Detecção de alta precisão de Sítios de Edição de RNA usando Scanner de Edição de RNA Diferencial Calibrado

Resumo

Este protocolo descreve o uso do Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), um fluxo de trabalho computacional que integra chamadas de variantes conjuntas DNA–RNA, recalibração otimizada para sinal e modelagem estatística consciente de replicações para identificar locais diferenciais de edição de RNA com alta precisão.

Resumo

A delimitação precisa da edição de RNA continua sendo tecnicamente desafiadora porque alterações pós-transcricionais genuínas devem ser distinguidas de variantes genômicas e artefatos de sequenciamento. Essa dificuldade é especialmente marcada para a edição de citidina para uridina catalisada pelas enzimas APOBEC, onde mudanças misturadas de DNA e RNA obscurecem o verdadeiro sinal de edição. O Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES) fornece uma estrutura computacional estruturada para lidar com essas limitações por meio de interrogação integrada de variantes DNA–RNA e preservação direcionada de assinaturas de edição autênticas. Este protocolo apresenta o fluxo de trabalho CADRES, incluindo preparação de dados, chamada conjunta de variantes de RNA, recalibração da qualidade de base que preserva sinais, filtragem de artefatos e avaliação diferencial da edição de RNA entre condições experimentais. O CADRES suporta sequenciamento pareado de RNA-seq e genoma inteiro ou êxoma inteiro com replicação biológica.  Uma estratégia de filtragem em múltiplos estágios, incluindo remoção de homopolímeros e triagem de parálogo baseada em PBLAT, reduz sistematicamente os falsos positivos enquanto preserva eventos de edição de baixa frequência. Ao combinar calibração com modelagem consciente de replicações, o CADRES aumenta a precisão e a reprodutibilidade da análise de edição de RNA, permitindo a interrogação da dinâmica de edição em diversos contextos biológicos. Comparado aos métodos estabelecidos, o CADRES foi projetado para melhorar a precisão na detecção de edição de RNA, especialmente para eventos C-to-U mediados por APOBEC.

Introdução

A edição de RNA constitui uma camada dinâmica de regulação pós-transcricional que permite substituições de nucleotídeos específicas do local dentro dos transcritos de RNA sem alterar a sequência de DNA subjacente. Nos metazoários, a desaminação adenosina-inosina (A>I) mediada por enzimas ADAR é a forma predominante e contribui para a diversificação de transcritos, estabilidade do mRNA, modulação imune inata e função^{neuronal 1,2}. Citidina-para-uridina (C>U) (doravante "C>U" no contexto biológico; "C>T" no contexto do sequenciamento), catalisada por membros da família APOBEC, opera junto a essas vias e está implicada no metabolismo lipídico, restrição viral, mutagênese e papéis regulatórios emergentes na biologia imune e do^câncer 3,4,5,6,7. Trabalhos recentes demonstraram que várias enzimas APOBEC, incluindo APOBEC1, APOBEC3A e APOBEC3B (A3B), catalisam a edição de RNA em contextos fisiológicos e patológicos 3,4,7,8,9,10. APOBEC3 enzimas também induzem edição de DNA, produzindo assinaturas mutacionais sobrepostas que complicam a discriminação entre edição de RNA e variação^genômica 8,10,11,12.

O sequenciamento de próxima geração permitiu a identificação em todo o transcriptoma de potenciais locais de edição de RNA, mas distinguir edições verdadeiras de SNVs genômicos ou ruído técnico continua sendo difícil. Eventos A>I e C>U aparecem como substituições A>G e C>T em bibliotecas de cDNA e podem ser confundidos por amortecimento incorreto, erros de polimerase, artefatos de mapeamento e mudanças de expressão específicas do contexto. Recursos públicos como o^{REDIportal 13} catalogam milhões de sites A>I, enquanto as anotações C>U permanecem escassas, refletindo restrições biológicas e analíticas. A identificação confiável da edição C>U — especialmente mudanças entre condições — permanece, portanto, uma necessidade analítica não atendida.

