Modelos de Tumores Transplantáveis Clinicamente Relevantes para Estudo do Câncer de Ovário Metastático e Resposta Terapêutica em Camundongos

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo passo a passo para estabelecer os modelos de tumor intraperitoneal e intrabursal para estudar a progressão do câncer de ovário, metássase e resposta terapêutica. Além disso, descrevemos como usar imagens in vivo não invasivas à base de luciferase nesses modelos para monitorar a progressão tumoral em camundongos.

Resumo

O câncer de ovário metastático é uma malignidade ginecológica extremamente letal que carece de opções de tratamento eficazes. O desenvolvimento de abordagens terapêuticas clinicamente tradutíveis para pacientes com câncer de ovário depende da compreensão dos fatores que impulsionam a metástase do câncer de ovário. Embora a maioria dos tumores sólidos apresente metástase hematógena, as células do câncer de ovário se espalham principalmente pela via intraperitoneal. Esse processo envolve o descolamento e a eliminação de células cancerígenas do tumor primário para a cavidade peritoneal, que então adquirem propriedades que lhes permitem resistir à anoikis e formar agregados multicelulares. Esses agregados celulares então se ligam e invadem o revestimento mesotelial do peritônio, formando lesões metastáticas. Modelos in vivo clinicamente relevantes são essenciais para entender como fatores celulares e o microambiente tumoral impactam as diferentes etapas do processo metastático e para testar novas estratégias terapêuticas. Dois modelos transplantáveis de tumores de camundongos amplamente utilizados para estudar a metástase e a resposta terapêutica do câncer de ovário são os modelos intraperitoneal e intrabursal. Neste relatório, descrevemos a metodologia passo a passo para estabelecer esses modelos e destacamos suas vantagens e limitações. Além disso, descrevemos como usar imagens bioluminescentes para monitorar a progressão tumoral de forma não invasiva usando esses modelos.

Introdução

Apesar do progresso significativo em nossa compreensão dos fatores que impulsionam a progressão do câncer de ovário, o câncer de ovário continua sendo a segunda malignidade ginecológica mais letal nos Estados^Unidos. Devido à falta de sintomas óbvios e à ausência de marcadores diagnósticos precoces confiáveis, mais de 70% dos pacientes com câncer de ovário apresentam doença metastática avançada no diagnóstico ^2,3. As terapias atuais não são eficazes no tratamento do câncer de ovário metastático e, consequentemente, as taxas de sobrevivência a 5 anos para pacientes com doença em estágio avançado permanecem inferiores a 30%^4. Uma das principais causas da falta de sucesso terapêutico é o surgimento da^{quimiorresistência 5}. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar os fatores que impulsionam a metástase do câncer de ovário e a quimiorresistência. Abordar essa lacuna de conhecimento será fundamental para desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes para combater essa doença. Para alcançar esses objetivos, precisamos de modelos in vivo que imitem com precisão as etapas principais da progressão do câncer de ovário.

Embora as linhagens celulares do câncer de ovário e os modelos tridimensionais in vitro tenham contribuído imensamente para nossa compreensão dos fatores que impactam a metástase e a resposta terapêutica, esses modelos apresentam várias ^{limitações 6,7,8}. Por exemplo, esses modelos não levam em conta as diferentes células não cancerígenas que fazem parte do microambiente tumoral, nem capturam as interações complexas que ocorrem dentro do microambiente ^{tumoral 6,7,8}. Além disso, é extremamente desafiador estudar fatores sistêmicos e seu impacto na progressão tumoral e na resposta a medicamentos usando modelos in^{vitro 6,7,8}. Essas limitações dos modelos in vitro destacam a necessidade de modelos in vivo que imitem com precisão as várias etapas da metástase do câncer de ovário, incluindo interações complexas com outros tipos celulares e fatores dentro do microambiente.

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) oferecem uma plataforma in vivo na qual tumores surgem espontaneamente em um microambiente natural com o sistema imunológico^{intacto 9}. No entanto, eles consomem tempo, são desafiadores e caros para gerar e manter¹⁰. A maioria dos GEMMs do câncer de ovário também possui um longo período de latência para o desenvolvimento tumoral, o que torna o trabalho com eles demorado e caro, mesmo depois de terem sido^gerados. Modelos transplantáveis, como xenoenxertos e aloenxertos, oferecem um bom equilíbrio entre relevância biológica e facilidade experimental, e frequentemente são muito menos caros de gerar do que os^{GEMMs 11}. Além de terem menor latência que os GEMMs, a facilidade com que as células tumorais podem ser geneticamente modificadas in vitro torna esses modelos convenientes e adequados para estudar como diferentes fatores genéticos impactam a progressão^{tumoral 10}. Devido a esses benefícios, modelos de tumores transplantáveis emergiram como ferramentas valiosas tanto para pesquisas básicas quanto translacionais em câncer de ovário.

