Artigo de revisão
A terapia gênica com vírus adenoassociado (AAV) requer Materiais Padrão de Referência (RSMs) bem caracterizados para garantir medições analíticas precisas e reprodutíveis dentro e entre laboratórios. Esta revisão examina a necessidade crítica de RSMs, avalia os padrões comerciais e farmacopeiais disponíveis e fornece estratégias práticas para o desenvolvimento interno de RSMs visando avançar terapêuticas de AAV seguras e eficazes.
O vírus adeno-associado (AAV) tornou-se um vetor líder para a terapia gênica in vivo, com oito produtos atualmente com autorização de comercialização. À medida que o campo evolui rapidamente, a necessidade de métodos analíticos robustos para caracterizar atributos críticos de qualidade (CQAs) — incluindo título da capsídea, título do genoma, conteúdo da capsídea (razão vazia/completa), identidade e pureza — continua crescendo. Materiais Padrão de Referência (RSMs) desempenham um papel fundamental ao fornecer lotes AAV bem caracterizados e padronizados que servem como referências universais. Os RSMs facilitam a validação de tecnologias analíticas emergentes, garantem a precisão e reprodutibilidade dos ensaios rotineiros e possibilitam a comparabilidade entre laboratórios. No entanto, o desenvolvimento de RSMs universais AAV é fundamentalmente limitado pela complexa biologia, diversidade de sorotipos, genomas vetoriais e variantes de capsídea engenheirada, o que exige padrões específicos de serotipo e aplicação. Avanços recentes, incluindo o lançamento de padrões de referência farmacopeicos AAV8 caracterizados por múltiplos métodos ortogonais, representam avanços significativos rumo à harmonização da medição. Esta revisão aborda a necessidade crítica de RSMs na terapia gênica AAV, avalia os padrões farmacopeiais e comerciais atualmente disponíveis, e delineia estratégias práticas para o desenvolvimento interno de RSMs. Estabelecer RSMs AAV robustos e específicos para sorótipo e protocolos operacionais harmonizados padrão (SOPs) é essencial para avançar a terapia gênica AAV e garantir precisão, reprodutibilidade e segurança em pesquisa, desenvolvimento e fabricação clínica.
A terapia gênica oferece uma estratégia transformadora para tratar doenças genéticas e adquiridas, entregando material genético funcional às células dos pacientes para corrigir ou regular a expressão gênica. Entre eles, os vírus adeno-associados (AAVs) se destacam por suas aplicações in vivo devido à sua diversidade de tropismo tecidular entre diferentes sorótipos e à expressão sustentada do transgeneepissômico 1.
Os AAVs são vírus compactos (~25 nm de diâmetro) de DNA do gênero Dependoparvovirus da família Parvoviridae . Esses vírus são não patogênicos e têm defeito de replicação, exigindo vírus auxiliares como adenovírus ou vírus herpes simplex parareplicação 2. O genoma do AAV possui dois genes, rep e cap, ladeados por duas repetições palindrômicas de 145 pares de bases conhecidas como repetições terminais invertidas (ITRs)3. Vetores AAV recombinantes (rAAV) são gerados substituindo sequências de codificação viral por cassetes terapêuticos contendo um promotor, transgene e elementos regulatórios ladeados por ITRs. Durante a produção, os genes rep e cap são entregues em trans, facilitando a replicação e o embalamento da fita terapêutica em capsídeos virais e gerando partículas não integradoras e deficientes em replicação, que mantêm capacidade robusta de transdução enquanto impedem a replicação viral do tiposelvagem 4. Oito terapias gênicas baseadas em rAAV receberam autorização de comercialização da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) ou da Food and Drug Administration (FDA) dos EUA, e os ensaios clínicos com AAVs estão em aumento. Em janeiro de 2025, 343 ensaios clínicos de AAV estavam registrados globalmente, representando um aumento de 34% em relação aos 255 ensaios em meados de 20225. Essa rápida expansão clínica intensifica a necessidade de um controle de qualidade rigoroso para garantir a segurançado paciente 6.