O objetivo geral do método apresentado aqui, o Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), é a identificação precisa de Variantes Diferenciais de RNA (DVRs): locais de edição que sofrem mudanças estatisticamente significativas na profundidade de edição entre duas ou mais condições^{definidas 14}. Ao desenvolver esse protocolo, buscamos enfrentar dois obstáculos persistentes. Primeiro, edições genuínas de RNA devem ser distinguidas das variantes codificadas em DNA. Segundo, as diferenças de edição devem ser quantificadas de maneira estatisticamente robusta entre conjuntos de dados de RNA-seq biologicamente replicados. A inovação central do CADRES está na integração da chamada conjunta de variantes DNA/RNA com um tratamento calibrado de variantes de RNA durante a recalibração de escore de qualidade de base (BQSR). Essa estratégia de "recalibração de reforço" preserva os novos locais de edição de RNA descobertos durante a BQSR, prevenindo assim uma degradação sistemática de qualidade que normalmente corroi a sensibilidade para edições de baixa^{frequência 15, 16, 17}. Essa abordagem reduz falsos negativos e melhora a especificidade em comparação com pipelines que dependem exclusivamente de bancos de dados incompletos de edição de RNA.

O CADRES se insere em um cenário de métodos que abordam diferentes aspectos da análise de edição de RNA. Artefatos de filtragem^{SNPiR 18} e^{RVboost 19} de conjuntos variantes apenas de RNA; ^{VaDiR 20} incorpora comparações DNA–RNA, mas não modela a estrutura replicada; O rMATS-DVR²¹ realiza testes diferenciais baseados em GLMM, mas depende exclusivamente do RNA-seq; e JACUSA/JACUSA2^22,23 suportam detecção consciente de replicações, mas não incorporam estratégias conjuntas de interrogação ou recalibração DNA–RNA. O CADRES unifica modelagem estatística consciente de replicações, chamada conjunta de variantes DNA/RNA e recalibração enriquecida para locais de edição de novo, fornecendo um fluxo de trabalho único otimizado para detectar edição de RNA dependente da condição — incluindo eventos C>U ligados à atividade^APOBEC 10,11,12.

Nesse contexto, os usuários podem considerar o CQUADRS apropriado quando seu sistema experimental atende aos seguintes critérios. Primeiro, o sequenciamento pareado de RNA-seq e genoma inteiro ou exoma completo das mesmas amostras está disponível, permitindo a partição rigorosa de eventos derivados de RNA a partir de variantes codificadas em DNA. Segundo, a questão biológica diz respeito às mudanças na edição de RNA em diferentes condições — como indução enzimática, estresse ambiental, estágios de desenvolvimento ou estados de doença — onde a modelagem estatística da profundidade específica de alelos entre replicações é essencial. Terceiro, o pesquisador busca maior especificidade na detecção de edição C>U, onde distinguir eventos de RNA da mutagênese de DNA impulsionada por APOBEC é indispensável. O CADRES é particularmente valioso em sistemas onde a atividade APOBEC induz edições tanto de RNA quanto de DNA, como demonstrado nos modelos A3B^{indutíveis 10, 11, 12} e onde métodos convencionais apenas de RNA exibem taxas inflacionadas de falsos positivos devido a SNVs confundidos ou artefatos de sequência repetitiva.

O CADRES oferece várias vantagens práticas. A chamada da variante conjunta DNA/RNA reduz os falsos positivos causados pelo SNV. A recalibração do boost preserva sinais de edição reais, incluindo eventos novos ausentes dos bancos de dados de referência. O GLMM derivado do rMATS fornece uma estrutura estatisticamente fundamentada para análise de edição diferencial entre réplicas. Juntas, essas funcionalidades fornecem uma plataforma calibrada e de alta precisão para estudar a edição dinâmica de RNA em ambientes experimentais e de doenças. Em nosso estudo^{anterior 14}, o CADRES foi rigorosamente comparado com métodos estabelecidos de detecção de edição de RNA, utilizando conjuntos de dados simulados in silico e modelos reais de células A3B induzíveis. Na avaliação in silico, o CADRES consistentemente obteve pontuações de precisão de 0,85–0,95 e pontuações de precisão de 0,92–0,98 em números replicados. O fluxo de trabalho geral do CADRES é ilustrado na Figura 1.

Protocolo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho puramente computacional de bioinformática para identificar eventos de edição de RNA C>U usando o framework CADRES. Todos os passos são realizados em um ambiente Linux usando a linha de comando. Apenas conjuntos de dados de sequenciamento disponíveis publicamente são utilizados, e nenhum sujeito humano ou vertebrado está envolvido.