Neste relatório, descrevemos o protocolo para estabelecer dois modelos diferentes de tumores de camundongos transplantáveis que são amplamente utilizados para estudar o câncer de ovário metastático: (1) o modelo intraperitoneal e (2) o modelo ortotópico ou intrabursal. Ambos os modelos podem ser estabelecidos como modelos de xenoenxerto ou aloenxerto. No modelo intraperitoneal, células cancerígenas são injetadas na cavidade peritoneal dos camundongos. A introdução de células do câncer de ovário no espaço intraperitoneal reflete o estágio da metástase do câncer de ovário, onde células metastáticas do câncer de ovário são liberadas do tumor primário para a cavidade peritoneal. Semelhante ao processo metastático em humanos, essas células transplantadas de câncer de ovário precisarão se adaptar ao microambiente peritoneal hostil, aderir e invadir a camada mesotelial que revestem a cavidade peritoneal e formar lesões metastáticas em órgãos e tecidos intraperitoneais, como o omento, mesenterio, fígado e diafragma. Dependendo da linhagem celular cancerígena usada para gerar o modelo intraperitoneal, tumores metastáticos podem ser acompanhados por ascite, como observado em doenças em estágio avançado em humanos. Assim, o modelo intraperitoneal tem sido amplamente utilizado para entender fatores que impulsionam a metástase do câncer de ovário e sua progressão para a doença em estágio^{avançado 12}. Esses modelos também são úteis para determinar a eficácia de novas estratégias terapêuticas para câncer de ovário^{metastático 12}. No modelo intrabursal ou ortotópico, as células cancerígenas são implantadas na bursa, uma estrutura membranosa que envolve o ovário do camundongo. Esse modelo imita os estágios iniciais da tumorigênese e metástase ovariana. Neste estágio, as células cancerígenas ainda estão confinadas à trompa de Falópio e ao ovário. É a partir desses locais que as células cancerígenas são liberadas para a cavidade peritoneal, metastatizando para outros órgãos. Portanto, o modelo intrabursal é útil para estudar tanto os estágios iniciais da tumorigênese ovariana quanto os eventos que levam à sua subsequente metástase transcoelômica através da cavidade^{peritoneal 12}.

Assim, embora os modelos intraperitoneal e intrabursal sejam excelentes ferramentas para estudar a metástase do câncer de ovário e a resposta terapêutica, eles diferem na fase específica ao longo do processo metastático que imitam. Embora os modelos intrabursais possam imitar a progressão do câncer de ovário dos estágios iniciais para os estágios posteriores do processo metastático, devido à latência associada a esse processo, eles geralmente são usados para estudar eventos iniciais na metástase do câncer de ovário. Para estudos focados em estágios avançados da metástase do câncer de ovário, o modelo intraperitoneal é mais adequado. Além disso, o modelo intrabursal também é tecnicamente mais desafiador de estabelecer em comparação com o modelo^{intraperitoneal 12}. Estabelecer o modelo intrabursal requer acesso a uma sala cirúrgica equipada com equipamentos microcirúrgicos que permitam a injeção precisa de células cancerígenas na bursa ovariana. A capacidade das células cancerígenas de estabelecer tumores ("taxa de absorção" ou "taxa de enfrarte") também é geralmente menor em modelos intrabursais em comparação com modelos intraperitoneais. Além disso, como tumores não podem ser facilmente observados após injeções ortotópicas ou intraperitoneais, uma técnica de imagem bioluminescente não invasiva é tipicamente empregada para monitorar a progressão tumoral. Portanto, tanto os modelos intraperitoneal quanto o intrabursal requerem equipamentos adicionais que permitam a imagem não invasiva dos^{tumores 12}. Em última análise, os objetivos experimentais, a disponibilidade de recursos e o conjunto de habilidades técnicas determinarão a escolha do modelo para cada estudo.

Este relatório descreve o protocolo passo a passo para estabelecer modelos de xenoenxertos de camundongos intraperitoneais e intrabursais usando linhagens celulares de câncer de ovário humano. Esses modelos podem ser estabelecidos transplantando as células em cepas de camundongos imunocomprometidas, como NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) ou o nu Foxn1 (B6. Cg-Foxn1 nu/J). O mesmo método pode ser adaptado para gerar modelos aloenxertos (sintênicos). Ao estabelecer modelos de aloenxertos, células de câncer de ovário de camundongos são implantadas em camundongos imunocompetentes com o mesmo background genético. Como modelos de aloenxerto são desenvolvidos usando camundongos imunocompetentes, eles são úteis para estudar como diferentes fatores regulam o microambiente do tumor ovariano, o papel do sistema imunológico na progressão do câncer de ovário e a eficácia da imunoterapia. Além de estabelecer os modelos de camundongos intraperitoneal e intrabursal xenotransplante, este relatório também descreve como usar imagens bioluminescentes para monitorar de forma não invasiva a progressão tumoral nesses modelos.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Maryland, Condado de Baltimore (Investigador Principal - Achuth Padmanabhan; Número do protocolo - 1947).  A lista completa de materiais e equipamentos usados neste protocolo e seus números de catálogo são fornecidas na Tabela de Materiais.

