Protocolo para Diferenciar Células-Tronco Pluripotentes em Células Semelhantes a Células Germeninas Primordiais

Resumo

Uma diretriz passo a passo para gerar células primordiais semelhantes a células germinativas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de forma robusta, utilizando um método 2D baseado em monocamada com sobreposição de extrato de membrana basal.

Resumo

O uso da diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas in vitro ampliou significativamente a compreensão dos eventos de especificação de linhagem que ocorrem durante o desenvolvimento inicial in vivo, um período extremamente desafiador de investigar. Uma das primeiras linhagens embrionárias especificadas no embrião humano é a linhagem das células germinativas, marcada pela indução das células germinativas primordiais (PGCs). Os PGCs são a única população fundadora dos gametas na fase avançada da vida, e sua especificação é um passo fundamental para a fertilidade do organismo. Aqui, é descrito um protocolo robusto para gerar células semelhantes às PGC (PGCLCs) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs), começando pela avaliação inicial do estado pluripotente e das características celulares das hiPSCs para garantir uma diferenciação eficaz dos PGCLCs. Para isso, são discutidos os efeitos de diferentes densidades celulares, revestimentos de placas e hiPSCs usados para diferenciação de PGCLC. Por fim, é fornecido um fluxo de trabalho para caracterização e quantificação dos hPGCLCs, utilizando imunofluorescência e citometria de fluxo. O protocolo de diferenciação foca em condições fáceis de estabelecer e testar na maioria dos laboratórios e que podem ser ajustadas conforme necessário. Além disso, esse protocolo é rápido, permitindo determinar se os hiPSCs são adequados para diferenciação PGCLC. O protocolo visa promover consistência e compatibilidade nos resultados do hPGCLC entre diferentes linhas de hiPSC e plataformas de cultura, garantindo rendimentos robustos que apoiem caracterização confiável e otimização adicional das etapas de diferenciação a jusante rumo ao sucesso da gametogênese in vitro em humanos.

Introdução

O desenvolvimento da linhagem germinativa humana é um processo altamente coordenado que inicia cedo no desenvolvimento embrionário e começa com a especificação das células germinativas primordiais (PGCs), a população que, em última análise, dá origem a ovocitos e^{espermatozoides 1}. In vivo, a especificação de PGC ocorre logo após a implantação ^2,3 em resposta a sinais indutivos de células^{vizinhas 4,5}. O desenvolvimento dos PGCs tem sido amplamente investigado em roedores, especialmente por meio de estudos genéticos que demonstraram o envolvimento de vias de sinalização, como BMP, WNT e^TGFβ 6,7,8,9. Após a especificação, os PGCs passam por reprogramação epigenética, caracterizada por desmetilação do DNA em todo o genoma e remodelação da cromatina, para posteriormente estabelecer a identidade germinativa (específica por sexo⁾ 10,11,12,13,14.

Em mamíferos, a especificação do PGC é impulsionada por intercomunicação coordenada entre vias de sinalização, e alguns aspectos são conservados evolutivamente em humanos, primatas não humanos, porcos e camundongos, incluindo o envolvimento de fatores de pluripotência como POU5F1 e NANOG ^{9,15,16,17,18}. Apesar das características compartilhadas, diferenças específicas de espécie nos mecanismos de diferenciação PGC e nas redes reguladoras genéticas limitam a tradução direta de modelos animais para^humanos 9,19,20,21.

Para entender gametogênese em humanos, estudos usando material humano são necessários, mas continuam desafiadores devido ao acesso limitado a embriões humanos precoces. Avanços contínuos nos protocolos que permitem a diferenciação in vitro de células semelhantes a células germinativas primordiais humanas (hPGCLCs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas, como as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), reduziram a dependência do tecido gonadal humano ao mesmo tempo em que possibilitaram o aumento de escala e estudos^{genéticos 18,22}. A maioria das estratégias estabelecidas para diferenciação de hPGCLC baseia-se em agregados tridimensionais (3D) ou corpos^{embrionários 18}. Usando essas plataformas, múltiplos estudos mostraram que as hPGCLCs recapitulam características-chave epigenéticas dos primeiros PGCs humanos, incluindo programas transcricionais^{germinais 23,24} e reprogramação de metilação do DNA em todo o^{genoma 25}. Juntas, essas plataformas in vitro avançaram substancialmente o conhecimento da biologia PGC humana, incluindo compromisso de linhagem e reajuste epigenético. No entanto, protocolos de diferenciação de hPGCLC baseados em agregação continuam desafiadores, pois são demorados, e o rendimento total dos hPGCLCs para caracterização epigenética robusta, ensaios adicionais de diferenciação ou uso em aplicações experimentais de alto rendimento permanece baixo.

