Exames knockout baseados em CRISPR-Cas9 em todo o epigenoma em células quimioresistentes

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar células quimioresistentes usando uma abordagem de escalonamento de dose, seguido por uma triagem baseada em CRISPR/Cas9 usando uma biblioteca focada de sgRNA direcionada a modificadores epigenéticos para identificar reguladores da quimiorresistência adquirida. O protocolo também oferece múltiplos pontos de otimização adaptados a modelos celulares quimioresistentes, oferecendo uma estrutura robusta para pesquisadores que investigam mecanismos de resistência.

Resumo

A resistência à quimioterapia continua sendo um grande desafio no tratamento do câncer, impulsionada pela capacidade das células cancerígenas de adquirir propriedades adaptativas, reconfigurar vias de sinalização e alterar a estrutura da cromatina para evitar a citotoxicidade induzida por medicamentos. Como esses processos dependem fortemente de mecanismos epigenéticos que regulam a organização da cromatina e a plasticidade transcricional, reguladores epigenéticos surgiram como contribuidores chave para a resistência à quimioterapia. Para investigar a resistência ao paclitaxel, um dos agentes quimioterapêuticos mais amplamente utilizados no câncer de mama triplo negativo (TNBC), utilizamos uma biblioteca knockout focada em epigenoma (EPIKOL), uma biblioteca baseada em CRISPR-Cas9, projetada para interferir sistematicamente com genes envolvidos na regulação da cromatina. Linhagens celulares quimio-resistentes foram geradas por meio de um protocolo de escalonamento de dose que recapitula adaptações medicamentosas clinicamente relevantes. No entanto, essas células resistentes exibem um fenótipo multirresistente a medicamentos (MDR), apresentando desafios significativos para a transdução viral eficiente e a seleção de populações celulares estáveis. Neste estudo, descrevemos etapas metodológicas chave para alcançar transdução e seleção lentiviral de alta eficiência, possibilitando a aplicação bem-sucedida de triagens EPIKOL CRISPR em modelos TNBC quimioresistentes. Seguindo o protocolo descrito, foi realizada uma triagem CRISPR em todo o epigenoma em células TNBC quimioresistentes, e novos reguladores epigenéticos da quimiorresistência foram identificados. Esse protocolo fornece uma estrutura robusta para identificar reguladores epigenéticos que contribuem para a resistência adquirida do paclitaxel, utilizando uma abordagem de perda de função baseada em CRISPR.

Introdução

O câncer de mama triplo negativo (TNBC) é um subtipo de câncer de mama que representa de 12 a 17% de todos os cânceres^{de mama 1}. É caracterizado pela expressão comprometida do receptor de estrogênio (RE), receptor de progesterona (PR) e receptor-2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), o que limita severamente a disponibilidade de opções de terapia direcionada e deixa a quimioterapia convencional como principal modalidade^{de tratamento 2}. Taxanos e antracilinas são comumente usados no tratamento com TNBC; no entanto, os pacientes geralmente desenvolvem resistência ^2,3. A aquisição da quimiorresistência é um processo complexo e multidimensional que inclui adaptações genéticas, metabólicas, transcricionais e^{epigenéticas 2,4}. Alterações epigenéticas surgiram como reguladores centrais da plasticidade celular, facilitando a reprogramação transcricional dinâmica que permite às células cancerígenas tolerar a toxicidade induzida pela^{quimioterapia 5}.

O taxol (paclitaxel) é um membro da classe dos taxanos, que causa morte celular ao prejudicar a dinâmica dos microtúbulos e funciona como um agente^{antimitótico 6}. Embora os pacientes com TNBC respondam inicialmente aos regimes quimioteráputicos, incluindo Taxol, a resistência geralmente se desenvolve ao longo do^{tempo 2}. A resistência adquirida ao Taxol está comumente associada à superexpressão de transportadores de cassete que se ligam ao ATP (ABC), especificamente ABCB1 (MDR1, P-glicoproteína), que mediam o efluxo de Taxol do medicamento, resultando em diminuição da toxicidade intracelular^{de medicamentos 7}. Como uma ampla gama de agentes quimioterapêuticos é substrato desses transportadores do ABC, sua regulação para cima limita o uso de outros medicamentos quimioterapêuticos, causando um fenótipo de resistência multirrápida (MDR⁾⁸. A inibição dos transportadores ABC tem se mostrado amplamente ineficaz como estratégia para superar a resistência a múltiplos medicamentos em ambientes clínicos, principalmente devido à sua expressão onipresente e papéis essenciais no transporte de uma ampla variedade de substratos endógenos^{e exógenos 9}. Embora o verapamil, um inibidor ABCB1 de primeira geração, tenha demonstrado benefício clínico limitado ou nenhum e tenha sido associado a toxicidade significativa em ensaios^{clínicos 10}, ele continua sendo uma ferramenta experimental valiosa para aumentar a eficiência da seleção em modelos in vitro de MDR.