1. Preparação de linhagens celulares de câncer de ovário para transplante em camundongos

Nota: Para todos os modelos in vivo descritos neste protocolo, as células de câncer de ovário devem ser preparadas para transplante em camundongos. As células de câncer de ovário devem ser preparadas em um capuz de cultura de tecido de fluxo laminar, conforme descrito abaixo, em temperatura ambiente, salvo especificação:

1. Cultive células de câncer de ovário a 37 ^°C em uma incubadora de_CO2 com jaqueta de água, mantida a 5% de CO₂ , usando meios padrão recomendados na literatura. Se se deseja a imagem in vivo não invasiva do tumor, as células do câncer de ovário precisam ser modificadas para expressar a luciferase de forma estável antes do transplante.
2. Quando as células atingirem cerca de 80%–85% de confluência, colhe-as em condições estéreis, conforme descrito abaixo:
   1. Aspire o meio a partir da placa de cultura de tecido.
   2. Lave as células aderentes duas vezes com soro 1X tamponado com fosfato (PBS) estéril, sem cálcio nem magnésio. A presença de cálcio e magnésio no PBS pode interferir na atividade da tripsina e promover a adesão celular. Aspire o PBS da placa de cultura de tecidos.
   3. Adicione 0,05% de Tripsina-EDTA à placa de cultura de tecidos. A quantidade de tripsina a ser utilizada dependerá do tamanho da placa de cultura de tecido e da linha celular em análise. Para a maioria das linhagens celulares que crescem em uma placa de 100 mm, use 1 mL de 0,05% de Tripsina-EDTA. Para linhagens celulares de câncer de ovário fortemente aderentes, como OVCA420, recomenda-se 1 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA.
   4. Transfira a placa com as células de volta para a incubadora de_CO2 com jaqueta de água de 37 ^°Cusada para cultura de tecidos e incube por 1–5 minutos. O tempo exato de incubação necessário dependerá da linhagem celular. Algumas linhagens celulares, como TYK-Nu e HEYA8, se desprendem muito rapidamente (1–2 minutos), enquanto outras, como OVCA420, levam mais tempo (4–5 minutos).
   5. Uma vez que as células sejam desconectadas, adicione um meio contendo FBS para interromper a ação da tripsina. Adicione 6 mL de meio contendo FBS por 1 mL de tripsina. Pipete suavemente para cima e para baixo para desalojar células da placa de cultura de tecido e dissociá-las em uma suspensão de célula única.
      Nota: Quando observadas sob um microscópio invertido de campo claro, células destacadas parecerão arredondadas (em vez de planas/alongadas) e flutuarão livremente, em vez de ficarem presas à base da placa.
   6. Colete as células em um tubo cônico e centrifuge a 400 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   7. Remova o supernadante contendo tripsina e resuspenda o pellet celular em meios de cultura celular frescos contendo FBS.
3. Conte células usando um corante de viabilidade celular, como azul de tripano e um hemocitômetro. Alternativamente, um contador automático de células pode ser usado para contar células.
4. Reconstituir as células em um volume definido de PBS 1X estéril (pH 7,4) de modo que a concentração desejada de células por unidade de volume seja alcançada. O número recomendado de células para injetar em linhagens celulares de câncer de ovário humano comumente utilizadas está mostrado na Tabela 1¹³.
   Nota: O volume máximo que pode ser injetado com segurança em camundongos depende do modelo. Para o modelo intraperitoneal, o volume máximo recomendado é de 500 μL (veja a seção 2.1). Para o modelo intrabursal, o volume máximo recomendado é de 5 μL (ver seção 2.2).
5. Mantenha a suspensão celular no gelo até a hora de injetá-la em camundongos. Injete células em camundongos o mais rápido possível, de preferência dentro de 30–45 minutos após prepará-las.