Recentemente, um método 2D baseado em monocamadas e sem alimentadores, usando extrato de membrana basal diluído (BMEx) em combinação com baixos níveis de BMP4 para diferenciar hiPSCs em hPGCLCs, mostrou-se relativamente fácil de escalar em placas de cultura de tecidos e alcançou altas eficiências (~55%) em uma janela de diferenciação curta (5 dias⁾²⁶. Comparado a outros sistemas 2D que exigiam uma etapa intermediária de priming de Activin A antes da indução e usavam concentrações mais altas de BMP4 (40–50 ng/mL)^27,28, essa abordagem BMEx não exigia uma etapa de pré-indução e usava níveis mais baixos de BMP4 (10 ng/mL), mantendo eficiência comparável e melhora escalabilidade.

Aqui, é fornecido um guia detalhado passo a passo do protocolo 2D de diferenciação BMEx do hPGCLC, começando com a avaliação inicial da manutenção do hiPSC, incluindo pluripotência e características celulares, seguida pelo teste dos efeitos de diferentes revestimentos de placas de hiPSC e densidades celulares na diferenciação do hPGCLC. Além disso, a caracterização a jusante por citometria de fluxo e imunofluorescência é descrita. Pontos críticos de manuseio e orientações para resolução de problemas para reduzir desvios laboratoriais são fornecidos, permitindo que pesquisadores reproduzam consistentemente a diferenciação de hPGCLC neste formato 2D.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes e regulamentos do Centro Médico da Universidade de Leiden (LUMC), do Biobanco e Biomateriais da LUMC (TCBio) e do Centro LUMC HiPSC de Leiden (sob BB24.037). Todos os materiais e linhas de controle macho (XY) hiPSC (M54 e M199) usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Todos os procedimentos de cultura de tecidos foram realizados em uma sala dedicada dedicada à Biossegurança de Nível 2, equipada com uma incubadora normoxica umidificada (37 °C, 5% CO₂), uma centrífuga de bancada multiuso (rotor de balde oscilante) e um gabinete de biossegurança Classe II com estereoscópio.

ATENÇÃO: Nem todas as linhas hiPSC podem se diferenciar em hPGCLCs ^26,29. No entanto, se outros hiPSCs foram usados para diferenciação de PGCLCs e PGCLCs foram observados, o método descrito aqui (Figura 1A) permitirá ampliar a produção de hPGCLC.

1. Revestir placas de cultura de tecidos para cultura de hiPSC

Este protocolo descreve o revestimento das placas de cultura de tecidos com BMEx diluído e vitronectina.

1. Revestimento de extrato de membrana basal (BMEx)
   1. Descongelar uma alíquota de BMEx no gelo. Pode ser Geltrex, Cultrex ou Matrigel.
   2. Dilua a alíquota do extrato de membrana basal em DMEM/F12 frio até uma concentração final de 1% (v/v) e resuspenda suavemente.
   3. Recubra o número desejado de poços de uma placa de 6 poços com 1 mL do BMEx diluído por poço.
   4. Incube a placa revestida por pelo menos 30 minutos a 37 °C.
      NOTA: Placas revestidas podem ser armazenadas entre 2 e 8 °C por até 1 semana. Ao usar placas revestidas armazenadas a 2–8 °C, incube a placa por pelo menos 10 minutos a 37 °C antes de usar novamente.
2. Revestimento de vitronectina
   1. Descongele uma alíquota de vitronectina em temperatura ambiente (RT) por 10–15 minutos.
   2. Dilua a vitronectina até uma concentração final de 5 μg/mL em DPBS sem cálcio e magnésio (DPBS -/-) e resuspenda suavemente.
   3. Revestir o número desejado de poços de uma placa de 6 poços com 1 mL de vitronectina diluída por poço.
   4. Incube a placa revestida de 6 poços por 1 hora na RT.

