Estratégias de Inserção de Lentes Específicas por Região para Imagem In Vivo de Cálcio em Ratos em Circuitos Corticais e Hipocampais

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para inserção e estabilização de lentes específicas por região, permitindo imagens de cálcio in vivo confiáveis em camundongos, melhorando a reprodutibilidade e reduzindo o processo de tentativa e erro na imagem de cálcio.

Resumo

Imagens in vivo de cálcio de populações neuronais usando lentes ópticas implantadas cirurgicamente são amplamente utilizadas para monitorar a atividade da população neuronal durante o comportamento. No entanto, o sucesso cirúrgico e a qualidade da imagem dependem criticamente de restrições anatômicas que variam entre regiões cerebrais. Este protocolo fornece orientação cirúrgica específica para a região para a seleção e implantação de lentes de imagem em áreas corticais e hipocampais comumente direcionadas. Especificamente, descreve um fluxo de trabalho cirúrgico que abrange localização de alvos e nivelamento do crânio, craniotomia específica por região e, quando necessário, remoção ou aspiração de dura-máter ou aspiração de tecido sobrejacente, bem como a seleção, inserção e fixação de lentes e suportes apropriados. Em particular, descrevemos três estratégias de implantação: implantação convencional de lente para o hipocampo ventral, implantação de lente com aspiração de tecido para o hipocampo dorsal e implantação de lente prismática para imagem cortical. Fornecemos ainda orientações práticas sobre como diferenças na profundidade do tecido, arquitetura vascular e organização dos circuitos informam parâmetros cirúrgicos chave, incluindo diâmetro do cristalino, tamanho da craniotomia, extensão da remoção do tecido, velocidade de inserção, procedimentos hemostáticos e métodos de fixação. Ao documentar explicitamente considerações cirúrgicas que muitas vezes são subnotificadas em métodos escritos, esse protocolo visa reduzir a tentativa e erro durante a implantação do cristalino e melhorar a reprodutibilidade experimental. No geral, este protocolo fornece um guia prático para selecionar e implementar de forma confiável estratégias de implantação de lentes apropriadas à região em circuitos corticais e hipocampais.

Introdução

A imagem de cálcio in vivo usando lentes ópticas implantadas tornou-se uma técnica central para monitorar a atividade neuronal em nível populacional em animais^comportados 1,2,3,4,5,6. Ao permitir registros longitudinais de conjuntos neuronais geneticamente definidos, essa abordagem forneceu insights críticos sobre a dinâmica dos circuitos subjacentes à percepção, aprendizagem e^{tomada de decisão} 2,6,7,8. No entanto, o sucesso da imagem baseada em lente depende não apenas do acesso óptico, mas também da cuidadosa consideração de restrições anatômicas específicas de cada região. Regiões corticais como o córtex pré-frontal (CPF), estruturas de profundidade média como o hipocampo dorsal e alvos profundos como o hipocampo ventral, diferem substancialmente na orientação dos circuitos e na tolerância ao deslocamento dos tecidos, entre outros fatores. Essas diferenças anatômicas exigem estratégias cirúrgicas específicas de região para seleção e implantação de lentes. Estudos anteriores estabeleceram métodos confiáveis para imagens de neurônios CA1 dorsais em camundongos fixos com a cabeça usando lentes implantadas^{verticalmente} 6,9,10,11, e lentes baseadas em prismas são amplamente usadas para imagens^{corticais 7,8}, onde o acesso óptico lateral permite registros específicos de todo ou laminar, dependendo da orientação do circuito alvo. Embora essas abordagens compartilhem o princípio comum do acesso óptico por meio de lentes implantadas, elas impõem restrições cirúrgicas distintas que devem ser abordadas de maneira específica para cada região.

Apesar da adoção crescente dessa técnica, uma fonte comum de falha experimental não está no mal-entendido conceitual, mas na falta de orientações cirúrgicas suficientemente detalhadas e específicas para cada região. Na prática, registros falhados frequentemente resultam de craniotomia imprecisa, remoção de tecido subótima ou insuficiente consideração de restrições vasculares e estruturais específicas da região. Embora procedimentos gerais de implantação de lentes tenham sido descritos em protocolos anteriores^{9, 10, 11, 12}, as nuances cirúrgicas práticas que determinam o sucesso da imagem, especialmente aquelas que diferem entre as regiões alvo, permanecem incompletamente documentadas.

