Uma plataforma web para quantificação automatizada baseada em imagens de ilhéus pancreáticos isolados de humanos e roedores

Resumo

Este protocolo descreve amostragem, coloração, aquisição de imagens e quantificação automatizada baseada na web de ilhéus pancreáticos humanos e roedores isolados, utilizando análise de imagens assistida por aprendizado profundo e controle de qualidade visual.

Resumo

O objetivo desta publicação é fornecer um protocolo passo a passo escrito e em vídeo em ação real para uso padronizado do IsletNet, uma plataforma web para quantificação automatizada de ilhéus pancreáticos isolados em imagens, desde amostragem e aquisição de imagens até upload de imagens, validação visual e geração automática de relatórios. A plataforma foi desenvolvida para avaliação padronizada e automatizada de imagens microscópicas bidimensionais de ilhéus pancreáticos isolados, a fim de apoiar fluxos de trabalho clínicos e experimentais de isolamento de ilhéus. A segmentação de imagens baseada em aprendizado profundo é usada para identificar ilhotas e tecidos exocrinos dos quais os contornos são extraídos para análise de imagens. Algoritmos computacionais subsequentemente quantificam a contagem, volume e pureza dos ilhéus. A ferramenta visual de Controle de Qualidade suporta validação especializada de análises automáticas de imagens, permitindo que os usuários aceitem, corrijam manualmente ou excluam imagens inválidas. O módulo Clinical Islet Isolation suporta análise lotada por frações de pureza e gera relatórios automáticos em PDF juntamente com imagens e arquivos de dados tabulares para download para registro e análise. O módulo de Comparação Simples compara estimativas automatizadas com resultados de referência obtidos localmente enviados junto com as imagens amostrais correspondentes para avaliar a adequação das imagens padronizadas localmente para análise automatizada. O protocolo também delineia recomendações para retreinamento usando imagens padronizadas geradas localmente quando necessário. Dados representativos de isolamentos de ilhotas de roedores e humanos, incluindo exemplos desafiadores, demonstram melhora no desempenho da análise automatizada após treinamento adequado.

Introdução

O transplante de ilhéus pancreáticos isolados em receptores diabéticos reduz ou elimina a necessidade de administração externa de insulina¹. O processo de isolamento de ilhéus de doadores cadavéricos ou vivos está sujeito a heterogeneidade biológica e procedimental, refletida em variações de rendimento e qualidade. O volume total de ilhotas representa a principal entrada para a determinação da dose e a tomada de decisões clínicas sobre adequação ao^{transplante 2}. O histograma do tamanho das ilhotas e o número do índice das ilhotas explicam as diferenças na eficácia relacionada ao tamanho³. Portanto, atenção é dada a ilhotas individuais além do volume total, que atualmente serve como um marcador substituto para o conteúdo das células beta. Ilhotas humanas isoladas são menos densas que as de roedores e frequentemente não estão bem separadas do tecido exócrino. Consequentemente, são mais difíceis de distinguir a menos que sejam tingidos. Foi adotado um método rápido e simples de coloração com zinco usando ditilona, no qual luz vermelha intensa é refletida pelos grânulos de insulina enriquecidos^{com zinco 4}. Dada a opacidade do tecido, apenas a luz refletida pela superfície é coletada, permitindo o uso de instrumentos simples de microscopia estereoscópica ou invertida equipados com uma fonte de luz e uma câmera.

Diversas tentativas foram feitas para reduzir a variação entre laboratórios empregando ferramentas digitais de análise^{de imagem} 5,6,7,8,9,10,11,12, porém, essas abordagens apresentam várias limitações. Nesses métodos, a segmentação de ilhotas e tecidos exocrinos depende do limiar manual, que é propenso a erros^subjetivos 5,6,7,8,9,10, ou utiliza abordagens totalmente automatizadas^{de segmentação 11,12}. Além disso, a instalação local de software é frequentemente exigida 5,6,7,8,9,10,11 e pode ser restrita a hardware ^{específico 10,11}, limitando a acessibilidade geral e a padronização.

O objetivo geral da presente publicação é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para quantificação automatizada de ilhéus pancreáticos isolados em imagens, utilizando uma plataforma de aprendizado profundo baseada na web com supervisão de especialistas humanos. O IsletNet aborda limitações associadas tanto à disponibilidade quanto à confiabilidade da análise de imagens de ilhots. Neste artigo, apresentamos diretrizes recomendadas para amostragem de enxertos de ilhéus, geração de imagens microscópicas adequadas e uso adequado das ferramentas IsletNet . O protocolo introduz o conceito de supervisão humana de resultados gerados automaticamente e apresenta fluxos de trabalho para usuários potenciais e estabelecidos (Figura 1). A ferramenta Simple Comparison permite que usuários potenciais comparem os resultados do IsletNet diretamente com métodos de referência obtidos localmente (Figura 1A). Como imagens padronizadas geradas localmente podem diferir substancialmente entre os centros, o IsletNet pode exigir retreinamento antes que uma análise confiável possa ser realizada (Figura 1B). Para facilitar esse processo, são fornecidas recomendações para coloração padronizada e aquisição de imagens. Para usuários estabelecidos, a ferramenta Clinical Islet Isolation foi projetada para suportar o fluxo de trabalho de isolamento humano de ilhotes (Figura 1C). Relatórios para download, juntamente com tabelas adicionais e visualizações geradas pelo IsletNet , são descritos na Tabela 1, enquanto os principais parâmetros calculados são resumidos na Tabela 2.

