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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Utilizando um modelo de camundongo induzido por dieta rica em gordura para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica, este estudo avalia os efeitos da suplementação com óleo de microalgas rico em ácido docosahexaenoico (DHA) e mostra que a intervenção melhora os perfis lipídicos hepáticos e está associada a alterações na composição da microbiota intestinal.
Metabólicamente, a doença hepática esteatótica disfuncional é um distúrbio metabólico prevalente associado à disbiose da microbiota intestinal e desequilíbrio lipídico hepático. Neste estudo, foi estabelecido um modelo de camundongos induzido por dieta rica em gordura para avaliar os efeitos da suplementação com óleo de microalgas rico em DHA. Os camundongos (n = 4 por grupo) foram alimentados com uma dieta rica em gordura por 8 semanas e receberam administração oral diária de óleo de microalgas, probióticos ou a combinação de óleo de microalgas rico em DHA e probióticos. Parâmetros metabólicos, composição da microbiota intestinal (sequenciamento do rRNA 16S), vias funcionais microbianas e perfis metabolômicos hepáticos foram avaliados. Os resultados mostraram que o óleo de microalgas rico em DHA melhorou a homeostase lipídica, como indicado pela redução dos níveis séricos de LDL-c e triglicerídeos hepáticos, além do aumento da lipoproteína de alta densidade (HDL-c), além de estar associado ao alívio de lesão hepática e estresse oxidativo. A análise do microbioma revelou mudanças seletivas na composição microbiana intestinal, incluindo o enriquecimento de Lactobacillus e Bifidobacterium e a redução de táxons associados à dieta rica em gordura, como Clostridium e Ruminococcus. O perfil funcional indicou alterações nas vias metabólicas microbianas, incluindo o ciclo de salvamento da L-metionina e a degradação da feniletilamina. A análise integrada microbioma–metaboloma identificou ainda associações entre táxons microbianos e metabólitos hepáticos envolvidos no metabolismo dos ácidos graxos, na renovação dos ácidos biliares e nas vias dos aminoácidos. Esses achados indicam que a suplementação com óleo de microalgas rica em DHA está associada a melhorias no metabolismo lipídico hepático e na composição da microbiota intestinal neste modelo, sem implicar um mecanismo causal direto.
A doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (MASLD) é uma condição global altamente prevalente, afetando aproximadamente 32,4% da populaçãomundial 1. MASLD é definida pelo excesso de gordura no fígado, que contribui para vários problemas de saúde associados. O trato digestivo humano contém uma comunidade microbiana sofisticada e equilibrada, incluindo bactérias, vírus, fungos eparasitas 2. Devido à interação entre essa comunidade microbiana e o fígado, os probióticos são vistos como um método promissor para prevenir e tratar a MASLD ao modular essa conexãocrítica 3. Pesquisas emergentes indicam que probióticos podem impactar positivamente a MASLD ao modular o microbioma intestinal e reduzir a inflamação. Especificamente, a administração de probióticos demonstrou restaurar o equilíbrio da microbiota intestinal e reduzir a inflamação hepática4. Além disso, certos probióticos, especialmente aqueles que poderiam acelerar o metabolismo dos ácidos biliares, demonstraram aliviar a esteatose hepática (fígado gorduroso) e apoiar a saúde metabólica geral em indivíduos com MASLD 5,6. Além disso, fortes evidências indicaram que pacientes com MASLD apresentam mudanças significativas no ambiente intestinal, uma condição conhecida comodisbiose 7,8. Uma descoberta crucial foi a redução da diversidade alfa, o que significa que o número total e a variedade de espécies microbianas são diminuídos. Além disso, a microbiota intestinal dos pacientes com MASLD é frequentemente caracterizada pela dominância do filo bacteriano Firmicutes 9,10,11. Indivíduos com MASLD geralmente consomem dietas pobres, geralmente apresentando alta ingestão de gorduras saturadas e baixo consumo de micronutrientesessenciais 12,13. Esses padrões alimentares pouco saudáveis, frequentemente observados em populações urbanas, correlacionam-se com uma proporção elevada de Firmicutes para Bacteroidetes em comparação com pessoas que vivem em ambientesrurais 14. Além disso, dietas ricas em gordura foram diretamente implicadas em causar um desequilíbrio intestinal mais profundo. Especificamente, tanto pesquisas em modelos animais quanto estudos em pacientes com doença hepática avançada, MASLD, mostraram que a ingestão elevada de gordura estava ligada à alteração do viromo intestinal. Essas alterações incluíram um aumento na atividade dos fagos líticos, que acabou agravando a disbiose intestinalexistente 15,16.