2. Estabelecimento de modelos transplantáveis de câncer de ovário em camundongos

1. Estabelecendo o modelo intraperitoneal do câncer de ovário
   Nota: Neste processo, células do câncer de ovário que expressam luciferase de forma estável são injetadas na cavidade peritoneal de uma camundonga adulta. O uso de células que expressam luciferase de forma estável permitirá o monitoramento longitudinal e não invasivo da progressão tumoral com o Sistema de Imagem In Vivo (IVIS).
   1. Prepare as células conforme descrito na seção 1. Resuspenda as células suavemente usando uma micropipeta de 1000 μL e garanta que as células permaneçam dissociadas.
      Nota: A falha em deslocar os tufos fará com que as agulhas entupam.
   2. Retire 500 μL de suspensão de células em uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha de 21G x 1 polegada. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na seringa.
      Nota: O volume máximo que pode ser injetado intraperitonealmente em uma fêmea adulta de camundongo (25–30 g) é de 500 μL. Portanto, ressuspenda as células em um volume tal que o número necessário de células esteja contido em um volume máximo de 500 μL. O número recomendado de células para injetar em linhagens celulares de câncer de ovário humano comumente utilizadas está mostrado na Tabela 1¹³.
      Nota: Se o camundongo pesa entre 20 e 25 g, recomenda-se injetar um volume menor (menos de 400 μL).
   3. Retire o animal da gaiola e coloque-o em uma superfície áspera ou com arame para contê-lo.
   4. Imobilize o camundongo acariciando suavemente a pele solta na base do pescoço usando a mão não dominante, como mostrado na Figura 1A.
   5. Pegue o mouse suavemente e gire o mouse de modo que seu lado ventral fique voltado para cima. Prenda a cauda do animal com os dedos, como mostrado na Figura 1B.
   6. Desenhe uma linha imaginária no meio do abdômen. Para localizar o local da injeção, imagine um triângulo entre a linha média e os dois mamilos no quadrante inferior direito. Certifique-se de que o local da injeção esteja no meio desse triângulo imaginário. Consulte a Figura 1B.
   7. Incline levemente a cabeça do rato para o chão, deixando-a mais baixa que a traseira. Imobilizar o rato nessa posição ajuda o conteúdo abdominal a se deslocar cranialmente. Isso reduz o risco de perfuração dos órgãos internos durante a injeção.
   8. Use um cotonete estéril de álcool para limpar a área da injeção.
   9. Usando a mão dominante, insira a agulha no local da injeção em um ângulo de 45° ou menos. Avance apenas 0,5 polegada e não mais que metade do comprimento da agulha. Certifique-se de que a agulha permaneça estável, pois o movimento na cavidade abdominal pode causar lesão nos órgãos internos.
   10. Dispense as células de forma lenta e constante na cavidade abdominal do camundongo.
   11. Puxe a agulha do mouse no mesmo ângulo de inserção. Imediatamente coloque um medidor esterilizado sobre o local da injeção para evitar qualquer vazamento.
   12. Descarte a agulha e a seringa no recipiente apropriado para objetos cortantes.
   13. Antes de colocar o rato na gaiola, marque com etiqueta auricular usando um método preferido. A marcação auricular permitirá a identificação do camundongo injetado posteriormente.
2. Estabelecendo o modelo intrabursal do câncer de ovário
   Nota: No modelo intrabursal, células de câncer de ovário que expressam luciferase de forma estável são injetadas diretamente na bursa ovariana de uma fêmea adulta de camundongo. Bursa é um saco membranoso que envolve os ovários murinos. A expressão estável de luciferase em células do câncer de ovário permitirá o monitoramento longitudinal não invasivo da progressão tumoral usando IVIS.
   1. Dia 1 – Preparando equipamentos e rato para a cirurgia de transplante intrabursal
      1. Autoclave: os instrumentos necessários para cirurgia. A lista de instrumentos é (Figura 2A):
         Tesoura de ponta fina, pinças curvas de ponta fina de 5 polegadas, Suporte para agulha Mayo-Heger, microfórceps de joalheiro dissecador, ponta fina, instrumentos para dissecar pinças com pontas finas
      2. Administrar analgesia pré-operatória de carprofeno (15 mg/Kg) a cada 24 horas por injeção subcutânea no camundongo.
         Nota: Administre o carprofeno analgésico por via subcutânea a cada 24 horas, começando 1 dia antes da cirurgia e continuando por 3 dias após a cirurgia.
   2. Dia 2 – Transplante intrabursal de células de câncer de ovário em camundongos
      1. Prepare as células do câncer de ovário para injeção conforme descrito na seção I. O volume máximo que pode ser injetado com segurança intrabursamente em um camundongo é de 5 μL. Portanto, é preferível ter células em concentração de 10⁴ células/μL. Isso permitirá o transplante de 5 x 10^{células de 4} células.
         Nota: O número recomendado de células para injeção em linhagens celulares de câncer de ovário humano comumente utilizadas está mostrado na Tabela 1¹³.
      2. Mantenha as células no gelo até o uso. Após a colheita, recomenda-se injetar as células o quanto antes, preferencialmente em até 30–45 minutos.
      3. Induza anestesia colocando o camundongo em uma câmara de isoflurano com uma taxa de fluxo de isoflurano de 4% e uma taxa de oxigênio de 3,5 L/min. Confirme que o camundongo está anestesiado verificando a imobilização e a ausência do reflexo de pinçar do dedo do pé.
      4. Transfira o rato anestesiado para uma cortina cirúrgica estéril que é colocada sobre uma bolsa térmica para roedores mantida a 37 °C. Coloque rapidamente um cone nasal e mantenha a anestesia com 1,5% de isoflurano e 98,5% de oxigênio. Certifique-se de que o rato esteja anestesiado confirmando a ausência do reflexo de beliscão dos dedos.
