Este protocolo descreve um método para gravar dados sincronizados de vídeo e áudio durante interações sociais com múltiplos mouses. O método utiliza um conjunto de microfones e localização da fonte sonora para atribuir vocalizações ultrassônicas (USVs) a camundongos individuais, permitindo uma análise quantitativa do comportamento vocal em animais e contextos sociais.
Artigo de método
Detectando e atribuindo vocalizações ultrassônicas a ratos individuais durante interações sociais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ratos (Mus musculus) se comunicam usando vocalizações ultrassônicas (USVs) durante interações sociais. No entanto, como os USVs de camundongos não estão associados a indicadores visuais claros e ocorrem em frequências fora da faixa auditiva humana, continua sendo difícil identificar camundongos vocalizantes individuais dentro de um grupo. Esse protocolo descreve um método para gravar dados sincronizados de vídeo e áudio ultrassônico durante interações sociais entre múltiplos animais, permitindo a captura simultânea do comportamento e da atividade vocal. Um pipeline computacional é delineado que integra rastreamento multi-animal, detecção de vocalização, localização de fontes sonoras e atribuição de vocalizações a animais individuais. Os procedimentos de validação usados para avaliar a precisão do rastreamento, extração vocalizada, precisão de localização e confiança na atribuição em cada etapa do pipeline são descritos mais detalhadamente. A aplicação desse protocolo a um conjunto de dados de demonstração com quatro animais gera rastreamento de vocalização resolvido individualmente, estimativas espacialmente precisas da fonte sonora e medidas quantitativas da saída vocal e das características acústicas. Juntas, essas abordagens fornecem uma estrutura robusta para ligar a comunicação vocal ao comportamento individual e possibilitam análises posteriores das diferenças sexuais, variabilidade individual e comunicação social em camundongos que interagem livremente.
Introdução
A comunicação social em todo o reino animal é um componente essencial da dinâmica comportamental, auxiliando em processos como sobrevivência e reprodução 1,2. Entre os mamíferos, os camundongos se comunicam acusticamente por meio de USVs, que abrangem frequências de 35 a 110kHz 3. Os USVs apresentam características complexas, transmitindo informações dependendo do contextocomportamental 4. Fêmeas apresentam preferência por USVs 5,6 machos de camundongo, e machos e fêmeas interagem vocalmente durante os comportamentosde cortejo 7, indicando que os USVs funcionam como sinais sociais chave. Como características específicas do USV estão ligadas a estados comportamentais distintosdo camundongo, atribuir vocalizações com precisão aos indivíduos é essencial para entender as interações sociais.
Apesar dos extensos esforços para elucidar as funções dos USVs e sua relação com o comportamentosocial 8, um desafio contínuo no campo tem sido a atribuição de USVs a camundongos individuais durante interações em grupo. As dificuldades surgem tanto devido à falta de movimentos visíveis da boca durante a produção doUSV 4 quanto à faixa de frequência dos USVs ser inaudível para o ouvidohumano 3. Como resultado, estudos anteriores sobre a relação entre USVs e comportamento social foram restritos a ensaios simplificados ou ambientes restritos que limitam a gama de comportamentos observáveis do grupo, fornecendo apenas uma visão parcial de como o comportamento vocal se desenrola em animais que interagem livremente.
Para refinar a compreensão da relação entre comunicação auditiva e comportamento social, é necessário capturar uma gama completa de comportamentos de camundongos e atribuir vocalizações aos indivíduos dentro de um grupo. Resolver identidades dos vocalizadores é essencial para determinar as faixas vocais dependentes do sexo e do contexto entre osindivíduos 8, testar hipóteses causais sobre como características vocais específicas impulsionam o comportamento conspecífico 10,11,12 e, quando aplicável, correlacionar a saída vocal com sinais cerebrais medidos simultaneamente (por exemplo, eletrofisiologia)13. Historicamente, acreditava-se que os camundongos machos eram os únicos vocalizadores; no entanto, a localização da fonte sonora revelou que camundongos fêmeas também produzem USVs em grupos7 ou quando emparelhados com ummacho 14. Sem determinar qual animal emitiu um USV, a ligação das características vocais ao comportamento individual e aos resultados sociais em grupos que interagem livremente permanece limitada. Portanto, utilizar um sistema de localização que permita atribuir vocalizações a animais individuais, mantendo a dinâmica natural de interação, é essencial.