Ácidos Graxos Poliinsaturados Ômega-3 (PUFAs), comumente encontrados no óleo de peixe, podem melhorar o metabolismo dos lipídios e regular a microbiota intestinal. O óleo de microalgas emergiu como uma fonte promissora e sustentável de PUFAs ômega-3. Especificamente, o óleo de microalgas Schizochytrium é uma fonte comercial promissora porque contém uma alta concentração de ácido docosahexaenoico puro (DHA). Estudos anteriores desse grupo relataram que, em um modelo de camundongos com obesidade induzida por dieta rica em gordura (HFD), a eficácia do óleo de microalgas na promoção da perda de peso foi comparável à do óleo de peixe e do medicamento para perda de peso Orlistat. De forma crítica, o óleo de microalgas apresentou esses efeitos de perda de peso antes do óleo de peixe ou do Orlistat17. Achados anteriores também mostraram que o óleo de microalgas exerceu efeitos distintos e benéficos sobre a microbiota intestinal em comparação com o óleo de peixe comercial e o Orlistat. Embora o óleo de microalgas não alterasse significativamente a diversidade bacteriana geral, ele estava associado a uma maior abundância de bactérias benéficas produtoras de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) e a uma redução nos táxons patogênicos, incluindo o gênero Desulfovibrio, associado à obesidade. Além disso, o óleo de microalgas restaurou notavelmente a capacidade metabólica da microbiota intestinal, aprimorando vias relacionadas a aminoácidos, SCFAs e metabolismo dos ácidos biliares, ao mesmo tempo em que diminuiu crucialmente a biossíntese dos lipopolissacarídeos (LPS). Essas modulações provavelmente foram responsáveis pela melhoria do metabolismo lipídico e pelo aumento da barreira mucosa do cólon, sugerindo que o óleo de microalgas era um suplemento alimentar superior para o alívio daobesidade 17.
Apesar do progresso na ligação entre a disbiose da microbiota intestinal e o desenvolvimento da MASLD, as relações específicas entre composição microbiana, funções metabólicas microbianas e metabolismo lipídico hepático permanecem incompletamente compreendidas. Em particular, as ligações causais entre alterações na microbiota e a progressão da doença permanecem incertas, e se intervenções alimentares, como o óleo de microalgas rico em DHA, estão associadas a mudanças coordenadas nas comunidades microbianas intestinais e nos perfis metabólicos do hospedeiro ainda não foi investigado sistematicamente. O óleo de microalgas rico em DHA é uma fonte sustentável e eficiente de ácidos graxos ômega-3, com teor de óleo de microalgas rico em DHA comparável aos suplementos derivados de peixes. Estudos anteriores sugeriram que a suplementação com óleo de microalgas rica em DHA pode melhorar a esteatose hepática e os parâmetrosmetabólicos 18,19. No entanto, suas associações com a composição da microbiota intestinal e a função metabólica microbiana no contexto da MASLD permanecem incertas.
Portanto, neste estudo, o presente estudo utilizou um modelo de camundongos induzido por dieta rica em gordura para avaliar os efeitos da suplementação com óleo de microalgas rica em DHA nos parâmetros metabólicos, composição da microbiota intestinal e perfis metabolômicos hepáticos. Foi hipotetizado que a suplementação com óleo de microalgas rica em DHA estaria associada a melhorias no metabolismo lipídico hepático e alterações concomitantes na composição da microbiota intestinal e nas vias metabólicas microbianas.