      5. Certifique-se de que o camundongo permaneça anestesiado durante todo o procedimento, confirmando a ausência do reflexo de beliscão a cada 15 minutos. Monitore a frequência respiratória do rato durante a anestesia para garantir que ela seja lenta e suave. Se a frequência respiratória mudar, ajuste a dosagem de isoflurano. Se o camundongo apresentar dificuldade respiratória ou ofego, diminua a dose. Por outro lado, se o camundongo apresentar aumento na frequência respiratória, aumente ligeiramente a dose de isoflurano.
         Nota: Evite manter o rato sob anestesia por mais de 40 minutos. Para isso, é importante ser eficiente e rápido durante o procedimento cirúrgico.
      6. Posicione o camundongo com o lado em que as células do câncer de ovário serão transplantadas intrabursamente, virado para cima, conforme mostrado na Figura 2B.
      7. Aplique pomada ocular em ambos os olhos do camundongo para protegê-los do ressecamento (dessecamento da córnea).
      8. Se o camundongo tiver pelo, raspe os pelos da metade inferior do rato do lado que está virado para cima. Limpe bem a área raspada e coloque o mouse em um novo tapete estéril. Se estiver trabalhando com o Foxn1 nu (B6. Cg-Foxn1 nu/J) cepa de camundongo, pule essa etapa.
      9. Use uma cobertura cirúrgica estéril para cobrir o camundongo de modo que apenas a metade inferior do corpo fique exposta.
      10. Lave as mãos corretamente com sabão antes do início da cirurgia e coloque um par novo de luvas cirúrgicas estéreis. Evite tocar em áreas ou itens não estéreis após colocar as luvas cirúrgicas.
      11. Use um aplicador estéril de ponta de algodão para aplicar o líquido betadine no local cirúrgico em um movimento circular no sentido horário de dentro para fora. Em seguida, use um swab álcool estéril para limpar a mesma área de forma semelhante. Repita esse procedimento mais duas vezes.
          Nota: Não toque em itens ou áreas não estéreis durante o procedimento cirúrgico. Troque as luvas imediatamente se houver contato com uma superfície não estéril. É altamente recomendado ter outra pessoa para ajudar durante a aplicação da intrabursal. Essa pessoa pode ajudar a manusear itens não estéreis durante a cirurgia.
      12. Espere 1 minuto para o álcool secar.
      13. Localize o local que fica aproximadamente 1,5 cm acima da pata traseira e a 5 mm da caixa torácica do camundongo, como mostrado na Figura 2B. Levante a pele nesse local com a pinça curva, depois faça uma incisão vertical de 5 mm com uma tesoura de ponta fina.
          Nota: Antes de fazer a incisão, certifique-se de que o camundongo está completamente sob efeito de anestesia, confirmando a ausência do reflexo de beliscão do dedo do pé.
      14. Segure a pele de um lado com microfórceps de ponta fina e faça uma incisão no tecido subcutâneo no mesmo local.
      15. Neste ponto, a camada peritoneal sob o tecido subcutâneo se tornará visível. Use uma pinça curva, serrada e de ponta fina para segurar a camada peritoneal e faça uma incisão de cerca de 2,5 mm de comprimento com tesoura de ponta fina.
      16. Segure o lado do retalho da incisão peritoneal com a pinça serrilhada e localize a almofada de gordura ovariana usando pinças finas. O ovário está localizado sob a almofada adiposa.
      17. Puxe delicadamente um pouco da almofada adiposa ovariana junto com o ovário através da incisão.
      18. Use a pinça de dissecação para segurar a almofada adiposa de modo que o ovário fique voltado para cima e imóvel.
          Nota: Não segure o ovário com pinças. Sempre use pinças serrilhadas para segurar a almofada de gordura porque o tecido está escorregadio.
      19. Peça à pessoa que está ajudando para preparar a seringa contendo a suspensão celular. Recomenda-se usar uma seringa de insulina de 0,3 mL.
      20. Insira suavemente a agulha com o chanfro voltado para cima na bursa ovariana a partir da junção da trompa de Falópio com o ovário. Certifique-se de que todo o chanfro entre dentro da bursa antes de pressionar o desentupidor.
          Nota: Tome cuidado para não perfurar a bursa na extremidade oposta do local de inserção.
      21. Empurre suavemente o êmbolo e transfira o conteúdo da seringa para a bursa ovariana. Remova a agulha rapidamente.
      22. O inchaço da bursa ao redor do ovário indicará inoculação bem-sucedida das células.
      23. Espere 5 segundos e coloque o ovário de volta suavemente na cavidade peritoneal.
      24. Feche o peritônio usando um ponto monofilamento absorvível 6-0 com um ou dois pontos cirúrgicos simples e interrompidos.
      25. Feche a incisão cutânea usando o ponto monofilamento absorvível 6-0 com um ponto cirúrgico simples e contínuo. Certifique-se de que não haja sangramento no local da incisão.
      26. Aplique pomada antibiótica tripla (Bacitracina, Neomicina e Polimixina B) no local da incisão após fechá-la.
      27. Administrar Carprofeno 15 mg/Kg subcutâneo ao rato para alívio da dor.
      28. Coloque uma etiqueta auricular no mouse usando um método preferido. A marcação auricular permitirá a identificação do camundongo injetado posteriormente.
      29. Transfira o rato para uma gaiola nova. Coloque essa gaiola com metade em uma bolsa térmica por pelo menos 60 minutos. Certifique-se de que o efeito da anestesia tenha desaparecido completamente até esse momento e que o rato esteja acordado e ativo.
          Nota: Ratos são propensos à hipotermia sob anestesia. Por isso, é importante fornecer calor externo para regular a temperatura corporal.
      30. Verifique os camundongos após 4-5 horas após a cirurgia para ver se há sinais de sangramento no local da incisão ou outro desconforto.
      31. Administre carprofeno de 15 mg/Kg para camundongos por via subcutânea a cada 24 horas pelos próximos 3 dias.
      32. Se as células inoculadas forem geneticamente modificadas para expressar luciferase de forma estável, a carga tumoral pode ser medida usando IVIS a partir do primeiro dia após a injeção, conforme descrito na seção 3.