O sistema de localização de fontes sonoras por matriz de microfones descrito aqui, publicadoanteriormente em 7,15, estima a origem espacial dos USVs dentro de uma arena e acompanha as posições de todos os animais presentes no momento da vocalização, permitindo que vocalizações sejam atribuídas ao emissor. Estimativas de fontes sonoras e posições de animais rastreadas são então integradas usando uma métrica baseada em probabilidade para apoiar a atribuição de USVs a animais individuais. A atribuição de vocalização converte gravações vocais de grupo previamente ambíguas em dados vocais animaisrotulados 7,15, permitindo análises quantitativas que relacionam o tipo e o tempo de vocalização ao comportamento e à ação subsequente da mesma espécie. O objetivo do presente trabalho é fornecer um protocolo detalhado para implementar esse método, que já foi quantificado evalidado 15. O protocolo a seguir descreve a configuração, calibração e implementação desse sistema, incluindo geometria de microfones, sincronização áudio-vídeo, detecção automática de som e estimativa probabilística de fontes, rastreamento de posição de múltiplos animais e o procedimento de atribuição de USVs ao animalemissor 7,15.
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Protocolo
Todos os protocolos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Delaware (número do protocolo: 1275) e conduzidos de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Construção do rig de localização de fontes sonoras
- Prepare a câmara de gravação.
- Montar uma estrutura cúbica (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm; largura × comprimento × altura), que serve como arena de gravação, e colocá-la em um gabinete atenuador acústico.
- Use malha de nylon para criar as paredes e forre a parte externa do gabinete com espuma acústica para reduzir as reflexões sonoras.
- Coloque um termômetro do lado de fora, mas próximo à câmara de gravação, do recinto para monitorar a temperatura ambiente durante as gravações.
- Realize todas as gravações em condições escuras.
NOTA: Manter condições ambientais estáveis durante as sessões de gravação e registrar parâmetros ambientais.
- Configure os sistemas de gravação de vídeo e áudio.
- Instale iluminação infravermelha acima da arena para permitir a gravação de vídeo no escuro.
- Posicione uma câmera de vídeo acima da arena e configure-a para gravar continuamente a 30 Hz.
- Configure o sistema de aquisição de áudio para gravar sinais ultrassônicos de um conjunto de microfones de oito canais a uma taxa de amostragem de 250 kHz.
NOTA: Oito microfones foram usados neste sistema, mas o número de microfones pode ser ajustado conforme as necessidades experimentais. - Sincronize as gravações de vídeo e áudio usando um gatilho externo compartilhado para garantir o alinhamento temporal.
- Confirme que os dados de vídeo e áudio são gravados simultaneamente e armazenados em cada sessão.
NOTA: Hardware e software de aquisição estão listados na Tabela de Materiais e na Tabela 1, respectivamente.
- Organize os microfones e a arena.
- Espalhe os microfones uniformemente ao longo das paredes da arena (dois por parede).
- Posicione os centros do microfone a 38,1 cm de distância, 19,05 cm de cada canto e 10,8 cm acima do piso da arena.
- Marque visualmente a localização dos microfones para facilitar a calibração e validação posteriores.
NOTA: LEDs podem ser usados para marcar posições de microfones.
2. Preparativos para registrar o comportamento social
- Preparem os animais experimentais.
- Selecione os ratos a serem gravados. Aqui, foram usados grupos de 2 camundongos machos e 2 fêmeas C57BL/6J, com idades entre 8 e 12 semanas de idade no momento da gravação.