Este protocolo de vídeo preenche essa lacuna fornecendo orientações explícitas e específicas para região para seleção e implantação de lentes em alvos corticais e hipocampais, usando o PFC e as regiões CA1 dorsal e ventral do hipocampo como exemplos representativos. Especificamente, descrevemos três estratégias de implantação, cada uma adaptada às restrições anatômicas e cirúrgicas da região-alvo e destacamos pontos-chave de decisão e armadilhas técnicas associadas a cada abordagem.

Na imagem de CA1 do hipocampo dorsal, o diâmetro relativamente grande das lentes convencionais frequentemente exige aspiração de tecido para criar espaço suficiente para a implantação. Se a remoção do tecido for incompleta ou realizada de forma inadequada, o tecido ao redor pode ser comprimido em vez de deslocado, levando ao acúmulo de neurônios próximos à superfície do cristalino e à formação de camadas celulares densamente compactas que obscurecem o plano de imagem pretendido. Para o hipocampo ventral, localizado profundamente no cérebro, a mira precisa exige controle exato do ângulo de inserção, trajetória e velocidade de penetração para minimizar danos nos tecidos e garantir a posição correta. Por outro lado, a implantação de lentes prismáticas para imagem de CPP dá maior ênfase à minimização do sangramento e preservação da integridade cortical por meio de uma craniotomia precisa e inserção cuidadosa do cristalino para evitar danos vasculares.

Este protocolo é destinado a pesquisadores que planejam implementar a imagem de cálcio baseada em lente GRIN em alvos corticais ou hipocampais em roedores, especialmente aqueles que enfrentaram desafios na reprodutibilidade cirúrgica ou qualidade da imagem. É mais aplicável ao mirar o CA1 dorsal, CA1 ventral ou córtex pré-frontal, e ao usar lentes GRIN ou prismáticas padrão em combinação com um miniscópio ou sistema de imagem equivalente montado na cabeça. Pesquisadores que atuam em outras regiões cerebrais ou que utilizam diferentes configurações de hardware devem tratar os princípios específicos de região descritos aqui como diretrizes adaptáveis, e não como procedimentos fixos. Ao documentar explicitamente essas considerações práticas, este vídeo visa reduzir a tentativa e erro, melhorar a reprodutibilidade em laboratórios e fornecer uma estrutura de princípios para selecionar estratégias de implantação apropriadas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de cuidado animal foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia (KAIST) sob o número de aprovação KA2025-060-V3. Todos os experimentos estavam em conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados.

1. Etapas preparatórias para a cirurgia

NOTA: Este protocolo foi desenvolvido usando camundongos adultos C57BL/6J e VIP-Cre knock-in de 8 semanas (RRID: IMSR_JAX:000664, IMSR_JAX:031628). A mesma abordagem geral pode ser aplicada a outras cepas; no entanto, alguns ajustes em detalhes específicos, como coordenadas do alvo, podem ser necessários.