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Detalhes de todos os animais, dietas, reagentes, kits, instrumentos, softwares e prestadores de serviços usados neste protocolo são fornecidos na Tabela de Materiais. Todos os estudos com animais foram realizados seguindo as Diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e receberam aprovação do Comitê de Animais Experimentais do Hospital Provincial de Shandong (aprovação ética nº 2022–007, aprovada em 24 de janeiro de 2022).
ATENÇÃO: Sangue animal, amostras fecais e tecidos devem ser manuseados como materiais potencialmente biohazardos. Todos os procedimentos envolvendo animais vivos, amostras biológicas, objetos cortantes, solventes orgânicos e reagentes de ensaio químico devem ser realizados de acordo com as normas institucionais de biossegurança, cuidado animal e segurança química. Carcaças de animais, tecidos, materiais contaminados com sangue e amostras fecais devem ser coletados em recipientes designados para resíduos de risco biológico e descartados por meio da instalação institucional de animais ou do escritório de biossegurança. Agulhas, agulhas de gavage, tubos capilares e outros objetos cortantes devem ser descartados imediatamente após o uso em recipientes aprovados. Resíduos de solvente orgânico, incluindo metanol, acetonitrilo e soluções contendo ácido fórmico, devem ser coletados em recipientes de resíduos químicos rotulados e descartados por meio do programa institucional de resíduos químicos perigosos. Resíduos provenientes de ensaios bioquímicos e de estresse oxidativo devem ser coletados e descartados de acordo com as fichas de dados de segurança do fabricante e as regras institucionais de segurança química.
Animais experimentais
Machos de seis semanas C57BL/6J (n = 4 por grupo) foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos (FPS), com um ciclo de 12 horas claro/escuro a 22 ± 2 °C e 50–60% de umidade relativa. Os animais tinham acesso ad libitum a comida e água, com no máximo cinco camundongos alojados por gaiola. Os camundongos controle foram alimentados com uma dieta padrão de chow composta por 70% de carboidratos, 20% de proteína e 10% de gordura (kcal). Para estabelecer o modelo de camundongos MASLD, camundongos foram alimentados com uma dieta rica em gordura por 8 semanas, contendo 20% de carboidratos, 20% de proteína e 60% de gordura (kcal). Todas as dietas eram armazenadas a 4 °C e reabastecidas duas vezes por semana. Os camundongos foram alocados aleatoriamente para grupos experimentais usando um gerador de números aleatórios, e o tamanho da amostra (n = 4 por grupo) foi determinado com base em estudos anteriores usando modelos semelhantes de camundongos induzidos por dietas ricas em gordura e experimentos preliminares. Todos os tratamentos foram aplicados no mesmo horário todos os dias para minimizar a variação circadiana.
O óleo de microalgas foi extraído e purificado pela Academia de Ciências Agrícolas de Shandong, com pureza de aproximadamente 99%. O óleo de microalgas era armazenado a −30 °C protegido da luz. Antes da administração, o óleo era preparado com um emulsificante e cuidadosamente misturado para garantir homogeneidade. Especificamente, o óleo de microalgas rico em DHA foi emulsionado em sódio carboximetilcelulose estéril de 0,5% contendo 0,5% de Tween-80 em soro fisiológico normal. O óleo de microalgas e o veículo emulsionante foram misturados na proporção de 1:9 (v/v) e vórtices por 2 minutos imediatamente antes do vavage para obter uma suspensão uniforme. Os camundongos do grupo tratado com óleo de microalgas recebiam a preparação uma vez ao dia por gavage oral usando uma agulha de alimentação estéril, em uma dose de 10 μL/g de peso corporal. O volume do gavage era ajustado diariamente de acordo com o peso corporal para garantir a consistência da dose. Os camundongos do grupo controle receberam um volume equivalente de soro fisiológico normal estéril sob as mesmas condições. A solução salina utilizada foi injeção de cloreto de sódio a 0,9%.