Figura 1: Fluxo de trabalho para usuários potenciais e estabelecidos da plataforma. (A) Fluxo de trabalho de validação local usando o módulo Simple Comparison. (B) Retraining requer um conjunto representando imagens localmente padronizadas. (C) Fluxo de trabalho de uso rotineiro usando o módulo de Isolamento de Ilhotas Clínicas. As etapas principais do fluxo de trabalho são resumidas para upload de imagens, análise, controle de qualidade visual (vQC) e geração de relatórios. Barras de balança não são aplicáveis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Arquivos de resultados para download gerados pela plataforma. Lista de arquivos de saída para download gerados pelas ferramentas Clinical Islet Isolation e Simple Comparison, agrupados por formato de arquivo e categoria de saída. A tabela inclui arquivos de relatório, saídas de imagens segmentadas, arquivos de visualização e exportações de planilhas para análise de contagem, volume, pureza e histogramas de ilhotes. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Parâmetros-chave incluídos em relatórios e saídas de planilhas para download. Lista detalhada de metadados, configurações definidas pelo usuário e parâmetros de análise quantitativa incluídos em arquivos XLSX e CSV para download gerados pelas ferramentas Clinical Islet Isolation e Simple Comparison. Os parâmetros incluem metadados de sessão, configurações de aquisição de imagens e métricas de quantificação de ilhotas para imagens e ilhotas individuais. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Protocolo

Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Ministério da Saúde da República Tcheca (Aprovação nº 49/2023) de acordo com a Diretiva 86/609/CEE do Conselho das Comunidades Europeias. Os procedimentos de isolamento e uso de ilhotas humanas foram aprovados pelo Instituto Estadual de Controle de Drogas (Aprovação nº sukls111286/2023). Imagens microscópicas padronizadas de preparações de ilhotas de ratos e humanos foram analisadas usando as ferramentas Simple Comparison e Clinical Islet Isolation para comparar a análise automatizada com a contagem manual. A tabela de conversão padrão (curta)¹³ era usada tanto para cálculos manuais quanto automáticos equivalentes a ilhots.

1. Supervisão Humana

1. Visão Inicial dos Resultados Primários (Figura 2)
   1. Aguarde os valores gerados automaticamente para contagem de ilhotes, volume e pureza, juntamente com a visualização gráfica das anotações automáticas correspondentes (por exemplo, contornos ou segmentações), aparecerem na janela de Resultados do Batch.
   2. Veja os resultados resumidos da imagem de amostra atual no painel de informações à esquerda (Figura 2A).
   3. Veja os valores replicados (Figura 2B) e as médias em lote (Figura 2C) na tabela à direita.
   4. Navegue na pré-visualização da imagem (Figura 2D, E) usando os links (Figura 2F). Clique com o botão direito na pré-visualização da imagem e siga o menu pop-up para baixar uma única imagem, se necessário.
   5. Navegue por imagens de exemplo usando as setas de navegação (Figura 2G) ou selecione diretamente da tabela.
   6. Abra a janela de Inspeção clicando dentro da pré-visualização atual da imagem (Figura 2D) para avaliar a qualidade dos contornos gerados automaticamente e validar os resultados.
2. Controle de Qualidade Visual
   1. Mova-se ao redor da imagem e faça zoom (Figura 3A) para dentro ou para fora para inspecionar os contornos em busca de possíveis erros.
   2. Alterne entre o Contorno (apenas ilhéus contados têm), imagem original e visualizações adicionais.
      NOTA: As visualizações disponíveis estão listadas na Lenda do lado direito da janela (Figura 3B) e podem ser acessadas usando os atalhos de teclado ou os links na barra de navegação superior (Figura 3C; Tabela 3).
   3. Prossiga para a próxima imagem pressionando a seta para baixo se os contornos forem aceitáveis (Tabela 3).
   4. Corrija erros de contorno manualmente sempre que possível. Se permanecerem ilhéus não detectados, parcialmente detectados ou espúrios, classifique a imagem como inválida e exclua-a da análise.
      NOTA: Imagens excluídas são marcadas na janela de Resultados em Lote (Figura 2J) e em todos os arquivos baixados.
3. Erros Corrigíveis: Ilhéus Adjacentes Não Separados
   1. Separe ilhotas adjacentes manualmente quando necessário.
   2. Clique com o botão esquerdo fora dos ilhotes para iniciar uma linha de separação (Figura 3D).
   3. Adicione cliques esquerdos intermediários para guiar a linha de separação entre ilhotas adjacentes (Figura 3E).
   4. Clique com o botão direito fora dos ilhotes para completar a linha de separação (Figura 3F).
   5. Submeta a linha de separação para atualizar o resultado (Figura 3G).
      NOTA: Ative ou desative a visualização das linhas de separação adicionadas conforme necessário (Figura 3H).
4. Erros Corrigíveis: Ilhéus Espúrios
   1. Use a ferramenta de separação para dividir uma ilhéu espúria em vários objetos menores que o limite de tamanho da ilhéu.
   2. Evite contar pequenos fragmentos de ilhotas definindo o limite mínimo pré-definido de tamanho de ilhéu (convencionalmente 50 μm). Ajuste o limiar conforme a prática laboratorial local, se necessário.
   3. Clique com o botão direito em qualquer ponto da linha e selecione a opção apropriada no menu pop-up para remover uma ou todas as linhas de separação adicionadas manualmente (Figura 3I).
5. Erros Incorrigíveis: Ilhotas Faltantes, Parcialmente Segmentadas ou Espúrias
   1. Alterne a visualização de Segmentação para verificar se os ilhéus foram detectados.
   2. Exclua do cálculo da média em lote qualquer imagem inválida contendo ilhéus não detectados, parcialmente detectados ou múltiplos espúrios (Figura 3J).
6. Erros Incorrigíveis: Objetos Mal Classificados
   1. Exclua a imagem da avaliação se tecido exócrino, artefatos de fundo ou bolhas forem classificados incorretamente como ilhotas (Figura 3J).