NOTA: A cepa, a razão de sexo, a faixa etária dos camundongos e o número de dias de registro no paradigma experimental atual são ajustáveis para diferentes objetivos experimentais. Para a demonstração desse método, um subconjunto de camundongos experimentais foi reutilizado ao longo de dois dias de gravação. Camundongos C57BL/6J com mais de 12 semanas podem apresentar sensibilidade reduzida a sons de altafrequência 16.
- Selecione os ratos a serem gravados. Aqui, foram usados grupos de 2 camundongos machos e 2 fêmeas C57BL/6J, com idades entre 8 e 12 semanas de idade no momento da gravação.
- Abrigue os animais.
- Aloje cada camundongo individualmente por 14 dias antes da gravação.
NOTA: A moradia individual minimiza a influência da experiência social prévia nas interações do grupo. - Forneça a cada gaiola com cama, enriquecimento e acesso imediatamente a comida e água.
- Aloje cada camundongo individualmente por 14 dias antes da gravação.
- Marque os animais para identificação visual.
- Dois dias antes da gravação, anestesie cada camundongo usando 2,5% de isoflurano em oxigênio a uma vazão de 1 L/min por meio de um vaporizador de precisão em uma câmara selada. Uma vez que cada camundongo seja anestesiado, transfera-o para fora da câmara, deitando-se com as costas acessíveis, recebendo a anestesia de um cone nasal durante o procedimento de marcação.
NOTA: O protocolo de anestesia descrito no paradigma experimental atual é aprovado em nosso protocolo animal e foi aplicado a cada camundongo em série, mas é ajustável para diferentes animais ou objetivos experimentais. - Enquanto cada camundongo estiver sob anestesia, aplique um padrão único nas costas usando tinta de cabelo não tóxica para permitir a identificação visual durante o acompanhamento.
- Monitore cada animal continuamente enquanto o contraste se fixa, mantendo a anestesia por aproximadamente 15 minutos, e registre a duração da anestesia.
- Enxágue e coloque cada camundongo em uma gaiola de recuperação aquecida até que esteja totalmente andando.
- Devolva cada camundongo a uma gaiola limpa individual, com cama, enriquecimento e acesso a comida e água.
NOTA: Aplique marcas em camundongos fêmeas antes dos machos para minimizar a transferência de sinais de cheiro masculinos que possam influenciar o comportamento subsequente.
- Dois dias antes da gravação, anestesie cada camundongo usando 2,5% de isoflurano em oxigênio a uma vazão de 1 L/min por meio de um vaporizador de precisão em uma câmara selada. Uma vez que cada camundongo seja anestesiado, transfera-o para fora da câmara, deitando-se com as costas acessíveis, recebendo a anestesia de um cone nasal durante o procedimento de marcação.
- Realize exposição a pessoas do sexo oposto.
- Um dia antes da gravação, prepare gaiolas limpas sem cama.
- Para cada rato experimental, coloque o animal em uma gaiola seguido por um rato novo do sexo oposto.
- Permita que os animais interajam por 10 minutos.
- Observe interações e registre manualmente eventos comportamentais.
- Após a exposição, devolva os animais experimentais para alojamentos individuais após a exposição.
NOTA: A exposição a sexos opostos é específica do paradigma experimental atual, pois aumenta a probabilidade de comportamento vocal durante gravações subsequentes em grupo17; no entanto, não é um componente obrigatório dos métodos descritos. Separe os animais se for observado comportamento copulatório.
- Determine os estados estrois das fêmeas.
- Aproximadamente 2 horas antes do registro, avalie o estado estroso de cada fêmea de camundongo (se usar fêmeas).
- Realize lavagem vaginal usando 30 μL de soro tampão fosfatado.
- Transfira a amostra de lavagem para uma lâmina de microscópio limpa e espalhe uniformemente.
- Deixe as lâminas secarem completamente.
- Aplique um verniz violeta cristalino em cada lâmina e use uma pipeta para enxaguar suavemente com água.
- Examine lâminas sob um microscópio óptico.