1. Anestesie o camundongo com 3% de isoflurano administrado por inalação a uma vazão de 1 L·^min-1 em uma câmara de indução.
2. Prenda o rato em uma estrutura estereotáxica usando barras auriculares e coloque a máscara anestésica sobre o focinho.
   NOTA: Mantenha a mesma concentração anestésica durante todo o procedimento.
3. Ajuste o sistema homeotérmico para 33,5 °C para manter a temperatura corporal durante a cirurgia.
4. Raspe a área cirúrgica e remova os pelos residuais com um cotonete embebido em uma solução de gluconato de clorexidina.
5. Aplique lubrificante ocular nos olhos do rato e cubra-os com pequenos pedaços de papel alumínio para protegê-los durante a cirurgia.
6. Antes da incisão, faça um beliscão no dedo do pé para confirmar que o camundongo está totalmente anestesiado.
7. Injete localmente a solução de lidocaína a 1% (misturada com bupivacaína a 0,5%) no local da incisão e administre a solução de cetoprofeno a 1% por injeção intramuscular.
8. Incisa a pele em formato elíptico, dimensionada para fornecer espaço suficiente para implantação subsequente em estágio capítolo. Tome cuidado para não cortar os músculos ao redor do crânio.
   NOTA: Incisão excessiva pode induzir inflamação extensa, que pode interferir nas gravações de longo prazo na mesma região.
9. Usando cotonetes estéreis, retraia suavemente a incisão lateralmente. Limpe a superfície exposta do crânio com cotonetes estéreis e depois raspe levemente com um raspador.
   NOTA: Esta etapa remove detritos e ruga levemente a superfície para facilitar a fixação subsequente da lente e da placa da cabeça.
10. Para alinhamento ao longo do eixo anteroposterior (AP), use bregma e lambda como pontos de referência. Meça as diferenças de altura entre os pontos de referência usando uma agulha calibre 26.
11. Se o eixo AP não estiver nivelado, afrouxe a máscara anestésica e ajuste a altura do adaptador da mandíbula na estrutura estereotáxica até que a diferença de altura entre bregma e lambda seja de 0,02 mm.
12. Para alinhamento ao longo do eixo mediolateral (ML), use pontos ± 3 mm da linha média como pontos de referência.
13. Se o eixo ML não estiver nivelado, reposicione corretamente as barras auriculares até que a diferença de altura esquerda-direita esteja dentro de 0,02 mm.

2. Craniotomia

1. Marque as localizações dos alvos (por exemplo, PFC, hipocampo) no crânio usando uma agulha mergulhada em tinta. Ao marcar a localização do alvo, também marque os limites para perfuração nas direções anterior, posterior, medial e lateral.
   NOTA: Para o PFC, onde a implantação é guiada por marcos vasculares, uma lente de 1 mm requer uma abertura de 1,5 mm (Figura 1A). Para o hipocampo ventral, um alvo profundo, uma lente de 0,6 mm requer uma abertura de 0,8 mm (Figura 1B). Para o hipocampo dorsal, onde é necessária aspiração de tecido, uma lente de 1 mm requer uma abertura de 1,2 mm (Figura 1C) para minimizar o espaço sem suporte ao redor da lente e reduzir o deslocamento lateral durante o posicionamento antes da fixação do adesivo.
2. Crie uma abertura quadrada arredondada usando uma furadeira manual guiada por marcações.
3. Durante a etapa inicial, a perfuração deve ser realizada o mais verticalmente possível para evitar as bordas inclinadas que se formam.
4. Realize a perfuração em vários passos curtos para minimizar o risco de dano cerebral.
   NOTA: Evite rasgar a dura-máter durante esse processo.
5. Quando o crânio restante ficar muito fino (como confirmado pela aplicação suave de pressão com fórceps), levante o retalho ósseo usando pinças, tomando cuidado para não danificar a superfície cerebral.
6. Suavize as bordas em uma velocidade de furadeira reduzida (Figura 2A). Se fragmentos de osso afiados permanecerem ao longo da borda do crânio (Figura2B), eles podem danificar o cristalino ou a superfície cerebral.
7. Remova cuidadosamente todos os detritos ósseos gerados durante o processo de perfuração. Irrige o local com soro para remover quaisquer fragmentos ósseos restantes.

Figura 1. Exemplos representativos de perfuração de crânios para cada região-alvo Fotografias representativas de crânios de camundongos após craniotomia. (A) Craniotomia direcionada ao córtex pré-frontal. (B) Craniotomia direcionada ao hipocampo ventral. (C) Craniotomia direcionada ao hipocampo dorsal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Perfuração do crânio e acabamento das bordas Ilustração esquemática da perfuração e acabamento das bordas do crânio. (A) Esquema da seção transversal de uma craniotomia devidamente finalizada com um limite inferior polido suavemente. (B) Exemplo mostrando restos de osso afiados causados por polimento insuficiente da borda inferior. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Preparação do tecido pré-implantacional

Antes de inserir a lente, prepare o tecido para permitir uma inserção estável da lente. Dependendo do alvo, use o método 3.1 ou 3.2.