O tratamento probiótico consistiu em uma formulação composta contendo Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) e Bacillus coagulans (GIM 1,645). As quatro cepas foram misturadas em uma proporção igual de células viáveis de 1:1:1:1. Cada cepa contribuiu com 2,5 × 107 CFU/mL para a formulação final, resultando em uma concentração bacteriana total de 1 × 108 CFU/mL. A mistura probiótica foi sintetizada pela Academia de Ciências Agrícolas de Shandong e não está disponível comercialmente. O tratamento probiótico consistiu em um caldo de fermentação probiótico composto contendo Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC e Bacillus coagulans GIM 1.645. A concentração bacteriana da formulação foi de 1 × 108 CFU/mL. O caldo probiótico de fermentação era armazenado a 4 °C antes do uso. Os camundongos do grupo tratado com probióticos receberam a formulação probiótica uma vez por dia por gavage oral em uma dose de 0,01 mL/g de peso corporal durante todo o período experimental.
As cepas individuais foram cultivadas sob condições apropriadas e colhidas na fase média do crescimento do troncário (OD₆₀₀ ≈ 0,6), depois combinadas na razão indicada. Culturas bacterianas foram centrifugadas para remover o sobrenadante, e os pellets foram ressuspensos em soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS). A suspensão bacteriana recém-preparada foi mantida no gelo antes da administração para preservar a viabilidade. A concentração bacteriana final foi ajustada para 1 ×10 8 CFU/mL antes da administração. Os camundongos do grupo probiótico receberam a formulação por gavage oral em uma dose de 0,01 mL/g de peso corporal uma vez ao dia durante todo o período experimental. Nenhum pré-tratamento antibiótico foi aplicado antes da administração do probiótico. Para reduzir o viés experimental, a avaliação de resultados foi realizada por pesquisadores cegos quando aplicável. A MASLD foi confirmada por meio de análise bioquímica do sangue.
Análise de sangue
Ao final do período experimental, os camundongos foram jejuados durante a noite (12 h) com livre acesso à água antes da medição da glicose e da coleta terminal de sangue. Os camundongos foram profundamente anestesiados com isoflurano usando um vaporizador anestésico até que a perda do reflexo pedal fosse confirmada. Amostras terminais de sangue foram coletadas por sangramento retroorbital. Após a coleta de sangue, os camundongos foram eutanasiados por luxação cervical sob anestesia profunda, e a morte foi confirmada pela cessação da respiração e do batimento cardíaco. O sangue foi deixado coagular em temperatura ambiente e depois centrifugado a 3.000 × g por 10 minutos para obter soro. As amostras de soro foram alicotadas e armazenadas a −80 °C até análise. Glicose sérica, colesterol total (TC), triglicerídeos (TG), colesterol lipoproteico de baixa densidade (LDL-c), colesterol lipoproteico de alta densidade (HDL-c), aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foram medidos usando um analisador bioquímico automático, seguindo as instruções do fabricante. Esses parâmetros foram quantificados usando ensaios colorimétricos enzimáticos com kits de reagentes padrão integrados ao sistema analisador. Todos os parâmetros bioquímicos foram normalizados ao volume sérico e expressos nas unidades especificadas pelo fabricante.
Ensaios de estresse oxidativo
Biomarcadores de estresse oxidativo foram medidos usando kits, incluindo os de malondialdeído, superóxido dismutase e catalase. Os ensaios foram realizados seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, os tecidos hepáticos foram homogeneizados em tampão gelado e centrifugados para obter supernadantes para análise. Os níveis de malondialdeído (MDA) foram determinados usando um ensaio de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS); a atividade da dismutase de superóxido (SOD) foi medida por sua capacidade de inibir reações mediadas por superóxido; e a atividade da catalase (CAT) foi quantificada monitorando a taxa de decomposição do peróxido de hidrogênio. As medições eram realizadas usando um leitor de microplacas, e os valores eram calculados usando curvas padrão ou as fórmulas fornecidas nos kits. Marcadores de estresse oxidativo foram normalizados ao peso do tecido hepático e expressos de acordo com as especificações do fabricante.