1. Configuração do ambiente e instalação de software

NOTA: Os requisitos computacionais mínimos para o fluxo de trabalho CADRES são os seguintes: CPU ≥ 8 núcleos (16 núcleos recomendados), RAM ≥ 32 GB (64 GB recomendados para conjuntos de dados de genoma completo) e espaço em disco ≥ 100 GB.

1. Confirme que existe um sistema operacional Linux disponível. Abra uma janela de terminal e garanta que a permissão esteja disponível para instalar no ambiente atual do usuário.
2. Instale um gerenciador de pacotes Conda se ele ainda não estiver presente no sistema. Baixe um instalador para uma distribuição mínima da Conda no site oficial dele. Execute o script de instalação seguindo as instruções na tela.
3. Verifique se o Conda está ativo digitando o seguinte comando e certifique-se de que o comando imprime um número de versão válido.
   $ conda --versão
4. Crie um diretório funcional para o fluxo de trabalho CADRES. Navegue neste diretório usando:
   $ CD /caminho/para/working_directory
5. Baixe o código-fonte do CADRES executando:
   $ git clone --branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
6. Entre no diretório clonado executando:
   $ CD CADRES
7. Crie um ambiente Conda dedicado usando o arquivo environment.yml fornecido no repositório CADRES. Execute o comando a seguir e permita que o processo de instalação seja concluído sem interrupções.
   $ conda env criar -f environment.yml
8. Ative o ambiente recém-criado digitando o seguinte comando. Confirme que o ambiente foi ativado verificando se o aviso do terminal agora exibe seu nome.
   $ conda ativar CADRES
9. Verifique se as ferramentas de linha de comando necessárias foram instaladas corretamente. Execute cada comando abaixo e confirme que eles retornam um número de versão, e não uma mensagem de erro:
   $ python --version
   $ samtools --versão
   $ gatk --ajuda
   $ bedtools --versão
   $ pblat
   NOTA: O conjunto exato de ferramentas incluídas no ambiente CADRES pode variar ligeiramente dependendo das atualizações do arquivo environment.yml. Se uma ferramenta estiver faltando, recrie o ambiente ou atualize a lista de dependências conforme necessário.
10. Certifique-se de que haja espaço suficiente em disco disponível. Confirme que existem pelo menos 100 GB de espaço livre para genomas de referência, índices de alinhamento e arquivos intermediários BAM digitando:
    $ df -h
11. Confirme que as permissões de escrita estão disponíveis em todos os diretórios de trabalho, de saída e temporários criando um arquivo de teste:
    $ toque test_file.txt
12. Apague o arquivo depois digitando:
    $ rm test_file.txt

2. Preparação de dados

NOTA: O conjunto de dados representativo utilizado neste protocolo consiste em: HEK293T células com A3B–GFP induzida por doxiciclina; WGS às 33×; RNA-seq de extremidade pareada específica para fita (2×150 bp, ≥60 leituras/amostra); n = 3 réplicas biológicas por condição (DMSO vs. doxiciclina 72 h). Dados completos: SRA PRJNA1211186. Um subconjunto de demonstração chr22 é fornecido no repositório CADRES.

O CADRES exige: (i) WGS (≥33×) ou WES (≥33×); (ii) RNA-seq específico para a cadeia, em extremidade pareada (≥60 milhões de leituras por amostra); (iii) duas condições experimentais com ≥2 réplicas biológicas cada.