O fenótipo MDR é um processo dinâmico e adaptativo que surge principalmente durante condições de^{estresse 2}. A expressão do transportador ABC é predominantemente controlada por mecanismos regulatórios transcricionais e epigenéticos, e não por eventos^{mutacionais 5,11}. A limitação de direcionar diretamente os transportadores ABC destaca a necessidade de identificar os reguladores a montante dessas proteínas como uma vulnerabilidade específica das células resistentes. Portanto, a investigação sistemática dos fatores epigenéticos tornou-se uma estratégia importante para identificar novos reguladores da resistência à quimioterapia e desenvolver terapias combinadas que visem essas vulnerabilidades.

As triagens funcionais de knockout baseadas em CRISPR-Cas9 permitem perturbações genômicas imparciais, sistemáticas e imparciais para estudar os efeitos da perda gênica no câncer na escala^{genômica 12}. No entanto, as bibliotecas CRISPR genômicas oferecem representação limitada de RNA guia único (sgRNA) por gene, o que reduz a sensibilidade quando comparada às bibliotecas^{focadas 13}. Importante, uma triagem robusta depende não apenas da qualidade das perturbações, mas também de um modelo apropriado e de um protocolo experimental otimizado. Nesse contexto, estudar um processo dinâmico e complexo, como resistência a medicamentos, pode se beneficiar de uma biblioteca focada com um protocolo^{personalizado 13}. Em um trabalho anterior, geramos uma biblioteca knockout CRISPR-Cas9 focada no epigenoma para atingir os reguladores^{de cromatina 14}. Comparada a outras bibliotecas CRISPR focadas em epigenoma disponíveis publicamente, a biblioteca epigenética knockout (EPIKOL) contém 779 genes, consistindo em leitores de cromatina, escritores, borrachas e proteínas associadas, cada um direcionado com 10 sgRNAs, permitindo assim aumentar a profundidade por gene e melhorar a robustez e reprodutibilidade das telas funcionais focadas em^{cromatina 14}. O EPIKOL está disponível tanto no sistema LentiGuide, no qual Cas9 é expresso de um vetor diferente, quanto no sistema LentiCRISPR, que inclui Cas9, proporcionando flexibilidade dependendo da linhagem celular. Alcançar cobertura suficiente de bibliotecas, definida como o número médio de células por sgRNA (por exemplo, 500×–1000×), é mais fácil para o EPIKOL quando comparado com bibliotecas genômicas amplas, proporcionando uma vantagem ao estudar as linhas celulares quimioresistentes de crescimento lento.

Embora o rastreamento CRISPR ofereça uma abordagem poderosa para examinar mecanismos de quimiorresistência, os fluxos de trabalho padrão de triagem agrupados não são otimizados para células quimioresistentes com efluxo ativo de fármacos. Puromicina, um antibiótico de seleção comumente usado em sistemas lentivirais CRISPR, pode ser bombeada para fora das células resistentes por transportadores ABC, principalmente ABCB1, impedindo a seleção bem-sucedida das células^{transduzidas 15,16}. Essa limitação pode levar a populações celulares heterogêneas, aumentando o ruído de fundo e, por fim, comprometendo a qualidade dos dados. Para enfrentar esse desafio, otimizamos a etapa de seleção da puromicina inibindo temporariamente o derrame de fármacos mediado por ABC com verapamil, permitindo assim o enriquecimento eficiente das células infectadas por sgRNA. Usando essa estratégia, identificamos o Bromodomínio e o PHD Finger Containing 1 (BRPF1) como regulador da expressão e resistência ao Taxol de ABCB1 no^{TNBC 17}. A inibição do BRPF1, geneticamente ou farmacologicamente, restaurou a sensibilidade ao Taxol em células resistentes, demonstrando a utilidade desse protocolo otimizado para identificar alvos acionáveis na^{quimiorresistência 17}.

Aqui, descrevemos as etapas principais na triagem CRISPR de seleção negativa em modelos quimioresistentes, focando especificamente nos desafios técnicos que muitas vezes são negligenciados na maioria dos protocolos de rastreamento por quimiorresistência ou CRISPR. O protocolo primeiro demonstra um método de escalonamento de dose passo a passo para a geração de células quimiorresistentes e, em seguida, otimiza as condições de entrega e seleção viral para superar o effluxo de fármacos mediado pelo transportador ABC. Juntas, essas otimizações garantem o enriquecimento eficiente das células sgRNA-positivas durante as triagens CRISPR, ao mesmo tempo em que eliminam efetivamente as células não transduzidas, proporcionando assim uma estratégia robusta e eficiente para transdução e seleção em células TNBC quimioresistentes. Por fim, o protocolo destaca os fundamentos para identificar impactos de triagem CRISPR por meio de sequenciamento de próxima geração e análise bioinformática.  Juntos, esse protocolo possibilita a implementação eficaz da plataforma de triagem EPIKOL para identificar potenciais alvos terapêuticos para superar a resistência 17,18,19.