Sequenciamento do rRNA 16S e análise do microbioma
Amostras fecais foram coletadas ao final do período experimental diretamente de camundongos individuais em condições estéreis, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 °C até a extração de DNA. O DNA microbiano foi extraído usando um kit comercial conforme o protocolo do fabricante. A região V3–V4 do gene bacteriano 16S rRNA foi amplificada usando primers 341F/806R. A amplificação por PCR foi realizada em um sistema de reação de 25 μL contendo DNA mole, 2x mistura mestre PCR e 0,2 μM de cada primer. O programa de amplificação consistia em desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 25 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 45 s, com uma extensão final a 72 °C por 10 minutos. As bibliotecas Amplicon foram construídas e sequenciadas em uma plataforma Illumina MiSeq usando uma estratégia de extremidade pareada de 2 × 250 bp por um provedor comercial de serviços de sequenciamento. A qualidade da biblioteca era avaliada antes do sequenciamento, e as bibliotecas agrupadas eram carregadas na densidade de cluster recomendada pelo fabricante. Leituras de baixa qualidade com bases ambíguas, comprimento insuficiente ou pontuação média de qualidade abaixo do Q20 foram removidas antes da análise posterior.
As leituras de sequenciamento bruto foram processadas usando QIIME 2 versão 2019.420. Resumidamente, as leituras de extremidade pareada foram desmultiplexadas, filtradas por qualidade, reduzidas ao ruído, mescladas e filtradas por quimera usando DADA2 com parâmetros padrão, salvo especificação em contrário. Variantes de sequência de amplicã (ASVs) não singleton foram mantidas para análise a jusante. A atribuição taxonômica foi realizada usando o banco de dados Greengenes versão 13_8 implementada no QIIME221. Dadas as limitações inerentes à resolução do sequenciamento do gene 16S rRNA, especialmente ao usar o banco de dados Greengenes, as anotações taxonômicas foram interpretadas exclusivamente no nível do gênero. A classificação em nível de espécie não foi considerada confiável e, portanto, não foi usada em análises posteriores, comparações estatísticas ou interpretações biológicas. Todas as características microbianas foram colapsadas ao nível do gênero antes da visualização e análise.
Métricas de diversidade alfa (Chao1, Espécies observadas, Shannon, Simpson, PD de Faith e uniformidade de Pielou) foram usadas. Comparações estatísticas da diversidade alfa entre grupos foram realizadas usando testes não paramétricos apropriados (por exemplo, teste de Kruskal–Wallis). A distância de Jaccard e a dissimilaridade de Bray-Curtis foram usadas como métricas de diversidade beta. Gráficos de Análise Coordenada Principal (PCoA), escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) e análise discriminante linear do efeito tamanho (LEfSe) foram usados para ilustrar mudanças nas comunidades do microbioma, com um limiar de pontuação LDA de 2,0. A análise multivariada permutacional da variância (PERMANOVA) foi usada para avaliar a significância estatística na diversidade beta. A visualização de dados e análises estatísticas foram realizadas utilizando a plataforma GenesCloud (https://www.genescloud.cn).
Perfis funcionais microbianos foram inferidos a partir de dados de sequenciamento de rRNA 16S, em vez de medidos diretamente por sequenciamento metagenômico ou transcriptômico em força. Com base na tabela de abundância de vias normalizadas ou grupos funcionais, as unidades funcionais previstas foram mapeadas para bancos de dados comumente usados, incluindo KEGG, MetaCyc e COG. A abundância de vias KEGG foi resumida de acordo com suas categorias funcionais hierárquicas, com classificações de vias de nível 2 usadas para comparação a jusante. A abundância média de cada categoria de vias foi calculada usando o software R.