2. Passagem para manutenção de hiPSCs

1. Prepare-se meio de cultura: meio de cultura celular sem soro mTeSR Plus suplementado com solução de prevenção de contaminação por micoplasma (MycoZap (1:1000)).
2. Aspire o meio de cultivo das células que estão prontas para serem levadas.
3. Adicione 0,5 mL de agente humano de seleção e passagem de PSC (ReLeSR) a cada poço e aspire isso em até 1 minuto. Certifique-se de que uma camada muito fina fique sobre as células.
4. Incube as células por 6 minutos a 37 °C.
5. Bata algumas vezes nas laterais da placa de 6 poços.
6. Desprenda cuidadosamente as células com meio de cultura de 1 mL, pipeteando para cima e para baixo com uma pipeta p1000, e certifique-se de verificar regularmente o tamanho dos fragmentos da colônia para manter seu tamanho entre 50 e 200 μm.
7. Pegue as placas pré-revestidas de 6 poços e remova a solução de revestimento (Passo 1).
8. Adicione 2 mL de meio de cultura em cada poço.
9. Transfira o meio de cultivo contendo os fragmentos da colônia dos hiPSCs destacados para o novo poço na proporção desejada.
   NOTA: A proporção ideal para dividir fragmentos de colônias de hiPSC é de 1:6-1:50, permitindo a passagem a cada 4–7 dias.
10. Coloque a placa de cultura celular com os fragmentos da colônia de hiPSCs passageiros em uma incubadora normóxica umidificada (37 °C, 5% CO₂).
11. Renove o meio de cultivo dia sim, dia não, com meio de cultivo de 2 mL até que os hiPSCs estejam prontos para serem aprovados novamente.
    NOTA: Adicione 4 mL de meio de cultura em vez de 2 mL em cada poço de 6 poços para evitar a necessidade de renovar durante o fim de semana.
    ATENÇÃO: Não faça hiPSCs quando a confluência for muito baixa e descarte a cultura quando a confluência for alta demais para manter uma cultura hiPSC saudável e evitar diferenciação espontânea.

3. diferenciação hPGCLC

1. Preparação antes da diferenciação do hPGCLC (Dia 0).
   1. Atualize o meio de cultura dos hiPSCs 1 hora antes de iniciar a diferenciação dos hPGCLC.
   2. Prepare a solução de revestimento: solução de BMEx 1% diluída v/v em DMEM/F12 frio.
   3. Recubra o número desejado de poços de uma placa de 12 poços com uma solução de revestimento de 0,5 mL.
   4. Incube a placa revestida por pelo menos 30 minutos a 37 °C antes de iniciar a diferenciação.
   5. Prepare o meio de placagem: solução BMEx 2% (v/v) em meio de cultivo frio e complemente com um meio de recuperação pós-descongelação (RevitaCell) (1:100).
      ATENÇÃO: Mantenha o meio de blindagem sobre gelo durante a preparação e o revestimento dos hiPSCs.
2. HiPSCs placando para diferenciação de hPGCLC (Dia 0).
   1. Remova o meio de cultura do poço 6 que contém os hiPSCs para usar na diferenciação de hPGCLC. Comece com hiPSCs de alta qualidade em confluência de 50–80%, sem sinais de diferenciação espontânea.
   2. Adicione 1 mL de solução de tripsina (Triple) por poço.
   3. Incube os hiPSCs por 5 minutos a 37 °C.
   4. Faça uma suspensão de célula única resuspendendo cuidadosamente as colônias dos hiPSCs 2–3 vezes com uma pipeta p1000.
   5. Verifique sob um microscópio invertido se uma suspensão de célula única foi obtida. Se não, ressuspenda as colônias do hiPSC mais 1 a 2 vezes com uma pipeta p1000.