1. Remoção da dura-máter (para hipocampo ventral, córtex pré-frontal): Se for realizada aspiração de tecido cerebral, a remoção da dura-máter não é necessária. No entanto, se o cristalino for implantado sem aspiração tecidual, a dura-madre deve ser removida.
   1. Para remover a dura-máter, dobre levemente a ponta da agulha de uma seringa de insulina e use-a como ferramenta de corte.
   2. Incida cuidadosamente a dura-madre em pequenos incrementos. Se necessário, segure o tecido inciso com pinças finas enquanto corta as partes restantes. Tome cuidado para não danificar o cérebro durante esse processo.
2. Aspiração do tecido superior (para hipocampo dorsal): O uso dessa abordagem requer um intervalo mínimo de duas semanas entre a injeção do vírus e a implantação do cristalino para evitar perda ou redução da expressão viral devido à aspiração.
   NOTA: Não é recomendado realizar aspiração de tecido antes da injeção viral, pois a injeção em tecido recentemente danificado pode comprometer a estabilidade da expressão. Por outro lado, permitir um período prolongado de recuperação após a aspiração também é subótimo, pois o crescimento do tecido pode dificultar a implantação subsequente do cristalino.
   1. Conecte a bomba a uma mangueira de 8 mm de diâmetro, que é então conectada à extremidade de uma seringa de 1 ml. Todas as conexões são bem vedadas com fita adesiva para evitar vazamento de ar.
      NOTA: Use uma bomba de aspiração capaz de gerar uma pressão negativa máxima de pelo menos 50 kPa. Como a bomba pode gerar vibração significativa, posicione-a afastada da mesa cirúrgica.
   2. Conecte a agulha alisada de calibre 24 à extremidade da seringa de 1 mL conectada (Figura 3).
   3. Aumente a pressão da bomba de aspiração para pelo menos 50 kPa.
   4. Leve cuidadosamente a ponta da agulha perto do tecido para que ele seja aspirado junto com soro. Durante essa etapa, use uma mão para manipular a agulha de aspiração e com a outra para aplicar continuamente soro fisiológico com a seringa. Isso evita que o sangue obstrua a visão e facilita a aspiração suave.
      NOTA: Embora o sangramento seja esperado durante o processo de aspiração, isso não exige ciclos repetidos de aspiração–hemostasia. É importante evitar aspiração excessiva nos locais de sangramento ativo, pois pode agravar a hemorragia devido a alterações mecânicas adicionais.
   5. Realize a aspiração de tecido em pequenos incrementos. Em intervalos, irrige o campo cirúrgico com soro fisiológico para avaliar a extensão e o local da remoção do tecido.
   6. Remova o tecido cerebral acima do alvo em um volume em forma de funil centrado no alvo, em vez de remover tecido de toda a abertura. Uma ilustração esquemática desse procedimento é fornecida na Figura 4.
      NOTA: Para isso, não se aproxime do tecido apenas de um ângulo; Em vez disso, ajuste a agulha para múltiplos ângulos durante a aspiração.
   7. A remoção do tecido deve parar um pouco acima da região alvo, deixando uma camada fina intacta. Para o hipocampo dorsal, a aspiração é avançada até o nível do corpo caloso; A aspiração é interrompida assim que a substância branca sob o córtex se torna visível (não remover o corpo caloso).
3. Se ocorrer sangramento após a remoção da dura-madre ou aspiração de tecido, aplique uma esponja de gelatina (por exemplo, Cutanplast) embebida em soro fisiológico gelado (4 °C) para controlar o sangramento antes da coagulação. Tome cuidado para evitar que o sangue permaneça no campo cirúrgico.
   NOTA: Em vez de limpar o sangue, aplique uma pressão suave usando a esponja.
4. Uma vez exposto o cérebro, coloque a esponja de gelatina embebida em soro fisiológico sobre a área para manter o tecido úmido durante todo o procedimento até a implantação do cristalino.