- Classifique o estado estroso com base nas proporções relativas de células epiteliais nucleadas, células epiteliais cornificadas eleucócitos 18.
- Registre o estado estroso de cada fêmea.
NOTA: Como os VUSs podem impactar a receptividade feminina durante o estro19,20, determinar o estado estro é específico do paradigma experimental atual.; no entanto, não é um componente obrigatório dos métodos descritos.
3. Gravações de interação social
- Prepare a arena de gravação.
- Adicione roupas de cama à base de papel branco ao piso da arena até uma profundidade uniforme de aproximadamente 1,25 cm.
- Certifique-se de que a cama cubra todos os cantos de forma uniforme.
- Verifique se todos os microfones estão alinhados, sem obstrução e orientados para a arena.
- Antes das gravações experimentais, coloque uma régua e um objeto de alto contraste no centro da arena para verificar o foco da câmera e estabelecer o escalonamento espacial.
- Remova os objetos de calibração antes que comecem as gravações comportamentais.
NOTA: A cama branca à base de papel oferece contraste para animais de pelo escuro, facilitando o rastreamento. Se animais de pelo mais claro estiverem sendo usados, uma cama preta à base de papel ajudaria no rastreamento. Se a duração das gravações for estendida, adicione comida e água à arena. Adicionar marcadores direcionais Norte/Sul e Leste/Oeste à régua facilita a identificação dos oito microfones.
- Realize gravações pré-comportamentais do sistema.
- Imediatamente antes das gravações comportamentais, grave 15 segundos de ruído de fundo com luzes infravermelhas acesas.
- Gravar 15 segundos de um teste de localização de microfone com luzes infravermelhas apagadas e luzes indicadoras de microfone acesas.
- Salve todas as gravações pré-comportamento para verificação posterior do desempenho do sistema.
NOTA: Essas gravações são usadas para verificar o funcionamento do microfone e os níveis de ruído de base. Scripts usados para gravação estão disponíveis no repositório de código associado.
- Registre o comportamento social do grupo.
- Prepare todas as configurações de gravação com antecedência para minimizar a interação com os animais antes da coleta dos dados.
- Coloque as fêmeas na arena.
- Coloque os ratos machos na arena.
NOTA: Se estiver gravando vários animais do mesmo sexo, coloque ambos simultaneamente. - Feche o recinto e comece a gravar.
- Grave o comportamento social do grupo continuamente por 10 minutos.
NOTA: A duração da gravação é ajustável. - Verifique se os arquivos de vídeo e áudio são legíveis e sem corrupção antes do pré-processamento.
- Ao final da gravação, remova todos os animais, exceto um.
- Registre animais individuais.
- Grave o rato restante sozinho na arena por 10 minutos.
- Repita gravações individuais para cada um dos ratos restantes.
- Pese cada mouse imediatamente após as gravações individuais.
NOTA: Gravações individuais são usadas para treinar e validar o rastreamento multi-animal. Documente a temperatura dentro do equipamento antes de cada sessão de gravação, pois a temperatura afeta a propagação do som. Repita a sessão de gravação se arquivos de vídeo ou áudio estiverem corrompidos ou incompletos.
4. Pré-processamento de vídeo
- Prepare os arquivos de vídeo.
- Verifique se todas as gravações de vídeo estão armazenadas em um único diretório associado ao experimento.
- Ajuste a intensidade do vídeo para o monitoramento.
- Se necessário, aplique um ajuste uniforme de brilho a todos os quadros de vídeo adicionando um valor constante (brightness_adjustment x 255) a cada pixel, onde brightness_adjustment é um escalar tipicamente variando de 0,1 a 0,6, dependendo das condições de iluminação.
- Se necessário, aplique um ajuste global de contraste usando remapeamento de intensidade (por exemplo, função de ajuste do MATLAB) com uma faixa de entrada definida (por exemplo, [0,2, 0,8]), que mapeia intensidades de pixels em 20% do máximo para preto e 80% do máximo para branco, escalando linearmente valores intermediários. Essa etapa é feita para aumentar a separação entre as marcas de identificação de cor clara e o fundo.