Figura 2. Janela de resultados de lote. (A) Resumo atual do resultado da amostra. (B) Resultados para imagens de amostra replicadas. (C) Valores médios em lote apenas de imagens aceitas. (Ré, Mi, Fá) Prévias gráficas de resultados com links. (G) Exemplos de flechas de navegação. (H, I, J) Imagens modificadas, aceitas e excluídas. (K) Barra de navegação superior do IsletNet . (L, M) Cabeçalho e rodapé da janela de resultados do lote. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Janela de inspeção para vQC e correção manual de contorno. (A) Exibição de zoom da imagem. (B) Dicas de lenda e navegação. (C) Barra de navegação superior da janela de Inspeção. (D–G) Construção e submissão de uma linha de separação manual para ilhotas adjacentes. (H) Interruptor para exibir ou esconder linhas de separação manual. (I) Remoção das linhas manuais de separação. (J) Alternar para excluir uma imagem das estatísticas. As barras de escala não são mostradas nesta visualização de interface. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 3: Modos de visualização, atalhos de teclado e controles de navegação disponíveis na janela de Inspeção. Resumo dos modos de visualização de imagem, atalhos de teclado e funções de navegação disponíveis durante o vQC e revisão manual dos resultados da segmentação na janela de Inspeção. A tabela inclui sobreposições de contorno, displays de segmentação, visualização de histogramas e controles de navegação de imagens usados nas ferramentas Clinical Islet Isolation e Simple Comparison. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

2. Navegando pela Plataforma

1. Versão de visualização e informações técnicas
   1. Revise a versão atual do software e a data de treinamento mais recente exibida na barra de navegação superior (Figura 2K).
   2. Abra a seção Início para acessar a descrição técnica e as informações de referência associadas.
2. Avaliação Preliminar das Imagens Locais
   1. Determine se imagens padronizadas geradas localmente já podem ser analisadas corretamente pela plataforma, com base nos critérios de erro descritos nas Etapas 1.2.4 e 1.5.2, ou se é necessário retreinar imagens padronizadas locais (Figuras 1A e 1B).

3. Comparação simples e treinamento externo com imagens locais

1. Comparação simples
   NOTA: Use a ferramenta Simple Comparison para comparar resultados de análise automatizada com um método de referência localmente estabelecido, tipicamente a contagem manual^{padrão 13}, tabelas^{alternativas 7,11,18} ou^{modelos 5,6}. Envie imagens padronizadas geradas localmente junto com os valores de referência correspondentes e o tipo de método de referência. O resultado inclui tabelas para download, imagens e relatórios em PDF (Tabela 1).
   1. Abra o painel de Comparação Simples na barra de navegação superior (Figuras 4A e 4B).
   2. Revise a seção de Dicas para as propriedades necessárias da imagem (Figura 4C).
   3. Baixe o modelo de form.xlsx (Figura 4D).
   4. Conte ilhotas em múltiplas amostras usando um método de referência localmente estabelecido.
   5. Adquira imagens microscópicas padronizadas correspondentes às amostras contadas.
   6. Certifique-se de que todos os ilhotes contados estejam totalmente incluídos no quadro da imagem.
   7. Insira os nomes exatos dos arquivos de imagem e os valores correspondentes dos parâmetros no modelo de form.xlsx usando pontos decimais em inglês (Figura 4E).
   8. Faça upload da planilha completa e dos arquivos de imagem correspondentes arrastando e solte ou usando os botões de upload (Figura 4F).
   9. Selecione a tabela de conversão ou modelo usado para estimar o volume de ilhotas (Figura 4G).
   10. Clique em Enviar lote para gerar a comparação lado a lado.
   11. Espere os resultados da análise aparecerem.
   12. Abra a janela de Inspeção para realizar a validação visual dos contornos.
   13. Exclua imagens da análise se os contornos estiverem incorretos (Figura 3J).
       NOTA: A edição manual de contornos não está disponível na ferramenta Comparação Simples.
   14. Baixe os resultados como tabelas, imagens e relatórios em PDF (Tabela 1).
2. Treinamento IsletNet para imagens localmente padronizadas
   1. Entre em contato com a equipe de desenvolvimento do Instituto de Medicina Experimental (IKEM) no info@isletnet.com.
   2. Compartilhe imagens representativas que cobrem a variedade de qualidade de imagem atualmente obtida localmente.
   3. Discuta os requisitos de qualidade de imagem com a equipe de desenvolvimento.
      NOTA: Os principais parâmetros de qualidade de imagem incluem contraste suficiente, inclusão completa de ilhotes dentro do quadro da imagem e sobreposição mínima entre ilhotas adjacentes. A coloração das ilhotas pode variar de vermelho a rosa ou violeta, desde que a distinção do tecido exocrino permaneça clara.
   4. Crie um conjunto de imagens de treinamento cobrindo a gama esperada de purezas, ampliações e variações de cor em ilhots.

