Preparação Padronizada do Músculo Liso Duodenal Isolado de Coelho para Avaliação Farmacológica In Vitro da Atividade Contrátil

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para padronizar a preparação do músculo liso duodenal isolado do coelho para avaliação farmacológica in vitro , utilizando um Sistema Experimental de Músculo Liso Horizontal a Temperatura Constante para registro em tempo real da atividade contrátil.

Resumo

A atividade contrátil coordenada do músculo liso gastrointestinal forma a base fisiológica para manter as funções normais de digestão, absorção e transporte, com sua disfunção intimamente associada a distúrbios de motilidade. A técnica de perfusão de órgãos isolados elimina interferências complexas in vivo — como fatores neurais, endócrinos e hemodinâmicos — servindo como um modelo clássico para estudos farmacológicos. Para isso, este estudo detalha um protocolo passo a passo para a preparação padronizada do músculo duodenal liso isolado de coelho. O fluxo de trabalho procedimental destaca as etapas críticas de preparação de soluções, eutanasia do coelho, realização de uma laparotomia asséptica precisa no meio do abdômen para excisão rápida de tecido, suspensão das tiras de músculo liso e calibração dos transdutores para registro de tensão em tempo real. Com base nessa plataforma técnica, validamos ainda mais o método avaliando os efeitos do Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) em contrações espontâneas e contrações tetânicas induzidas por acetilcolina/cloreto de bário. Em conclusão, esse protocolo proporciona uma estrutura metodológica robusta e altamente reprodutível, fornecendo uma plataforma amplamente aplicável para triagem in vitro para a avaliação farmacológica de agentes terapêuticos que visam a motilidade gastrointestinal.

Introdução

A atividade contrátil coordenada do músculo liso gastrointestinal serve como base fisiológica para manter as funções digestivas, absortivas e de transporte^{normais 1}. Sua disfunção está intimamente associada a vários distúrbios clínicos comuns, incluindo síndrome do intestino^{irritável 2}, dispepsia^{funcional 3} e distúrbios de motilidade gastrointestinal^{pós-operatória 4}. Elucidar os mecanismos moleculares e farmacológicos que regulam a atividade dos músculos lisos é crucial para desenvolver novas terapias procinéticas ou antiespasmódicas. Nesse campo de pesquisa, a técnica de perfusão de órgãos isolados serve como um modelo clássico. Ele oferece valor prático ao eliminar interferências complexas in vivo, como fatores neurais, endócrinos e hemodinâmicos, permitindo assim uma avaliação direta e precisa dos efeitos de drogas ou substâncias ativas no tônus muscular^{liso 5,6}.

Estabelecer protocolos estáveis e confiáveis para preparação in vitro de tecidos e registro de dados é essencial para obter resultados reproduzíveis e de alta qualidade. Os métodos experimentais existentes in vitro para músculos intestinais exigem otimização e padronização adicionais em várias áreas: manejo padronizado de animais experimentais, técnicas cirúrgicas meticulosas para colheita de tecidos, controle ambiental consistente dos sistemas de perfusão e aquisição automatizada de dados juntamente com análise padronizada. Por exemplo, temperatura e níveis de pH do fluido de perfusão, danos mecânicos durante a colheita de tecidos e ajustes de pré-carga de tecido podem impactar significativamente a viabilidade do tecido e introduzir erros experimentais. Esses fatores comprometem a confiabilidade dos resultados e dificultam a comparabilidade entre diferentes estudos ^7,8.