- Corte as intensidades dos pixels para a faixa válida para a profundidade de bits do vídeo (ou seja, de 0 a 255 para vídeo de 8 bits).
NOTA: Parâmetros idênticos de pré-processamento devem ser aplicados a todos os quadros dentro de uma gravação e entre as gravações para garantir consistência. Esses ajustes são opcionais e dependem das condições de gravação. Para os dados representativos apresentados aqui, nenhum ajuste de brilho ou contraste foi aplicado. Quando ajustes forem necessários, os usuários devem pré-visualizar o primeiro quadro processado para confirmar o contraste adequado entre os animais e a arena antes de processar todo o vídeo.
- Exporte os vídeos pré-processados.
- Salve os arquivos de vídeo pré-processados usando a mesma taxa de quadros e alinhamento temporal das gravações originais.
- Mantenha os arquivos de vídeo originais para referência e verificação.
NOTA: Scripts usados para pré-processamento de vídeo e os valores específicos dos parâmetros aplicados estão disponíveis no repositório de código associado.
5. Rastreamento multi-animal
- Prepare o software de rastreamento e os dados.
- Instale um software de rastreamento multi-animal e todas as dependências necessárias. Este estudo utilizou MOuse TRacker (MoTR; Tabela 1) porque o formato de saída é compatível com o Muse (Tabela 1), outro software em nosso pipeline usado para cálculos de localização de fontessonoras 21.
NOTA: Outros softwares automatizados de rastreamento, como Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 ouDeepLabCut 23, poderiam ser usados para rastrear animais, desde que a posição do animal, a direção do rumo e a posição do nariz sejam geradas. - Organize arquivos de vídeo pré-processados para que gravações de um único animal e de múltiplos animais fiquem claramente separadas.
- Verifique se todos os arquivos de vídeo têm taxas de quadros e resoluções espaciais consistentes.
NOTA: Instruções de instalação de software e requisitos de dependência são fornecidos no repositório de código associado.
- Instale um software de rastreamento multi-animal e todas as dependências necessárias. Este estudo utilizou MOuse TRacker (MoTR; Tabela 1) porque o formato de saída é compatível com o Muse (Tabela 1), outro software em nosso pipeline usado para cálculos de localização de fontessonoras 21.
- Treine os modelos de um único animal.
- Selecione gravações de um único animal correspondentes a cada sujeito experimental.
- Treine um classificador de identidade separado para cada animal usando características extraídas da gravação de um único animal daquele animal. Durante as gravações em grupo, essas saídas de classificador por animal são combinadas com informações de trajetória entre os quadros para manter a identidade animal.
- Verifique se o treinamento foi concluído com sucesso antes de prosseguir.
NOTA: Gravações de um único animal são usadas para inicializar o rastreamento específico de identidade em sessões com múltiplos animais.
- Gravar gravações com múltiplos animais.
- Aplique o modelo de rastreamento treinado a gravações de interação social com múltiplos animais.
- Gerar estimativas quadro a quadro da posição, orientação e formato corporal dos animais para cada sujeito.
- Salve as saídas de rastreamento para análises posteriores.
6. Segmentação acústica
- Prepare os dados de áudio.
- Verifique se todas as gravações de áudio dos canais individuais de microfone estão presentes e acessíveis.
- Detectar vocalizações.
- Execute o software de segmentação acústica, Ax (Tabela 1), em cada gravação para detectar USVs.
- Configure parâmetros de tempo-frequência definidos em um arquivo de entrada considerado pelo Ax. A frequência de amostragem do microfone foi ajustada para 250 kHz.