   6. Transfira a suspensão da célula hiPSC para um tubo de 15 mL.
   7. Adicione 4 mL de DMEM-F12 medium ao tubo de 15 mL.
   8. Centrifuge a suspensão da célula hiPSC a 200 x g por 5 minutos.
   9. Aspire o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente as células de hiPSC em meio de placagem de 0,5–1,0 mL.
   10. Conte o número de hiPSCs usando um contador celular ou hemocitômetro e calcule o número de hiPSCs necessários por poço para a diferenciação do hPGCLC.
       NOTA: Como ponto de partida, pode-se usar uma densidade de chapa de 40–80K células/^cm2 . No entanto, para cada linhagem celular e em cada número de passagem, recomenda-se a otimização da densidade do revestimento para alcançar o rendimento ideal. Aqui, os hiPSCs foram placados com uma densidade de chalocagem de 10K a 100K células/^cm2.
   11. Resuspenda cuidadosamente o número necessário de hiPSCs no volume apropriado de meio de revestimento (1 mL por poço de uma placa de 12 poços) e garanta que uma suspensão homogênea de células seja obtida usando uma pipeta p1000.
   12. Pegue a placa revestida de 12 poços da incubadora e remova a solução de revestimento.
   13. Adicione 1 mL da suspensão da célula a cada poço de uma placa de 12 poços.
   14. Agite cuidadosamente a placa para garantir que as células estejam distribuídas uniformemente no poço.
   15. Coloque a placa de 12 poços em uma incubadora normoxica umidificada (37 °C, 5% CO₂) por 16–24 horas.
3. Diferenciação hPGCLC (Dia 1–2)
   1. Prepare o meio basal RB27: RPMI160 avançado com B-27 (1:100), 1X substituto de aminoácido (Glutamax), 1X aminoácidos não essenciais MEM e solução de prevenção de contaminação por micoplasma (1:1000).
   2. Prepare meio de diferenciação: solução 2% (v/v) de BMEx em meio basal frio RB27 e adicione BMP4 a uma concentração final de 10 ng/mL. O extrato da membrana basal é necessário para induzir a lumenogênese e acionar a especificação PGCLC in vivo.
      ATENÇÃO: Mantenha o meio de diferenciação no gelo ou a 4 °C. Os meios de diferenciação podem ser preparados para os Dias 1 e 2 do protocolo de diferenciação.
   3. No dia 1 (dentro de 16–24 horas após a colocação dos hiPSCs), retire a placa da incubadora e retire o meio de revestimento.
   4. Lave os poços adicionando 0,5 mL de meio basal RB27 por poço.
   5. Aspire o meio basal RB27 e adicione 1 mL de meio de diferenciação por poço.
   6. Coloque a placa com as células de volta na incubadora normóxica umidificada (37 °C, 5% CO₂).
   7. No segundo dia da diferenciação, refresque as células com 1 mL de meio de diferenciação por poço.
4. Diferenciação hPGCLC (Dia 3–5)
   1. Preparar meio de comutação: meio basal RB27 suplementado com BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) e EGF (50 ng/mL). O meio switch reflete a mudança in vivo da especificação hPGC para sobrevivência e proliferação. O BMEx é omitido porque a lumenogênese não é mais necessária.
   2. No dia 3 e no dia 4, atualize cada poço com um meio de switch de 1 mL.
   3. No quinto dia de diferenciação, as hPGCLCs podem ser caracterizadas usando imunofluorescência ou citometria de fluxo.

