Método Colorimétrico Anthrone para Quantificar o Glicogênio no Fígado e Músculo Esquelético de Rato

Resumo

Este protocolo descreve um método colorimétrico anthrone para quantificar o glicogênio no fígado e no músculo esquelético de rato em diferentes estados metabólicos.

Resumo

O glicogênio é uma importante reserva intracelular de glicose no fígado e no músculo esquelético e desempenha um papel fundamental no metabolismo dos carboidratos. O glicogênio hepático é essencial para preservar a homeostase glicêmica sistêmica, enquanto o glicogênio dos músculos esqueléticos apoia a atividade física e o desempenho dos exercícios. A quantificação precisa do glicogênio tecidual é, portanto, fundamental para estudos nos quais o metabolismo do glicogênio é regulado dinamicamente ou patologicamente alterado. Aqui, descrevemos um método colorimétrico anthrone confiável e sensível para quantificar o teor de glicogênio no fígado e músculo esquelético de ratos. O protocolo consiste em etapas sequenciais, incluindo digestão alcalina, desproteinização, precipitação de glicogênio, lavagem com álcool e desenvolvimento de cor usando reagente anthrone. A aplicabilidade desse método é demonstrada em ratos submetidos a três condições fisiologicamente relevantes: alimentação ad libitum , jejum noturno e realimentação de curto prazo. Esses paradigmas experimentais capturam estados metabólicos-chave associados ao armazenamento, depleção e ressíntese do glicogênio. A análise por blot oeste ortogonal das principais enzimas, glicogênio sintase e glicogênio fosforilase, fornece suporte mecanicista às mudanças metabólicas observadas. A aplicabilidade desse método é ainda demonstrada em animais tratados com epinefrina para modelar a quebra aguda do glicogênio induzida por estresse. Coletivamente, esse método oferece uma ampla faixa dinâmica e sensibilidade suficiente para quantificar o glicogênio tecidual em estados fisiológicos marcadamente diferentes. Ele oferece uma ferramenta confiável para investigar o metabolismo do glicogênio in vivo e também pode ser aplicado a modelos de cultura celular in vitro.

Introdução

O glicogênio é um polissacarídeo altamente ramificado que atua como um importante reservatório de energia no músculo esquelético e no fígado dos mamíferos, e em menor grau em outros órgãos como cérebro, rim, coração e tecido^{adiposo 1}. Durante a alimentação, o excedente de glicose passa por polimerização ou lipogênese de novo , sendo armazenado como glicogênio ou lipídios. No entanto, durante o jejum ou exercício físico, o glicogênio sofre degradação enzimática, garantindo um fornecimento constante e rápido de glicose para suprir as demandas energéticas. Essa capacidade de tamponamento do glicogênio é essencial para manter a homeostase glicêmica durante os ciclos fisiológicos de jejum e realimentação².

A síntese de glicogênio é catalisada pela glicogênio sintase (GYS), que existe em duas isoformas de mamíferos: GYS1 e GYS2. GYS1 é predominantemente expressa no músculo esquelético, enquanto GYS2 é a isoforma hepática. A atividade catalítica do GYS é suprimida pela fosforilação em múltiplos locais, incluindo o Ser641, sob condições de jejum, enquanto sua atividade é estimulada ao desfosforilar sob condições de alimentação. A quebra do glicogênio é catalisada pela glicofosfatase. A isoforma hepática é PYGL, e a isoforma muscular é PYGM. Em contraste com a GYS, sua atividade catalítica é estimulada na fosforilação em Ser15 durante o jejum e é suprimida após a desfosforilação após a^{alimentação 3}.

A regulação adequada do metabolismo do glicogênio é fundamental para inúmeros processos biológicos, e o metabolismo do glicogênio desregulado foi identificado como um fator causal em muitas doenças. Especificamente, o metabolismo alterado do glicogênio hepático está associado a vários distúrbios metabólicos, incluindo doenças de armazenamento^{de glicogênio 4}, diabetes^{tipo 2 5}, doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica ^6,7 e resposta contrarregulatória comprometida à hipoglicemia⁸. Além disso, o glicogênio cerebral é essencial para a formação da memória^{de longo prazo 9}, enquanto o glicogênio muscular esquelético é um regulador chave da capacidade de resistência¹⁰. Portanto, a quantificação precisa do glicogênio tecidular é fundamental para estudos nos quais o metabolismo do glicogênio é regulado dinamicamente ou patologicamente alterado, permitindo a investigação dos mecanismos da doença e a avaliação de intervenções moduladoras do glicogênio.