NOTA: Três tamanhos de janela para a Transformada de Fourier Rápida Não Uniforme foram considerados, incluindo 64, 128 e 256 amostras. Foi aplicado um produto tempo-largura de banda multi-taper de 3 com 5 tapers, juntamente com um limiar de significância de 0,05. Foi usada uma duração mínima de 0 amostras, com corte de baixa frequência de 30 kHz e corte de alta frequência de 110 kHz. O tamanho da convolução foi definido para cobrir 1001 Hz por 0,001 s. Uma bandeira foi incluída para fundir sinais harmonicamente relacionados. Para detalhes específicos, veja Neunuebel et al.7. - Extraia os candidatos a USVs com base nessas características tempo-frequência.
- Salve as saídas de segmentação como uma planilha para cada gravação.
NOTA: Instruções de instalação de software, scripts e configurações de parâmetros são fornecidos no repositório de códigoassociado 7.
- Compile as saídas de segmentação.
- Gerar uma lista consolidada dos eventos de vocalização detectados contendo tempos de início, tempos de deslocamento e limites de frequência.
- Salve arquivos de vocalização consolidados para análises de localização a jusante.
7. Localização de fontes sonoras
- Prepare as entradas para localização.
- Confirme se as saídas de segmentação acústica e os resultados de rastreamento multi-animal estão disponíveis para cada gravação.
- Organize as entradas de localização para que dados de áudio, dados de rastreamento e informações da geometria da arena fiquem acessíveis ao software de localização.
NOTA: Scripts usados para organizar arquivos de entrada, definir estruturas de diretórios necessárias e coletar informações sobre geometria da arena são fornecidos no repositório de código associado.
- Estime as localizações das fontes sonoras.
- Aplique o algoritmo de localização da fonte sonora, MUSE (Tabela 1), a cada vocalizaçãodetectada 7.
- Usando gravações de microfones, estima a origem espacial de cada vocalização dentro da arena.
- Para cada vocalização, estima a localização da fonte sonora usando reamostragem jackknife, repetindo o procedimento de localização oito vezes, omitindo cada vez um microfone para que cada estimativa seja baseada nos sete microfones restantes. Isso gera oito estimativas por vocalização.
NOTA: Diferenças no tempo de chegada entre microfones são críticas para estimar a localização da fonte sonora. A reamostragem jackknife é usada para avaliar a confiabilidade da localização e reduzir a sensibilidade a canais individuais de microfone. Scripts usados para estimar a localização da fonte sonora são fornecidos no repositório de códigoassociado 7.
- Calcule as distribuições de probabilidade de localização da fonte sonora.
- Para cada vocalização, calcule uma matriz decovariância 24 e use essa e as estimativas médias de pontos jackknife para calcular a densidade de probabilidade no chão da arena.
- Integre localização com posições de animais.
- Extraia as posições rastreadas da cabeça ou do nariz de todos os animais no momento de cada vocalização.
- Para cada vocalização, avalie a densidade de probabilidade de localização na localização do nariz de cada animal.
- Para cada vocalização, calcule uma métrica de confiança de atribuição para cada animal com base nos valores de probabilidade. A métrica de confiança da atribuição é calculada para cada animal como o valor de densidade no nariz daquele animal dividido pela soma dos valores de densidade de todos os animais. Chamamos essa métrica de índice de probabilidade do mouse (MPI)15.
- Atribua vocalizações.
- Se a métrica de confiança de atribuição para um único mouse exceder 0,95, o sinal é atribuído aesse mouse 7,15.
- Rotule vocalizações que não atendem aos critérios de atribuição como não atribuídas.
- Salve as saídas de localização e atribuição para validação e análise posteriores.
NOTA: Limiares de atribuição, critérios de confiança e código são fornecidos nos scripts de análise associados.
8. Validação dos resultados
- Valide o rastreamento multi-animal.
- Carregue as saídas de rastreamento finalizadas para cada gravação.
- Sobrepor as posições dos animais e o formato do corpo nos quadros de vídeo correspondentes.
- Inspecione visualmente os resultados do rastreamento para confirmar a posição precisa do mouse e a atribuição consistente de identidade entre os quadros.
