É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Protocolo Integrado para Avaliação de Linfáticos Meníngeos: Injeção de Cisterna Magna, Imagem de Linfonodos, Dissecção Meníngea e Coloração em Montagem Inteira

381 vistas

⸱

DOI:

10.3791/71140

⸱

29 de maio de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para avaliar os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de camundongos, que desempenham um papel importante em múltiplas doenças neurológicas. O objetivo desse protocolo é fornecer um método integrado que permita tanto a avaliação funcional da drenagem dos traçadores quanto a caracterização morfológica detalhada da rede de MLVs dorsais.

Resumo

Vasos linfáticos meníngeos (MLVs) emergiram como reguladores críticos da homeostase do sistema nervoso central (SNC), e a disfunção dos VLM tem sido implicada em vários distúrbios neurológicos. Uma avaliação abrangente da morfologia e função dos MLVs é, portanto, essencial para entender seu papel na fisiologia e doenças do SNC. Este protocolo descreve um método integrado para avaliar MLVs em camundongos usando quatro técnicas-chave: injeção intra-cisterna-magna (i.c.m.) de traçadores fluorescentes, imagem ao vivo dos linfonodos cervicais (CLNs), dissecção meníngea e coloração em montagem total. Primeiro, a agulha de 30 G é conectada à seringa e à bomba de infusão por meio de um tubo de polietileno (PE). Após a anestesia do camundongo, a dura-máter é exposta por dissecação contunda dos músculos do pescoço, e a agulha de injeção é inserida na cisterna magna (CM) para entregar o traçador ao líquido cefalorraquidiano (LCR) com controle preciso. A drenagem traçante para os CLNs pode ser visualizada em tempo real, enquanto a dissecação meníngea subsequente e a coloração de montagem inteira permitem uma análise morfológica detalhada dos MLVs dorsais. Todo o procedimento pode ser concluído em até 3 horas, incluindo injeção de i.c.m., perfusão de tecido, isolamento do crânio e colocação em solução fixadora. Esse protocolo também pode ser adaptado para administração intracraniana de fármacos ou combinado com análises moleculares, já que o procedimento de dissecação meníngea é compatível com tecidos frescos e não fixados, adequados para extração de RNA e proteínas.

Introdução

Os MLVs estão localizados nos seios durais e são capazes de transportar componentes do LCR e células imunes do SNC até osCLNs 1,2. A descoberta dos MLVs desafiou o conceito tradicional de "privilégio imunológico" do sistema nervoso central e emergiu como um ponto crítico de pesquisanos últimos anos 3. Estudos mostraram que a função comprometida dos MLVs está intimamente associada a várias doenças, incluindo Alzheimer, declínio cognitivo relacionado à idade, tumores cerebrais e infecções do SNC 4,5,6,7. À medida que a pesquisa nessa área avança, há uma necessidade crescente por métodos experimentais integrados, reproduzíveis e bem padronizados.

A maioria dos protocolos existentes para pesquisa em vasos linfáticos foca nos vasos linfáticosperiféricos 8,9,10. Em estudos relacionados a MLVs, um estudo descreveu um procedimento simples de canulação de CM que permite acesso direto ao LCR sem danificar o parênquima do crânioou do cérebro 11. Quando combinado com técnicas de imagem, esse método pode avaliar efetivamente a função do sistema glymphático e a dinâmica do LCR. No entanto, protocolos experimentais detalhados para estudar a função e morfologia dos MLVs não foram bem documentados.

O protocolo atual integra imagens funcionais com análise morfológica, permitindo a aquisição simultânea de dados de função de drenagem e morfologia estrutural do mesmo animal, reduzindo assim o número de animais usados e melhorando a comparabilidade e consistência dos dados. No geral, esse protocolo pode ser usado para estudar mudanças estruturais e funcionais em MLVs em vários modelos de doença, bem como para avaliar os efeitos de intervenções farmacológicas ou genéticas nos MLVs. O protocolo fornece descrições detalhadas dos passos operacionais, principais precauções e orientações para solução de problemas. Além disso, a técnica de injeção de i.c.m. descrita neste protocolo pode ser aplicada independentemente para a administração intracraniana de fármacos, e o procedimento de dissecção meníngea é compatível com tecido fresco para extração subsequente de RNA ou proteína, oferecendo considerável flexibilidade e escalabilidade.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os procedimentos para camundongos descritos neste protocolo foram realizados em conformidade com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Xangai (Aprovação nº ECSHU 2023-099).

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e tampões

ATENÇÃO: Opere em uma capela exaustiva química e use luvas para minimizar os riscos potenciais ao usar PFA, uma substância moderadamente tóxica e cancerígena. Todas as operações envolvendo álcool isoamílico devem ser realizadas em uma exaustão química longe das fontes de ignição, usando luvas e máscara, para reduzir os riscos de exposição.