Vários métodos de quantificação de glicogênio foram relatados, incluindo o método Anthrone^11,12, o método da amiloglucosidase¹³, o método¹⁴ do ácido fenol-sulfúrico e o método não invasivo de espectroscopia magnética magnética nuclear (MRS^{) 15}, cada método apresentando certas vantagens e limitações. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o método colorimétrico anthrone para quantificar o glicogênio no fígado e músculo esquelético de rato (Figura 1). Esse protocolo inclui etapas sequenciais de digestão alcalina, desproteinização, precipitação de glicogênio, lavagem em álcool e desenvolvimento de cor usando reagente anthrone. Esse método é simples, econômico e requer instrumentação especializada mínima. Para demonstrar sua sensibilidade e reprodutibilidade, calculamos o limite de detecção (LOD), o limite de quantificação (LOQ), bem como o coeficiente de variação intra-ensaio e inter-ensaio (CV%), usando uma série de padrões de glicogênio. Para demonstrar sua aplicabilidade, os níveis de glicogênio no fígado e no músculo esquelético foram avaliados sob três condições fisiologicamente relevantes: alimentação ad libitum, jejum noturno de 16 horas e realimentação de curto prazo. Além disso, o método foi demonstrado usando animais tratados com epinefrina para modelar a degradação do glicogênio induzida por estresse agudo. A análise de western blot ortogonal das principais enzimas envolvidas no metabolismo do glicogênio foi realizada para corroborar as mudanças metabólicas observadas.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho de quantificação do glicogênio. Representação esquemática do fluxo experimental de quantificação do glicogênio no fígado e músculo esquelético. O procedimento inclui coleta de tecidos, digestão alcalina, precipitação de proteínas, isolamento de glicogênio e detecção colorimétrica baseada em antrona. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC; #1905019) da Universidade Médica de Nanjing.

1. Preparação de Reagentes

1. Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes utilizados neste estudo.
2. Prepare todas as soluções antes do início dos experimentos.
3. Ajuste o volume da solução conforme necessário.
4. Prepare 1 M de solução de hidróxido de sódio (NaOH)
   1. Peso 40 g de pellets NaOH.
   2. Adicione os pellets de NaOH a 800 mL de água destilada.
   3. Mexa a solução com uma haste de vidro até que não restem partículas não dissoludas na base do vaso.
   4. Transfira a solução para um frasco volumétrico de 1 L.
   5. Reduza o volume para exatamente 1 L com água destilada.
   6. Armazene a solução em um frasco bem fechado em temperatura ambiente (RT; 18°C–23°C).
      ATENÇÃO: NaOH é corrosivo. Use óculos de proteção, luvas e jaleco. Pellets comerciais de NaOH não são 100% puros e absorvem água. Evite exposição prolongada de pellets ao ar.
5. Prepare solução de estoque de cloreto de lítio (LiCl) a 20%
   1. Peso 20 g de pó de LiCl anidro.
   2. Adicione o pó de LiCl a 80 mL de água destilada.
   3. Mexa a solução até que não restem partículas não dissoludas na base do recipiente.
   4. Transfira a solução para um frasco volumétrico de 100 mL.
   5. Aumente o volume para exatamente 100 mL com água destilada.
   6. Guarde a solução em um frasco bem fechado na RT.
      NOTA: LiCl pode irritar a pele, os olhos e o trato respiratório. Use óculos de proteção, luvas e jaleco. O LiCl é altamente higroscópico. Minimize a exposição ao ar para evitar a absorção de água.
6. Prepare a solução de reação anthrone
   1. Coloque 28 mL de água destilada em um béquer de 1 L.
   2. Adicione 72 mL de ácido sulfúrico concentrado de alta pureza (98%) (H₂SO₄) à água.
   3. Deixe a mistura esfriar para o RT.
   4. Adicione 50 mg de anthrone à solução.
   5. Mexa até que o trono seja dissolvido.
   6. Adicione 3 g de tiourea à solução.
   7. Mexa até que a tioureia se dissolva.
   8. Transfira a solução para um frasco de vidro âmbar ou enrolado em papel alumínio.
   9. Armazene a solução na geladeira (2°C–8°C) por no máximo uma semana.
      ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é altamente corrosivo, causa queimaduras químicas graves e reage violentamente com a água. Use jaleco, luvas resistentes a produtos químicos e uma proteção facial. Realize todas as etapas em uma exaustão química certificada. A diluição gera calor intenso. Sempre adicione ácido à água.
7. Prepare etanol 95% contendo 0,1% de LiCl
   1. Adicione 95 mL de etanol absoluto a uma garrafa de vidro.
   2. Adicione 4,5 mL de água destilada.
   3. Adicione 0,5 mL de solução de estoque LiCl 20%.
   4. Misture bem.
8. Prepare metanol com 80% contendo 0,1% de LiCl
   1. Adicione 80 mL de metanol absoluto em um frasco de vidro.
   2. Adicione 19,5 mL de água destilada.
   3. Adicione 0,5 mL de solução de estoque LiCl 20%.
   4. Misture bem.
9. Prepare uma solução de ácido tricloroacético (TCA) 100% (v/c)
   1. Peso 100 g de pó de TCA.
   2. Adicione o pó de TCA a 80 mL de água destilada.
   3. Mexa até dissolver.
   4. Transfira a solução para um frasco volumétrico de 100 mL.
   5. Aumente o volume para exatamente 100 mL com água destilada.
   6. Guarde a solução em um frasco de vidro bem fechado na RT.
10. Prepare uma solução saturada de ácido benzoico
    1. Adicione 0,5 g de cristais de ácido benzoico a 100 mL de água destilada em um béquer de vidro de 250 mL.
    2. Aqueça a mistura a 90°C em uma placa quente com agitação magnética contínua.
    3. Continue aquecendo até que não restem partículas não dissoludas na base do recipiente.
    4. Deixe a solução esfriar para o RT.
    5. Aspire o supernadante transparente que está livre de partículas visíveis.
    6. Guarde a solução em um frasco de vidro bem fechado na RT.
11. Prepare padrões de glicose
    1. Dissolva 50 mg de pó de glicose em uma solução saturada de ácido benzoico de 50 mL para preparar uma solução de 1 mg/mL de estoque.
    2. Prepare padrões de glicose (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg/mL) em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por diluição serial com ácido benzoico saturado, conforme segue.
       1. Adicione 500 μL de solução de estoque de 1 mg/mL ao Tubo 1 para preparar o padrão de 1 mg/mL.
       2. Adicione 250 μL de solução estocada e 250 μL de ácido benzóico saturado ao Tubo 2 para preparar o padrão de 0,5 mg/mL.
       3. Adicione 200 μL de solução do Tubo 2 e 300 μL de ácido benzoico saturado ao Tubo 3 para preparar o padrão de 0,2 mg/mL.
       4. Adicione 250 μL de solução do Tubo 3 e 250 μL de ácido benzoico saturado ao Tubo 4 para preparar o padrão de 0,1 mg/mL.
       5. Adicione 250 μL de solução do Tubo 4 e 250 μL de ácido benzoico saturado ao Tubo 5 para preparar o padrão de 0,05 mg/mL.
       6. Adicione 200 μL de solução do Tubo 5 e 300 μL de ácido benzoico saturado ao Tubo 6 para preparar o padrão de 0,02 mg/mL.
       7. Adicione 250 μL de solução do Tubo 6 e 250 μL de ácido benzóico saturado ao Tubo 7 para preparar o padrão de 0,01 mg/mL.
       8. Adicione 500 μL de ácido benzoico saturado em um tubo separado para preparar o blank (0 mg/mL).
    3. Tampe cada tubo e faça o vórtice brevemente por 10 segundos para misturar bem.