Protocolo

Todos os reagentes e equipamentos usados neste estudo estão fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Geração de linhas celulares de câncer de mama triplo negativo resistentes ao Taxol

1. Para determinar a sensibilidade das células aos medicamentos, ajuste-se a densidade celular de SUM159PT células aderentes para 2 ×^{10 3 células} por poço em placas pretas inferiores transparentes de 96 poços com a mistura de nutrientes F12 de Ham, suplementada com 5% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 10 mM de HEPES e 1 μL/mL de hidrocortisona, e incubar as células por 16 horas em incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de_CO-2.
2. Prepare estoque de Taxol dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO). Para tratar células, prepare diluições seriadas de Taxol em meios de cultura, variando de 0,3 nM a 10 μM (por exemplo, 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1μM, 10 μM), e use o DMSO isoladamente como controle do veículo.
3. Trate as células com doses crescentes de 200 μL de Taxol (preparadas no passo 1.2) como triplicados e deixe a placa em incubadora de cultura celular por 72 horas a 37 °C com 5% de CO_2.
4. Após 72 horas de tratamento medicamentoso, meça a viabilidade celular com um ensaio de quantificação celular de tetrafosfato de adenosina (ATP) baseado em luminescência. Use um leitor de microplacas para medir luminescência e normalizar valores para controles DMSO. Calcule os valores de concentração inibitória de 10% (IC10) e IC50 por regressão não linear usando um modelo logístico dose-resposta de quatro parâmetros em um software estatístico apropriado.
5. Para começar a gerar células quimioresistentes, semeie 2 × 10^{células de 5} SUM159PT por poço em placas de 6 poços. Incube durante a noite a 37 °C com 5% de_CO2.
6. No dia seguinte, trate células com valores de Taxol IC10 ou IC50 em 2 mL de meio de cultura por 72 horas como concentrações iniciais.
7. Se as células tolerarem a concentração atual do medicamento, divida-as em dois poços. Mantenha um poço como controle de reserva em meio fresco e substitua o meio no segundo poço por meio contendo o dobro da concentração anterior de Taxol.
   NOTA: Se as células precisarem de recuperação devido a mudanças morfológicas induzidas pelo estresse, como projeções celulares anormais, arredondamento e descolamento extensos ou redução significativa da proliferação, mantenha-as em meio livre de drogas e espere até que as células se tornem saudáveis e confluentes. Depois, repita os passos começando pelo passo 1.7.
8. Ao gerar células resistentes, passar células parentais com meio contendo DMSO como controle. Ajuste o volume do DMSO para corresponder à quantidade de DMSO presente no tratamento correspondente com Taxol.
9. Meça a viabilidade celular como nos passos 1.2–1.4 a cada 3–4 semanas e continue esse procedimento até que se obtenha uma diferença significativa (p < 0,05 ou 10–50 vezes dependendo do medicamento aplicado) entre os valores de IC50 das linhagens celulares parentais e resistentes. O procedimento de incrementação da dose normalmente leva de 6 a 9 meses, dependendo do medicamento utilizado.
10. Após a obtenção de células resistentes estáveis, mantenha-as na dose de manutenção (última dose aplicada) do medicamento durante o cultivo para preservar o fenótipo resistente.
    NOTA: A geração de células quimioresistentes pelo método de escalonamento de dose é um processo que consome muito tempo, e a duração depende de vários fatores, incluindo a linhagem celular, a taxa de crescimento intrínseco e o agente quimioterapêutico específico utilizado. Geralmente, leva de 6 a 9 meses, dependendo do nível de resistência clinicamente relevante. Uma abordagem alternativa para determinar diferenças significativas nos níveis de resistência é avaliar a concentração mínima de medicamentos na qual as células resistentes sobrevivem, mas as células parentais não.
11. Caracterização de células resistentes: Realizar sequenciamento de RNA, western bloting, reação em cadeia quantitativa da polimerase (qPCR) e ensaios de viabilidade celular com tratamento medicamentoso (por exemplo, ensaio de formação de colônias) para caracterizar o fenótipo das células resistentes. Certifique-se de reavaliar o fenótipo resistente após várias passagens para demonstrar que o fenótipo elevado de IC50 permanece estável ao longo do tempo.