1. Prepare o genoma de referência e a anotação.
   1. Baixe o genoma de referência (FASTA) e o arquivo de anotação GTF do Ensembl ou de um repositório comparável. O genoma de referência recomendado é o conjunto primário Ensembl GRCh38: https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/ e a anotação GTF recomendada é a versão 45 do GENCODE:
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/.
   2. Indexe a referência FASTA:
      $ samtools faidx FASTA_FILE.fa
      Garanta que as convenções de nomeação dos cromossomos (por exemplo, "chr1" versus "1") sejam consistentes em todos os materiais de referência.
2. Obtenha os dados de sequenciamento.
   1. Obtenha arquivos DNA-seq FASTQ (WGS ou WES) com ≥33× de profundidade.
   2. Obtenha arquivos FASTQ RNA-seq de extremidade pareada específicos para a cadeia, com ≥60 milhões de leituras por amostra, em duas condições biológicas e pelo menos duas réplicas biológicas por grupo.
3. Alinhe as leituras de sequenciamento de DNA usando BWA-MEM.
   1. Construa um índice BWA:
      Índice de $ bwa Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
   2. Alinhe e converta para BAM:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz | Visualização Samtools -B > WGS.BAM
4. Alinhe as leituras de sequenciamento de RNA usando STAR.
   1. Gerar o índice genômico STAR:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf
   2. Alinhar leituras de RNA
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --saída SAMtipo BAM Não Classificado \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outNomeFilePrefixo pass1_
      NOTA: Isso produz um arquivo de junção de slice (pass1_SJ.out.tab) contendo tanto junções anotadas quanto novidades.
   3. Regenere o índice genômico STAR incorporando novas junções:
      $ cat pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
   4. Realize o alinhamento da segunda passagem usando o índice atualizado:
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outNomeFilePrefixo output_name
5. Prepare recursos auxiliares de referência.
   1. (Recomendado) Obter dbSNP VCF
      Baixe o VCF humano GRCh38 dbSNP (por exemplo, dbSNP build 150) do servidor FTP NCBI:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ Coloque o arquivo baixado (por exemplo, dbsnp_150.vcf.gz) no diretório de trabalho.
      NOTA: Entradas derivadas de RNA (molType="cDNA") no dbSNP podem mascarar verdadeiros locais de edição de RNA. Exclua-os usando:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
   2. (Recomendado) Ordenar o VCF do dbSNP
      Ordene o VCF para que seja compatível com o genoma de referência e o GATK:
      $ gatk SortVcf \
      -Eu dbsnp_150.vcf.gz \
      -O dbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --dicionário-de sequências Homo_sapiens. GRCh38.dict
   3. (Recomendado) Indexe o dbSNP VCF ordenado
      Crie um índice para o VCF ordenado de dbSNP:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      NOTA: É necessário um dicionário de referência correspondente. Se o arquivo Homo_sapiens. GRCh38.dict está ausente, gere-o da seguinte forma:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -R Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      -O Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.ditto
   4. (Recomendado) Obtenha VCF da linha germinativa da gnomAD
      Baixe o VCF dos locais variantes da linha germinativa gnomAD do GRCh38 em: https://gnomad.broadinstitute.org/downloads Use o VCF genômico apropriado para o pipeline (por exemplo, gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz).
   5. (Recomendado) Ordenar o VCF do gnomAD
      Ordene o VCF do gnomAD usando o mesmo dicionário de referência para garantir a compatibilidade:
      $ gatk SortVcf \
      -Eu gnomad.vcf.gz \
      -O gnomad.sorted.vcf.gz \
      --dicionário-de sequências Homo_sapiens. GRCh38.dict
   6. (Recomendado) Indexe o VCF ordenado do gnomAD
      Crie um índice para o VCF ordenado do gnomAD:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      NOTA: Certifique-se de que a nomeação dos cromossomos (por exemplo, "chr1" vs "1") corresponda ao FASTA de referência antes de rodar o SortVcf.
6. Obtenha uma referência conhecida de edição de RNA.
   NOTA: Um arquivo de referência REDIportal (rediportal.txt) compatível adequado para CADRES é curado dentro do repositório CADRES e pode ser baixado diretamente de:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0. Este arquivo é usado para anotação de eventos de edição conhecidos na Etapa 3.
7. Prepare anotações genéticas no formato RefGene. Baixe a anotação RefGene (por exemplo, refGene.txt.gz da UCSC). Descomprima se necessário e certifique-se de que os nomes dos cromossomos correspondam aos do genoma de referência.
   NOTA: Um exemplo adequado para CADRES está curado dentro do repositório CADRES e pode ser baixado diretamente de:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. Execução do Fluxo de Trabalho Analítico CADRES

NOTA: A Seção 3 é executada no terminal Linux com o ambiente CADRES Conda ativado.