2. Tratamento Animal

1. Manejo geral
   1. Ratos machos Sprague–Dawley domésticos (230–270 g) em uma instalação animal sob condições específicas livres de patógenos (estado de saúde VAF/Plus, Laboratórios Charles River), certificados livres de patógenos comuns de roedores, incluindo vírus Sendai, Mycoplasma pulmonis e parvovírus de rato.
   2. Ofereça uma dieta padrão para comer e permita acesso livre à água.
   3. Mantenha os animais em um ciclo de 12 horas claro/escuro (luzes acesas às 08:00 h e luzes apagadas às 20:00).
   4. Mantenha a RT entre 22°C–23°C.
   5. Mantenha a umidade relativa entre 30% e 70%.
2. Jejum noturno
   1. Transfira ratos para gaiolas comuns.
   2. Remova a comida e ofereça acesso livre à água.
   3. Mantenha o jejum por 16 horas, das 16:30 às 08:30 da manhã seguinte.
3. Realimentação
   1. Forneça comida regular (200 g) para ratos em jejum noturno.
   2. Permita que os animais se alimentem à vontade por 2 horas.
4. Desafio da epinefrina
   1. Prepare solução de cloridrato de epinefrina.
      1. Pese 5 mg de pó de cloridrato de epinefrina usando uma balança analítica calibrada.
      2. Transfira o pó para um tubo centrífugo de 15 mL e adicione 10 mL de soro fisiológico.
      3. Tampe o tubo e inverta 10 vezes para preparar uma solução de estoque de 0,5 mg/mL.
   2. Injetar ratos não em jejum intraperitonealmente solução de cloridrato de epinefrina a um volume de 1 mL/kg de peso corporal (0,5 mg/kg de peso corporal)³.
      1. Segure o animal com a cabeça para baixo para permitir que o conteúdo abdominal se desloque cranialmente.
      2. Insira uma agulha calibre 25 no quadrante inferior direito do abdômen em um ângulo de 45°.
      3. Aspire para confirmar a ausência de sangue ou conteúdo entérico antes da injeção.
   3. Injetar os animais controle intraperitonealmente com soro fisiológico em volume de 1 mL/kg.
   4. Colete amostras de sangue das veias caudais.
      1. Segure o rato para expor a cauda.
      2. Comprima e aqueça a cauda por 10 segundos para facilitar o fluxo sanguíneo.
      3. Fure a veia lateral da cauda a 3 cm da ponta usando uma agulha estéril calibre 25.
      4. Descarte a primeira gota de sangue usando gaze limpa para evitar contaminação do fluido tecidual.
      5. Colete a segunda gota de sangue para medir a glicose.
   5. Meça a glicose no sangue usando um glicose a cada 15 minutos por 60 minutos.
      1. Calibre o glicosímetro conforme as instruções do fabricante.
      2. Verifique a precisão do glicosímetro mensalmente usando soluções de controle.
      3. Guarde as tiras de teste no recipiente original para evitar a exposição à umidade.
      4. Use tiras de teste imediatamente após a retirada do recipiente.
      5. Insira uma tira de teste no glicosímetro para ativar o medidor automaticamente.
      6. Permita que a amostra de sangue entre na tira por ação capilar.
      7. Registre o valor de glicose no sangue exibido.