3. Imagem não invasiva de tumor de camundongo usando o Sistema de Imagem In Vivo (IVIS)

Um objetivo importante em vários estudos utilizando os modelos de tumores transplantáveis descritos neste relatório é obter dados longitudinais sobre a progressão tumoral. Embora o volume dos tumores subcutâneos possa ser estimado com um calibre vernier, essa não é uma opção viável para tumores formados usando os modelos intraperitoneal e intrabursais. Para superar esse desafio e determinar a carga tumoral intraperitoneal, a maioria dos laboratórios utiliza imagens bioluminescentes não invasivas à base de luciferase. Para possibilitar isso, células cancerígenas transplantadas são projetadas para expressar estabilidade a luciferase, que produz bioluminescência após a administração do substrato, D-luciferina. A bioluminescência é detectada de forma não invasiva usando um Sistema de Imagem In Vivo (IVIS). Esse sinal é então quantificado para acompanhar a carga tumoral e revelar informações sobre metástase e eficácia terapêutica medicamentosa. A seguir, descrevemos o protocolo para acompanhamento da carga tumoral por meio de imagens bioluminescentes não invasivas à base de luciferase com IVIS em camundongos.

1. Preparação do substrato de D-luciferina
   1. Prepare 15 mg/mL de solução de D-luciferina em 1X PBS (pH 7,4) sob condições estéreis.
   2. Esterilize a solução com filtro usando um filtro de 0,22 μm.
   3. Embrulhe a solução em papel alumínio para protegê-la da luz até o uso.
2. Inicializando o imager IVIS para aquisição de imagem
   1. Abra o software "Imagem viva" no computador conectado ao imager IVIS e faça login.
   2. O imager precisa ser inicializado para aquisição de imagem. Isso é feito da seguinte forma:
      1. Ao fazer login, uma janela do painel de controle do IVIS será aberta, conforme mostrado na Figura 3A.
      2. Clique no botão "inicializar" localizado no lado inferior direito da janela (Figura 3A). Vai levar alguns minutos para o sistema inicializar.
         Nota: Inicialmente, a barra de temperatura na parte inferior da janela fica vermelha, indicando que a câmera de imagem está em processo de atingir sua temperatura alvo de -90 °C (Figura 3B).
      3. Quando a câmera de imagem atinge a temperatura alvo (-90 °C), a barra de temperatura fica verde, e o status do sistema mostra "Pronto para uso" (Figura 3C). Agora o imager está pronto para fotografar o mouse.
         Nota: O tempo de exposição, o binning e o f/stop podem ser ajustados conforme as necessidades do usuário.
3. Preparando o camundongo para a imagem IVIS
   Antes de imaginar o camundongo, a D-luciferina deve ser injetada intraperitonealmente.
   1. Retire o rato da gaiola e coloque-o sobre uma superfície áspera ou com arame. Acaricie suavemente os camundongos para prendê-los corretamente, conforme descrito na seção 2.1.
   2. Pegue o mouse e gire de forma que o lado ventral fique voltado para cima.
      Nota: Se o mouse estiver devidamente preso, todas as quatro pernas se estenderão para fora ao levantar, conforme mostrado na Figura 1B. Segure a cauda entre os dedos como uma medida extra de contenção durante o procedimento.
   3. Use um swab álcool estéril para limpar o local da injeção, conforme no protocolo de injeção intraperitoneal da seção 2.1.
   4. Use uma seringa de 1 ml de TB e uma agulha de 30 g e 1/2 polegada para injetar intraperitonealmente um volume apropriado de D-luciferina da solução padrão para alcançar uma dose final de 150 mg/kg de D-luciferina.
      Nota: Consulte o protocolo de injeção intraperitoneal na seção 2.1 para instruções sobre como realizar a injeção intraperitoneal. Se for usado camundongos C57BL/6 (para modelos de aloenxerto singênico), é altamente recomendado remover o pelo antes de realizar imagens bioluminescentes usando IVIS. Pelo preto e pele pigmentada atenuam significativamente a luz, reduzindo a intensidade do sinal.
   5. Coloque o rato de volta na gaiola com cuidado. O tempo exato de espera e de exposição precisarão ser determinados empiricamente. Isso pode ser determinado da seguinte forma.
      1. Anestesie o camundongo imediatamente após a injeção de D-luciferina e faça a imagem dele conforme descrito na Seção 3.4 a cada 2 minutos por 20 minutos.
         Nota: Ao realizar este experimento pela primeira vez, recomenda-se determinar como o sinal de luciferase varia ao longo do tempo após a administração de D-luciferina. Isso ajudará a determinar o momento mais apropriado para fotografar o camundongo após a administração de D-luciferina em experimentos subsequentes. O sinal bioluminescente pode variar dependendo de vários fatores, incluindo a linhagem celular, modelo de xenoenxerto de camundongo, nível de expressão de luciferase, etc.
      2. Em cada intervalo, faça estimativas de 5, 10 e 15 segundos.