Figura 4. Ferramenta simples de comparação, painel e fluxo de trabalho. (A) Barra de navegação superior. (B) Painel de comparação simples. (C) Enviar dicas e instruções. (D, E) form.xlsx modelo download e visualização de parâmetros enviados. (F) Área de upload por arrastar e soltar para imagens e planilhas. (G) Selecionar a conversão tamanho para volume do ilhéu. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Amostragem

NOTA: Ilhéus sedimentam rápida e diferencialmente de acordo com o tamanho e o formato, o que pode influenciar os resultados da amostragem.

ATENÇÃO: Realize todos os procedimentos de manuseio de ilhotas dentro de um capuz de fluxo laminar, usando o equipamento de proteção individual adequado.

1. Use tubos de 50 mL ou 250 mL para a suspensão do ilhéu.
2. Determine a fração de amostragem necessária de acordo com o volume e a pureza observados do pellet usando procedimentos operacionais padrão locais.
3. Misture cuidadosamente a suspensão do ilhéu, invertendo suavemente o tubo cinco vezes imediatamente antes da coleta da amostra.
4. Retire a amostra imediatamente usando uma ponta de pipeta de grande calibre para evitar obstrução por tecido exocrino e minimizar danos nas ilhas.

5. Otimização da Aquisição de Imagens de Ilhotas

1. Preparação de Ditizona
   NOTA: É necessária uma coloração consistente com ditizona para garantir contraste suficiente entre ilhotas e tecido exocrino. Dois métodos de preparação comumente usados são descritos abaixo.
   ATENÇÃO: A ditizona é uma toxina reprodutiva suspeita. O dimetil sulfóxido (DMSO) é tóxico e penetrante na pele. O hidróxido de sódio é altamente corrosivo e pode causar queimaduras químicas graves. Manuseie todos os produtos químicos usando o equipamento de proteção individual adequado, evite contato com a pele e descarte resíduos de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.
   1. Resuspensão em DMSO¹³
      1. Peso 50 mg de pó de ditizona.
      2. Dissolva a ditizona em 5 mL de DMSO.
      3. Incube a solução a 37°C e faça vórtice vigorosamente por 1 minuto a cada 5 minutos até a dissolução estar completa.
      4. Dilua 1 mL da solução original com 20 mL da Solução Salífera Balanceada Hank's contendo 2% de soro fetal bovino para preparar a solução de trabalho.
      5. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
      6. Envolva o tubo em papel alumínio para proteger a solução da luz.
         NOTA: Use a solução de trabalho em aproximadamente 12 horas.
   2. Resuspensão em solução alcoólica alcalina (alternativa à Ref. 8)
      1. Peso 50 mg de pó de ditizona.
         NOTA: Prepare as aliquotas com antecedência, se desejar.
      2. Adicione 800 μL de etanol 70% à ditizona.
      3. Adicione 400 μL de solução de hidróxido de sódio de 1 M e faça um vórtice cuidadosamente até que a dissolução esteja completa.
      4. Dilua a solução com soro salino tamponado com fosfato, contendo 0,2 mg/mL de albumina humana, até um volume final de 20 mL.
      5. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
      6. Envolva o tubo em papel alumínio para proteger a solução da luz.
         NOTA: Use a solução de trabalho em aproximadamente 12 horas.
2. Coloração de Ilhotas
   1. Adicione 25 μL de solução de trabalho de ditizona ao centro de um prato de 35 mm.
   2. Adicione 50 μL de ilhéus suspensos na Solução Salada Balanceada Hank's contendo albumina, Meio Completo de Cultura ou Meio de Transplante.
      NOTA: O volume real da amostra varia entre 20-50 μL, dependendo do pellet de pureza-fração, com uma concentração final de ditizona de 0,85 mg/mL a 1,37 mg/mL.
   3. Pipete a suspensão para dentro e para fora três vezes usando o primeiro batente lentamente para misturar as soluções suavemente, evitando a formação de bolhas.
   4. Incube a amostra entre 20°C e 25°C por 1–2 minutos enquanto monitora visualmente a coloração ao microscópio até que as ilhéusas fiquem vermelhas brilhantes. Algumas preparações podem conter ilhotas mal manchadas, para as quais o IsletNet também é treinado.
   5. Use uma seringa de 10 mL para injetar rapidamente 4 mL de soro salino tamponado com fosfato, suplementado com 0,2 mg/mL de albumina, diretamente na amostra manchada, evitando bolhas e respingos.
   6. Imediatamente gire o prato vigorosamente em um movimento circular para misturar as soluções, movendo as ilhotas para o centro antes de se estabilizar.
      OPÇÃO 1: Adicione cuidadosamente 4 mL de PBS/albumina, deixando as ilhotas em ditizona intactas. Depois, gire suavemente o prato em um movimento circular para misturar as soluções, mantendo as ilhéulas no centro. Espere até o ditizone se dispersar no prato.
      OPÇÃO 2 (adequada para estereomicroscópio): Em vez de diluir os ilhéus, espalhe a gota de ditazona-ilhote em uma camada fina usando uma ponta ou agulha de pipeta, em vez de diluir para reduzir reflexões.
   7. Inspecione a amostra ao microscópio e imediatamente retorne quaisquer ilhotes deslocados ao campo da câmera suavemente, girando a solução ao redor com a ponta de uma pipeta.
   8. Inicie a aquisição da imagem imediatamente para minimizar as alterações de citotoxicidade e volume de ilha.
3. Aquisição de Imagem
   NOTA: Use um microscópio estéreo ou invertido equipado com uma objetiva de baixa ampliação e uma fonte de luz estável. Proteja a antena contra fontes adicionais de luz, como a iluminação do ambiente.
   1. Ligue a fonte de luz e deixe a lâmpada halógena esquentar por 5 minutos.
   2. Defina uma intensidade padronizada de luz para evitar o brilho e a subexposição. O alcance exato depende do hardware de imagem utilizado.
      NOTA: A intensidade ótima da luz pode variar de acordo com a ampliação e a pureza da amostra.
   3. Selecione o objetivo e a configuração de zoom que permitam que todos os ilhéus permaneçam dentro do campo de visão da câmera.
   4. Mantenha a mesma ampliação para todas as amostras dentro de um lote e, de preferência, para todos os lotes de pureza.
   5. Calibre o balanço de branco usando um slide de branco normalizado, se necessário. Se a qualidade da imagem permanecer insatisfatória devido a características únicas da preparação do ilhéu, ajuste os valores RGB e/ou configurações de gama.
   6. Ajuste o tempo de exposição e, se necessário, a intensidade ou ganho de iluminação usando o histograma de cor, evitando a superexposição.
      NOTA: Amostras contendo abundante tecido exocrino podem exigir configurações diferentes de câmera ou iluminação devido à luz refletida do tecido não ilhéu. Para garantir a reprodutibilidade, salve esses parâmetros como um arquivo de configuração separado para referência futura.
   7. Capture a imagem e salve o arquivo em um formato suportado, incluindo JPG, PNG, TIFF ou BMP.
      NOTA: Inclua a data, fração de pureza, ampliação ou tamanho do pixel, e diluição no nome do arquivo para facilitar futuras reanálises (por exemplo, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Adquira uma imagem do micrômetro de palco usando as mesmas configurações de ampliação e zoom usadas para a imagem de amostras.