3. Colheita de tecidos

1. Eutanásia e preparação
   1. Eutanasiar animais por overdose de isoflurano. Coloque os animais em uma câmara de indução e exponha-os a 5% de isoflurano entregue em 100% de oxigênio a 2 L/min por pelo menos 3 minutos.
   2. Verifique a morte confirmando a cessação da respiração.
   3. Confirme perda do reflexo corneano e do beliscão do dedo do pé.
      1. Toque suavemente a córnea usando um aplicador estéril com ponta de algodão para confirmar a ausência de resposta de piscar.
      2. Aplique uma pressão firme na membrana entre os dedos da pata traseira usando pinças contundentes para confirmar a ausência de resposta motora.
   4. Coloque o lado ventral do rato para cima em uma bandeja de dissecação.
   5. Molhar a pele abdominal com etanol 75% usando um borrifador.
      NOTA: Minimize o tempo entre a eutanásia e a preservação dos tecidos para reduzir a degradação do glicogênio causada pela isquemia postmortem.
2. Dissecação hepática
   1. Faça uma pequena incisão na pele aproximadamente 1 cm caudal até o processo xifoide.
   2. Estenda a incisão em direção ao esterno.
   3. Separe a pele do músculo subjacente.
   4. Realize uma laparotomia transversal bilateral fazendo uma incisão horizontal de 4 cm aproximadamente 1 cm caudal até o processo xifoide e estendendo-se lateralmente em direção às margens subcostais esquerda e direita para expor totalmente a cavidade abdominal.
   5. Identifique o fígado.
   6. Retire o lobo mediano direito (Figura 2A).
   7. Pese o tecido em até 1 minuto.
   8. Coloque o papel em um recipiente plástico de polipropileno.
   9. Congele o tecido rapidamente em gelo seco.
3. Dissecação do músculo esquelético
   1. Use o músculo gastrocnêmio como amostra representativa porque ele contém uma população mista de fibras de contração rápida e lenta que refletem as características metabólicas e contráteis do membro^{posterior 16}.
   2. Coloque o rato de bruços.
   3. Faça uma incisão longitudinal na pele ao longo da parte posterior do membro posterior, desde a fossa poplítea até a tuberosidade calcânea.
   4. Separe a pele.
   5. Identifique e reflita os músculos bíceps femoral e semitendinoso.
      1. Identifique o bíceps femoral como o grande músculo posicionado lateralmente que cobre a metade superior da parte posterior da coxa.
      2. Identifique o semitendinoso como o músculo estreito em forma de tira que corre medialmente ao longo da parte posterior da coxa e se insere próximo ao joelho.
   6. Expõe o músculo gastrocnêmio.
   7. Transecte o tendão de Aquiles em sua inserção distal no calcâneo usando tesouras cirúrgicas finas.
   8. Separe o músculo sóleo.
   9. Liberar a fixação proximal do músculo gastrocnêmio nos epicôndilos medial e lateral do fêmur.
   10. Remova todo o músculo gastrocnêmio (Figura 2B).
   11. Pese o tecido em até 1 minuto.
   12. Coloque o papel em um recipiente plástico de polipropileno.
   13. Congele o tecido rapidamente em gelo seco.

Figura 2: Procedimentos de dissecção de tecidos para fígado e músculo esquelético. (A) Passos sequenciais para expor a cavidade abdominal e extração de tecido hepático, incluindo incisão na pele, extensão da incisão, separação da pele do músculo subjacente e laparotomia transversal. (B) Passos sequenciais para isolar o músculo gastrocnêmio, incluindo incisão longitudinal, reflexão dos músculos sobrepostos, identificação de estruturas anatômicas e excisão do músculo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Ensaio Colorimétrico de Glicogênio