Portanto, este estudo visa estabelecer e elaborar um protocolo padronizado para preparar amostras isoladas de músculo liso duodenal de coelhos e realizar registro de tensão em tempo real. Este protocolo descreve sistematicamente todo o processo, desde ética e bem-estar animal experimental, laparotomia asséptica e isolamento preciso de segmentos intestinais, até a obtenção de controle ambiental, configurações padronizadas de pré-carga de tensão e aquisição de dados de alta fidelidade usando um sistema integrado de perfusão horizontal a temperatura constante e um sistema fisiológico de aquisição de sinais multicanal. Com base nessa plataforma técnica padronizada, aplicamos ainda métodos de dosagem cumulativa para avaliar quantitativamente os efeitos do Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), atendendo aos padrões de qualidade da Farmacopeia Chinesa (edição 2025)⁹, em contrações espontâneas e contrações tetânicas induzidas por cloreto de acetilcolina e bário em músculo liso duodenal isolado. O Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), uma forma dosificante da clássica fórmula da medicina tradicional chinesa Huoxiang Zhengqi, é comumente usado na China para distúrbios gastrointestinais, fornecendo a justificativa para avaliar seus efeitos diretos em músculos lisos intestinais isolados. Este estudo não apenas fornece evidências farmacológicas experimentais diretas elucidando os efeitos regulatórios do músculo liso gastrointestinal do HXZQ-OL, mas o protocolo experimental também serve como um modelo metodológico padronizado e reproduzível para triagem farmacológica e estudos in vitro de tecidos do músculo liso gastrointestinal.

Protocolo

Coelhos brancos adultos saudáveis da Nova Zelândia, de ambos os sexos (pesando 2,0–2,5 kg), foram usados neste trabalho. Todos os procedimentos experimentais com animais foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Nº de Aprovação: [2026070]). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados. O diagrama do fluxo de trabalho está ilustrado na Figura 1.

1. Preparação da solução

NOTA: Todas as soluções funcionais, incluindo a solução de Tirodo, acetilcolina (ACh), cloreto de bário, atropina e verapamil, devem ser preparadas frescas imediatamente antes do experimento.

1. Prepare 1 L da solução de Tirode dissolvendo 137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 0,4 mM de NaH₂PO₄, 1,0 mM de MgCl₂, 12 mM de NaHCO₃ e 5,6 mM de D-glicose. Antes do uso, sature com uma mistura de 95% O₂ / 5% CO₂ por 15–30 minutos, ajustando o pH para 7,3–7,4 (veja a Tabela de Materiais).
2. Prepare uma solução ACh de 1 mM de estoque. Pegue 20 μL e adicione a 20 mL da solução do Tirodo. Misture cuidadosamente para obter uma solução de 1 μM de ACh.
3. Prepare uma solução de cloreto de bário (BaCl₂) de 1 M. Pegue 20 μL e adicione 20 mL da solução de Tyrode. Misture bem para obter uma solução de 1 mM de BaCl₂.
   NOTA: BaCl₂ é altamente tóxico e irritante. Ao manusear, use equipamentos de proteção individual em uma exaustão e descarte o líquido residual conforme as regulamentações.
4. Prepare uma solução de estoque de sulfato de atropina de 10 mM. Pegue 20 μL e adicione 20 mL da solução de Tyrode. Misture cuidadosamente para obter uma solução de sulfato de atropina de 10 μM.
5. Prepare uma solução de 1 mM de cloridrato de verapamil. Pegue 2 μL e adicione a 20 mL da solução de Tyrode. Misture cuidadosamente para obter uma solução de cloridrato de verapamil com 0,1 μM.
   NOTA: As concentrações das soluções preparadas foram determinadas referenciando estudos anteriores^{6, 10 e 11} e foram ainda mais otimizadas por meio de nossos experimentos preliminares para garantir condições experimentais ideais.