4. Caracterização de hPGCLCs por imunofluorescência e citometria de fluxo

1. Caracterização por imunofluorescência.
   1. Prepare solução de permeabilização: 0,3% Triton X-100 diluído em PBS.
   2. Preparar solução de lavagem: 0,05% Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Prepare solução bloqueante: albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBST.
   4. Remova o meio de troca dos poços usados para diferenciação de hPGCLC.
   5. Lave as células com 1 mL por poço de DPBS (-/-).
   6. Fixe as células com 1 mL por poço 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS por 15 minutos em RT.
   7. Lave as células 3 vezes por 5 minutos com PBS, usando 1 mL por poço.
      NOTA: Neste ponto, as placas podem ser armazenadas a 4 °C antes de iniciar a imunofluorescência.
   8. Permeabilize as células com solução de permeabilização por 15 minutos em RT, usando 1 mL por poço.
   9. Lave as células 3 vezes por 5 minutos com solução de lavagem, usando 1 mL por poço.
   10. Bloqueie células com solução bloqueante por 1 hora em RT, usando 1 mL por poço.
   11. Prepare a solução primária de anticorpos: dilua os anticorpos primários de interesse na solução bloqueadora.
       NOTA: Aqui, foram usadas as seguintes duas combinações de anticorpos para marcadores PGC: anti-SOX17 de cabra e anti-TFAP2C de coelho, e anti-SOX17 de cabra e anti-POU5F1 de camundongo (Tabela de Materiais).
   12. Remova a solução bloqueante, adicione 0,4 mL de solução primária de anticorpos por poço e incube durante a noite a 4 °C.
       NOTA: É importante incluir controles negativos para avaliar a ligação inespecífica de anticorpos. Para isso, mantenha-se um bem durante a noite em solução bloqueante, omitindo os anticorpos primários, mas depois tinga bem com a solução secundária de anticorpos.
   13. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos e lave as células 3 vezes por 5 minutos com PBST.
   14. Prepare solução secundária de anticorpos: dilua os anticorpos secundários de interesse (Tabela de Materiais) e DAPI (1:500) em solução bloqueante.
       NOTA: A solução secundária de anticorpos é sensível à luz e deve ser mantida no escuro.
   15. Remova PBST e adicione 0,4 mL de solução secundária de anticorpos por poço por 1 hora em RT no escuro.
   16. Lave as células 3 vezes por 5 minutos com PBS, usando 1 mL por poço.
   17. Faça imagens das células (lente objetiva 20x).
       NOTA: Imagens de imunofluorescência foram obtidas usando um objetivo 20x no microscópio Airysscan, enquanto imagens em campo claro foram capturadas usando um objetivo 4x e um objetivo 10x no microscópio EVOS.
2. Caracterização por citometria de fluxo
   1. Prepare o buffer FACS: 0,5% BSA no DPBS (-/-)
   2. Remova o meio de troca dos poços com os hPGCLCs.
   3. Lave as células com 1 mL de DPBS (-/-).
   4. Adicione 0,5 mL de Accutase pré-aquecida por poço e incube por 15 minutos a 37 °C. Para dissociação, a Accutase é preferida à solução de tripsina porque os hPGCLCs são altamente sensíveis à dissociação.
   5. Faça uma suspensão de célula única resuspendendo cuidadosamente as células 2–3 vezes com um p1000.
   6. Verifique sob um microscópio invertido se uma suspensão de célula única foi obtida. Se não, ressuspenda as células mais 1 a 2 vezes com uma pipeta p1000.
   7. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de 40 μm para um tubo de 15 mL.
   8. Lave o filtro de 40 μm com um buffer FACS de 5 mL.
   9. Centrifuge a suspensão da célula a 300 x g por 5 minutos.
   10. Remova o sobrenadante.
   11. Resuspenda o pellet celular em um buffer FACS de 0,3 mL em um tubo de 1,5 mL.
       NOTA: É opcional contar células usando um contador celular ou um hemocitômetro. Se as células forem contadas, espere cerca de 1 milhão de células por poço de uma placa de 12 poços.
   12. Prepare amostras de controle adequadas para citometria de fluxo (controles não colorados e de coloração única). Para isso, transfira 15–30 μL da suspensão da célula para tubos de 1,5 mL e encha até 100 μL com o buffer FACS.
       NOTA: Para este estudo, foram preparadas 3 colorações únicas: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) e 7AAD (1:200). As soluções que contêm os anticorpos conjugados e o 7AAD são sensíveis à luz e devem ser mantidas no escuro.
   13. Adicione os anticorpos conjugados de interesse diretamente à suspensão celular para alcançar uma diluição adequada. Aqui, os seguintes anticorpos conjugados para marcadores PGC foram usados juntos: EPCAM-PEcy7 (1:200) e ITGA6-BV421 (1:200) (Tabela de Materiais).
   14. Incube as células com os anticorpos conjugados por 30 minutos no gelo no escuro.
   15. Adicione 1 mL de tampão FACS às amostras, controle não corado, controle de anticorpo único e centrifuge a 300 x g por 5 minutos.
   16. Remova o sobrenadante.
   17. Resuspenda as amostras em 0,5 mL e as amostras controle em 0,2 mL, do buffer FACS contendo 1 mM de EDTA. Isso impede que as células se aglomerem.
   18. Adicione as amostras e controles a um tubo FACS de 5 mL com uma tampa de filtro de células, depois passe pelo filtro de células.
   19. Adicione 7AAD diretamente a cada amostra vários minutos antes de medir no citometro de fluxo.
   20. Meça amostras usando um Citômetro de Fluxo. Aqui, o analisador celular baseado em fluorescência foi usado para medir as amostras, os dados foram coletados usando o software FACSDiva (v9.0) e o software FlowJo (v10.10.0) foi usado para analisar os dados.
   21. Use as amostras controle (não coradas e controles de anticorpo único) para configurar a estratégia de controle e realizar compensação se necessário.
   22. Faça vórtice nas amostras antes de colocá-las na máquina.
   23. Extraia a população celular de todos os eventos primeiro estabelecendo uma porta baseada na área [área de dispersão dianteira (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A)].
   24. Dessa população celular, extrai-se células únicas com base no tamanho [largura de FSC (FSC-W) e altura de FSC (FSC-H)] e granularidade [SSC-W e SSC-H].
   25. Exclua células mortas de análises adicionais estabelecendo uma porta para células 7AAD-negativas.
   26. Use a amostra para verificar se os portões estão corretamente ajustados e ajuste-os se necessário.
   27. Analise os marcadores de interesse dessa população de células vivas. Aqui, as células portadas positivas tanto para EPCAM quanto para ITGA6 correspondiam aos hPGCLCs.