6. Ferramenta de Isolamento de Ilhotas Clínicas

NOTA: As principais etapas do fluxo de trabalho estão resumidas na Figura 1C. Analise imagens em lotes de fração de pureza à medida que as amostras ficam disponíveis.

1. Definindo o tamanho do pixel
   NOTA: O tamanho calculado do pixel permanece válido apenas quando a imagem do micrômetro de estágio é adquirida usando as mesmas configurações de ampliação e zoom das amostras analisadas.
   1. Abra o painel de Isolamento de Ilhotas Clínicas .
   2. Clique em Upload Micrometer Stage e selecione a imagem do micrômetro stage.
   3. Desenhe os pontos finais da linha vermelha de medição ao longo de uma distância conhecida na régua digital.
      NOTA: Use uma distância de calibração maior sempre que possível para melhorar a precisão da medição.
   4. Insira a distância conhecida em micrômetros (μm).
   5. Envie o tamanho do pixel calculado.
      NOTA: A plataforma mantém o tamanho calculado do pixel até ser modificado manualmente.
2. Upload em lote de imagens de fração de pureza
   NOTA: Use 3–4 amostras replicadas para garantir o cálculo confiável da média do lote e dos valores do desvio padrão. Use a mesma diluição para todas as amostras dentro de um lote.
   1. Arrastar e soltar imagens que representam amostras replicadas da mesma fração de pureza na área de upload.
      NOTA: A plataforma impede o uso repetido da mesma imagem com base no reconhecimento de nome de arquivo.
   2. Modificar o tamanho do pixel, se necessário.
   3. Insira o limite mínimo de tamanho das ilhotas.
   4. Insira o valor da diluição da amostra (por exemplo, 1000).
   5. Insira o volume do pellet em mililitros registrado do frasco original.
   6. Insiram as iniciais do operador.
      NOTA: As iniciais do operador aparecem no relatório gerado.
   7. Insira o ID da Sessão que representa o procedimento de isolamento atual.
   8. Insira o ID do lote (por exemplo, 1 Alta Pureza).
      NOTA: A plataforma ordena frações alfanumericamente de acordo com o ID do Lote.
   9. Clique em Enviar Batch para iniciar a análise.
3. Revise e Finalize os Resultados do Lote
   NOTA: Feche a janela de Resultados do Lote anterior clicando no cabeçalho, se necessário (Figura 2L).
   1. Aguarde os resultados numéricos e gráficos aparecerem na janela de Resultados em Lote.
   2. Abra a janela de Inspeção clicando dois vezes na pré-visualização da imagem na janela de Resultados do Lote.
   3. Revise e, se necessário, corrija os contornos conforme descrito no Passo 1.
   4. Prossiga para a próxima imagem usando a seta para baixo se os contornos forem aceitáveis.
   5. Adicione outro lote ou prossiga para o resumo da sessão usando os botões localizados na parte inferior da janela (Figura 2M).
4. Edição em lote
   NOTA: A plataforma armazena nomes de arquivos de imagem ao longo da sessão para evitar o uso inadvertido e repetido da mesma imagem. Isso inclui imagens removidas. Renomeie as imagens antes de reutilizar, se necessário.
   1. Clique em Editar Batch para adicionar ou remover imagens, corrigir especificações de amostra ou renomear o lote (Figura 2L).
      NOTA: Registre os nomes dos arquivos de imagem antes de modificar o lote se houver reutilização de imagens.
   2. Clique em Remover Batch para deletar o lote completamente (Figura 2L).
5. Visualizando o Resumo e Gerando Relatórios
   1. Clique em Mostrar Resumo para exibir a visão geral da sessão (Figura 2M).
      NOTA: Volte aos lotes anteriores e edite-os se necessário.
   2. Veja o número total de ilhots, volume e valores de volume de pellets para a sessão junto com os valores médios correspondentes do lote.
6. Baixe o relatório.
   NOTA: O relatório breve inclui a contagem total de ilhéus, volume, pureza, valores de pellets, histogramas e resumos de pureza-fração. O relatório completo inclui ainda informações gráficas para cada imagem de amostra, com os valores aceitos exibidos em vermelho e os valores excluídos exibidos em preto.