2. Produção de lentivírus

1. Dia 0: Semente as células HEK293T como 4 × 10^{10 6} por 100 mm de cultura de tecidos com o Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% de FBS e 1% de Penicilina-Estreptomicina, para alcançar 90% de confluência no dia seguinte.
2. Dia 1: Prepare misturas de polietilenimina (PEI) e DNA em DMEM sem soro (-/-) separadamente para cada vírus. Use as Tabelas 1 e 2 para ajustar o volume e as concentrações de PEI e DNA de acordo com o rendimento viral desejado.
   NOTA: O PEI é usado quatro vezes o total de μg de DNA (por exemplo, em uma placa de 100 mm, use 30 μL de PEI, totalizando 7,5 μg de DNA). A produção de vírus em antenas de 100 mm é seguida neste protocolo, e o vírus obtido de 5 a 10 antenas de 100 mm permitirá a realização de múltiplas triagens. Para experimentos de validação ou infecções em pequena escala, um único poço de uma placa de 6 poços ou uma placa de 60 mm é suficiente. Como o cloridrato linear de polietilenimina é um agente tóxico de transfecção, certifique-se de que a confluência celular esteja em 90% no momento da transfecção.
   1. Depois de misturar bem, adicione a mistura de DNA ao tubo PEI. Misture bem e deixe os complexos PEI-DNA em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente.
   2. Depois, adicione os 600 μL do complexo PEI-DNA aos HEK293Ts, em direção ao ponto. Coloque as placas na incubadora viral por 16 horas a 37 °C com 5% de CO_2.
3. Dia 2: Substitua o meio das células infectadas aspirando o PEI e o meio que contém vírus, adicionando 8 mL de DMEM completo para cada prato de cultura de tecido de 100 mm. Incube as células para permitir a produção viral.
4. Dia 3: Realize a primeira coleta de vírus removendo suavemente os 8 mL de sobrenadante para um tubo centrífuga de tamanho apropriado e armazene a 4 °C. Se houver várias placas para a produção viral, combine os supernadantes. Depois, adicione 8 mL de DMEM fresco e completo em cada prato e retorne os pratos à incubadora do vírus.
5. Dia 4: Repita as etapas de coleta e combine com os sobrenacionantes do Dia 3.
   1. Prepare uma solução de polietilenoglicol (PEG)-8000 a 50% (p/v) em solução de soro tampão fosfatado (PBS) para obter solução de 5× de estoque PEG. Autoclave para dissolver e esterilizar.
   2. Centrifuge os supernadantes virais coletados a 300 x g por 5 minutos para pelletar as células residuais, depois prossiga para a filtração.
   3. Filtre 16 mL de sobrenadante viral usando um filtro de 0,45 μm (seja seringa ou filtro a vácuo de 50 mL) para o tubo contendo 4 mL de solução PEG para alcançar uma concentração final de 1× de PEG e remover detritos e células remanescentes.
   4. Tampe o tubo e misture por inversão. Repita essa etapa para todas as preparações virais. Armazene durante a noite a 4 °C no escuro, com agitação suave opcional.
   5. No dia seguinte, precipitados visíveis devem estar presentes. Centrifuge os tubos a 1400 x g por 20 minutos a 4 °C.
      NOTA: Pellets virais precipitados por PEG podem ser armazenados a 4 °C até 5 dias antes da centrifugação; no entanto, o título viral pode diminuir com a incubação prolongada.
   6. Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante, deixando um pequeno volume (aproximadamente 100 μL) no tubo para evitar perturbar o pellet.
   7. Centrifuge os tubos por 5 minutos a 300 x g para coletar o máximo de líquido possível das laterais do tubo. Depois, descarte cuidadosamente o sobrenadante restante.
   8. Para concentrar o vírus 100 vezes, adicione PBS a 1/100 do volume inicial do sobrenadante viral ao pellet e ressuspenda o pellet por pipeteamento (por exemplo, se começar com 16 mL de sobrenadante viral, adicione 120–140 μL de PBS ao pellet para atingir o volume final de 160 μL, levando em conta o volume do pellet). Evite pipetar vigorosamente; Aliquot o vírus.
      NOTA: O título esperado após a concentração de PEG é >1 × 10⁸ partículas infecciosas/mL (ip/mL) para o sistema LentiGuide e >1 × 10⁷ para o sistema LentiCRISPR. Títulos inferiores em uma ordem de magnitude ainda podem ser aceitáveis, mas devem ser verificados em relação à infectividade da linha-alvo e ao volume viral necessário.
   9. Se a concentração do vírus não for necessária, aliquota o vírus para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento. Armazene vírus concentrado ou não concentrado a -80 °C. Alvejante e pratos de lixo.
      NOTA: Para uma descrição mais detalhada da produção e manejo de lentivirais, os leitores são encaminhados aos protocolos^{estabelecidos 20}. Para problemas comuns encontrados durante a produção de lentivírus, consulte a Tabela Suplementar 1.

	1 poço de placa de 6 poços	Placa de 60 mm	Placa de 100 mm	Placa de 150 mm
PEI (estoque 1 mg/mL) volume	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
Volume DMEM (-/-)	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tabela 1: Volumes necessários de PEI e DMEM para diferentes placas da mistura PEI.

	1 poço de placa de 6 poços	Placa de 60 mm	Placa de 100 mm	Placa de 150 mm
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Vetor-alvo	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) ajusta o volume final para	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tabela 2: Volumes de plasmídeo e DMEM necessários para diferentes placas da mistura de DNA.

3. Estabelecimento de seleção otimizada de puromicina para células MDR

NOTA: Em células quimiorresistentes que apresentam superexpressão de ABCB1, a seleção da puromicina falha devido ao efluxo ativo de puromicina mediado por ABCB1, impedindo a seleção eficaz das células infectadas por sgRNA. Para superar essa limitação, verapamil é coadministrado com puromicina para inibir transitoriamente o efluxo mediado por ABCB1, permitindo o acúmulo intracelular de puromicina e eliminando de forma eficiente células não infectadas.