      3. Use esses dados para traçar uma curva padrão. Com base na curva, escolha o tempo de espera e de exposição em que o sinal atinge um platô mantendo a maior intensidade.
         Nota: Normalmente esse tempo é entre 5 e 10 minutos, mas pode variar dependendo do modelo.
4. Imagem não invasiva de tumores de camundongos usando IVIS
   1. Após o período de espera, coloque o camundongo em uma câmara de isoflurano com taxa de isoflurano de 4% e vazão de oxigênio de 3,5.
   2. Confirme que o camundongo está anestesiado verificando a ausência do reflexo de pinçar do dedo do pé.
   3. Coloque o rato no palco dentro do imager IVIS e deslize o nariz para dentro do cone nasal para manutenção anestésica durante a imagem. Certifique-se de que eles fiquem dentro das linhas marcadas do foco da câmera e feche a porta do imager.
      Nota: Haverá cinco posições no palco dentro do imager. Cada posição também terá seus respectivos cones nasais anestésicos. Isso permite fotografar 5 camundongos simultaneamente. Dependendo do número de mouses para imagem, ajuste o campo de visão da câmera na caixa do painel de controle de "D" (campo mais amplo) para "A" (foco estreito). O camundongo pode ser colocado em qualquer lugar do palco, desde que seus narizes fiquem dentro dos cones do nariz anestésico durante toda a duração da imagem. Recomenda-se fotografar os camundongos sequencialmente, primeiro do lado dorsal e depois do lado ventral.
   4. Ajuste o tempo de exposição e clique em "Adquirir" no painel de controle (Figura 3C).
      Nota: Certifique-se de que luminescência, fotografia e sobreposição estejam "ATIVADAS" no painel de controle.
      Uma vez capturada a imagem, a imagem do rato com sinal de luciferase aparecerá na tela.
   5. Abra o imager e vire o mouse para que o lado ventral fique virado para cima e clique em "Adquirir" após fechar a porta do imager.
      Nota: Certifique-se de que o nariz do camundongo esteja dentro do cone nasal para garantir a manutenção da anestesia durante a imagem.
   6. Assim que as imagens dorsal e ventral forem adquiridas, abra a porta do imageador e coloque o rato de volta em sua gaiola.
   7. Espere de 5 a 10 minutos para garantir que o rato recupere a consciência.
5. Análise da imagem do IVIS para determinar a carga tumoral no camundongo
   1. Ajuste da escala de cores das imagens
      1. Salve as imagens brutas na pasta apropriada clicando em "arquivo" seguido de "Salvar como".
         Nota: O imageador ajusta automaticamente a escala de cores com base na intensidade do sinal. É recomendável manter a escala de cores constante em todas as imagens tiradas ao longo do experimento. A escala de cores também pode ser ajustada posteriormente abrindo a imagem raw usando este software.
      2. Para ajuste manual, outra janela da paleta de ferramentas aparece no canto superior direito da tela (Figura 3D), vá para "Ajuste de imagem" e então escolha "manual" para escala. Insira o número mínimo e máximo desejado para o valor da escala e clique em "Enter" (Figura 3E).
         Nota: Ao ajustar a escala de cores de uma imagem adquirida anteriormente, primeiro abra o arquivo raw infoclick.txt imagem salvo da respectiva pasta usando "file" seguido de "open".
         3.5.1.3. Salve essa imagem separadamente da imagem raw na pasta apropriada.
   2. Análise da carga tumoral no camundongo
      Nota: Para a medição quantitativa da carga tumoral, você pode medir a intensidade do sinal de cada camundongo em imagens tiradas durante todo o período. Você pode colocar esses valores no Excel ou GraphPad Prism para análise estatística e para gerar gráficos lineares da progressão tumoral.
      1. Abra o arquivo infoclick.txt raw salvo da respectiva pasta.
      2. Vá para a seção ROI (Região de Interesse) da janela da paleta de ferramentas que aparece no canto superior direito (Figura 3F).
      3. Desenhe a área de retorno do investimento em cada mouse manual ou automaticamente com a ajuda da função "desenhar" usando qualquer forma que funcione melhor para você. Para fazer isso manualmente, mantenha a área consistente para todas as imagens de todos os mouses que estão sendo comparados.
         Nota: Para inoculação intraperitoneal, a seleção manual do ROI para todo o tórax e abdômen na imagem ventral do camundongo funciona melhor. Para inoculação intrabursal, a seleção manual do ROI na área da imagem dorsal com sinal funciona melhor.
         Nota: A seleção automática de ROI selecionará apenas regiões com maior intensidade de sinal de imagem.
      4. Clique em "Medir ROI" (Figura 3F). Isso abrirá outra janela com dados sobre as contagens totais e médias de cada ROI selecionado.
      5. Salve esse arquivo na pasta apropriada para que possa ser acessado depois. Use esses dados para plotar o gráfico no MS Excel ou no GraphPad Prism.