Figura 3. Configuração do dispositivo de aspiração Fotografia do conjunto completo do dispositivo de aspiração. A extremidade distal do tubo é conectada a uma bomba de aspiração, e todas as junções são seladas firmemente para garantir uma sucção estável. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Aspiração de tecido durante preparação de craniotomia Uma ilustração esquemática que mostra a profundidade e extensão aproximadas da aspiração de tecido necessária para implantação de lente direcionada a dCA1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Implante de lente

Dois métodos de implantação de lentes serão descritos aqui. Ambos envolvem inserir a lente avançando-a para dentro do tecido, mas diferem na forma como a lente é aplicada. Selecione o método apropriado das Seções 4.1 e 4.2.

1. Implantação de lente com suporte de lente de alumínio (para CPF e CA1 ventral)
   1. Antes da sessão cirúrgica, certifique-se de que a lente GRIN (ou prisma) esteja permanentemente fixada dentro do suporte de alumínio^usando supercola.
   2. Imediatamente antes da implantação, esterilize a lente saliente e o suporte da lente por imersão em uma solução de gluconato de clorexidina a 0,5%. Antes da inserção da lente, certifique-se de que a solução tenha secado completamente.
   3. Monte a unidade pré-montada do suporte da lente no manipulador de armação estereotáxica, garantindo que as porcas fiquem firmemente apertadas para evitar deslocamento durante a inserção.
   4. Como a lente pode não ser perfeitamente ortogonal ao suporte, primeiro alinhe manualmente a haste roscada a olho para garantir que ela esteja alinhada horizontalmente com a moldura estereotáxica ou pontos de referência ao redor.
   5. Uma vez alcançado o alinhamento visual, use um microscópio estereoscópico para definir a referência de ponto zero em bregma.
   6. Abaixe a lente a uma taxa constante de 0,5 mm·^min-1 (para PFC). Para áreas profundas do cérebro, como o hipocampo ventral, use uma taxa de inserção mais lenta para minimizar danos nos tecidos e garantir uma mira precisa.
   7. Durante a implantação do cristalino no hipocampo ventral, avance o cristalino 0,2 mm a cada 2 minutos até atingir uma profundidade de 2,0 mm. Continue abaixando a lente lentamente de 2,0 mm para 3,0 mm.
   8. O avanço é reduzido para 0,1 mm a cada 2 minutos, além de 3,0 mm de profundidade.
   9. Abaixe a lente em etapas de 0,05 mm a cada 2 minutos até atingir a profundidade final do alvo.
   10. Como esse processo frequentemente induz sangramentos significativos, aplique pequenos pedaços de esponja de gelatina embebida em soro estéril no local da craniotomia para manter um campo limpo e controlar o sangramento durante o avanço do cristalino.
   11. Depois que a lente atingir a profundidade alvo, espere pelo menos 10 minutos para que o local cirúrgico seque completamente. A umidade residual pode comprometer a adesão do cimento dental.
   12. Quando seco, aplique o adesivo até que todo o conjunto esteja coberto, deixando apenas a superfície superior do suporte da lente exposta.
   13. Depois que o adesivo estiver totalmente curado, para minimizar o choque mecânico durante o descolamento do suporte, afrouxe parcialmente as barras auriculares.
   14. Corte a ponte do suporte com bicos de raspanete. Após o corte, aperte novamente as barras auriculares antes de prosseguir com as etapas seguintes.
2. 4.2. Implantação de lente com bomba de aspiração (para CA1 dorsal)
   1. Preparação do suporte de lente: Conecte a ponta estreita da ponta de uma P1000 a uma mangueira de borracha de 4 mm de diâmetro, e a extremidade oposta da mangueira é conectada a uma seringa de 1 mL. Todas as juntas são seladas com fita de Teflon para garantir conexões herméticas.
   2. Monte a seringa de 1 mL conectada à mangueira horizontalmente no suporte estereotáxico.
   3. Montagem da ponta: Corte a ponta P1000 a 2 e 27 mm da extremidade estreita e mantenha o segmento de 2 a 27 mm. Corte a ponta do P200 a 24,5, 27 e 45 mm a partir da extremidade estreita, mantendo os segmentos de 0–24,5 mm e 27–45 mm (Figura 5A).
   4. Insira o segmento 0–24,5 mm da ponta P200 no segmento 27–45 mm e fixe com supercola (por exemplo, Loctite, Figura 5B). Insira os segmentos montados do P200 no segmento da ponta do P1000 e fixe com supercola. Alinhe os eixos centrais de todos os segmentos da ponta. Ajuste a distância entre a extremidade da ponta P1000 e a extremidade estreita da ponta interna da P200 para 1 mm (Figura 5C).
   5. Remova a agulha de aspiração presa à seringa e substitua-a por um suporte de lente fixado ao suporte estereotáxico (descrito acima).
   6. Esterilize a lente mergulhando-a em solução de gluconato de clorexidina a 0,5% antes de colocá-la no suporte.
   7. Monte o suporte da lente no sistema estereotáxico e ajuste a bomba de vácuo para ≥ 50 kPa. Fixe o conjunto da ponta (descrito acima) ao suporte por meio de um encaixe de pressão e carregue a lente no conjunto da ponta usando pinças.
   8. Posicionamento da lente: Após confirmar a fixação estável da lente ao conjunto da ponta, posicione a borda inferior da lente no bregma como ponto de referência e depois mova-se para o local do alvo. Avance a lente uma distância adicional igual ao seu raio (0,5 mm neste caso) ao longo do eixo anteroposterior (AP) para alinhar o centro da lente com o alvo.
   9. Alinhe a ponta do cristalino com a borda medial da craniotomia.
   10. Abaixe a lente 1,7 mm ao longo do eixo dorsoventral (DV) (para CA1 dorsal). Se ocorrer sangramento durante o avanço, retraa lentamente o cristalino, interrompa o sangramento, remova o sangue do cristalino e reinicie a inserção.
       NOTA: Avance os primeiros 0,7 mm a uma taxa de 0,1 mm por 10 s e avance lentamente os restantes 1 mm a uma taxa de 0,2 mm por minuto.
   11. Quando a lente atingir o alvo, fixe-a (descrita abaixo) usando Superbond e cimento dentário após deixar a superfície do crânio secar completamente. Nessa etapa, tome cuidado para evitar que o adesivo entre a lente e o suporte entre ele.
   12. Para remover o suporte após a fixação, desligue o aspirador e depois desconecte o suporte e a mangueira.
       NOTA: Essa sequência garante que não reste pressão negativa residual no sistema após a desativação da bomba.
   13. Levante o suporte cuidadosamente para evitar que o conjunto da ponta cai.