1. Dia 1: Digestão alcalina
   1. Adicione 0,4 g de papel em um tubo centrífugo de 50 mL. Uma tolerância de ± 0,1 g é permitida para garantir um processamento rápido e minimizar a degradação dos tecidos.
   2. Adicione 10 mL de solução de NaOH de 1 M ao tubo.
   3. Pice o tecido usando lâminas estéreis ou tesouras até que os fragmentos de tecido tenham aproximadamente 1–2 mm de tamanho.
   4. Coloque o tubo em banho-maria a 95°C ± 5°C.
   5. Incube por 30 minutos.
   6. Faça um vórtice na amostra a 2.500 rpm por 10 segundos a cada 10 minutos durante a incubação.
   7. Remova o tubo do banho-maria.
   8. Deixe a amostra esfriar para RT.
2. Preparação de lisato para ensaio proteico
   1. Transfira 1 mL de lisato alcalino para um tubo de microcentrífuga usando um pipetador calibrado P1000.
   2. Centrifuge a 8.000 × g por 10 minutos.
   3. Colete o sobrenadante.
   4. Reserve o sobrenadante para o ensaio de proteína BCA.
3. Desproteinização mediada por TCA
   1. Transfira 3 mL de lisato alcalino para um tubo centrífugo de 15 mL.
   2. Adicione 1 mL de solução 100% (v/v) de TCA.
   3. Adicione 6 mL de água destilada para levar o volume total para 10 mL.
   4. Faça vórtice na mistura a 2.500 rpm por 10 segundos.
   5. Coloque o tubo sobre gelo (0°C–4°C).
   6. Incube por 1 hora para precipitar proteínas.
4. Coleção de sobrenadantes desproteinizados
   1. Transfira 1 mL da mistura para um tubo de microcentrífuga.
   2. Centrifugar a 8.000 × g por 10 minutos em RT.
   3. Reserve o sobrenadante.
5. Precipitação de glicogênio
   1. Transfira 0,4 mL do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
   2. Adicione 0,8 mL de etanol 95% contendo 0,1% de LiCl.
   3. Faça vórtice na mistura cuidadosamente.
   4. Incubar em terapia de descanso por 16 horas.
6. Dia 2: Pelletagem de glicogênio
   1. Centrifuge a amostra a 1.000 × g por 15 minutos em RT para obter um pellet branco firme e semi-translúcido de glicogênio (Figuras 3A e Figura 3B).
   2. Descarte o supernadante.
7. Primeira lavagem com glicogênio
   1. Adicione 1,5 mL de metanol 80% contendo 0,1% de LiCl ao pellet.
   2. Faça vórtice na amostra a 2.500 rpm por 10 segundos.
8. Centrifugação após lavagem
   1. Centrifuge a 1.000 × g por 5 minutos em tempo de descanso.
   2. Descarte o supernadante.
9. Segunda lavagem com glicogênio
   1. Repita a etapa de lavagem uma vez.
   2. Remova qualquer líquido residual aspirando cuidadosamente usando um pipetador P200 com ponta fina para garantir que o pellet de glicogênio permaneça intacto.
10. Dissolução do glicogênio
    1. Adicione 0,8 mL de água destilada ao pellet.
    2. Vórtice a 2.500 rpm até que uma solução clara e homogênea, sem partículas visíveis, seja alcançada.
11. Preparação de padrões e amostras
    1. Prepare tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para padrões de glicose, amostras em branco e desconhecidas em triplicado.
       NOTA: Adicione reagentes a cada tubo de acordo com a Tabela 1.
    2. Adicione 50 μL de cada padrão de glicose aos tubos designados.
    3. Adicione 50 μL de água destilada ao tubo em branco.
    4. Adicione uma amostra de glicogênio de 50 μL a cada tubo desconhecido.
    5. Adicione 200 μL de solução de reação anthrone a cada tubo.
12. Desenvolvimento de cor do Anthrone e medição de absorção
    1. Faça um vórtice completo em todos os tubos.
    2. Coloque os tubos em banho-maria a 95°C ± 5°C.
    3. Incubar por 15 minutos.
    4. Remova os tubos e deixe que esfriem para o RT.
    5. Transfira 200 μL de cada tubo para uma placa de 96 poços.
    6. Meça a absorvância a 620 nm usando um leitor de microplacas (modo endpoint, 25°C) com correção automática do comprimento do caminho até 1 cm.
    7. A curva padrão deve ter um coeficiente de determinação (R²) de ≥0,995, conforme determinado por regressão linear, para ser considerada aceitável.
    8. Qualquer padrão ou amostra individual replicada com um percentual de CV de >20% entre medições triplicadas deve ser considerada não confiável e repetida.

Figura 3: Isolamento e quantificação do glicogênio sob diferentes estados nutricionais. (A) Imagem representativa de pellets de glicogênio precipitados de amostras de fígado sob condições de alimentação, jejum e refed. (B) Imagem representativa de pellets de glicogênio precipitado a partir de amostras de músculo esquelético sob condições de alimentação, jejum e refed. (C) Curva padrão gerada a partir de padrões de glicose mostrando a relação linear entre absorção em 620 nm e concentração de glicose. (D) Níveis de glicose no sangue sob condições alimentadas, em jejum e refed. (E) Conteúdo hepático de glicogênio sob condições alimentadas, em jejum e em regime de reprodução. (F) Conteúdo de glicogênio muscular esquelético sob condições de alimentação, jejum e re-condicionado. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 6 por grupo). A análise estatística foi realizada usando análise unidirecional comum da variância (ANOVA), com múltiplas comparações corrigidas pelo método de Benjamini–Hochberg. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns: não significativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Reagentes	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Em branco	Amostra desconhecida
Solução padrão de glicose	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Água destilada (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Amostra de glicogênio	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Solução de reação de Anthrone	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tabela 1: Configuração da reação para ensaio colorimétrico de glicogênio. Configuração da reação para padrões de glicose, amostras de glicogênio em branco e desconhecidas usadas no ensaio colorimétrico de Anthrone. Volumes definidos de padrões de glicose, água destilada ou amostras de glicogênio foram combinados com solução de reação anthrone antes da incubação e medição da absorvância.

5. Cálculo do Conteúdo de Glicogênio Tecidular

NOTA: Normalize o glicogênio medido para peso úmido do tecido ou massa proteica total.