Resultados

A qualidade e o estado estável dos hiPSCs são importantes para uma diferenciação adicional
os hiPSCs foram mantidos em placas de 6 poços por pelo menos 3 passagens (nos diferentes revestimentos) antes dos experimentos e análises de diferenciação. As hiPSCs foram transmitidas quando as colônias celulares atingiram uma confluência de 70–80% (Figura 1B), que também é a confluência ideal para iniciar a diferenciação de hPGCLC. Culturas saudáveis de hiPSC apresentaram morfologia uniforme da colônia, sem áreas escuras ou diferenciadas, visíveis em imagens de campo claro (Figura 1B). No entanto, a qualidade das hiPSCs foi afetada quando as colônias celulares não foram mantidas em sua confluência ideal ou apresentaram sinais de diferenciação (Figura 1B). Em baixa confluência, a hiPSC continuou a proliferar, e mais tempo foi necessário para a formação da colônia até que a confluência fosse adequada para experimentos de passagem ou diferenciação. Em alta confluência, hiPSCs cresceram uns sobre os outros, enquanto regiões diferenciadas surgiram. O estado de pluripotência dos hiPSCs foi confirmado pela expressão de SOX2 ou POU5F1, ambos fatores de transcrição essenciais para manter a pluripotência e autorrenovação nos^{hiPSCs 30}, e, mais importante, o SOX2 não é expresso pelos hPGCLCs³¹. A coloração com faloidina foi usada para avaliar a organização do citoesqueleto e a morfologia das colônias, indicativa da qualidade dos hiPSCs. Note que diferenças na morfologia celular estão associadas à redução de SOX2 ou POU5F1 (Figura 1B).

Efeito do substrato de manutenção do hiPSC na diferenciação do hPGCLC
Para avaliar se a manutenção de hiPSCs em diferentes substratos de revestimento afetava a diferenciação para hPGCLCs, os hiPSCs foram cultivados em diferentes substratos (Geltrex, Matrigel, Cultrex e vitronectina) (Figura 2). Em todos os substratos, os hiPSCs apresentaram níveis robustos e uniformes de SOX2 nuclear ou POU5F1, indicativos de seu estado pluripotente. Colônias de hiPSC mantidas em Geltrex, Matrigel e Cultrex apresentaram morfologia comparável, incluindo bordas bem definidas e formas gerais irregulares das colônias, em comparação com as colônias arredondadas com vitronectina (Figura 2). HiPSCs que atingiram confluência de 70–80% foram placados com uma densidade de 40K células/^cm2 e diferenciados em hPGCLCs no Geltrex²⁶. No 5º dia, imagens de campo claro mostraram colônias características de hPGCLC em todas as condições (Figura 3). Além disso, HCCLCs SOX17/TFAP2C/PDPN triplo positivos ou dupplamente positivos SOX17/POUF51 hPGCLCs foram identificados em todas as condições (Figura 3). Isso sugeriu que o protocolo de diferenciação poderia ser usado com hiPSCs cultivados sob diferentes condições.

Efeito da densidade inicial de células hiPSC na diferenciação de hPGCLC
É importante verificar a densidade ótima de semeadura para diferenciação ótima de hPGCLC (no Geltrex), pois diferentes hiPSCs têm taxas de proliferação diferentes. Além disso, caso a eficiência na diferenciação de hPGCLC caia à medida que os hiPSCs são continuamente travessados, recomenda-se ajustar a densidade da célula de semeamento de hiPSC. Para avaliar o impacto da densidade das células de semeamento na eficiência da diferenciação de hPGCLC, hiPSCs foram semeados em diferentes densidades, de 10K a 100K células/^{cm 2} (Figura 4A). No quinto dia, a porcentagem de hPGCLCs foi avaliada por citometria de fluxo usando dois anticorpos conjugados diferentes para marcadores PGC humanos, EPCAM e integrina α6 (ITGA6)³². A análise de citometria de fluxo seguiu uma estratégia padrão de gate sequencial, mostrada para HiPSCs M199 semeados em 40K células/^cm2 (Figura 4B). Resumidamente, a população celular total (todos os eventos) foi controlada para excluir detritos (área das partículas), depois células individuais foram selecionadas com base no tamanho (FSC) e granularidade (SSC), e finalmente, células mortas foram excluídas com base na coloração com 7AAD. Posteriormente, a porta para quantificar células que expressam EPCAM-cy7 e ITGA6-BV421 foi estabelecida usando amostras coradas e não coradas (Figura 4B).

Comparando a eficiência de diferenciação de hPGCLC usando diferentes densidades de células de semeadura e usando hiPSC cultivados em diferentes substratos revelou uma tendência dependente da densidade (Figura 4C). Na densidade de semeadura de 20–40K células/^cm2, os hiPSCs M54 e M199 apresentaram a maior proporção de hPGCLCs duplamente positivos em EPCAM+/ITGA6+, obtidos a partir de hiPSCs mantidos em Geltrex e Cultrex. Curiosamente, densidades mais altas resultaram em menor eficiência de diferenciação. Os resultados de imunofluorescência usando marcadores PGC SOX17/TFAP2C/PDPN ou SOX17/POUF51 nos hPGCLCs validaram os resultados da citometria de fluxo (Figura 4D). Esses resultados sugeriram que ajustar a densidade de semeadura aos hiPSCs específicos é importante para obter a eficiência ótima de diferenciação. A combinação de imunofluorescência e citometria de fluxo aumenta a robustez do ensaio de diferenciação hPGCLC.