NOTA: Os resultados de rastreamento incluem elipses codificadas por cores indicando a direção da cabeça sobrepostas em cada mouse em cada quadro de vídeo. O tamanho da elipse e a orientação do corpo devem corresponder ao tamanho e à orientação do mouse, respectivamente, em cada quadro. A cor da elipse deve ser consistente para cada mouse durante a gravação. - Identificar e corrigir erros de rastreamento.
Salve os resultados de rastreamento corrigidos para análises posteriores.
NOTA: Erros comuns de rastreamento ocorrem durante interações sociais próximas ou próximos aos limites da arena. Corrija todos os casos de inversões cabeça-cauda, trocas de identidade e saltos e derrapagens de elipse.
NOTA: Programas para visualizar a saída de rastreamento e corrigir erros são fornecidos no repositório de código.
- Valide a extração da vocalização.
- Carregue as saídas de segmentação acústica para cada gravação.
- Gerar espectrogramas a partir de dados de áudio bruto para janelas de tempo representativas.
- Sobrepõe eventos de vocalização detectados, incluindo intervalos individuais de tempo e frequência de vocalização, sobre espectrogramas.
- Confirme visualmente a correspondência entre eventos detectados e vocalizações observadas nos espectrogramas.
- Se forem observados erros sistemáticos, ajuste os parâmetros de segmentação antes de reexecutar as etapas de extração e localização, ou ajuste manualmente qualquer caso de erro de segmentação (ou seja, erro de identificação do tempo ou faixa de frequência da vocalização).
- Valide a tarefa de vocalização.
- Carregar a localização da fonte sonora e as saídas de atribuição.
- Para cada vocalização, visualize estimativas de localização, distribuições espaciais de probabilidade e posições dos animais sobrepostas aos quadros de vídeo.
- Confirme que as densidades de probabilidade de localização estão centradas próximas à cabeça do animal designado e claramente separadas dos outros animais.
- Verifique se as vocalizações que não falharem aos critérios da tarefa estão rotuladas como não atribuídas.
NOTA: As verificações para a saída da atribuição incluem a verificação de que todas as saídas esperadas foram geradas e que o mapa de probabilidade para cada vocalização está localizado dentro dos limites da arena e ao redor do mouse atribuído à vocalização. - Salve os resultados validados da atribuição para análises posteriores.
NOTA: Limiares de confiança na atribuição e critérios de validação são definidos nos scripts de análise associados.
9. Análises de dados
- Visualize a localização da fonte sonora.
- Para sessões de gravação de um ou múltiplos animais, selecione quadros de vídeo durante os quais as vocalizações foram detectadas.
- Gerar representações esquematizadas dos quadros de vídeo selecionados.
- Gerar um esquema espacial a partir da saída do MUSE traçando as posições de todos os microfones, as estimativas individuais dos pontos da fonte sonora, a localização estimada da fonte sonora, a distribuição de probabilidade espacial, a(s) posição(ões) do mouse(s), a identidade do vocalizador inferida e uma barra de escala.
- Gerar espectrogramas da vocalização correspondente conforme registrado por cada canal de microfone.
NOTA: Essas visualizações são úteis para avaliar qualitativamente o desempenho da localização tanto em contextos individuais quanto em grupo.
- Quantifique o erro de localização e a precisão.
- Calcule a distância entre a localização estimada da fonte sonora e a posição do animal gravado para quantificar o erro de localização. Use gravações de um único mouse para esses cálculos, pois há apenas um emissor e a fonte é conhecida.
- Para avaliar a precisão da tarefa, transforme estimativas da fonte sonora e as posições correspondentes dos animais em um referencial centrado no animal vocalizando.
- Visualize a distribuição espacial das estimativas da fonte sonora em relação à posição do animal centralizado.
- Gerar espectrogramas para visualizar vocalizações.
- Identifique episódios de vocalização de interesse usando saídas de extração vocal contendo a identidade do vocalizador, tempos de início e deslocamento da vocalização, e limites de frequência alta e baixa.
- Selecione janelas de tempo que vão desde antes do início da primeira vocalização até depois do deslocamento da última vocalização em cada combate.