Resultados

Ilhéus de Rato Puro

No primeiro experimento, foram adquiridas 36 imagens representando 12 amostras contendo um total de 249 ilhéus purificados de ratos durante quatro sessões independentes de imagem. As imagens eram geradas usando um estereomicroscópio sob três condições de iluminação padronizadas, porém distintas, empregando halógenos e fontes de luz de diodo emissor de luz (LED), juntamente com diferentes configurações de câmera. Segmentações de verdade no terreno (GT) foram geradas manualmente para três imagens representativas pelo especialista em treinamento da IsletNet .

Quando as imagens foram analisadas usando a versão pública da ferramenta Simple Comparison, nenhum dos contornos gerados automaticamente passou pelo controle de qualidade visual (vQC, Figura 5F). A plataforma foi posteriormente retreinada usando imagens locais representativas, e todos os contornos gerados pela versão experimental retreinada passaram por vQC (Figura 5C).

A razão entre estimativas automatizadas e manuais do volume das ilhotas demonstrou desempenho consistente nas três condições de imagem após retreinamento, com valores medianos de 1,03, 0,98 e 0,94 para as condições de iluminação A, B e C, respectivamente (Figura 5A). Esses resultados representaram uma melhoria substancial em comparação com o modelo de treinamento original (Figura 5B).

A comparação pixel a pixel com segmentações GT demonstrou uma concordância próxima entre contornos automatizados e gerados manualmente após retreinamento (Figura 5D), correspondendo à colocação precisa dos contornos em imagens representativas (Figura 5C). Em contraste, o modelo de treinamento original mostrou uma proporção aumentada de pixels falsos negativos (Figura 5G) e deslocamento de contorno (Figura 5F), resultando em uma mudança para categorias menores de ilhotas nos histogramas correspondentes de tamanho de ilhotas (Figura 5E vs 5H).

Figura 5. Avaliação do retreinamento de plataforma usando três sistemas de imagem e preparativos para ilhotes de ratos. (A) Comparação das estimativas do IsletNet e do equivalente manual de ilhéus (IEQ) após retreinamento usando três configurações de imagem. (B) Comparação das estimativas de IEQ do IsletNet e manuais usando o modelo original de treinamento público. (C, F) Colocação representativa de contorno usando a ferramenta vQC após e antes de retreinar o modelo, respectivamente. Pontas de seta brancas indicam a colocação correta dos contornos e as pontas magenta indicam colocação incorreta dos contornos. (Ré, Sol) Comparação pixel-wise com a verdade terrestre após retraining e com o modelo de treinamento original, respectivamente. Regiões verdadeiro positivo, falso positivo, falso negativo e verdadeiro negativo são indicadas na legenda. (E, H) Histogramas representativos do tamanho das ilhotas após retreinamento e com o modelo de treinamento original, respectivamente, comparados com contagem manual. Configuração de imagem 1 = iluminação de LED; configuração de imagem 2 = iluminação halógena; configuração de imagem 3 = iluminação em campo escuro com LED. Barras de escala = 100 μm. Os boxplots são mostrados de acordo com a convenção de Tukey; os bigodes se estendem a pontos de dados dentro de 1,5 × intervalo interquartil entre o primeiro e o terceiro quartis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Preparações clínicas para ilhotas humanas

No segundo experimento, 17 imagens representando um único procedimento de isolamento de ilhéu humano com três pares de pureza-fração foram analisadas usando a versão pública da plataforma. Uma amostra foi perdida. Após a vQC, todas as imagens representando frações de pureza média e baixa foram excluídas devido à detecção de ilhotas espúrias (dados não mostrados). A plataforma foi posteriormente retreinada usando imagens locais representativas.

Após o retreinamento, todas as imagens passaram por vQC após a adição de três linhas de separação manuais. A comparação por lotes com contagem manual demonstrou uma subestimação geral de ≤5% para a contagem total de ilhotas e estimativas de volume. Amostras diluídas entre 2.000 e 4.000 vezes continham entre 80 e 4 ilhéus, dependendo da fração de pureza. A contribuição relativa das frações individuais de pureza para a preparação final é mostrada na Figura 6A. A fração de alta pureza 1VC2 contribuiu predominantemente com ilhotas menores em comparação com a fração de pureza média 2SC1. O histograma do tamanho total das ilhotas gerado automaticamente pela plataforma é mostrado na Figura 6B.

Figura 6. Quantificação e análise de amostras de isolamento de ilhotas humanas. (A) Estimativas de contagem e volume equivalente de ilhotas usando métodos IsletNet e contagem manual em frações de pureza do enxerto completo. (B) Histograma do tamanho final da ilhéu gerado pelo IsletNet usando valores médios em lote. (C) Comparação entre estimativas do IsletNet e manuais para contagem e volume em 17 imagens individuais. (D) Detalhe representativo da imagem da amostra 3NC1 mostrando a imagem original e a colocação dos contornos gerada pelo IsletNet reentrenado. (E) Comparação pixelada da segmentação IsletNet com a verdade no terreno gerada pelo especialista em contagem manual versus especialista em treinamento no IsletNet (GT1 vs. GT2). Regiões verdadeiro positivo, falso positivo, falso negativo e verdadeiro negativo são indicadas na legenda. (F) Histograma representativo do tamanho do ilhéu para a mesma imagem comparando resultados do IsletNet e do manual. Pontas de flecha magenta indicam deslocamento de contorno e de categoria de tamanho de ilhéu. Barras de escala = 100 μm. Os boxplots são mostrados de acordo com a convenção de Tukey; os bigodes se estendem a pontos de dados dentro de 1,5 × intervalo interquartil entre o primeiro e o terceiro quartis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Estimativas automatizadas e manuais foram posteriormente comparadas para todas as imagens individuais (Figura 6C). As razões medianas entre estimativas automatizadas e manuais foram de 1,00 para a contagem de ilhotas e 0,93 para o volume de ilhéus, com vários valores aberrantes observados. Em uma amostra representativa de baixa pureza (3NC1), a plataforma identificou o mesmo número de ilhotas que a contagem manual (cinco ilhéus), mas estimou um volume de ilhotas 29% menor. Esses pontos de dados são indicados por pontas de seta na Figura 6C.