Resultados

Dados representativos de um modelo de câncer de ovário intraperitoneal usando células OVCAR8 marcadas com luciferase em camundongos nus imunocomprometidos com Foxn1 são mostrados na Figura 4. A expressão estável de luciferase nessas células permitiu o monitoramento longitudinal da progressão tumoral por meio de imagens bioluminescentes não invasivas usando o imager IVIS, conforme descrito na seção III. A injeção intraperitoneal de 5 milhões de células de OVC...

Discussão

A capacidade de imitar interações complexas entre células tumorais, microambiente e fatores sistêmicos faz dos modelos de camundongos um excelente recurso para estudar a progressão do câncer de^{ovário 12}. Além de avançar nossa compreensão dos fatores que impulsionam a progressão e a metástase do câncer de ovário, modelos de camundongos in vivo também desempenham um papel importante na avaliação pré-clínica de pequenas moléculas e nas estratégias de tratamento para ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro estéril de seringa de 0,22 um, 33mm	Fisher Scientific	09-720-004
Seringa de 1 ml de TB	BD	309659
21G, agulha de 1 polegada	BD	305167
30G, ½ agulha de polegada	BD	305106
Pinça curva de ponta fina de 5 polegadas	Fisher Scientific	1631
6-0 Sutura monofilamentosa absorvível	MaxonTM	6532-11
Swab de álcool (álcool isoprolílico 70%)	Dukal Corp	80003156
Betadina (solução de iodo a 1%)	Produtos Purdue	367618150085
Carprofeno Inj, 50mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Centrífuga	Eppendorf	5702
D-luciferina	Laboratórios Syd	MB000102-R70170
Micropinças de joalheiro dissecando, ponta fina	Fisher Scientific	08-953E
Pomada para os olhos	Medvet	11897
Tesoura de ponta fina	Fisher Scientific	8940
Bolsa térmica	Sunbeam	731-500
Instrumentos que Dissecam Pinças com Pontas Finas	Fisher Scientific	S08096
Seringa de Insulina 3/10ml	BD	328438
Isofurano	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Maionese - Suporte de Agulha Reta Heger	Fisher Scientific	08-966
PBS 1X estéril (1X), sem cálcio nem magnésio	Corning	21-040-CV
Aplicadores de ponta de algodão estéril	McKeesson	24-106-1S
Calibre Estéril	Kendall	3033
Almofada/Toalha/Drapeado Estéril, não fenestrada	Henry-Schein	100-9687
Pomada Tripla Antibiótica	Globo	4006-4SL
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho	Gibco	25200-056