Figura 5. Conjunto de pontas (A) Segmentos das pontas de pipeta P1000 e P200 usados para a construção do conjunto da ponta. (B) Esquema da configuração montada. Insira o segmento menor da ponta P200 no segmento maior da ponta P200 e então encaixe o segmento da ponta P1000 por fora. (C) Conjunto de ponta totalmente montado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Cimentação

1. Aplique cimento de resina dentária (por exemplo, Super-Bond C&B) para cobrir a superfície do crânio e a superfície lateral da lente.
2. Depois que o adesivo estiver totalmente curado, remova o suporte da lente conforme descrito acima.
3. Use o cimento dental para cobrir o crânio exposto com uma camada em forma de cúpula. Certifique-se de que a lente não sobressairá do nível do cimento dentário.
4. Aplique cimento preto ou esmalte preto ao redor da lente para evitar interferências da luz ambiente.
5. Para proteger a lente, cubra a superfície da lente com selante de silicone (por exemplo, Kwik-Cast). Depois que o selante de silicone endurecer, aplique adesivo de silicone (por exemplo, Kwik-sil) sobre o cimento dentário (Figura 6).
   NOTA: Este protocolo é baseado na implantação de uma lente GRIN padrão. Portanto, é necessária uma cirurgia secundária da placa base após a recuperação. Deixe de 4 a 8 semanas após a injeção para expressão viral suficiente, depois identifique o plano focal ideal antes de fixar permanentemente a placa base.