Garantir que os produtos rAAV sejam seguros e eficazes para uso humano requer uma caracterização detalhada dos atributos críticos de qualidade (CQAs), incluindo quantidade, potência, pureza, identidade, segurança e estabilidade. No entanto, a caracterização dos AAVs continua inerentemente desafiadora devido às complexidades estruturais desses vetores. AAVs são partículas icosaédricas compostas por três proteínas capsídeas virais (VP1, VP2, VP3), montadas em uma proporção aproximada de 1:1:10, e variações na montagem das proteínas podem afetar a eficiência datransdução 7. A carga útil terapêutica de DNA deve ser empacotada na capsídea com alta fidelidade; populações de cápsides heterogêneas são inerentemente geradas durante a produção de rAAV, consistindo em capsídeos contendo um genoma completo (cápsides completos), um genoma parcial (capsídeos parcialmente preenchidos) ou nenhum material genético (cápsides vazios). Para aumentar essa complexidade, diferentes sorótipos AAV apresentam eficiências distintas em embalagem, tropismos teciduais e perfis imunológicos, exigindo o desenvolvimento de ensaios adaptados ao sorotipo. Além desses desafios biológicos, existe um problema crítico na forma como as medições são realizadas. Laboratórios diferentes utilizam ensaios, protocolos e abordagens de análise de dados distintos para medir a mesma CQA. Como resultado, os valores relatados para amostras idênticas podem diferir em ordens de magnitude entre os sítios8. Mesmo dentro de um único laboratório, mudanças ao longo do tempo em reagentes, instrumentos, operadores ou configurações de análise podem levar a alterações nos resultados do mesmolote 9. Quando as medições não são comparáveis, estabelecer associações confiáveis entre CQAs e desfechos pré-clínicos ou clínicos torna-se desafiador, complicando assim a tomada de decisõesregulatórias 10,11.
A padronização visa resolver essa questão garantindo a comparabilidade das medidas. Na análise farmacêutica, a padronização abrange dois aspectos principais: o uso de materiais padrão físicos de referência comuns (RSMs) e a adesão a procedimentos operacionais escritos e harmonizados (SOPs), garantindo que diferentes laboratórios meçam título, identidade, qualidade, potência e pureza de formaconsistente 12. Os RSMs são amostras bem caracterizadas que atuam como referências. Ao validar ensaios contra o mesmo RSM, os laboratórios fixam suas medições em um ponto de referência comum. Isso reduz a variabilidade entre os laboratórios e permite que os resultados de diferentes estudos, produtos e locais de fabricação sejam comparados de forma confiável13. Além disso, ele também serve como um controle interno para monitorar o desempenho do ensaio e monitorar a consistência ao longo dotempo 14. Os procedimentos padrão de prevenção também garantem que os métodos analíticos sejam executados de forma consistente entre os laboratórios, minimizando a variabilidade decorrente de diferenças no pré-tratamento da amostra, instrumentação, estratégia de calibração, processamento de dados e prática operadora 8,9,12. Juntos, esses dois componentes formam a base de um robusto quadro de padronização analítica.
Esta revisão aborda sistematicamente os principais aspectos da padronização na análise de AAV. Examinamos os tipos de RSMs e suas aplicações analíticas, avaliamos os RSMs específicos de AAV atualmente disponíveis quanto à sua adequação ao propósito e fornecemos orientações práticas consolidadas para produção, purificação, caracterização e armazenamento interno de RSMs. Identificamos ainda os desafios manufatureiros predominantes e as limitações analíticas. Reconhecendo que os RSMs isolados não são suficientes, também discutimos os SOPs harmonizados como um componente complementar e igualmente importante da padronização. Em conjunto, esta revisão tem como objetivo ser uma referência prática para cientistas analíticos, profissionais de qualidade e fabricantes que buscam avançar na harmonização da medição e apoiar a tomada de decisões regulatórias baseadas na ciência na terapia gênica AAV.