Análise metabolômica não direcionada de amostras de fígado
Os tecidos hepáticos eram rapidamente excisados imediatamente após a confirmação da morte, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a −80 °C antes da análise. Aproximadamente 50 mg de tecido hepático congelado foram homogeneizados em metanol gelado:água (4:1, v/v) suplementado com padrões internos. A razão tecido para solvente extraído foi de 1:10 (p/v). As amostras foram vórtices por 1 minuto, sonicadas no gelo por 10 minutos e depois incubadas a −20 °C por 30 minutos para melhorar a precipitação de proteínas. Os homogenados foram completamente misturados, submetidos à sonicação sobre gelo e centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Os supernadantes foram cuidadosamente coletados, evaporados sob um fluxo moderado de nitrogênio e reconstituídos em metanol de 50% para análise subsequente.
Amostras de controle de qualidade (QC) foram geradas agrupando volumes iguais de cada amostra e analisadas intermitentemente ao longo da corrida para avaliar a estabilidade analítica e a reprodutibilidade. A análise metabolômica não direcionada foi realizada usando um sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho acoplado a espectrometria de massa de alta resolução, operado por um provedor comercial de serviços. Os metabólitos foram separados em uma coluna C18 em fase reversa usando um sistema de solvente binário composto por água com 0,1% de ácido fórmico e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico. O volume de injeção era de 2 μL, a temperatura da coluna era mantida em 40 °C e a vazão era ajustada a 0,30 mL/min. Um programa de elução em gradiente foi utilizado para alcançar uma ampla separação dos metabólitos. A detecção por espectrometria de massas foi realizada tanto em modos de ionização por eletrospray positivo quanto negativo, em uma faixa m/z de 70–1.000 para alcançar ampla cobertura de metabólitos. A tensão de pulverização de íons foi ajustada para 3,5 kV no modo positivo e −2,5 kV no modo negativo. A temperatura capilar foi mantida em 320 °C, e os dados foram adquiridos em modo de varredura completa com aquisição de EM/MS dependente dos dados para anotação de metabólitos. Os dados brutos eram processados usando um software dedicado de metabolômica (MassLynx v4.1) para detecção, alinhamento e normalização de características. A identificação de metabólitos foi realizada com base em massa, tempo de retenção e padrões de fragmentação MS/MS precisos, por comparação com bancos de dados públicos, incluindo o Human Metabolome Database (HMDB) e a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), quando aplicável.
Análise multivariada e de vias
Os dados processados de metabolômica foram submetidos a análises estatísticas multivariadas, incluindo análise de componentes principais (PCA) e análise discriminante parcial de mínimos quadrados (PLS-DA), para visualizar diferenças metabólicas entre grupos experimentais. Metabólitos diferenciais foram identificados com base em uma combinação de importância variável nas pontuações de projeção (VIP) (>1,0) e significância estatística (p < 0,05). Metabólitos identificados foram ainda mapeados para vias metabólicas usando análise de enriquecimento de vias KEGG para elucidar processos biológicos associados à suplementação de óleo de microalgas rico em DHA.
Análise estatística
Os dados foram apresentados como média ± SEM e analisados usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. A significância estatística foi definida como p < 0,05. A análise de enriquecimento dos metabólitos do fígado foi realizada usando R (versão 4.4.1). Associações par a par entre gêneros microbianos e metabólitos do fígado foram analisadas usando correlações de rank de Spearman. Apenas correlações significativas (taxa de falsas descobertas, FDR < 0,05) com |ρ| ≥ 0,6 foram incluídas nas análises integrativas de rede. O processamento de dados de microbioma e metabolômica foi realizado conforme descrito acima, incluindo o uso da plataforma GenesCloud e procedimentos de controle de qualidade.