1. Determine a concentração de verapamil que bloqueia o vazamento de fármacos mediado por ABCB1 sem afetar a viabilidade celular. Para isso, utilize o agente quimioterapêutico ao qual a resistência foi adquirida (neste caso, Taxol) em combinação com doses crescentes de verapamil.
   1. Semente SUM159PT células resistentes ao Taxol e parentais para placas pretas inferiores claras de 96 poços, com 2 × 10³ células por poço em triplicado. Incube as células durante a noite a 37 °C com 5% de CO_2.
   2. Trate as células com diluições seriadas de verapamil (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) mantendo uma concentração constante do Taxol (por exemplo, dose de manutenção) em todas as condições.
   3. Após 72 horas de tratamento, avalie a viabilidade celular com um ensaio de quantificação de viabilidade celular baseado em luminescência por ATP. Determinar a concentração de verapamil que não reduz a viabilidade sozinha (≥90%–95% de viabilidade em comparação com controles não tratados), mas restaura a sensibilidade em células resistentes.
2. Para encontrar a concentração de puromicina a ser usada em combinação com verapamil, semente SUM159PT células resistentes ao Taxol em uma placa de 96 poços a 2 × 10³células por poço. Incube a placa por 16 horas a 37 °C com 5% de_CO2.
   1. Prepare diluições seriadas de puromicina (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg/mL) no meio contendo a concentração de verapamil previamente determinada e trate as células de acordo.
   2. Após 72 horas, meça a viabilidade celular com um ensaio de quantificação de ATP baseado em luminescência e determine a concentração mínima de puromicina que elimina todas as células (≤5% de viabilidade) na presença de verapamil. Essa concentração será usada para seleção durante a triagem CRISPR.
      NOTA: Essas etapas de otimização da concentração de fármacos dependem da linha celular e do contexto. Fatores como sensibilidade intrínseca ao medicamento, níveis de expressão do transportador ABC e taxa de crescimento podem influenciar as concentrações efetivas. Portanto, realize essa otimização para cada nova linha celular e modelo de resistência. (Para referência, 5 μg/mL de puromicina em combinação com 20 μM verapamil é usada para células resistentes a Taxol usadas neste^{estudo 17}). Para a seleção de puromicina + verapamil, consulte a Tabela Suplementar 1.

4. Cálculo da titulação viral e multiplicidade da infecção (MOI)

1. Dia -1: Semente SUM159PT células resistentes ao Taxol como 2 × 10⁵ em cada poço de uma placa de 6 poços com a mistura completa de nutrientes F12 do presunto.
2. Dia 0: Realize quatro diluições em série do vírus na mistura de nutrientes F12 de Ham contendo sulfato de Protamina (PS) a 8 μg/mL. (Para vírus concentrados, comece com 1 μL e dilua dez vezes em cada diluição como 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Para vírus não concentrados, ajuste os volumes de acordo (por exemplo, 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Dê 1 mL de meio contendo vírus para cada um dos quatro poços. Deixe um poço como controle de seleção puromicina e outro como controle não tratado.
3. Dia 1: Substitua o meio viral por 2 mL de substrato fresco 16 horas após a infecção.
4. Dia 2: Transfira o conteúdo celular de cada poço para um prato de cultura celular de 100 mm com a mistura de nutrientes F12 do Ham contendo puromicina + verapamil nas concentrações determinadas na etapa 3.2. Se as células não selecionadas estiverem sobreconfluentes, semam uma fração definida (por exemplo, 1/2), e isso será levado em consideração ao fazer os cálculos finais.
   NOTA: Reabasteça o meio com puromicina fresca + verapamil, se necessário, nos 3-4 dias seguintes até que todas as células da placa de controle estejam mortas.
5. Dias 4–5: Quando as células da placa de controle estiverem mortas, determine as placas que têm células suficientes para contar. Tripsinize as células, conte e determine o número total de células.
6. Após contar as células viáveis, calcule a eficiência de transdução e a Multiplicidade de Infecção (MOI) da seguinte forma (use a Tabela Suplementar 2 como modelo):
   1. Calcule a taxa de transdução (fração de células infectadas) usando a fórmula abaixo
      
      
      N_Selecionados: Número total de células após a seleção de puromicina nos poços infectados
      _{N Controle} : Número total de células no poço de controle não transduzido e não selecionado
      p: Taxa de transdução (fração das células infectadas).
      NOTA: Se apenas uma fração das células controle não tratadas foi semeada, leve isso em consideração ao calcular N_Controle
   2. Calcule o MOI. Durante a transdução lentiviral, os eventos de infecção seguem uma distribuição de Poisson. Portanto, a fração de células infectadas com pelo menos um vírus é definida como:
      p =1- ^{e -MOI}
      Assim, calcule o MOI como:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Calcule o título lentiviral (partícula infecciosa/mililitro, IP/mL) com base no número de células infectadas:
      Título (IP/mL) = (MOI x_{N inicial})/ Volume do vírus
      _{N inicial}: número de células semeadas para infecção
      Volume do vírus: volume de vírus adicionado por poço (em mL)
      NOTA: Calcule o título lentiviral para cada infecção separadamente e determine o título final tomando a média dos poços mostrando a quantidade proporcional do vírus e os valores de título. Poços que mostrem saturação ou desvio da escala proporcional devem ser excluídos dos cálculos de título.

5. Geração e/ou validação de uma linha celular estável que expressa Cas9

NOTA: Esta etapa é necessária ao usar LentiGuide_EPIKOL. Se uma linha Cas9-estável validada já estiver disponível, ou se LentiCRISPR_v2_EPIKOL for utilizada, prossiga diretamente para a Seção 6.