2. Preparação de amostras de músculo liso duodenal de coelho in vitro

1. Eutanásia de coelhos
   1. Prenda o coelho no dispositivo de contenção (Figuras 2A, B e Figura 3A). Realize a eutanásia administrando uma overdose de pentobarbital sódico (120 mg/kg) via veia auricular em coelhos (Figura 2C e Figura 3B).
      NOTA: A morte completa deve ser confirmada pelos seguintes critérios: pupilas dilatadas, ausência de reflexo luminoso pupilar, cessação da respiração e do batimento cardíaco, e perda do reflexo plantar.
2. Preparação e desinfecção do local cirúrgico
   1. Fixe o coelho na posição supina sobre a mesa de cirurgia (Figura 2D e Figura 3C). Usando tesoura cirúrgica (Figura 2E) ou uma máquina de barbear elétrica, remova cuidadosamente todos os pelos abdominais para expor a pele na área cirúrgica designada (Figura 3D).
   2. Usando pinças de esponja (Figura 2E), segure um algodão embebido em iodo (Figura 2F,G). Começando no centro da incisão cirúrgica planejada, aplique a solução antisséptica em um padrão concêntrico e circular de dentro para fora (Figura 3E).
      NOTA: A área de desinfecção deve se estender além das bordas da incisão para garantir cobertura completa de toda a pele do campo cirúrgico. Após a desinfecção, espere pelo menos 3 minutos para que o antisséptico seque naturalmente na superfície da pele.
   3. Coloque uma cortina estéril (Figura 2H) sobre a área abdominal desinfetada para expor o campo cirúrgico (Figura 3F).
3. Posicionamento e incisão da incisão abdominal
   1. Usando um bisturi (lâmina #23) (Figura 2E), faça uma incisão longitudinal de 8 cm ao longo da linha média do abdômen, desde abaixo do processo xifoide até acima da sínfise púbica.
   2. Dissecar a pele e o tecido subcutâneo camada por camada. Seguindo a linha alba, dissece a bainha anterior do músculo reto abdominal, fibras musculares e peritônio camada por camada para entrar na cavidade abdominal (Figura 3G).
   3. NOTA: Durante o procedimento, evite danificar órgãos abdominais enquanto garante a hemostasia para evitar a contaminação do sangue no campo cirúrgico e nos órgãos abdominais.
4. Separação duodenal
   1. Abra a cavidade abdominal ao longo da incisão (Figura 3H). Retraa suavemente os lóbulos hepáticos cefálicos usando gaze salina úmida (Figura 2I) para expor totalmente o estômago e o duodeno (Figura 3I).
   2. Selecione o segmento inicial do duodeno (porção bulbar ou descendente superior) localizado a 2–3 cm do pilor como local de colheita de tecido.
   3. NOTA: Evite tração direta ou clampagem do segmento intestinal alvo sempre que possível para minimizar lesões mecânicas. Em vez disso, use pinças contundentes para segurar suavemente o mesentério adjacente, ou cotonhotes umedecidos com soro para manipular e posicionar delicadamente o tecido.
   4. Usando tesouras oftalmológicas estériles (Figura 2E), ressece rápida e com precisão um segmento de 1–2 cm (Figura 2J) do tubo duodenal (Figura 3J,K).
   5. Transfira imediatamente o segmento intestinal excisado para um recipiente de cultura (Figura 2K) contendo solução de Tirode pré-refrigerada (4 °C) continuamente perfundida com um gás misto (95% O₂ / 5% CO₂).
5. Aparação, limpeza e armazenamento temporário de segmentos intestinais
   1. Usando pinças oftálmicas (Figura 2E), dissece suavemente o mesenterio e o tecido adiposo ao redor que aderem à parede intestinal.
   2. Usando uma seringa cheia de solução fria de Tyrode (equipada com uma agulha de ponta romba) (Figura 2L), injete suavemente a solução de enema na cavidade intestinal. Lave lentamente o interior da cavidade intestinal 2 a 3 vezes para limpar completamente seu conteúdo.
   3. Coloque os segmentos intestinais limpos em uma solução fresca e oxigenada de Tyrode para armazenamento temporário até experimentos subsequentes.

3. Inicialização e infusão de solução do sistema experimental de músculo liso horizontal a temperatura constante

1. Adicione a solução de Tyrode ao prato de pré-aquecimento do Sistema Experimental de Músculo Liso Horizontal a Temperatura Constante DSQG-1 (Figura 4B; veja a Tabela de Materiais).
2. Ligue a energia do sistema, toque no painel de operação para ajustar a temperatura do banho para 37 °C e comece a pré-aquecer (Figura 4C).
3. Pressione o botão de Infusão , e o sistema dispensará automaticamente 20 mL da solução de Tyrode no tanque do banho.
4. Pressione o botão Drenagem para drenar completamente o líquido para o recipiente de coleta de resíduos.
5. Pressione o botão Enxaguar e o sistema completará automaticamente o processo de primeiro drenar o conteúdo e depois reabastecer com líquido.
6. Pressione o botão Parar para encerrar imediatamente todos os processos contínuos de infusão, drenagem e enxágue.
7. Pressione o botão de Inflação para introduzir continuamente o gás misturado (95% O₂ / 5% CO₂) no banho. Ajuste a taxa de fluxo de gás para a escala 5 para garantir a subsequente oxigenação experimental dos tecidos.
   NOTA: A escala 5 indica uma vazão de gás de 100 mL/min. Taxas de fluxo excessivamente altas podem causar aumento da turbulência da solução, afetando a estabilidade das gravações de tensão.