1. Calibração e Recalibração de Pressão
   NOTA: O Passo 1 padroniza arquivos BAM e realiza a recalibração Boost — um BQSR aprimorado que incorpora dbSNP, gnomAD e um conjunto preliminar de candidatos à edição de RNA para preservar sinais genuínos de edição. Liste todos os arquivos RNA BAM separados por espaços. Saída: BAMs recalibrados (sufixo: _recalibration.bam) e sites candidatos Boost.
   1. Para executar o Passo 3.1:
      $ Python pipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /caminho/para/rna_sample1.bam /caminho/para/rna_sample2.bam ... \
      --dna_bam /caminho/para/wgs_normal.bam \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /caminho/para/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --prefixo project_demo
      NOTA: Os candidatos a reforço são construídos a partir de uma chamada preliminar conjunta DNA-RNA Mutect2 (--max-events-in-region 4, apenas filtro PASS; sem limiares adicionais de AF/qualidade). O filtro por homopolímero e repetição são tratados na Etapa 3.2.
2. Chamada de variantes, estimativa de contaminação e filtragem
   NOTA: O Passo 3.2 realiza a chamada conjunta de variantes DNA-RNA com estimativa de contaminação (via gnomAD), depois filtra os candidatos pelo contexto do homopolímero e pelo realinhamento do PBLAT. Saída: {prefix}.final.vcf.
   1. Para executar o Passo 3.2:
      $ Python pipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.bam ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --gnomad /caminho/para/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --prefixo project_demo
      NOTA: Esta etapa produz o conjunto final de chamadas variantes (project_demo.final.vcf), rigorosamente filtrado, representando diferenças de alta confiança RNA-DNA em todas as amostras. Parâmetros-chave: Mutect2 --qualidade base mínima mediana 12, --eventos máximos na região 4; PBLAT minbasequal 5; todos são pré-configurados no script do pipeline.
3. Testes estatísticos e anotação funcional
   NOTA: O Passo 3.3 quantifica a edição diferencial de RNA usando um GLMM adaptado do rMATS (correção de Benjamini-Hochberg FDR), e anota cada local com a região do gene, símbolo gênico e status de edição conhecido. Saída: {prefixo}_Result.txt (DVRs com valores P e FDR).
   O filtro de realinhamento PBLAT remove candidatos que mapeiam múltiplos loci genômicos, aumentando a especificidade em regiões repetitivas. Sua THREAD_COUNT interna é controlada pela flag --threads em pipeline_step2_variant_calling.py.
   1. Para executar o Passo 3.3:
      $ Python pipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.bam ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.bam ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /caminho/para/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /caminho/para/rediportal.txt \
      --gene_anno /caminho/para/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --rótulos Tratado Controle
      NOTA: Parâmetros-chave: samtools mpileup -q 30 (qualidade mínima de mapeamento), -Q 17 (qualidade mínima base); teste de razão de verosimilhança rMATS-GLMM com corte Δψ = 0,0001, ligação logit binomial com penalidade normal multivariada consciente de replicações (rho = 0,9); correção de Benjamini-Hochberg FDR; Todos são pré-configurados no script do pipeline
      As três etapas do pipeline suportam execução multithread via a flag --threads (padrão: 4 por passo). O Passo 2 também aceita --contamination_threads (padrão: 2).

4. Inspeção e visualização de resultados

1. Após o fluxo de trabalho CADRES ser concluído, navegue até o diretório de saída. O arquivo principal de resultados, {prefix}_Result.txt, lista todas as Variantes Diferenciais de RNA (DVRs) detectadas, incluindo coordenadas genômicas, alelos, contagens de alelos em nível de replicado, frações de edição, diferenças entre grupos e métricas estatísticas associadas (valor P e FDR). Anotações em nível de gene (símbolo do gene, região, fio, tipo de variante, SNP conhecido/status de edição) também estão incluídas. O arquivo resumo que acompanha, {prefix}_Result_summary.txt, fornece contagens de cada tipo de substituição e sua classificação em SNP DVRs, DVRs conhecidos para edição de RNA e DVRs inovadores.
2. (Opcional) Gerar visualizações padrão executando o script de pós-análise. Abra uma sessão R e insira:
   Console R:
   fonte("Pós-análise.R")
   O script Post-analysis.R está incluído em https://github.com/junsun-hash/CADRES/.
3. Um diálogo de seleção de arquivos será exibido; escolha {prefix}_Result.txt. O script produz seis figuras de PNG.
   NOTA: A janela de seleção de arquivos requer uma sessão R na área de trabalho. Em servidores headless, edite a variável input_file diretamente (linha 10 de Post-analysis.R) e execute Rscript Post-analysis.R.