- Extraia as trilhas de tensão dos arquivos de canais de áudio para as janelas de tempo selecionadas.
- Gerar espectrogramas transformando os traços de tensão extraídos do domínio do tempo para o domínio da frequência.
- Marque os pontos de tempo correspondentes às vocalizações atribuídas e não atribuídas usando cores distintas no espectrograma.
- Para sessões de interação social, identifique episódios de vocalização produzidos por diferentes indivíduos e gere espectrogramas com identidades de vocalizadores indicadas usando cores específicas de cada identidade.
- Quantifique a saída vocal por indivíduo.
- Use a saída do código de localização da fonte sonora para atribuir a cada vocalização um rótulo de identidade, de modo que as identidades dos animais não localizadas, localizadas, mas não atribuídas, e individuais sejam codificadas numericamente.
- Soma o número de vocalizações produzidas por cada animal individual.
- Compare as contagens de vocalização entre indivíduos e entre sexos.
- Analise as características vocais.
- Extraia os contornos de frequência para cada vocalização.
- Quantifique parâmetros vocais como frequência máxima, frequência mínima, frequência média, largura de banda e duração da vocalização.
- Compare os parâmetros vocais entre os sexos.
- Realize análises estatísticas apropriadas com base nas propriedades distributivas dos dados.
NOTA: Selecione métodos estatísticos para corresponder às propriedades paramétricas das variáveis medidas. Aqui, o número de sujeitos é muito baixo para comparações estatísticas.
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Resultados
Os resultados apresentados neste artigo são de gravações realizadas ao longo de 2 dias e têm a intenção de ilustrar o resultado do protocolo, originalmente publicado em Warren et al.15. Esses dados não têm a intenção de apoiar inferências estatísticas ou conclusões generalizadas.
Extração e atribuição dos USVs
Os USVs eram gravados durante sessões de interação social tanto individuais quanto em grupo, utilizando o si...
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Discussão
A atribuição confiável de VSUs a animais individuais durante interações em grupo tem sido uma grande limitação técnica no estudo da comunicação vocal de camundongos. Embora camundongos sejam amplamente usados para estudar a comunicação social, a incapacidade de atribuir vocalizações a indivíduos específicos limitou a análise quantitativa do comportamento vocal em ambientes sociais naturalistas. Um método que permita o rastreamento vocalizado específico de animais durante interações socia...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos à equipe do Centro de Pesquisa de Vida e Ciências da Universidade de Delaware pelo cuidado animal, a Jim Farmer e Jamie Quesenberry pela ajuda na construção dos equipamentos laboratoriais, e ao Grupo de Computação de Alto Desempenho da Universidade de Delaware pelo apoio na manutenção do cluster de computação. Agradecemos a Andre Yichong Ma pela ajuda na coleta de dados. O trabalho foi financiado pelo NIH, com os números de subvenção R01MH122752 e T32GM142603.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alpha-Dri Bedding | Shepherd Specialty Papers | ALPHA-dri | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Extrusão de Alumínio | 8020 | Construído sob medida para combinar com a arena de gravação | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| BNC-2110 | National Instruments | 777643-01 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Painel de Acrílico Transparente | Home Depot | MC-24 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| CM16/CMPA40-5V | Avisoft | 40014 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Computador | Hewlett–Packard | Z620 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Grasshopper 3 | FLIR | GS3-U3-41C6M-C | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Luzes IR | GANZ | IR-LT30 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| NI PXIe-1073 | National Instruments | 781161-01 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| NI PXIe-6356 | National Instruments | 781053-01 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Nice ‘N Easy, Born Blonde Maxi | Clairol | 2523721 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Malha de nylon para paredes de gaiola | McMaster-Carr | 9318T25 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Cabo de Energia | National Instruments | 763000-01 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| SCHC68-68-EPM | National Instruments | 192061-02 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
| Espuma Sonex | Pinta Acoustic | VLW-35 | Necessário para o sistema de localização de fonte sonora |
Referências
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