1. RSM: definições e necessidade
Os RSMs são organizados hierarquicamente, com dois tipos principais: RSMs primários e secundários. De acordo com o Guia ISO 30, um padrão primário é definido como um "padrão designado ou amplamente reconhecido por possuir as maiores qualidades metrológicas e cujo valor é aceito sem referência a outros padrões da mesma quantidade, dentro de um contexto especificado". Por exemplo, RSMs da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.), Farmacopeia Britânica (BP), etc., que foram amplamente caracterizados por meio de estudos multilaboratoriais, qualificam-se como RSM primário. Fabricantes individuais posteriormente utilizam esses RSMs primários para calibrar e qualificar seus próprios materiais de referência de trabalho proprietários, que servem como RSMs secundários para testes rotineiros de controlede qualidade 12,15. Assim, a ISO define um RSM secundário como um "padrão cujo valor é atribuído por comparação com um padrão primário da mesma quantidade". Essa abordagem hierárquica garante rastreabilidade: as medições internas remontam a padrões primários, que por sua vez são caracterizados por métodos analíticos deponta 16. O uso dos RSMs fornece benchmarks comuns que permitem aos fabricantes calibrar e validar seus métodos analíticos até o mesmo ponto de referência, levando assim a medições mais precisas. As autoridades reguladoras, portanto, incentivam o uso de RSMs primários para calibrar RSMs internos e validar métodos de teste, melhorando a consistência em toda a fabricação deAAVs 17,18. Isso permite a padronização entre técnicas analíticas variadas, levando a uma melhor comparação dos resultados de caracterização de rAAV entre laboratórios e diferentesprodutos 17,19. A comparabilidade aprimorada aprimora a compreensão dos riscos de segurança potencialmente associados a doses altas ou impurezas relacionadas ao produto, como capsídeos vazios e parcialmente preenchidos. Em última análise, esses insights podem informar a formulação de políticas regulatórias baseadas na ciência, como um limiar mínimo de capsídeas completas, análogo ao critério de ≥70% de células viáveis para terapias celulares somáticas, contribuindo assim para produtos de terapia gênica mais seguros econfiáveis 13,20,21.
Para rAAV, várias CQAs ilustram claramente a necessidade de padronização. O título do genoma vetoral determina diretamente a dose do paciente; Títulos imprecisos correm risco de subdosagem ou superdosagem. PCR quantitativa (qPCR) e PCR digital (dPCR) são amplamente usadas para medir título, mas os resultados podem diferir para a mesma amostra se diferentes calibrantes ou protocolos de curvas padrão internosforem usados 11. O conteúdo de capsídeos (a proporção de capsídeos cheios, parcialmente preenchidos e vazios) é outra CAQ crítica, pois capsídeas vazias e parcialmente preenchidas podem contribuir para a imunogenicidade ou reduzir aeficácia 6. Mais de dez técnicas diferentes são usadas para medir o conteúdo da capsídea, incluindo ultracentrifugação analítica (AUC), Cromatografia de Exclusão de Tamanho acoplada a espalhamento de luz multiângulo (SEC-MALS), fotometria de massa (MP), espectrometria de massa por detecção de carga (CDMS), microscopia eletrônica (EM), cromatografia por troca de ânions (AEX), foco isoelétrico capilar (cIEF), espectroscopia ultravioleta-visível (UV/Vis), entre outras. Além disso, o conteúdo de capsídeos é frequentemente estimado indiretamente usando a razão entre o título do genoma do vetor e o título da partícula viral, determinada por qPCR ou dPCR e ELISA, respectivamente (PCR/ELISA)22. Cada técnica mede diferentes propriedades físicas e pode relatar valores distintos de conteúdo de capsid para as mesmas amostras. Um estudo interlaboratorial recente do NIST comparando UV/Vis, AUC, SEC-MALS e PCR/ELISA demonstrou variabilidade substancial entre métodos e entre laboratórios, com PCR/ELISA apresentando reprodutibilidade particularmente baixa e AUC apresentando divergência significativa entre laboratórios, apesar de ser amplamente considerado um métodode referência 8. Esses achados indicam que reduzir a variabilidade na análise de AAV requer tanto RSMs compartilhados quanto fluxos de trabalho analíticos harmonizados, conforme discutido na Seção 5.
