Método Colorimétrico Anthrone para Quantificar o Glicogênio no Fígado e Músculo Esquelético de Rato

Resumo

Este protocolo descreve um método colorimétrico anthrone para quantificar o glicogênio no fígado e no músculo esquelético de rato em diferentes estados metabólicos.

Resumo

O glicogênio é uma importante reserva intracelular de glicose no fígado e no músculo esquelético e desempenha um papel fundamental no metabolismo dos carboidratos. O glicogênio hepático é essencial para preservar a homeostase glicêmica sistêmica, enquanto o glicogênio dos músculos esqueléticos apoia a atividade física e o desempenho dos exercícios. A quantificação precisa do glicogênio tecidual é, portanto, fundamental para estudos nos quais o metabolismo do glicogênio é regulado dinamicamente ou patologicamente alterado. Aqui, descrevemos um método colorimétrico anthrone confiável e sensível para quantificar o teor de glicogênio no fígado e músculo esquelético de ratos. O protocolo consiste em etapas sequenciais, incluindo digestão alcalina, desproteinização, precipitação de glicogênio, lavagem com álcool e desenvolvimento de cor usando reagente anthrone. A aplicabilidade desse método é demonstrada em ratos submetidos a três condições fisiologicamente relevantes: alimentação ad libitum , jejum noturno e realimentação de curto prazo. Esses paradigmas experimentais capturam estados metabólicos-chave associados ao armazenamento, depleção e ressíntese do glicogênio. A análise por blot oeste ortogonal das principais enzimas, glicogênio sintase e glicogênio fosforilase, fornece suporte mecanicista às mudanças metabólicas observadas. A aplicabilidade desse método é ainda demonstrada em animais tratados com epinefrina para modelar a quebra aguda do glicogênio induzida por estresse. Coletivamente, esse método oferece uma ampla faixa dinâmica e sensibilidade suficiente para quantificar o glicogênio tecidual em estados fisiológicos marcadamente diferentes. Ele oferece uma ferramenta confiável para investigar o metabolismo do glicogênio in vivo e também pode ser aplicado a modelos de cultura celular in vitro.

Introdução

O glicogênio é um polissacarídeo altamente ramificado que atua como um importante reservatório de energia no músculo esquelético e no fígado dos mamíferos, e em menor grau em outros órgãos como cérebro, rim, coração e tecido^{adiposo 1}. Durante a alimentação, o excedente de glicose passa por polimerização ou lipogênese de novo , sendo armazenado como glicogênio ou lipídios. No entanto, durante o jejum ou exercício físico, o glicogênio sofre degradação enzimática, garantindo um fornecimento constante e rápido de glicose para suprir as demandas energéticas. Essa capacidade de tamponamento do glicogênio é essencial para manter a homeostase ....

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC; #1905019) da Universidade Médica de Nanjing.

1. Preparação de Reagentes

1. Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes utilizados neste estudo.
2. Prepare todas as soluções antes do início dos experimentos.
3. Ajuste o volume da solução conforme necessário.
4. Prepare 1 M de solução de hidróxido de sódio (NaOH)
   1. Peso 40 g de pellets NaOH.
   2. Adicione os pellets de NaOH a 800 mL de água destilada.
   3. Mexa a solução com uma haste de vi....

Resultados

Níveis de glicogênio muscular hepático e esquelético sob diferentes estados nutricionais

O jejum noturno diminuiu significativamente os níveis de glicose no sangue (média ± erro padrão da média [SEM]) de 7,9 ± 0,4 mM em ratos alimentados ad libitum para 5,4 ± 0,3 mM. Os níveis de glicose no sangue foram restaurados para 8,3 ± 0,1 mM após 2 horas de realimentação (Figura 3D). Consistente com essas mudanças, os níveis de glicogênio hepático.......

Discussão

Neste artigo, descrevemos um método colorimétrico anthrone modificado para quantificar glicogênio em tecidos animais. Além das etapas sequenciais convencionais de colheita de tecidos, digestão alcalina, precipitação de glicogênio, lavagem em álcool e desenvolvimento de cor baseado em anthrone, incorporamos uma etapa de desproteinização para reduzir a interferência de fundo (Figura 1). Em seguida, aplicamos esse método para avaliar alterações no conteúdo de g.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Usado para processamento de amostras e configuração de reação
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Usado para manipulação de lisado e etapas de precipitação
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Buffer para lavagem de membrana em western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Incubação de placa de ensaio BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Usado para digestão de tecido e extração
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Medição de absorbância baseada em placa
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Pesar pós químicos
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagente para detecção colorimétrica de glicogênio
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Detecção de glicogênio sintase 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Detecção de glicogênio sintase 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Detecção de GYS fosforilado
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Detecção de fosforilação da glicogênio fosforilase
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Detecção da glicogênio fosforilase do fígado
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Detecção da glicogênio fosforilase do músculo
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Quantificação de proteína
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Preparação de solução saturada para padrões
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Pinçamento de dedos; dissecação de tecido
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Agente de bloqueio em western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Detecção de sinais de western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Desenvolvimento de sinal em western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Solvente para preparação de reagentes
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Indução da degradação do glicogênio in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Precipitação e lavagem de glicogênio
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Dissecação de tecido
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centrifugação de amostras
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medição da glicemia
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medir o nível de glicose na veia da cauda
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Medir o nível de glicose na veia da cauda
Glucose	Macklin	G6172	Preparação da curva padrão
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Preparação de uma série de padrões de glicogênio
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Detecção de anticorpos primários
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Homogeneização de tecido
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Corante de proteína total para normalização
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Eutanásia animal
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Aquecimento de amostras durante ensaios
Lithium chloride	Macklin	767397	Melhora a precipitação de glicogênio
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Passo de lavagem de glicogênio
Microplate reader	BioTek	ELx800	Medição de absorbância a 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membrana de transferência de proteína
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubação de substrato quimiluminescente
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Transferência de solução
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Remoção de líquido residual
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Preservação da fosforilação de proteínas
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Armazenamento de tecidos coletados
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Prevenção da degradação de proteínas
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Extração de proteína
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Separação de proteína
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Misturar com amostras de proteína antes de carregar nos poços do gel SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Eletroforese SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Eutanásia animal
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Digestão de tecido e extração de glicogênio
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Modelo animal experimental
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Aplicar álcool 75% no pelo animal para umedecer e desinfetar
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Dieta de manutenção para roedores
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Dissecação de tecido
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	Injeção intraperitoneal e punção da veia da cauda
Thiourea	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	T112512	Estabiliza reagente antrone