  1. Prepare instrumentos cirúrgicos, como um par de tesouras retas, dois pares de pinças curvas de ponta fina, dois pares de pinças de ponta romba, um par de micro tesouras e um par de micropinças retas com pontas lisas (não serrilhadas).
    NOTA: Limpe os instrumentos cirúrgicos com etanol 75% e mantenha-os secos antes e depois do experimento.
  2. Preparem os tampões.
    1. 1x PBS.
    2. 4% de solução fixa com paraformaldeído (4% PFA).
    3. Solução bloqueante (1x PBS contendo 3% de albumina sérica bovina (BSA), 0,5% Triton X-100 e 2% soro bovino fetal).
    4. Buffer de diluição de anticorpos (1x PBS contendo 3% de BSA e 0,5% de Triton X-100).
    5. Meio de montagem antifade.
      NOTA: O reagente preparado pode ser armazenado a 4 °C por um mês.
  3. Prepare solução anestésica 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin, 1,25%, 50 mL)
    1. Pese 0,625 g de Tribromoetanol em um tubo de 2 mL, adicione 1,25 mL de álcool isoamílico e dissolva bem (shaker de 37 °C).
    2. Transfira a solução totalmente dissolvida de álcool Tribromoetanol-isoamílico para um tubo cônico de 50 mL, adicione 1x PBS para levar o volume total a 50 mL e misture bem.
    3. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm em um armário de segurança biológica.
  4. Prepare Ovalbumina, solução conjugada de Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/mL). Dissolva 2 mg de OVA-647 em 1 mL de líquido cefalorraquidiano artificial (LCR).

2. Montagem da agulha de injeção e conexão com a bomba de microinjeção

  1. Use pinças sem embutido para soltar a agulha de 30 G e manter a ponta11 (diâmetro externo 0,30 mm, diâmetro interno 0,15 mm, comprimento 8 mm).
  2. Use um comprimento de tubo de PE-10 de 30 cm (diâmetro externo 0,64 mm, diâmetro interno 0,28 mm) para conectar a agulha quebrada de 30 G à agulha de microinjeção contendo uma agulha de 30 G (Figura 1).
  3. Monte a agulha de microinjeção, com o tubo e a agulha de 30 G acoplados, na bomba de microinjeção.

3. Injeção de CIM e imagem ao vivo

ATENÇÃO: Se a agulha for inserida muito fundo e penetrar no parênquima cerebral, o injeto será entregue ao tecido cerebral em vez do compartimento do LCR, comprometendo a precisão do resultado e potencialmente levando à mortalidade de camundongos. Durante o procedimento cirúrgico, é necessário monitoramento fisiológico contínuo do camundongo. A profundidade da anestesia deve ser avaliada a cada 15 minutos usando o reflexo de beliscão do dedo para garantir que o animal permaneça sem dor. A temperatura corporal deve ser mantida em 37 °C ± 0,5 °C usando uma bolsa térmica para prevenir hipotermia e seus efeitos associados na função fisiológica. Além disso, a respiração e a frequência cardíaca devem ser registradas a cada 30 minutos, avaliadas observando os movimentos torácicos e palpando o ápice cardíaco. Durante a injeção de CIM, se a agulha for inserida profundamente e causar sangramento, isso indica uma injeção fracassada. Encerre o experimento e eutanasie o animal.

