedaços usando tesoura estéreis ou um bisturi e transfira diretamente para um tubo microfúgio de 2 mL.
  2. Isolamento de DNA genômico
    NOTA: A extração de DNA genômico pode ser feita usando o kit Qiagen DNEasy Blood and Tissue seguindo as instruções do fabricante ou utilizando o seguinte protocolo de fenol-clorofórmio.
    1. Prepare o tampão de lise de DNA combinando 5 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL de EDTA (pH 8,0), 25 mL de 5 M NaCl e 50 mL de 10% de SDS, e leve o volume final para 500 mL com água destilada estéril.
    2. Adicione 1 mL de tampão de lise de DNA e 10 μL de Proteinase K (20 mg/mL) a cada amostra e misture completamente por inversão.
    3. Incubar as amostras a 56 °C durante a noite para permitir a lise completa.
    4. A centrífuga lisa a 16.000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletizar detritos insolúveis.
    5. Transfira o sobrenadante clarificado para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL.
      ATENÇÃO: Fenol:clorofórmio:isoálico-álcool é tóxico e corrosivo. Realize todas as etapas envolvendo solventes orgânicos em uma exaustão química enquanto usa equipamentos de proteção individual adequados.
    6. Adicione um volume igual de fenol:clorofórmio:isoamílico e misture vigorosamente por vortice por aproximadamente 15 s até que uma mistura homogênea seja formada.
    7. Centrifugar a 16.000 × g por 10 minutos a 4 °C para separar as fases orgânica e inorgânica.
    8. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo sem perturbar a interfase.
      NOTA: Evite aspirar material da interfase branca para minimizar a contaminação por proteínas e RNA.
    9. Adicione 0,7 volume de isopropanol à fase aquosa recuperada e misture vigorosamente por meio de vórtice por aproximadamente 15 s.
    10. Centrifuge a 16.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
    11. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e enxágue a pastilha de DNA com 500 μL de etanol a 70%.
    12. Centrifuge a 16.000 × g por 10 minutos a 4 °C e remova completamente o etanol.
    13. Seque o pellet de DNA ao ar em temperatura ambiente por 10 minutos.
    14. Ressuspenda o pellet de DNA em 50 μL de água destilada estéril.
    15. Incubar amostras a 37 °C por 1 hora ou a 4 °C durante a noite para facilitar a resssuspension total do DNA genômico.
    16. Meça a concentração e pureza do DNA por meio de quantificação nanodrop ou fluorométrica.

5. Sequenciamento de próxima geração de bibliotecas CRISPR


NOTA: Gerar uma amostra de referência para permitir o cálculo das mudanças na dobra do gRNA ao longo do tempo. MEFs transdutos (Seção 2) ou glândulas mamárias (Seção 4) colhidos 3 dias após a infecção, assim como o plasmídeo original maxiprep, podem ser usados para determinar a representação do guia na biblioteca inicial e no estoque viral.