1. Produzir lentivírus Cas9 usando o vetor LentiCas9_blast conforme descrito na seção 2.
2. Infecte células no dia seguinte, com um MOI de 10. Calcule a quantidade do vírus de acordo com o MOI pretendido na seção 4, use a quantidade calculada de volume viral e entregue diretamente às células da placa que contém o meio de cultivo contendo 8 μg/mL de sulfato de protamina (PS).
3. Substitua o meio viral por meio fresco 16 horas após a infecção
4. No dia seguinte, aplique a seleção de blasticidina administrando às células o meio de cultura contendo a concentração previamente determinada de blasticidina (concentração final determinada por linhagem celular com ensaio de viabilidade celular conforme descrito na seção 3) até que as células não infectadas sejam eliminadas (tipicamente 6–7 dias).
   NOTA: Se células que expressam Cas9 forem cultivadas por períodos prolongados antes da triagem, repita a seleção de blasticidina para eliminar células Cas9-negativas.
5. Validação Cas9 (recomendada): Valide a atividade do Cas9 usando sgRNAs controle que visem genes essenciais (sequências de sgRNA estão disponíveis na biblioteca EPIKOL; veja a Tabela Suplementar 3) ou sistemas repórteres como a proteína fluorescente verde (GFP) para avaliar a eficiência do knockout e a cinética. Métodos detalhados de validação podem ser encontrados em um estudo anterior¹⁹.

6. CRISPR em todo o epigenoma, eliminação, infecção da biblioteca lentiviral e triagem

NOTA: Para garantir um mapeamento preciso de genótipo para fenótipo, as triagens CRISPR agrupadas exigem infecção com baixo MOI e cobertura suficiente de bibliotecas (tipicamente 500×–1000), dependendo da rigor experimental e do comportamento da linhagem celular. Para princípios gerais de fluxos de trabalho de triagem CRISPR em todo o genoma agrupados, incluindo design de bibliotecas e configuração experimental, veja protocolos^{publicados anteriormente 21,22}. Para EPIKOL, é fortemente recomendado manter a cobertura >500x durante toda a triagem, pois cair abaixo desse limite aumenta o risco de queda estocástica de sgRNA, especialmente no setor de tratamento medicamentoso da triagem. Os cálculos a seguir são necessários para determinar o número inicial de células, a eficiência da transdução e o volume viral necessários para que a transdução de EPIKOL realize uma infecção de baixo MOI sem comprometer a complexidade da biblioteca.