2. paisagem rAAV RSM
Os esforços para estabelecer RSMs para AAV resultaram em duas fontes fornecendo RSMs AAV primários. Entre as fontes farmacopeicas, a USP é atualmente a única fornecedora de RSM primário de AAV. Além dos USP, os RSMs AAV primários também estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Uma variedade crescente de RSMs secundários comerciais para múltiplos sorotipos também está disponível, refletindo esforços comunitários contínuos para enfrentar a falta de padronização inerente à caracterização dos AAV. A Tabela 1 resume os materiais atualmente disponíveis do AAV RSM e suas principais características.
3. Estratégias de fabricação da RSM:
Produzir RSMs AAV de alta pureza apresenta desafios inerentes. Alcançar preparações de cápsideas 100% vazias é complicado pelo fato de que cápsides "vazias" podem conter material genético residual. Da mesma forma, obter preparações puras de capsídeas completas se mostra difícil porque capsídeas vazias e parcialmente preenchidas compartilham características físicas semelhantes e co-purificam com capsídeas completas durante os processosde separação 10. Apesar desses desafios, avanços significativos na tecnologia de produção agora permitem o enriquecimento de populações de capsídeos predominantemente cheios ou predominantemente vazios. A seção a seguir oferece uma visão abrangente das tecnologias atuais de produção e separação, bem como dos métodos de caracterização e condições de formulação que podem ser empregados para produzir, caracterizar e armazenar os RSMs AAV.
4. Caracterização analítica: Definição do padrão
Uma vez que o RSM foi produzido, purificado e formulado, é realizada uma caracterização analítica abrangente. Essa etapa garante a qualidade do RSM e sua aplicabilidade como referência em diferentes métodos analíticos. Empregar técnicas analíticas ortogonais para avaliar os mesmos atributos de qualidade é particularmente importante para garantir a robustez e, por isso, é altamente recomendado. Os principais atributos de qualidade especificamente para o RSM da AAV podem ser divididos em três categorias: título, identidade e pureza, conforme listado na Tabela 2.
5. Programas de Operações Operacionales Operacionales Harmonizadas como segundo pilar da padronização analítica da AAV
Além da disponibilidade de RSMs bem caracterizados, uma padronização significativa na análise de AAV também exige SOPs harmonizados e suficientemente detalhados. Mesmo quando o mesmo método analítico é aplicado, os resultados podem diferir substancialmente entre os laboratórios devido a diferenças no pré-tratamento da amostra, configurações instrumentais, estratégia de calibração, processamento de dados e critérios de interpretação, fatores que demonstraram contribuir para a variabilidade interlaboratorial independentemente da própria plataformaanalítica 8,9.
Isso é ilustrado por um estudo colaborativo do NIST, Instituto Nacional para Inovação na Fabricação de Biofarmacêuticas (NIIMBL) e USP, no qual seis laboratórios avaliaram as mesmas amostras de AAV5 e AAV8 quanto ao conteúdo do capsídeo usando quatro métodos. Métodos ópticos, incluindo SEC-MALS e UV/Vis, mostraram a maior concordância interlaboratorial, enquanto o PCR-ELISA mostrou baixa reprodutibilidade e foi considerado inadequado para uso quantitativo sem harmonização adicional. Apesar de ser amplamente considerado um método padrão-ouro, o SV-AUC apresentou maior variabilidade interlaboratorial do que o SEC-MALS, e esforços de acompanhamento para desenvolver procedimentos padronizados do SV-AUC foram identificados como um passo importante 8,81.
Uma conclusão semelhante surgiu para a determinação do título genômico por dPCR, onde pré-tratamento da amostra, estratégia de extração, plataforma do instrumento, condições de diluição, tempo de lise da capsídea e histórico de congelamento-descongelamento podem afetar os valores relatados. Importante destacar que o controle processual mais rigoroso demonstrou reduzir substancialmente a variabilidade, ressaltando ainda mais o valor dos SOPsharmonizados 9.