A maior ilhéu, parcialmente presa em tecido exocrino, a partir desta imagem representativa é mostrada na Figura 6D, incluindo a imagem original e a sobreposição de contorno gerada automaticamente. A comparação pixel a pixel com segmentações GT geradas independentemente por dois especialistas é mostrada na Figura 6E. Os histogramas correspondentes do tamanho das ilhotas demonstraram uma mudança na distribuição de tamanho entre segmentações manuais e automatizadas (Figura 6F).

Desempenho operacional da análise automatizada

O desempenho operacional das ferramentas de Comparação Simples e Isolamento de Ilhas Clínicas foi avaliado sob condições padrão de internet, com velocidades médias de download e upload de 50 Mbps e 30 Mbps, respectivamente. Cinco lotes de imagens contendo 12 imagens cada foram analisados usando tamanhos de imagem que variavam de arquivos JPEG de 0,5 MB até arquivos TIFF de 20 MB. A duração do download foi medida para pacotes completos de resultados ZIP.

Os tempos de visualização da análise e os durados de download aumentaram progressivamente com o tamanho da imagem para ambas as ferramentas (Tabela 4). A ferramenta Clinical Islet Isolation exigia tempos de processamento mais longos do que a ferramenta Simple Comparison para conjuntos de imagens equivalentes. Esses resultados demonstram a relação prática entre resolução de imagem, formato de arquivo e throughput de análise durante a operação rotineira.

Tabela 4: Tempos de visualização da análise e durações de download para as ferramentas de Isolamento de Ilhotas Clínicas e Comparação Simples. Comparação dos tempos de processamento necessários para visualização de resultados e download de arquivos usando lotes de imagens de diferentes tamanhos e formatos de arquivo. As medições foram obtidas usando lotes contendo 12 imagens e são reportadas como o tempo decorrido desde o envio do lote até a visualização do resultado ou a conclusão do download. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

O protocolo apresentado aqui descreve o fluxo de trabalho prático para usuários potenciais e estabelecidos do IsletNet, com ênfase em dois recursos críticos da plataforma: vQC especializado e retreinamento de redes neurais. Os resultados representativos demonstram que a quantificação automatizada precisa depende não apenas do desempenho da segmentação de imagens, mas também da capacidade do usuário de avaliar criticamente a colocação dos contornos e a adequação da imagem antes de aceitar os resultados. Duas ferramentas avançadas adicionais, Comparação Pixel a Pixel e Minhas Segmentações, foram usadas para gerar resultados selecionados de validação; No entanto, essas ferramentas são destinadas principalmente ao suporte ao treinamento de redes neurais e, portanto, não estão incluídas no fluxo de trabalho do protocolo.

O IsletNet foi desenvolvido como uma ferramenta de referência colaborativa e amplamente acessível para análise padronizada de imagens de ilhotas em laboratórios. A rede neural foi treinada e validada usando segmentações GT anotadas manualmente de imagens microscópicas bidimensionais originais de ilhéus isolados de humanos e ratos^{14, 15 e 16}. Dois modelos separados para preparações tingidas com ditizone, e um modelo adicional de pesquisa para ilhéus de ratos não corados, com acesso disponível mediante solicitação. A versão da plataforma e a data do treinamento são exibidas na interface do usuário. A IsletNet segmenta automaticamente ilhotas e tecidos exocrinos e, posteriormente, calcula o número, volume e pureza dos ilhotes usando o tamanho do pixel definido pelo usuário e o limite mínimo de tamanho do ilhéu. A escolha do limiar de tamanho das ilhotas depende da qualidade da imagem e do propósito da análise (comparação lado a lado com a contagem manual versus estudo de pequenas ilhotas) e não da espécie. Dada a resolução da microscopia convencional, o tamanho mínimo significativo do ilhéu é 50 μm 7,8,9,12, mas pode ser reduzido até 10 μm para imagens obtidas com um instrumento ^{apropriado 10}. As estimativas do volume das ilhotas são geradas usando tabela de conversão padrão baseada em^{esferas 13}, bem como tabelas alternativas^{7, 18, 19}, incluindo as aproximações ajustadas da elipse^{5, 6} e os modelos de Espináculo e Esfíracle^{baseados em contorno 17}. Os valores resultantes são reportados em equivalentes de ilhotas e nanolitros, enquanto a pureza é calculada a partir da área ou do volume estimado do tecido. Um passo crítico no protocolo é a aquisição de imagens microscópicas padronizadas adequadas para segmentação automatizada. O IsletNet foi treinado usando imagens adquiridas com microscópios estereoscópicos e invertidos equipados com uma variedade de câmeras e sistemas de iluminação complementares de óxido metálico. Objetivos de baixa ampliação (1–2×) são vantajosos porque permitem que a amostra completa permaneça dentro do campo de visão, mantendo um tamanho de pixel compatível com a detecção confiável de pequenos ilhéus. Iluminação consistente, balanço de branco estável e prevenção de superexposição da imagem são essenciais para a geração confiável de contornos. Os resultados representativos demonstram que o retreinamento usando imagens locais representativas pode melhorar substancialmente o desempenho da segmentação em condições de imagem heterogêneas. Como orientação prática, imagens são geralmente adequadas para treinamento no IsletNet quando os limites de ilhotas e tecidos exocrinos são claramente distinguíveis para um observador experiente. Imagens contendo ilhotas agrupadas ou fortemente sobrepostas devem ser evitadas sempre que possível.