Resultados

Para avaliar CADRES sob condições experimentais realistas, usamos um sistema de APOBEC3B induzível (A3B) em 293 células T. Um construto lentiviral responsivo à doxiciclina que expressa A3B-GFP foi introduzido em células 293T, e integrantes estáveis foram selecionados com puromicina. A indução com doxiciclina por 72 horas produziu expressão robusta de A3B-GFP, confirmada pela fluorescência da GFP e pelo aumento dos níveis de mRNA de A3B. Amostras induzidas e não induzidas foram então subm...

Discussão

O fluxo de trabalho CADRES apresentado aqui fornece uma estratégia calibrada e internamente consistente para detectar eventos diferenciais de edição de RNA com alta especificidade, especialmente a desaminação C>U catalisada por enzimas APOBEC. Vários passos dentro do protocolo são fundamentais para sua precisão. O sequenciamento genômico e transcriptômico correspondente é essencial para distinguir edições genuínas de RNA de polimorfismos de DNA subjacentes, enquanto o procedimento de rec...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BCFtools	Samtools project	N/A	Version 1.21. Variant calling and VCF manipulation. URL: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	Versão 2.31.1. Operações aritméticas do genoma. URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Biopython project	N/A	Versão 1.85. Ferramentas Python para biologia molecular. URL: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	Versão 0.7.18. Alinhamento de DNA-seq. URL: https://github.com/lh3/bwa
CADRES source code	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	Versão 1.0.0. Scripts do pipeline CADRES. URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda ou Miniconda	Anaconda Inc.	N/A	Versão 23.1. Gestor de pacotes e ambiente. URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	Build 155. Banco de dados de variantes germinativas comuns. URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	Versão 4.3.0.0. Kit de ferramentas de análise de genoma. URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	Versão 2.39. Sistema de controle de versão. URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	Versão 3.1. Frequências alélicas populacionais. URL: https://gnomad.broadinstitute.org
Arquivo de anotação GTF	Ensembl	N/A	Versão 109. Anotação de genes para GRCh38. URL: https://www.ensembl.org
Genoma de referência humano GRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	Versão 109. Montagem de genoma de referência. URL: https://www.ensembl.org ou https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Estação de trabalho ou servidor Linux	Vários	N/A	Ubuntu 20.04. Arquitetura x86_64 necessária. URL: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genome Browser	N/A	Versão 2.5.1. Realinhamento paralelo BLAT. URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	Versão 2.20.8. Manipulação de dados NGS. URL: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Software Foundation	N/A	Versão 3.9.19. Linguagem de programação. URL: https://www.python.org
R	R Foundation	N/A	Versão 4.5.2. Computação estatística. URL: https://www.r-project.org
Pacote R: forcats	CRAN	N/A	Versão 1.0.0. Manipulação de fatores. URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
Pacote R: ggplot2	CRAN	N/A	Versão 4.0.1. Visualização de dados. URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
Pacote R: ggrepel	CRAN	N/A	Versão 0.9.5. Repulsão de rótulos de texto. URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
Pacote R: lme4	CRAN	N/A	Versão 1.1.35. Modelos lineares mistos de efeitos. URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
Pacote R: readr	CRAN	N/A	Versão 2.1.5. Leitura rápida de arquivos. URL: https://cran.r-project.org/package=readr
Pacote R: stringr	CRAN	N/A	Versão 1.6.0. Manipulação de strings. URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
Referência REDIportal	Universidade de Bolonha	N/A	Versão 2.0. Banco de dados de locais de edição de RNA A-to-I. URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
Anotação RefGene	UCSC Table Browser	N/A	Versão 109. Anotação da estrutura do gene. URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtools project	N/A	Versão 1.21. Manipulação de arquivos BAM. URL: https://github.com/samtools/samtools
Alinhador STAR	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	Versão 2.7.11b. Alinhamento de RNA-seq. URL: https://github.com/alexdobin/STAR