Figura 6. Esquemas de cimentação e vedação para fixação da lente Ilustrações esquemáticas da fixação da lente após a implantação. A superligação é aplicada na superfície lateral do cristalino e no crânio ao redor (cinza). Após a cura completa do superbond, o cimento dentário é formado em forma de cúpula para igualar a altura da lente (rosa). Depois que o cimento endurece, um selante de silicone é aplicado para cobrir a superfície da lente (verde). Por fim, é aplicado um adesivo de silicone para cobrir e envolver a cúpula de cimento (azul claro). (A) Fixação da lente direcionada ao hipocampo dorsal. (B) Fixação de lente direcionada ao PFC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

A análise histológica após a implantação da lente usando o protocolo acima confirmou a colocação precisa tanto da lente GRIN quanto da lente GRIN acoplada a prismas. Em ambos os casos, as lentes foram posicionadas corretamente para registrar a atividade neural do córtex pré-frontal medial (Figura 7A) e da região CA1 do hipocampo dorsal (Figura 7B), respectivamente.

Discussão

O sucesso da imagem de cálcio in vivo baseada em lentes depende de várias etapas cirúrgicas que variam entre regiões cerebrais e geometrias de lentes, cada uma determinando diretamente a qualidade e confiabilidade dos sinais registrados. A Figura 10 resume o fluxo de trabalho cirúrgico geral para cada estratégia de implantação. O dimensionamento preciso da craniotomia é um passo fundamental: uma abertura muito grande em relação ao diâmetro da lente ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
8  Mangueira mm (diâmetro externo)	Tygon	E-3603
Bomba de aspiração	Cliq	VC-701
Cimento preto (Líquido Ortho-Jet contemporâneo)	Lang Dental Mfg. Co.	1506, preto
Cimento preto (Ortho-Jet Powder contemporâneo)	Lang Dental Mfg. Co.	1530, preto
Bupivacaína HCl com injeção pesada	Myungmoon	649801341
Solução de gluconato de clorexidina 5 %	Sungkwang	657400190
Cutanplast (odontologia)	Mascia Brunelli	5610101
Cimento dentário	Vértice	Tipo 2, Classe 2
Broca (diâmetro da ponta: 0,5  mm)	Ferramentas Científicas Finas	19007-05
Lubrificante para os olhos (Optixcare Pet Eye Lube Plus)	Aventix Saúde Animal	OPX-4242
Pinças	Ferramentas Científicas Finas	11254-20, 11051-10
Lente GRIN (0.6  ×   7,3  mm)	Inscopix	1050-004597
Lente GRIN (1.0  ×   4.0  mm)	Inscopix	1050-004595
Sistema homeotérmico para controlar a temperatura corporal em pequenos animais	Aparato de Harvard	Modelo: HB101
Isoflurano (Terrell)	Piramal	NDC 66794-011-25
Injeção de Ketoprofeno 100  mg/2  mL	Bukwang	642201001
Kwik-Cast	Instrumentos de Precisão Mundial	KWIK-CAST
Kwik-Sil	Instrumentos de Precisão Mundial	KWIK-SIL
Injeção de hidrato de lidocaína HCl 2%	Daihan	645104361
Esmalte de unha (Preto)	Wakemake	11
Lente Prisma GRIN (1.0 x 4.3 mm)	Inscopix	1050-004601
Solução salina	JW Corporação Farmacêutica	201703175
Micruscópio estéreo	Olympus	SZ61
Suporte estereotáxico (suporte padrão de eletrodo)	KOPF	Modelo 1770
Super Bond C & B (Catalisador)	Sun Medical	0334-0010
Super Bond C & B (radiopaca tipo L)	Sun Medical	0334-0020
Super Bond C & B (Monômero)	Sun Medical	0334-0013
Tesoura cirúrgica	Ferramentas Científicas Finas	14060-10
Cola UV (Adesivo Óptico Norland)	Produtos Norland	NOA 63