  1. Pese o rato e administre 200 mg/kg de Avertin por injeção intraperitoneal para anestesiar o rato.
    NOTA: Anestésicos alternativos (por exemplo, cetamina/xilazina) podem ser usados.
  2. Aplique creme depilatório na região cervical para remover pelos sobre os linfonodos quando o reflexo de beliscão do dedo cessar e a respiração ficar lenta e estável.
  3. Raspe a região dorsal do pescoço.
  4. Coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica sobre uma almofada térmica com a cabeça inclinada em um ângulo de 120° em relação ao porta-malas (Figura 2A).
  5. Limpe a área sequencialmente com povidona-iodo e 75% de etanol.
  6. Aplique pomada oftálmica de eritromicina.
  7. Faça uma incisão na linha média da pele do pescoço e separe as camadas musculares de forma direta.
    NOTA: Usando dois pares de pinças de ponta romba, separe as camadas musculares para minimizar o sangramento.
  8. Disseca o músculo com pinças de ponta fina até que a dura-máter translúcida que cobre o CM se torne visível  (Figuras 2B, C).
    NOTA: Use uma pinça curva de ponta fina para retrair os músculos e manter uma exposição constante do CM.
  9. Sob um estereomicroscópio, use pinças contundentes para segurar a agulha e inseri-la em um ângulo de 45° em relação ao plano da dura-máter, a uma profundidade de aproximadamente 1–2 mm. Posicione o bisel da agulha paralelo à dura-máter, de modo que fique completamente abaixo dela (Figura 2D).
    NOTA: Aplique uma força suave com a agulha para perfurar a dura-mãe. A perfuração bem-sucedida é indicada por uma perda palpável de resistência, juntamente com a visualização da ponta da agulha sob a dura-máter e a saída do LCR.
  10. Use papel absorvente para secar qualquer líquido cefalorraquidais vazando.
  11. Ajuste a bomba de microinjeção para fornecer a 1 μL/min. Injete 5 μL de solução de OVA-647 (2 mg/mL) no CM4 (Figura 2E).
  12. Deixe a agulha no lugar por 2 minutos para evitar o refluxo.
  13. Aplique uma gota de cola biológica nas meninges.
  14. Feche a incisão cirúrgica.
  15. Realize imagens in vivo do camundongo para monitorar a intensidade do contraste nos CLNs em vários momentos (30 min, 60 min). Use os seguintes parâmetros de imagem: tempo de exposição: 0,5 s; filtro de excitação: 640 nm; Filtro de emissão: 680 nm.

4. Isolamento da parte dorsal do crânio do camundongo

NOTA: Confirme a ausência do reflexo de pinçar do dedo do pé e a cessação da respiração espontânea antes de iniciar a dissecação torácica.

  1. Eutanasie o camundongo com overdose de Avertin (600 mg/kg) e realize perfusão cardíaca com 20 mL de 1x PBS ou soro fisiológico normal.
  2. Decapite o rato para isolar a cabeça.
  3. Faça uma incisão ao longo da linha média do crânio para abrir o couro cabeludo.
  4. Use dois hemostatos curvos para separar o couro cabeludo bilateralmente por meio de uma retração suave. Em seguida, insira os hemostatos curvos nas fossas orbitárias e retire cuidadosamente o couro cabeludo residual das regiões nasal e oral (Figuras 3A–C).
    NOTA: Este método permite a separação rápida e completa do couro cabeludo.
  5. Remova a mandíbula mantendo o crânio intacto (Figura 3D).
  6. Remova o osso da base do crânio para expor a parte ventral do cérebro (Figura 3E).
  7. Extraia cuidadosamente o cérebro com pinças contundentes, evitando contato com a dura-máter dos ossos parietais (Figura 3F).
  8. Imergir completamente o crânio dorsal em 5 mL, 4% de PFA e fixar por 24 horas a 4 °C (Figura 3G).
    PONTOS DE PAUSA: Armazene crânios fixos a 4 °C por no máximo uma semana. Retire a amostra de 4 °C e permita que retorne à temperatura ambiente antes da dissecação meníngea.

5. Dissecação de meninges do crânio do camundongo

  1. Lave o crânio fixo com 5 mL 1x PBS, repetindo a lavagem três vezes (10 min cada).
  2. Coloque o crânio com o lado dorsal para baixo em um recipiente de 10 cm cheio de 1x PBS  (Figura 4A).
  3. Use a ponta da pinça de ponta fina para segurar ou pressionar a bola timpânica e removê-la do crânio (Figura 4B).
    NOTA: Remover a bola timpânica é um passo crítico para evitar o rasgo meníngeo causado pela adesão durante a separação do crânio.
  4. Corte de perto ao longo da superfície ventral do crânio por cerca de 2 mm com tesoura para alisá-los (Figura 4C).
  5. Use pinças finas, limpe meticulosamente o tecido branco residual da região de confluência dos seios nasais (COS) das meninges (Figura 4D).
    NOTA: A remoção incompleta do tecido residual é uma das principais causas de coloração inespecífica na imunomarcação.
  6. Use micropinças finas para levantar suavemente uma borda das meninges a partir da margem do crânio, depois levante a borda oposta (Figuras 4E, F).
  7. Segure a borda em forma de tigela da meninge e puxe para separá-la do crânio na região do COS (Figura 4G).
  8. Remova o osso maxilar com tesoura (Figura 4H).
  9. Segure novamente a borda em forma de tigela das meninges e puxe para separar as meninges do crânio na área do osso frontal (Figura 4I).
  10. Coloque as meninges intactas em uma placa de 24 poços contendo 1 mL PBS 1x, pronta para coração.
    NOTA: Se as meninges romperem durante a autópsia, especialmente na junção dos seios sagital superior e transverso, a amostra pode não ser adequada para análise posterior. Se for observada alta coloração de fundo inespecífica, adicione uma etapa de têmpera após a fixação de PFA (por exemplo, incube com solução de glicina 0,1 M por 40min 12) para reduzir ainda mais o sinal de fundo.