  1. Amplificação por PCR de cassetes de gRNA a partir de DNA genômico
    1. Use pares de primers listados na Tabela 2 para indexar amostras de forma única, permitindo multiplexação e desmultiplexação de até 306 amostras após o sequenciamento.
    2. Prepare reações de PCR usando 1 μg de DNA genômico como molde em um volume total de reação de 50 μL contendo 25 μL de 2x Q5 Master Mix, 2,5 μL de primer frontal de 10 μM e 2,5 μL de primer reverso de 10 μM.
    3. Inclua uma reação de controle sem modelo paralelo para monitorar a contaminação.
    4. Realize amplificação por PCR usando as seguintes condições de ciclo, ajustando a temperatura de recozimento com base na temperatura de fusão específica do primer da biblioteca:
      1 ciclo de 98 °C por 30 s
      5 ciclos de 98 °C por 10 s, 68 °C (-1 °C/ciclo) por 10 s e 72 °C por 15 s
      20 ciclos de 98 °C por 10 s, 63 °C por 30 s e 72 °C por 15 s
      1 ciclo de 72 °C por 2 minutos
    5. Resolva os produtos de PCR em um gel de agarose a 2,5% para verificar o tamanho correto do amplicon.
    6. Confirme a presença de bandas em aproximadamente 306 pb para bibliotecas de sgRNA baseadas em pLKO e 430 pb para bibliotecas de dgRNA baseadas em pXPR502 (Figura 6).
      NOTA: Um controle claro sem molde garante a pureza dos reagentes e confirma que o ensaio está livre de contaminação cruzada.
    7. Purificar produtos de PCR usando um método adequado de purificação de DNA e quantificar a concentração de DNA usando quantificação fluorométrica.
  2. Sequenciamento de próxima geração
    1. Determine a profundidade de sequenciamento necessária com base na complexidade esperada da biblioteca e na clonalidade da amostra.
      NOTA: Para tumores suspeitos de serem clonais, aproximadamente 1 milhão de leituras por amostra são suficientes para quantificar com precisão a representação dos guias. Para calcular a profundidade de sequenciamento a partir das glândulas mamárias, multiplique o número de guias na biblioteca pela cobertura de 1.000 vezes e, em seguida, multiplique por 6 pg de DNA/célula genômica para calcular a massa total de DNA genômico por amostra que deve ser amplificada por PCR. O número total de leituras necessárias para sequenciar é igual ao número de guias na biblioteca multiplicado por 1.000.
    2. Poole bibliotecas purificadas de diferentes amostras em concentrações equimolares.
    3. Bibliotecas de sequência compartilhadas usando uma plataforma de sequenciamento Illumina de leitura curta.
  3. Análise de dados
    1. Demultiplexar arquivos FASTQ de sequenciamento bruto usando índices específicos de amostra.
    2. Trim lê para a sequência do protoespaçador de gRNA usando Trimmomatic69. Para amostras CRISPR-A, leituras de trim para 14 bp, e para CRISPR-KO, leituras de trim para 20 bp a partir da extremidade do primer frontal.
    3. Alinhe as leituras trimmed para a biblioteca de referência correspondente de gRNA usando o Bowtie70. Use parâmetros de alinhamento -v 2 e -m 1 para CRISPR-KO e -v 2 e -m 2 para CRISPR-A e piscinas mistas.
      NOTA: Normalmente, mais de 90% das leituras são alinhadas com sucesso. O baixo alinhamento normalmente resulta de erros de corte, formatação incorreta dos arquivos de entrada ou contaminação da amostra durante a PCR.
    4. Quantifique as leituras alinhadas para cada gRNA usando a função de contagem no MAGeCK72 para gerar tabelas finais de contagem de gRNA para análise a jusante.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, fornecemos um protocolo para triagem CRISPR in vivo em conjunto na glândula mamária do camundongo. Esse pipeline pode ser usado de ponta a ponta para projetar e amplificar bibliotecas de gRNA agrupadas a partir de matrizes de oligonucleotídeos, clonar as bibliotecas de gRNA em espinhas dorsuais lentivirais, produzir lentivírus de alto título, realizar a entrega intraductal de bibliotecas lentivirais agrupadas na glândula mamária adulta e recuperar gRNAs para a deconvolução...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma consideração fundamental para a triagem CRISPR in vivo em conjunto é alcançar cobertura suficiente de bibliotecas enquanto se mantém a transdução escassa de células únicas para preservar a resoluçãoclonal 2. Na glândula mamária do camundongo, o compartimento epitelial consiste conservadoramente em aproximadamente 3,5 × 105 células porglândula 36. Com uma taxa média de transdução lentiviral de 15%, o que minimiza a fr...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. é consultor e fundador da ViVerita Therapeutics, e seu laboratório patrocinou acordos de pesquisa e de serviços com a ViVerita Therapeutics.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios pelos comentários e discussões úteis relacionados a este trabalho. Também agradecemos e reconhecemos o Centro de Fenogenômica por toda a ajuda e expertise no trabalho com camundongos no Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI), Toronto, Canadá. Este estudo foi apoiado por uma bolsa de projeto dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (PJT462506) e por uma bolsa do Programa de Projetos do Instituto de Pesquisa Terry Fox para a D.S. (TFRI Projeto #1107) para a D.S. e pela Fundação Família Nicol. E.R.L. foi apoiado pelo Prêmio de Treinamento em Pesquisa da Sociedade Canadense do Câncer e pelo Fundo Memorial Frank Fletcher. A K.N.A. foi apoiada por uma Bolsa de Pós-Doutorado H.L. Holmes e bolsas 1318698 e 26089 da Cancer Research Society. J.N. foi apoiado por uma Bolsa de Estudos de Pós-Graduação – Mestrado do Canadian Institutes of Health Research Canada e por um Prêmio de Pesquisa Doutoral (#193389). Y.L foi apoiado pela bolsa de Excelência em Pesquisa, Diversidade e Independência (#ED6-190718) dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k ou 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
Placas de cultura celular de 15 cmCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Fosfatase alcalinaNEBM0290L
AmpicilinaFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Sequenciamento profundo (Next-Seq ou Hi-Seq)Illumina
Kit de extração de DNA de sangue e tecido DNAesyQiagen69506
Meio Eagle modificado de DulbeccoWisent319-015-CL
Células eletrocompetentes EnduraLucigen60242-1
Kit de meio EpiCult-B para camundongosStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Soro bovino fetalWisent090-150
Kit de limpeza de DNA em gelZymo ResearchD4008
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
Cânulas de eletroporação Gene Pulser/MicroPulserBioRad1652089
Kim-wipeKimberly-Clark34155
Ágar LBWisent Technologies800-011-LG
Extrusor de micropipetasSutter InstrumentP97
Kit de miniprep de plasmídeoFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer para BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Kit de limpeza de oligoZymo researchD4060
Primers de sequenciamento illumina PAGE purificadosIDT DNA
Micropipetas PCRDrummond5-000-1001-X10
PEI (polietilenimina)Sigma408727-100ML
Penicilina e EstretomicinaWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poli-L-LisinaSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato camundongosJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Tubos de ultracentrífugaBeckman Coulter344058
Unidades de filtro a vácuoFisher ScientificSCHVU02RE

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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