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Óleo de microalgas rico em DHA melhora o metabolismo lipídico, lesão hepática e estresse oxidativo hepático em camundongos MASLD induzidos por HFD
Para avaliar o efeito dos suplementos alimentares na homeostase da glicose e dos lipídios, parâmetros bioquímicos foram avaliados em cinco grupos: comida regular (RC), dieta rica em gordura (HFD), suplementada com óleo de microalgas rica em DHA, suplementada com probióticos e camundongos combinados ...
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Nos últimos anos, vários estudos investigaram mudanças no microbioma associado à MASLD. No entanto, a maioria desses estudos tem se concentrado em comparar indivíduos saudáveis com pacientes com MASLD ou em examinar diferentes graus de esteatose24. Consequentemente, ainda há evidências limitadas detalhando as alterações específicas da microbiota intestinal associadas à fibrose hepática na MASLD, embora a fibrose seja o fator mais crítico na previsão dos desfechos ...
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Os autores não têm nada a revelar.
Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Tecnologia ("Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China" nº 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) e pelo Sistema Moderno de Indústria de Tecnologia Agrícola da Província de Shandong, China (Número da bolsa: SDAIT-26).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japão | RR902A | Usado para amplificação de PCR de rRNA 16S |
| Acetonitrila | Merck, Alemanha | 100030 | Solvente usado para a fase móvel do UHPLC |
| Vaporizador de anestesia | Ciências da Vida RWD | R580 | Usado para administrar anestesia isoflurano em camundongos |
| Analisador bioquímico automático | Instituto de Engenharia Biológica Jian Cheng, Nanjing, China | A110-1 & A111-1 | Mede parâmetros séricos (glicose, TC, TG, LDL-C, HDL-C, AST, ALT) e os níveis de lipídio do fígado |
| Bacillus coagulans (GIM 1.645) | Centro de Coleta de Culturas Microbianas de Guangdong, China | GIM 1.645 | Cepa componente da formulação probiótica |
| Carboximetilcelulose sódico (CMC-Na) | Sigma-Aldrich, EUA | C4888 | Usado como componente emulsionante para preparação de óleo de microalgas rico em DHA |
| Kit de ensaio de Catalase (CAT) | Nanjing Construction Ltd. | A007-1-1 | Detecta atividade da CAT (um indicador da capacidade antioxidante) no tecido hepático |
| Pacote de software DADA2 | Equipe de Desenvolvimento DADA2 | Incluído no QIIME 2 v2019.4 | Usado para redução de ruído e filtragem quimera de leituras de sequenciamento |
| Óleo de microalgas rico em DHA (derivado de Schizochytrium sp.) | - | - | Rico em ácido docosahexaenoico (DHA); administrado diariamente por Gavage aos 10 e micro; L/g como intervenção experimental |
| Animais experimentais (machos C57BL/6J camundongos) | Empresa de Tecnologia Animal do Laboratório Vital do Rio Pequim. | - | 6 semanas de vida, n = 4 por grupo; usado para estabelecer o modelo MASLD via alimentação por HFD |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich, EUA | F0507 | Aditivo de fase móvel para análise metabolômica |
| Banco de dados Greengenes | Greengenes | Versão 13_8 | Usado para atribuição taxonômica microbiana |
| Dieta Rica em Gordura (HFD) | Research Diets Inc., EUA | D12492 | Composto por 20% carboidratos, 20% proteínas e 60% gorduras (kcal); alimentado por 8 semanas para induzir MASLD |
| Espectrômetro de massa de alta resolução | Thermo Fisher Scientific, EUA | Q Exactive Orbitrap | Usado para detecção de metabólitos em modos de íons positivos e negativos |
| Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB) | Universidade de Alberta, Canadá | Lançamento de 2024 | Banco de dados público de anotação de metabólitos |
| Plataforma Illumina MiSeq | Illumina, Inc., EUA | Sistema MiSeq | Usado para o par end 2 & times; Sequenciamento a 250 pbbs |
| Isoflurano | Merck, Alemanha | PHR2874 | Usado para anestesia por inalação em camundongos |
| Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) | Laboratórios Kanehisa, Japão | Versão 2023 | Banco de dados usado para enriquecimento de vias e anotação de metabólitos |
| Lactobacillus acidophilus (KDB-03) | Academia de Ciências Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente da formulação probiótica |
| Lactobacillus casei (KDB-LC) | Academia de Ciências Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente da formulação probiótica |
| Lactobacillus plantarum (DY-1) | Academia de Ciências Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente da formulação probiótica |
| Nitrogênio líquido | Air Liquide | - | Usado para congelamento rápido e preservação de amostras fecais e hepáticas |
| Kit de ensaio de Malondialdeído (MDA) | Nanjing Construction Ltd. | A003-1 | Detecta MDA (um marcador de peroxidação lipídica/dano oxidativo) no tecido hepático |
| Software MassLynx | Waters Corporation, EUA | Versão 4.1 | Usado para metabolômica, processamento de dados brutos, extração de características e normalização |
| Metanol | Merck, Alemanha | 106035 | Solvente usado para extração de metabólitos |
| Plataforma de análise de dados do microbioma | Genescloud | V1 | Plataforma online: https://www.genescloud.cn/home; usado para análises de visualização de microbioma PCoA, NMDS, LEfSe e outras |
| Kit de DNA do Solo OMEGA | Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EUA) | (M5635-02) | Isolamento de DNA |
| OTUs referenciam sequências | Genescloud | Referenciado de McDonald et al. 2012; usado para atribuição de taxonomia de variantes de sequência de amplicons (ASVs) | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, EUA | 10010023 | Usado para ressuspensão de pellets bacterianos |
| Primer 341F/806R | Tsingke Biotechnology Co., Ltd., China | - | Usado para amplificação do rRNA 16S V3 e ndash; Região V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| Probióticos | - | - | Cepas específicas não mencionadas explicitamente; usado como intervenção comparativa (principalmente melhora a homeostase glicose) |
| Software QIIME 2 | - | 2019.4 | Usado para análise bioinformática do microbioma (processamento ASV, cálculo de diversidade alfa/beta) |
| Software R | - | 4.4.1 | Utilizado para análise de enriquecimento de metabólitos hepáticos e análise de correlação de Spearman de associações microbianas-metabólitos |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf, Alemanha | 5810R | Usado para centrifugação de amostras de soro e metabolômica |
| Coluna C18 de fase reversa | Waters Corporation, EUA | 186002350 | Utilizado para separação cromatográfica de metabólitos |
| Soro fisiológico | Shijiazhuang Nº 4 Farmacêutico | 2211112304 | Administrado diariamente por gavage ao grupo controle (em vez do tratamento com óleo de microalgas) |
| Dieta padrão de chow | Keao Xieli Feed Ltd., China | 1016706714625204224 | Composto por 70% de carboidratos, 20% de proteína, 10% de gordura (kcal); alimentado para o grupo de controle (RC) |
| Agulha de alimentação estéril | Laboratórios Instech, EUA | FTP-20-38 | Usado para administração oral de gavage |
| Kit de ensaio de superóxido dismutase (SOD) | Nanjing Construction Ltd. | A001-3 | Detecta atividade de SOD (um indicador de capacidade antioxidante) no tecido hepático |
| Pré-adolescente-80 | Sigma-Aldrich, EUA | P4780 | Usado como componente emulsionante para preparação de óleo de microalgas rico em DHA |
| Homogeneizador ultrassônico | Scientz Biotechnology, China | JY92-IIN | Usado para a sonicação do tecido hepático durante extração de metabólitos |
| Metabolômica Hepática Não Direcionada | Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | Código do Projeto: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| Misturador de vórtice | Thermo Fisher Scientific, EUA | Misturador de vórtice LP | Usado para homogeneização e emulsificação de amostras |
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