Figura 1: fluxo de trabalho de diferenciação do hPGCLC e qualidade dos hiPSCs. (A) Esquema do fluxo de trabalho utilizado neste estudo. Os hiPSCs foram mantidos (em meio de cultura) e atingiram confluência de 60–80% no dia da diferenciação (Dia 0, D0). Em D0, os hiPSCs foram dissociados em células individuais e placados na densidade de semeadura desejada (no meio de placagem). No dia seguinte, as células foram tratadas com meio de diferenciação (D1–D3), seguido por meio de troca (D3–D5). No D5, hPGCLCs foram usados para imunofluorescência ou citometria de fluxo. (B) Imagens de campo claro (fileira superior - ampliação 4x); imunofluorescência para SOX2, coloração com FALOIDINA e coloração DAPI (fileira do meio); e para POU5F1, coloração com FALOIDINA e coloração DAPI (fileira inferior) mostrando hiPSCs com diferentes confluências. Barras de escala = 50 μm. Os desenhos da Figura 1A foram criados pelos autores usando ferramentas básicas de desenho no Adobe Illustrator; nenhum software ou ferramenta paga foi utilizado. Portanto, não era necessário nenhum tipo de licença de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Efeito de vários substratos de revestimento durante a cultura de hiPSC. Imagens de campo claro (fileira superior); imunofluorescência para SOX2, coloração com FALOIDINA e coloração DAPI (fileira do meio); e para POU5F1, coragem com PHALOIDINA e DAPI (fileira inferior) mostrando hiPSCs cultivados em diferentes substratos de revestimento. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito de vários substratos de revestimento durante a cultura de hiPSC na diferenciação de hPGCLCs. Imagens de campo claro (fileira superior - ampliação 10x); imunofluorescência para SOX17, TFAP2C, PDPN e coloração DAPI (linha do meio); e para a diferenciação de POU5F1, SOX17 e DAPI (fileira inferior) dos hPGCLCs (usando Geltrex) no Dia 5, começando a partir de hiPSCs cultivados em diferentes substratos de revestimento. A linha amarela tracejada destaca regiões com hPGCLCs. Barras de escala = 25μm (fileira superior) e 50 μm (fileiras do meio e inferior). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Efeito da densidade de semeadura hiPSC na diferenciação dos hPGCLCs. (A) Imagens de campo claro no Dia 1 (D1) e D3 da diferenciação de hPGCLCs usando diferentes densidades de semeadura de hiPSC (40K células/^{cm 2}, 60K células/cm2, 80K células/^{cm 2}). Barras de escala = 250 μm. Ampliação 4x. (B) Gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando a estratégia de gate para quantificar a porcentagem de HPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs. Para isso, foram usados hiPSCs M199 (em Geltrex) com uma densidade de semeadura de 40K células/^cm2. (C) Gráfico de barras que representa as porcentagens de hiPGCLCs EPCAM+/ITGA6+ em D5 ao usar hiPSCs (M199 e M54) cultivados em diferentes revestimentos e semeados em densidades diferentes. (D) Imunofluorescência para SOX17, TFAP2C, PDPN e coloração DAPI (painéis esquerdos); e o SOX17, POU5F1 e coragem DAPI (painéis direitos) em D5 da diferenciação de hPGCLCs usando hiPSCs (M199 e M54, em Geltrex) semeados em células 40K e 80K/cm2. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A gametogênese in vitro constitui uma poderosa plataforma experimental para investigar o desenvolvimento da linhagem germinativa humana, toxicidade reprodutiva e infertilidade sob condições controladas de cultura e em base específica para cada paciente. Embora múltiplos protocolos para diferenciar hPGCLCs de hiPSCs tenham sido^{relatados 18}, o progresso na área foi dificultado pela disponibilidade limitada de abordagens padronizadas, escaláveis e reprodutíveis em laboratórios. Estudos recentes descreveram abordagens simplificadas e eficientes para indução de hPGCLC, incluindo diferenciação^{micropadronizada baseada em BMP4 27}, uma plataforma monocamada 2D rápida que permite a geração de hPGCLC em 3,5^{dias e 28}, e um sistema de cultura 3D que modela o desenvolvimento peri-implantacional e a sinalização paracrina de nicho³³. Embora esses protocolos suportassem eficientemente a diferenciação do hPGCLC, ainda não têm a capacidade de servir como plataformas de alta produtividade. Para que estudos baseados em hPGCLC sejam amplamente aplicáveis, especialmente para triagens toxicológicas reprodutivas, os protocolos devem ser robustos, tecnicamente acessíveis e compatíveis com ensaios quantitativos posteriores. Aqui, é apresentada uma análise passo a passo do protocolo de diferenciação BMEx do hPGCLC, enfatizando parâmetros técnicos críticos que determinam a reprodutibilidade e o desempenho.