6. Bloqueio, anticorpo primário e coloração secundária de anticorpos

  1. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar o PBS 1x para que as meninges aderam ao fundo da placa do poço.
  2. Bloqueie as meninges de montagem inteira com solução bloqueante de 200 μL em uma placa de 24 poços por 1 h em temperatura ambiente.
    NOTA: Espalhe suavemente as meninges completamente na solução bloqueadora usando pinças para garantir uma exposição uniforme.
  3. Use uma pipeta para remover a solução bloqueadora.
  4. Incubar as meninges de toda a montagem com 200 μL de anticorpo anti-LYVE-1 diluído (marcador específico do vasolinfático 13) em uma diluição de 1:200 (concentração final de 1 μg/mL) durante a noite a 4 °C.
  5. Use uma pipeta para remover a solução de anticorpos.
  6. Lave três vezes com 1x PBS (10 min cada).
  7. Incubar meninges de montagem inteira com o DAPI (concentração final de 1 μg/mL) e Alexa Fluor 488 anti-rato de burro IgG (concentração final de 2 μg/mL) por 1 hora em temperatura ambiente em 1x PBS.
    NOTA: Proteja da luz durante a incubação de anticorpos.
  8. Use uma pipeta para remover a solução de anticorpos.
  9. Lave três vezes com 1x PBS (10 min cada).

7. Montagem e imagem

  1. Pipete 100 μL de 1x PBS no centro de uma lâmina.
  2. Flutuar e espalhar as meninges de toda a montanha dentro da gota (Figura 5A).
  3. Aspire o PBS 1x para permitir que o tecido adera de forma plana à lâmina (Figura 5B).
  4. Aplique 20 μL de meio de montagem sobre as meninges de montagem inteira.
  5. Coloque uma cobertura sobre o papel de papel (Figura 5C).
  6. Seque as lâminas ao ar em temperatura ambiente e armazene as lâminas a 4 °C.
    PONTOS DE PAUSA: Os slides podem ser armazenados a 4 °C por até um mês. Remova a lâmina de 4 °C e deixe voltar à temperatura ambiente. Remova qualquer condensação da superfície deslizante com papel absorvente.
  7. Use uma lente objetiva 20x para adquirir imagens MLVs. Ajuste o canal para FL Green com comprimento de onda de emissão de 518 nm e tempo de exposição de 100 ms.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Após a injeção de OVA-647 em i.c.m., imagens in vivo de pequenos animais revelaram sinais fluorescentes ovalados distintos distribuídos bilateralmente na região cervical (Figura 6A). Em injeções bem-sucedidas, o traçador ficou claramente visível nos CLNs após a injeção, com intensidade de fluorescência atingindo o pico de aproximadamente 60 minutos (Figura 6B). Além disso, sinais fluorescentes foram observados nos linfo...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este protocolo oferece um método abrangente para avaliar a função e morfologia dos MLVs, integrando injeção de i.c.m., imagens in vivo de CLNs, dissecação meníngea e coloração em montagem total. Uma vantagem chave dessa abordagem integrada em relação aos métodos convencionais é que ela permite a avaliação simultânea da função de drenagem linfática e da morfologia dos vasos dentro do mesmo animal, eliminando a necessidade de coortes separadas e, assim, reduzindo a variabilidade e...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por financiamento do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2023YFC2306500), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82502108) e Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2024M760542).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Referências

  1. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  2. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212, 991-999 (2015).
  3. Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. A (delayed) history of the brain lymphatic system. Nat Med. 25, 538-540 (2019).
  4. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease. Nature. 560, 185-191 (2018).
  5. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  6. Li, X., et al. Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system. Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).
  7. Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
  8. Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
  9. Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
  10. Akwii, R. G., et al. Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation. J Vis Exp. (197), e65393 (2023).
  11. Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378 (2018).
  12. Hsieh, Y. T., Chen, S. L. Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence. Bio Protoc. 14, e5076 (2024).
  13. Banerji, S., et al. Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).
  14. Da Mesquita, S., et al. Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy. Nature. 593, 255-260 (2021).
  15. Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
  16. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
  18. Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Vasos Linf ticos MeningesInje o de Marcador FluorescenteLinfonodos CervicaisDura m terSistema Nervoso CentralPerfus o Tecidual
Protocolo Integrado para Avaliação de Linfáticos Meníngeos: Injeção de Cisterna Magna, Imagem de Linfonodos, Dissecção Meníngea e Coloração em Montagem Inteira
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.