1. Determinação padrão de curva e concentração
   1. Use leituras de absorção dos oito tubos padrão de glicose.
   2. Subtraia valores em branco das leituras de absorvância antes de plotá-los em relação às concentrações de glicose.
   3. Ajuste uma curva de regressão linear usando regressão ordinária de mínimos quadrados no Excel (Figura 3C).
   4. Calcule a concentração de glicose em cada amostra desconhecida de glicogênio (C_desconhecida) interpolando sua absorção subtraída em branco na curva padrão linear usando a equação de regressão obtida no Passo 5.1.3.
2. Normalização ao peso úmido do tecido
   1. Calcule o conteúdo de glicogênio usando a seguinte equação:
      
   2. Defina_{C desconhecido} como a concentração de glicose (mg/mL) na amostra desconhecida de glicogênio determinada no Passo 5.1.4.
   3. Defina 0,8 como o volume da amostra dissolvida de glicogênio (mL) no Passo 4.10.1.
   4. Defina 0,9 como o fator usado para converter o valor da glicose em valor de glicogênio.
   5. Defina 2,5 como o fator de diluição introduzido durante a precipitação de glicogênio no Passo 4.5.
   6. Defina 10 como o fator de diluição que contabiliza a alíquota de 1 mL analisada a partir da mistura total de 10 mL preparada no Passo 4.3.3.
   7. Defina 10/3 como o fator de diluição que contabiliza os 3 mL de alíquota usados do total de 10 mL de digestão alcalina preparada no Passo 4.1.2.
3. Normalização para a massa total de proteínas
   1. Calcule o conteúdo de glicogênio usando a seguinte equação:
      
   2. Defina_{C desconhecido} como a concentração de glicose (mg/mL) na amostra desconhecida de glicogênio determinada no Passo 5.1.4.
   3. Defina 0,8 como o volume da amostra dissolvida de glicogênio (mL) no Passo 4.10.1.
   4. Defina 0,9 como o fator usado para converter o valor da glicose em valor de glicogênio.
   5. Defina 2,5 como o fator de diluição introduzido durante a precipitação de glicogênio no Passo 4.5.
   6. Defina 10 como o fator de diluição que contabiliza a alíquota de 1 mL analisada a partir da mistura total de 10 mL preparada no Passo 4.3.3.
   7. Defina 1/3 como o fator de correção que leva em conta a alíquota de 3 mL usada do digesto alcalino no Passo 4.3.1.
   8. Defina concentração de proteína como a concentração de proteína total (mg/mL) na digestão alcalina determinada pelo ensaio BCA no Passo 4.2.4.

6. Western Blot de enzimas-chave que catalisa o metabolismo do glicogênio

1. Considerações gerais
   1. Consulte os protocolos previamente descritos para procedimentos padrão de western^{blot 17,18}.
2. Extração de proteínas
   1. Peso 75 mg de tecido congelado rapidamente. Uma tolerância de ± 25 mg é permitida para garantir um processamento rápido e minimizar o descongelamento dos tecidos.
   2. Adicione 1 mL de tampão de lise RIPA gelado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM de NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% desoxicolato de sódio; 0,1% SDS; e 1 mM de EDTA) suplementado com inibidores de protease e fosfatase.
   3. Homogeneize o tecido usando um homogeneizador rotor-estador portátil.
3. Preparação do lisado
   1. Incube homogeneados no gelo por 30 minutos.
   2. Faça vórtice nas amostras a 2.500 rpm por 10 segundos a cada 10 minutos durante a incubação.
   3. Centrifuge a 10.000 × g usando um rotor de ângulo fixo por 5 minutos a 4°C.
4. Quantificação de proteínas
   1. Colete o sobrenadante como lisato total de proteína.
   2. Realize um ensaio de BCA para determinar a concentração de proteínas.
   3. Prepare os padrões de BSA de 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 e 1 mg/mL diluídos no tampão de lise RIPA.
   4. Em uma microplaca de 96 poços, carregue 20 μL de cada amostra padrão ou desconhecida em poços individuais.
   5. Adicione 200 μL de reagente de trabalho BCA (preparado misturando 50 partes do Reagente A com 1 parte do Reagente B) em cada poço.
   6. Incube a placa de reação a 37°C por 30 minutos.
   7. Após resfriamento para RT (18°C–23°C), meça a absorção a 562 nm usando um leitor de microplacas (modo final, 25°C) com correção automática do comprimento do caminho até 1 cm.
5. SDS-PAGE
   1. Misture 15 μg de proteína com o buffer de carregamento SDS-PAGE.
   2. Aqueça as amostras a 95°C por 5 minutos.
   3. Resfrie as amostras no gelo.
   4. Coloque as amostras em um gel SDS-PAGE com 10%.
   5. Resolver proteínas por eletroforese em tampão em funcionamento (25 mM Tris, 192 mM glicina e 0,1% SDS).
   6. Faça o gel funcionar a 100 V de temperatura constante até que a frente do corante azul de bromofenol chegue ao fundo do gel.
6. Transferência e bloqueio de proteínas
   1. Transfira proteínas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF.
   2. Para membranas de nitrocelulose, equilibre a membrana em tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, metanol 20%, pH 8,3) por 10 minutos.
   3. Para membranas PVDF, ative a membrana por imersão em metanol 100% por 30 segundos, depois equilibre no tampão de transferência por 10 minutos.
   4. Monte o sanduíche de transferência na seguinte ordem: esponja, papel filtrante, gel, membrana, papel filtrante, esponja.
   5. Realize a transferência de proteína a corrente constante de 200 mA por 90 minutos a 4°C.
   6. Prepare 3% (v/v) de BSA em TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; e 0,1% Tween-20).
   7. Bloqueie a membrana em RT por 1 hora com balanço constante.
      NOTA: Use BSA em vez de leite desnatado ao detectar proteínas fosforiladas.
7. Incubação primária de anticorpos
   1. Prepare solução primária de anticorpos em tampão bloqueador com diluição de 1:1.000.
   2. Incube a membrana com anticorpo primário a 4°C durante a noite, balançando constantemente.
8. Lavagem
   1. Lave a membrana com TBST.
   2. Repita a lavagem três vezes por 10 minutos cada.
9. Incubação secundária de anticorpos
   1. Prepare anticorpo secundário conjugado com HRP em tampão bloqueante com diluição de 1:10.000.
   2. Incube a membrana na RT por 1 hora com balanço constante.
10. Lavagem
    1. Lave a membrana com TBST.
    2. Repita a lavagem três vezes por 10 minutos cada.
11. Detecção quimioluminescente
    1. Prepare o substrato quimioluminescente misturando volumes iguais de luminol/realçador e soluções estáveis de peróxido.
    2. Aplique substrato em um volume de 0,1 mL/cm de área de superfície de^{membrana 2} e incube por 2 minutos em RT em um agitador orbital (100 rpm).
    3. Capture sinais usando um imageador quimioluminescente.
    4. Testes os tempos de exposição variando de 10 a 300 s e selecione uma exposição dentro da faixa linear de detecção para cada blot.
    5. Verifique a linearidade do sinal confirmando a ausência de saturação de pixels usando o software embutido do instrumento.
12. Análise de imagens
    1. Analise a intensidade da banda usando o software ImageJ (versão 1.51, NIH).
    2. Converta imagens para tons de cinza de 8 bits e aplique subtração de fundo com bola rolante com raio de 50 pixels.
    3. Defina cada faixa usando uma região retangular de interesse de dimensões idênticas e subtraia o fundo local de uma área em branco adjacente para obter valores de densidade integrados brutos.
13. Coloração total de proteínas
    1. Incube a membrana em solução de tinta da Índia 0,1% em TBST na RT por 1 hora com balanço constante.
    2. Lave a membrana três vezes por 10 minutos cada com TBST.
    3. Quantifique múltiplas bandas coradas como controles de carga para normalizar sinais de imunobloting.
       NOTA: Use coloração total de proteínas em vez de genes domésticos (HKGs), pois a expressão de HKG pode variar sob diferentes condições^{experimentais 19}.