RSMs e SOPs devem, portanto, ser vistos como pilares complementares da padronização analítica da AAV. Os RSMs fornecem a âncora de medição necessária para rastreabilidade e calibração, enquanto os SOPs reduzem a variabilidade procedural e ajudam a garantir que os valores atribuídos sejam reproduzidos consistentemente entre analistas, instrumentos e laboratórios.
A terapia gênica rAAV está avançando mais rápido do que a capacidade do campo de caracterizar consistentemente atributos de qualidade. Esta revisão demonstra que a principal barreira para a caracterização comparável de AAV não é a falta de ferramentas analíticas, mas sim a ausência de âncoras de medição compartilhadas e fluxos de trabalho harmonizados. Os RSMs enfrentam esse desafio transformando medições dependentes do método em valores rastreáveis e comparáveis. Os RSMs possibilitam validação de métodos, melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios e fornecem controles contínuos para detectar deriva do ensaio. No entanto, a produção de RSMs AAV de alta qualidade continua sendo tecnicamente exigente devido à dificuldade de obter populações de capsídeos puros vazios e completos, à necessidade de caracterização ortogonal abrangente e à exigência de estabilidade de longo prazo sob condições de armazenamento definidas. Avanços recentes em tecnologias de fabricação e purificação permitiram a produção de preparações predominantemente vazias e completas de capsida, que podem ser usadas para gerar RSMs internos, e as ofertas atuais de órgãos farmacopeiais (USP), consórcios colaborativos (ATCC) e fornecedores comerciais representam progressos significativos. No entanto, o desenvolvimento de RSMs AAV universais é fundamentalmente limitado pela diversidade de sorótipos, genomas vetoriais e, cada vez mais, variantes de capsídeas engenheiradas. Ao contrário dos anticorpos monoclonais, a heterogeneidade do AAV exige RSMs específicos de sorótipo e aplicação. Essa complexidade é ainda mais amplificada por capsídeos híbridos e/ou engenheirados, que exigem que os desenvolvedores mantenham RSMs primários internos proprietários, fragmentando assim o cenário da medição. Além disso, outros atributos de qualidade, como modificações pós-traducionais (PTM), foram destacados como potenciais CQA e não possuem RSMs bem caracterizados para PTMs, criando uma lacuna crítica na compreensão desse atributo vetorial. Além da disponibilidade de RSM, os SOPs harmonizados são igualmente críticos. O campo se beneficiaria de métodos compêndios — protocolos padronizados e detalhados publicados por órgãos farmacopéicos — que garantam que todos os laboratórios executem testes consistentes e controlados para as CQAs do AAV. Documentos de orientação escritos detalhando as melhores práticas para métodos comumente usados reduziriam ainda mais a variação entre laboratórios e harmonizariam os fluxos de trabalho analíticos. Ao estabelecer RSMs de medição de AAV rastreáveis e implementar práticas de caracterização consistentes e precisas, a comunidade pode fortalecer a base científica que liga as CQAs à segurança e eficácia, apoiar decisões regulatórias confiantes e, em última análise, entregar terapias gênicas mais seguras e confiáveis aos pacientes.
Tabela 1: RSMs rAAV atualmente disponíveis e suas características
Esta tabela resume os materiais padrão de referência rAAV disponíveis e suas principais características. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Conjunto recomendado de métodos analíticos para caracterização interna de RSM
Esta tabela resume os métodos analíticos recomendados para a caracterização interna das RSM. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Os autores declaram não haver conflitos de interesse
Este projeto recebeu financiamento do Programa-Quadro da União Europeia para Pesquisa e Inovação, Horizon Europe, sob o Acordo de Subvenção nº 101119880. Este projeto foi financiado pelo subsídio "Flandres Resilience" do Governo Flamengo, originado pela "European Recovery and Resilience Facility" (RRF) (VV021/13).
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