1. Dia -1: Semeie uma quantidade total de células calculada abaixo em placas de cultura celular de 100 mm ou 150 mm com o número apropriado de células por placa.
   1. Calcule o número de células infectadas com sucesso para alcançar a cobertura desejada da biblioteca (use a Tabela Suplementar 2 como modelo):
      N_infectados = (número de sgRNAs) × (cobertura de alvos)
   2. Calcule o número inicial de células por replicado para compensar a fração de células não infectadas em casos de infecção com baixo MOI (0,3–0,4):
      _{N iniciando} = N_infectados/p
      onde p é a taxa de transdução (fração de células infectadas) determinada com base na distribuição de Poisson (veja o passo 4.6).
      NOTA: Esse ajuste garante que um número suficiente de células individuais infectadas por sgRNA estará presente no pool após a infecção por baixo MOI para atingir a cobertura desejada da biblioteca.
2. Dia 0 - Transdução
   1. Calcule o volume viral necessário por replicação
      Volume viral necessário = (N_inicial × MOI) / (Título viral (ip/mL previamente determinado))
      NOTA: A eficiência de transdução na faixa MOI alvo de 0,3–0,4 corresponde aproximadamente a
      26%–33% de células resistentes à puromicina antes da seleção.
   2. Infectar células com o volume viral calculado no meio de cultura completo contendo 8 μg/mL de sulfato de Protamina (PS). Reduzir o volume do meio para aumentar o contato vírus-célula durante a infecção (por exemplo, 8 mL em vez de 10 mL para uma placa de 100 mm)
   3. Prepare combinações independentes de infecção para cada réplica biológica.
      NOTA: Pelo menos duas réplicas biológicas são recomendadas; três são preferíveis. Réplicas biológicas devem ser transduzidas, selecionadas e mantidas separadamente (incluindo mudanças de mídia e passagem) e não devem ser agrupadas em nenhuma etapa antes do sequenciamento.
3. Dia 1 - Substituir mídia viral por mídia fresca após 16 horas e incubar a 37 °C com 5% de CO₂
4. Dia 2 - Seleção das células transduzidas: Aplicar a seleção de puromicina na presença de verapamil (concentrações determinadas no passo 3.2) para enriquecer células infectadas por sgRNA em células resistentes a SUM159PT Taxol. Continue a seleção até que todas as células da placa de controle não infectada sejam eliminadas (tipicamente ~3 dias).
5. Dia 5 - Amostragem de referência T₀ : Após a conclusão da seleção puromicina + verapamil, tripsinize as células e colete um pellet celular inicial de tempo zero (T₀) de cada réplica biológica correspondente ao nível de cobertura decidido durante a transdução. Como servirá como referência para a distribuição inicial da biblioteca, colete os pellets de células assim que a seleção estiver concluída, antes que ocorra qualquer perda de células. Semeie números de celular suficientes para manter a cobertura o tempo todo.
   NOTA: Após a seleção de puromicina + verapamil, o número de células transduzidas sobreviventes variará dependendo do tempo de duplicação da linhagem celular e da eficiência de transdução alcançada. A população sobrevivente normalmente se recupera até a densidade inicial de semeadura após a conclusão da seleção e pode excedê-la em linhas celulares de crescimento mais rápido. Se o número de células sobreviventes permitir, colete múltiplos pellets T₀ e congele amostras de reserva a -80 °C. Além disso, células infectadas com EPIKOL podem ser criopreservadas em nitrogênio líquido mantendo a cobertura. Esses estoques de reserva podem ser descongelados em caso de falha inesperada da tela ou para futuras abordagens experimentais alternativas (por exemplo, testando tratamentos medicamentosos adicionais). Verifique a eficiência da transdução usando uma placa de controle não infectada para confirmar que a eficiência pretendida foi alcançada (veja a seção 4). Se a eficiência de transdução observada for maior do que o esperado, reinicie o experimento para garantir que a transdução seja realizada com baixo MOI, evitando a integração múltipla de sgRNAs por célula.
6. Execução da triagem: Após permitir a conclusão da edição genômica mediada por Cas9, durante a duração determinada na seção 5, divida as células em grupos de tratamento.
   NOTA: Isso normalmente leva de 7 a 9 dias após a transdução, pois a eficiência máxima de knockout é atingida aproximadamente no dia 7 de²³ pós-transdução. Para alvos epigenéticos, a janela de 9 dias também permite alterações no nível de cromatina antes do início da seleção do medicamento.
   1. Divida as células em braços experimentais preservando a cobertura: um é o braço de controle, que é uma condição básica que recebe DMSO, e o outro é o braço de tratamento que é a condição que recebe Taxol.
   2. Manter culturas para 14–16 duplicações populacionais. O nível de duplicação populacional (PDL) é calculado como:
      PDL = PDL_s + 3,322 (Log C_f – log_{C i})
      PDL_s = nível inicial de duplicação populacional
      C_i = número inicial de célula semeado
      C_f = número total de células ao final de um período de crescimento
   3. Em cada passagem, monitore a viabilidade e a cinética de crescimento e evite gargalos mantendo números celulares adequados. Ajuste a intensidade do tratamento se ocorrer morte celular excessiva.
      NOTA: Procure coletar pellets de células de backup em cada passagem, semanalmente ou em determinados PDLs durante a tela. Essas amostras de reserva podem servir como pontos de tempo alternativos para sequenciamento ou como amostras de otimização para o processo de extração genômica de DNA. Criopreservar células periodicamente para evitar perda inesperada de células.
7. Amostragem_final T: Ao atingir o PDL desejado, colete os pellets finais de ponto de tempo (T_final) para cada réplica e condição mantendo a cobertura da biblioteca por pelota. Armazene os pellets a -80 °C até a extração de gDNA a jusante.
   NOTA: Procure terminar a triagem em PDLs comparáveis entre os braços, mesmo que a duração da cultura varie entre condições.

7. Extração de DNA genômico

1. Extrair DNA genômico (gDNA) usando um método validado (por exemplo, MN NucleoSpin Tissue Kit), com pequenos ajustes no protocolo para melhorar a eficiência da lise de grandes pastilhas celulares agrupadas.
   1. Siga o protocolo de tecidos em vez do protocolo celular devido ao tamanho grande do pellet. Considere aumentar o volume dos reagentes e usar múltiplas colunas de spin por célula (não exceda 5 × 10⁶ células por coluna), se necessário, para garantir uma lise eficiente.
      NOTA: Antes da lise, ressuspender o pellet com uma quantidade mínima de PBS (~50 μL) pode melhorar a eficiência da lisis. A lise incompleta do pellet pode entupir a coluna de spin, resultando em redução da produção de DNA.
   2. Siga as recomendações de eluição de alto rendimento e alta concentração. Elute gDNA em um volume reduzido de tampão de elução (aproximadamente 2/3 do volume recomendado) por coluna, especialmente se os pellets celulares forem divididos em múltiplas colunas.
2. Meça a qualidade e quantidade do gDNA (por exemplo, Nanodrop).