4. Conectar um sistema de gravação e processamento fisiológico multicanal com operação por software

1. Conecte o cabo de dados do transdutor do Sistema Experimental de Músculo Liso Horizontal a Temperatura Constante ao Canal 1 do Sistema Multicanal de Registro e Processamento Fisiológico (Figura 4D).
2. Ligue a fonte de alimentação externa do Sistema de Gravação e Processamento Fisiológico Multicanal e ligue o computador. Clique duas vezes no ícone RM6240XC Sistema de Gravação e Processamento Fisiológico Multicanal na área de trabalho para iniciar o sistema experimental de software (veja a Tabela de Materiais).
3. Na barra de menu, selecione Experimento | Digestão | Características fisiológicas do músculo liso intestinal para carregar o módulo experimental correspondente.
4. Defina os seguintes parâmetros: modo canal para Tensão, frequência de amostragem para 400 Hz, sensibilidade para 1,5 g, constante de tempo para DC e frequência do filtro para 30 Hz.
5. Clique no botão Start no canto superior direito da interface do software para iniciar a aquisição e exibição do sinal em tempo real. Clique no botão Gravar para exibir simultaneamente o osciloscópio e salvar o sinal adquirido no disco rígido em tempo real.
6. Na barra de menu, selecione Experimento | Zeramento rápido para ajustar o sinal de tensão ao nível de base.
   NOTA: Se o sinal se desviar da linha de base por mais de uma unidade de coordenadas verticais, ajuste manualmente o ponto zero do transdutor de tensão usando uma chave de fenda.
7. Na barra de menu, selecione Experimento | Método de exibição de dados em tempo real | Placa flutuante. Na caixa de diálogo que aparece, escolha Medição Normal em Tempo Real - Rápido paraexibir dados de tensão em tempo real do músculo intestinal na janela flutuante.

5. Ajuste de suspensão e pré-carga de tensão da faixa muscular duodenal

1. Ajuste o espaçamento da frente para trás dos ganchos de papel girando o botão horizontal do parafuso de acordo com o comprimento da tira muscular duodenal, garantindo que ela corresponda ao comprimento da tira.
2. Mantenha o segmento intestinal em sua configuração cilíndrica natural e alinhe a linha de visão com a abertura circular transversal do lúmen intestinal.
3. Usando pinças oftálmicas, retraia suavemente a abertura intestinal para manter a permeabilidade.
4. Insira delicadamente a ponta do gancho de tecido no lúmen intestinal.
5. A uma distância de 2–3 mm da margem intestinal, perfure a parede intestinal superior de camada única de dentro para fora usando a ponta do gancho de tecido.
   NOTA: O gancho de tecido deve penetrar a camada muscular para garantir uma ancoragem segura, evitando a fixação superficial apenas na camada serosa, para evitar cortes mecânicos e rasgos da parede intestinal pelo gancho quando a pré-carga é aplicada.
6. O outro lado da parede intestinal é idêntico ao primeiro lado. Após identificar o ponto correspondente paralelo, penetre apenas na parede intestinal de camada única nesse ponto (Figura 3L).
7. Gire novamente o botão horizontal do parafuso para ajustar o espaçamento dos ganchos, garantindo que a faixa muscular duodenal permaneça naturalmente relaxada.
8. Aplique gradualmente a tensão ajustando o ajustador fino unidimensional até que a tensão média da tira muscular duodenal se estabilize em 0,8 ± 0,1 g (Figura 4A).
   NOTA: Inspecione visualmente todo o comprimento do intestino para garantir que ele permaneça reto e cilíndrico, livre de torções, rotações ou dobras em espiral. Se não for o caso, reduza imediatamente a tensão e reajuste o ponto de fixação em uma das extremidades.
9. Antes de iniciar o experimento, equilibre a tira muscular duodenal na câmara de perfusão por 60 minutos. Durante esse período de equilíbrio, substitua a solução do tirodo por um novo tampão a cada 15–20 minutos até que seu ritmo contrátil espontâneo se estabilize.
   NOTA: O período de equilíbrio de 60 minutos foi considerado completo apenas quando os segmentos intestinais isolados apresentaram atividade contrátil espontânea estável por pelo menos 15 minutos consecutivos. Os critérios objetivos para estabilização foram definidos quantitativamente da seguinte forma: (1) deriva de tensão em repouso de < ±5%, (2) variância na amplitude contátil média de < ±10% ao longo de intervalos consecutivos de 5 minutos e (3) flutuação de frequência de < ± 1 ciclo/minuto.
10. Registre a curva de atividade contrional espontânea da tira muscular duodenal como dados de referência de referência para experimentos subsequentes.