7. Sensibilidade e Reprodutibilidade do Método

1. Preparação de padrões de glicogênio
   1. Prepare uma solução de 20 mg/mL de glicogênio em 1 M de NaOH.
   2. Prepare uma série de padrões de glicogênio (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg/mL) em tubos centrífugos de 15 mL por diluição gradual com 1 M NaOH, conforme descrito abaixo.
      1. Prepare o Tubo 1 (1 mg/mL) misturando uma solução de estoque de glicogênio de 500 μL com 9,5 mL de 1 M de NaOH.
      2. Prepare o Tubo 2 (0,5 mg/mL) misturando 250 μL de solução de glicogênio com 9,75 mL de 1 M de NaOH.
      3. Prepare o Tubo 3 (0,2 mg/mL) misturando 100 μL de solução de glicogênio com 9,9 mL de 1 M de NaOH.
      4. Prepare o Tubo 4 (0,1 mg/mL) misturando 50 μL de solução de glicogênio com 9,95 mL de 1 M de NaOH.
      5. Prepare o Tubo 5 (0,05 mg/mL) misturando 25 μL de solução de glicogênio com 9,975 mL de 1 M de NaOH.
      6. Prepare o Tubo 6 (0,02 mg/mL) misturando 10 μL de solução de glicogênio com 9,99 mL de 1 M NaOH.
      7. Prepare o Tubo 7 (0,01 mg/mL) misturando 100 μL de solução do Tubo 1 com 9,9 mL de 1 M NaOH.
      8. Prepare o Tubo 8 (0,005 mg/mL) misturando 50 μL de solução do Tubo 1 com 9,95 mL de NaOH 1 M.
      9. Prepare o blank (0 mg/mL) adicionando 10 mL de 1 M NaOH a um tubo centrífugo de 15 mL.
   3. Tampe cada tubo e vórtice a 2.500 rpm por 10 segundos para misturar.
2. Ensaio colorimétrico Anthrone
   1. Extrair glicogênio e realizar o ensaio colorimétrico anthrone de acordo com os Passos 4.1.4–4.12.6.
   2. Registre leituras de absorção em 620 nm (A₆₂₀).
3. Cálculo da concentração de glicogênio
   1. Gerar a curva padrão de glicose e calcular a concentração de glicose em cada amostra padrão (_padrão C) conforme especificado no Passo 5.1.
   2. Calcule a concentração de glicogênio em cada tubo padrão usando a seguinte equação:
      