Um dos principais determinantes para a diferenciação bem-sucedida é o estado inicial de pluripotência dos hiPSCs. Número de passagem, saúde celular, características específicas de linhas e condições pré-diferenciação da cultura podem influenciar os resultados da diferenciação do hPGCLC. Inicialmente, durante a manutenção do hiPSC, a atenção pode ser voltada para o substrato do revestimento, densidade da célula de semeadura e formato da placa de cultura, que juntos definem a arquitetura da colônia e os ambientes de sinalização no início da diferenciação do hPGCLC. O presente estudo demonstra o efeito do uso de hiPSCs cultivados em diferentes revestimentos e diferentes densidades de semeadura na diferenciação de hPGCLCs (em Geltrex). Ambas as linhas de hiPSC testadas aqui mostraram máxima eficiência de diferenciação com densidade de semeadura de 20.000–40.000 células/^cm. Isso ressalta a necessidade de determinar densidades ideais de semeadura ao introduzir novas linhas celulares, após passagens estendidas ou alterar layouts experimentais ou formatos de placas de cultura. Mesmo mudanças aparentemente menores nas razões área-volume ou na cinética de crescimento podem precisar de otimização para preservar alta eficiência de diferenciação. Assim, recomenda-se que os usuários realizem experimentos-piloto em pequena escala para primeiro determinar as condições ótimas para a diferenciação do hPGCLC.

Apesar de sua robustez, o método apresenta limitações que devem ser reconhecidas. Embora compatível com múltiplos revestimentos e densidades, a eficiência de diferenciação permanece sensível às propriedades intrínsecas do hiPSC, incluindo o estado epigenético e a história de passagem, que não são totalmente controláveis. Vários hiPSCs testados pareciam incapazes de se diferenciar em hPGCLCs²⁶. Mais importante ainda, ao contrário da vitronectina, que é um produto totalmente definido, o BMEx é um produto de origem animal sujeito a variações de lote para lote, o que pode afetar a reprodutibilidade. Embora diferentes lotes de Matrigel, Cultrex e Geltrex tenham sido previamente testados e tenham apresentado resultados^{consistentes 26}, isso continua sendo uma preocupação, e alternativas totalmente definidas ao BMEx devem ser consideradas para garantir reprodutibilidade e transferibilidade futuras. Aqui, duas linhas hiPSC macho (XY) foram usadas, mas esse protocolo foi testado tanto com linhas femininas (XX) quanto macho (XY)²⁶. Por fim, embora o protocolo tenha resultado em hPGCLCs, que demonstraram ser transcricionalmente semelhantes às hPGCs e terem competência para desenvolvimento^{futuro 26,34}, a maturação posterior para estágios posteriores de células germinativas não foi abordada aqui. Embora a escalabilidade tenha sido demonstrada para aplicações no estilo triagem, a adaptação baseada em automação e a validação entre laboratórios em um painel mais amplo de linhas hiPSC fortalecerão ainda mais a utilidade translacional.

Em relação às estratégias de diferenciação hPGCLC existentes, esse protocolo oferece várias vantagens. Em contraste com abordagens altamente especializadas ou restritas a matrizes, ele acomoda substratos de manutenção de hiPSC comumente usados e formatos de placas de cultura, reduzindo assim barreiras técnicas. A ênfase na otimização de densidade e no controle de qualidade em estágio inicial melhora ainda mais a reprodutibilidade, um desafio persistente no campo da gametogênese in vitro .

O arcabouço metodológico descrito aqui é particularmente relevante para toxicologia reprodutiva, modelagem de infertilidade e biologia do desenvolvimento. Sua compatibilidade com formatos escaláveis permite triagem composta de médio a alto rendimento, enquanto sua reprodutibilidade apoia comparações de estudos cruzados e esforços colaborativos de consórcios. De forma mais ampla, a padronização sistemática dos protocolos de indução de hPGCLC em laboratórios, comparando caracterização e endpoints^{funcionais 18,35}, será essencial para avançar a gametogênese in vitro rumo a plataformas preditivas relevantes para humanos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01