6. Aquisição experimental de dados

1. Para experimentos em andamento, na barra de menu, selecione Ferramentas | Visão dividida para realizar análise estatística em tempo real dos dados capturados da forma de onda.
2. Para arquivos de dados armazenados, clique no botão Abrir na barra de ferramentas, selecione um arquivo de dados salvo com a extensão .lsd e carregue registros históricos de experimentos.
3. Clique no ícone Medir na barra de ferramentas, selecione o modo Região . Mova o cursor do mouse sobre a área da forma de onda, mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse para selecionar quaisquer dois pontos, e o sistema exibirá um painel de dados mostrando o valor médio de tensão dentro daquele segmento.
4. Clique no ícone Medir na barra de ferramentas, selecione modo Período . Usando o botão esquerdo do mouse, clique em cinco picos de onda distintos consecutivos (pontos de pico) ao longo da forma de onda. Clique com o botão direito do mouse, e o painel de dados calculará e exibirá a frequência de contração (em bpm) (Figura Suplementar S1).

Resultados

Este protocolo experimental descreve o método padronizado de preparação para tiras musculares duodenais isoladas de coelho e o processo de registrar suas mudanças dinâmicas de tensão e frequência em tempo real usando um sistema de perfusão de órgãos isolados. Seguindo esse protocolo, o HXZQ-OL foi adicionado sequencialmente por dosagem cumulativa em um banho de solução de tirodo de 20 mL, alcançando concentrações de volume final de 10, 20, 30, 40 e 50 μL/mL no banho. Referenciando os padrões da Farmacopeia Chinesa (ediçã...

Discussão

Técnicas de perfusão isolada de órgãos e registro de tensão representam métodos clássicos para estudar a fisiologia do músculo liso e a farmacologia. Seus achados têm grande importância para elucidar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a distúrbios de motilidade gastrointestinal, doenças vasculares e disfunção^uterina 12,13,14,15. Utilizando um modelo duo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5-10 µL Pipeta	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
Pontas de Pipeta de 10 µL	LABSELECT	T-001-10
Balão volumétrico de 10 mL	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
Balão volumétrico de 100 mL	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
Pipeta de 100-1000 µL	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
Pontas de Pipeta de 1250 µL	LABSELECT	T-001-1250
Balão volumétrico de 20 mL	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
Pontas de Pipeta de 200 µL	LABSELECT	T-001-200
Tubo de centrífuga cônico de 50 mL	LABSELECT	CT-002-50A
Pipeta de 5-50 µL	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Cloreto de acetilcolina	Supelco	PHR1546
Computador de Laboratório All-in-One	Lenovo	R5-3500U
Sulfato de atropina	Macklin	A822893
Cloreto de bário	Sigma-Aldrich	342920
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Osmômetro de ponto de congelação	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Sistema de Experimento de Músculo Liso de Temperatura Constante Horizontal	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Líquido Oral Huoxiang Zhengqi	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Sistema Multicanal de Gravação e Processamento Fisiológico	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
Coelhos Brancos da Nova Zelândia	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (Licenciamento No.: SCXK[Su]2022-0004)	ambos os sexos (pesando 2,0–2,5 kg)
pHmetro	Shanghai Leici	PHS-25
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P5405
Povidona-iodina	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Balança de precisão (0,1 mg)	Sartorius	BCE64i
Solução salina	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6014
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888
Fosfato de dihidrogênio de sódio	Supelco	1063700250
Pentobarbital de sódio	Sigma-Aldrich	P3761
Cloreto de Verapamil	Macklin	V820460
Misturador Vortex	Kylin-Bell	XW-80A