   3. Defina_{C padrão} como a concentração de glicose (mg/mL) determinada em cada amostra padrão.
   4. Defina 0,8 como o volume da amostra de glicogênio (mL).
   5. Defina 0,9 como o fator para converter o valor da glicose em valor de glicogênio.
   6. Defina 2,5 como um fator de diluição.
   7. Defina 10 como o fator de diluição que contabiliza a alíquota de 1 mL analisada a partir da mistura total de 10 mL preparada no Passo 4.3.3.
   8. Defina 1/3 como o fator de correção que leva em conta a alíquota de 3 mL usada do digesto alcalino no Passo 4.3.1.
   9. Repita o procedimento completo mais três vezes em um dia, totalizando quatro corridas.
   10. Repita as quatro corridas ao longo de quatro dias, totalizando 16 corridas.
4. Cálculo do LOD e LOQ
   1. Plote todas as 16 leituras de absorção no eixo y com cada concentração padrão de glicogênio no eixo x.
   2. Calcule a curva de regressão linear e^R2. Uma regressão linear com R² de ≥0,995 é considerada aceitável.
   3. Calcule o LOD e o LOQ usando as seguintes equações:
      
      
   4. Defina σ como o erro padrão da resposta (intercepto y).
   5. Defina S como a inclinação da curva de regressão linear.
5. Cálculo do percentual de CV% intra-ensaio e entre ensaios
   1. Para cada padrão de glicogênio, calcule o CV% intra-ensaio dos valores calculados das quatro corridas do Dia 1 usando a seguinte equação:
      
   2. Defina s₁ como o desvio padrão dos valores das quatro sequências do Dia 1.
   3. Defina como o valor médio das quatro corridas no Dia 1.
   4. Repita esse cálculo para o Dia 2, Dia 3 e Dia 4 para obter CV₂,_{CV 3} e_{CV 4}.
   5. Calcule o percentual final de CV intra-ensaio usando a seguinte equação:
      
   6. Calcule o CV% entre ensaios usando a seguinte equação:
      
   7. Defina s_inter como o desvio padrão de CV₁, CV₂, CV₃ e CV₄.
   8. Defina como o valor médio de CV₁, CV₂,_{CV 3} e CV₄.

Resultados

Níveis de glicogênio muscular hepático e esquelético sob diferentes estados nutricionais

O jejum noturno diminuiu significativamente os níveis de glicose no sangue (média ± erro padrão da média [SEM]) de 7,9 ± 0,4 mM em ratos alimentados ad libitum para 5,4 ± 0,3 mM. Os níveis de glicose no sangue foram restaurados para 8,3 ± 0,1 mM após 2 horas de realimentação (Figura 3D). Consistente com essas mudanças, os níveis de glicogênio hepático...

Discussão

Neste artigo, descrevemos um método colorimétrico anthrone modificado para quantificar glicogênio em tecidos animais. Além das etapas sequenciais convencionais de colheita de tecidos, digestão alcalina, precipitação de glicogênio, lavagem em álcool e desenvolvimento de cor baseado em anthrone, incorporamos uma etapa de desproteinização para reduzir a interferência de fundo (Figura 1). Em seguida, aplicamos esse método para avaliar alterações no conteúdo de g...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Usado para processamento de amostras e configuração de reação
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Usado para manipulação de lisado e etapas de precipitação
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Buffer para lavagem de membrana em western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Incubação de placa de ensaio BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Usado para digestão de tecido e extração
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Medição de absorbância baseada em placa
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Pesar pós químicos
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagente para detecção colorimétrica de glicogênio
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Detecção de glicogênio sintase 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Detecção de glicogênio sintase 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Detecção de GYS fosforilado
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Detecção de fosforilação da glicogênio fosforilase
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Detecção da glicogênio fosforilase do fígado
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Detecção da glicogênio fosforilase do músculo
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Quantificação de proteína
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Preparação de solução saturada para padrões
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Pinçamento de dedos; dissecação de tecido
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Agente de bloqueio em western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Detecção de sinais de western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Desenvolvimento de sinal em western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Solvente para preparação de reagentes
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Indução da degradação do glicogênio in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Precipitação e lavagem de glicogênio
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Dissecação de tecido
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centrifugação de amostras
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medição da glicemia
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medir o nível de glicose na veia da cauda
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Medir o nível de glicose na veia da cauda
Glucose	Macklin	G6172	Preparação da curva padrão
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Preparação de uma série de padrões de glicogênio
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Detecção de anticorpos primários
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Homogeneização de tecido
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Corante de proteína total para normalização
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Eutanásia animal
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Aquecimento de amostras durante ensaios
Lithium chloride	Macklin	767397	Melhora a precipitação de glicogênio
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Passo de lavagem de glicogênio
Microplate reader	BioTek	ELx800	Medição de absorbância a 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membrana de transferência de proteína
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubação de substrato quimiluminescente
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Transferência de solução
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Remoção de líquido residual
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Preservação da fosforilação de proteínas
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Armazenamento de tecidos coletados
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Prevenção da degradação de proteínas
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Extração de proteína
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Separação de proteína
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Misturar com amostras de proteína antes de carregar nos poços do gel SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Eletroforese SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Eutanásia animal
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Digestão de tecido e extração de glicogênio
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Modelo animal experimental
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Aplicar álcool 75% no pelo animal para umedecer e desinfetar
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Dieta de manutenção para roedores
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Dissecação de tecido
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	Injeção intraperitoneal e punção da veia da cauda
Thiourea	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	T112512	Estabiliza reagente antrone