O protocolo também destaca várias limitações e considerações de solução de problemas associadas à análise automatizada de imagens. Embora o IsletNet aumente substancialmente a taxa de transferência, a objetividade e a reprodutibilidade em comparação com a contagem totalmente manual, o método permanece sensível à qualidade da imagem. A colocação incorreta dos contornos (detecção de ilhotas espúrias e falha em sepa-rate dos ilhotes adjacentes) pode ocorrer ocasionalmente e afetar a quantificação a jusante. Uma verificação de qualidade virtual rotineira continua essencial antes de aceitar resultados automáticos. A aplicação imediata no local no IsletNet é vantajosa porque imagens inadequadas podem ser readquiridas com parâmetros de imagem ajustados. A correção manual dos contornos automáticos é possível dentro da janela de Inspeção, exceto para ilhéus ausentes ou múltiplos ilhéus espúrios. Além disso, o algoritmo de separação automatizada baseia-se em geometria de contorno e estatísticas de distribuição de tamanho de ilhotas e, portanto, pode diferir da interpretação inicial de um especialista individual, permanecendo ainda assim aceitável do ponto de vista analítico.

A confiabilidade do IsletNet é determinada principalmente pela consistência entre a qualidade local da imagem e o conjunto de dados de treinamento, e não apenas pela espécie. Embora o conjunto de treinamento atual contenha ilhotas humanas de variadas puridades e ilhotas de ratos de alta pureza, a plataforma pode ser estendida para outras espécies, desde que as características da imagem permaneçam consistentes com os dados de treinamento. Por exemplo, ilhotas suínas purificadas por cultura podem se assemelhar a ilhotas humanas embutidas presentes no conjunto de dados de treinamento. Em contraste, ilhéus extensivamente cultivados com coloração fraca de ditizona não foram representados durante o treinamento e podem exigir treinamento adicional. A ferramenta Simple Comparison, portanto, suporta uma etapa importante de validação para novos usuários ou novas configurações de imagem. Os resultados apresentados aqui destacam como diferentes interpretações de especialistas sobre ilhotas embutidas podem influenciar a geração de GT e a estimativa de volumes a jusante. Para enfrentar a ausência de amplo consenso de especialistas em futuros estudos multicêntricos, o aplicativo^{IsletSwipe 20} foi desenvolvido para facilitar a anotação de imagens baseada em consenso.

Comparado à contagem manual convencional sob microscópio, o IsletNet oferece um rendimento substancialmente maior, documentação digital permanente e resultados quantitativos padronizados, ao mesmo tempo em que reduz a variabilidade dependente do operador. A contagem manual ainda pode fornecer maior confiança na identificação de tecidos em casos borderline, mas é limitada por estimativas subjetivas de tamanho, menor escalabilidade e extensos requisitos de treinamento de pessoal. Como um serviço baseado na web, o IsletNet possibilita comparabilidade entre laboratórios por meio de análises centralizadas, porém anônimas. A velocidade da análise continua dependendo da largura de banda local da internet, tamanho do arquivo de imagem e complexidade da imagem. Arquivos TIFF maiores podem melhorar a fidelidade da imagem, mas exigem tempos de upload e download mais longos em comparação com imagens JPEG comprimidas.

No geral, os resultados apresentados aqui demonstram que uma quantificação automatizada confiável pode ser alcançada quando a aquisição local de imagens permanece reproduzível e consistente com o conjunto de treinamento. Os usuários são incentivados a incorporar a vQC em sua rotina e considerar reeducação sempre que mudanças substanciais nas condições locais de imagem forem introduzidas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Unsterile
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Para dispensação de suspensão de ilhota antes da coloração
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC grade ou cell culture grade
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Pó
Ethanol, 70%	Fornecedor local	N/A	(v/v) em H2O; para preparação de DTZ
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	Heat-inactivated, qualified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Com ou sem phenol red (especificar com base no ensaio)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	Solução de alta concentração (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Software padrão de aquisição de imagem
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	Objetivos 1.25x e 2x
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	Fonte de luz LED; guia de ganso de 2 braços
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Fonte de luz halógena (14,5 V, 90 W); controle de intensidade manual; guia de ganso de 2 braços
Laboratory essentials	Vários	N/A	Pipetas, tubos, agulhas, seringas, temporizadores de laboratório, EPI padrão
MicroCam software	Bresser	N/A	Software padrão de aquisição de imagem
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	Câmera CMOS, 3,1 MP
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	Tamanho de poro de 0,22 µm, membrana PES
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	Câmera CMOS, 5 MP, alto alcance dinâmico
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Software padrão de aquisição de imagem
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Fornecedor local	N/A	Para ajuste de pH e solubilização durante a preparação de DTZ
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm de comprimento; divisões de 50 µm para calibração
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	Objetivo apocromático 1x