8. Preparação de biblioteca de sequenciamento EPIKOL a partir de DNA genômico

1. Use um gabinete dedicado para PCR para realizar todas as etapas da PCR da biblioteca e evitar contaminação por plasmídeos durante as PCRs de gDNA, pois os moldes de plasmídeo se amplificam de forma mais eficiente que o DNA genômico e podem distorcer a distribuição do sgRNA.
   1. Limpe o espaço de trabalho, micropipetas e prateleiras com 10% de água sanitária e 70% de etanol, respectivamente.
   2. Aliquota todos os reagentes (especialmente os espoletadores) em volumes descartáveis antes do uso para reduzir o risco de contaminação cruzada e ciclos de congelamento-descongelamento.
   3. Armazene os reagentes a -20 °C e mantenha-os no gelo durante a instalação da PCR.
2. Otimize o volume inicial de entrada de gDNA mirando entre 200× a 500× cobertura por sgRNA para manter a complexidade adequada da biblioteca. Exemplo: Para a biblioteca EPIKOL, gDNAs são preferencialmente extraídos de pellets celulares coletados com 1000× de cobertura, e a cobertura final de 250× é usada para amplificação de gDNA.
   1. Calcule a entrada de gDNA necessária para a cobertura desejada da seguinte forma.
      Quantidade de gDNA = (Número de sgRNAs) × cobertura × (66pg DNA/núcleo)
      Exemplo: 8000 gRNA × (cobertura de 250×) × (6,6 pg DNA/núcleo) = 13,2 μg gDNA/amostra devem ser amplificados.
   2. Realize um teste de PCR usando condições de reação externas e internas de PCR nas Tabelas 3, Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6 com quantidades crescentes de gDNA por reação (por exemplo, 1 μg, 3 μg, 6 μg) para determinar a quantidade ideal de gDNA por tubo.
      NOTA: Entrada insuficiente de gDNA ou ciclagem excessiva de PCR podem introduzir viés de amplificação e distorcer a cobertura do sgRNA.
   3. Faça um gel de agarose a 2% para analisar produtos internos de PCR. Certifique-se de observar uma faixa brilhante em aproximadamente 350 pb.
   4. Com base na quantidade ideal de gDNA por tubo, determine o número total de reações PCR necessárias por amostra para alcançar a cobertura desejada da biblioteca, evitando quantidades excessivas de gDNA por reação individual.
      NOTA: Se forem necessários 13,2 μg de gDNA total e 3,3 μg de gDNA por reação fornecerem amplificação ideal, prepare quatro reações PCR paralelas com 3,3 μg de gDNA em um volume de reação de 100 μL. Nesse contexto, o volume do gDNA não deve exceder 10% do volume da reação para evitar inibição por PCR devido ao excesso de entrada de moldes de molde.
3. Amplificar fitas cassete sgRNA a partir do molde de gDNA (PCR Primeira/Externa)
   1. Amplifique as regiões genômicas contendo o cassete lentiviral sgRNA estável, integrado de forma estável, usando os primers listados na Tabela Suplementar 2. Realize reações de PCR com a quantidade de gDNA determinada no passo 8.2 ( veja a Tabela 3) usando as condições de reação de PCR na Tabela 4. Prepare um tubo de controle PCR que não tenha DNA molde para verificar possíveis contaminações e mantenha os tubos no gelo o tempo todo.
   2. Adicione a DNA Polimerase por fim, misture bem com batidas ou pipeteamentos, e centrifuge brevemente os tubos de PCR antes de colocá-los no ciclador térmico. Realize o arranque a quente para evitar amplificação inespecífica.
   3. Após a conclusão da PCR externa, agrupe todas as reações de PCR em um tubo microcentrífuga. Limpeza por PCR ou visualização em gel após PCR externa não é necessária. Use o produto de PCR agrupado diretamente como modelo na segunda PCR (interna). Armazene os produtos de PCR a -20 °C.

Reagente	Volume por reação
dNTP (10 mM cada)	2 μL
Polimerase de fúsio	1 μL
Buffer GC 6'	20 μL
Primer frontal (10 μM)	5 μL
Primer reverso (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Água livre de nuclease	até 100 μL (67–X μL)
Total	100 μL

Tabela 3: Reagentes necessários para a primeira/PCR externa.

Número do ciclo	Desnaturalização	Recozimento	Extensão
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabela 4: Condições de PCR para a primeira/PCR externa.

4. Realize codificação de barras de índice (PCR Segunda/Interna) e extração de gel
   1. Durante a segunda PCR (interna), o primer de índice reverso é usado para codificar as amostras com código de barras; portanto, use primers de índice diferentes para cada amostra.
      NOTA: Para bibliotecas geradas usando a espinha dorsal pLentiCrispr v2 , use primers de índice reverso que terminam com bases CT, rotuladas como lenticrisprv2_rev(índice X) (veja a Tabela Suplementar 2).
   2. Para bibliotecas geradas usando a backbone pLentiGuide , use índices que terminam com bases GT e são rotulados como rev_index_X na Tabela Suplementar 2.
   3. Prepare uma mistura de primers escalonados para frente combinando 2 μL de cada um dos nove primers escalonados (stock 100 μM) e adicionando 162 μL de água sem nuclease a um tubo estéril de microcentrífuga. A concentração final da mistura do primer será de 10 μM.
   4. Use o produto externo de PCR em pool como entrada e realize duas reações internas de PCR paralelas de 100 μL por amostra, usando as instruções das Tabelas 5 e 6. Prepare uma reação de controle por PCR usando o controle 'Sem DNA modelo' de PCR externo (passo 7.3) como entrada para monitorar a possível contaminação.
   5. Adicione a DNA Polimerase por fim, misture bem com batida ou pipeteamento, centrifuge brevemente os tubos de PCR antes de colocá-los no ciclador térmico. Realize o arranque quente para evitar amplificações inespecíficas.
   6. Combine e execute reações internas de PCR em gel de agarose a 2% para separar o amplicão alvo.
      NOTA: Nenhuma banda deve ser detectada nos controles PCR sem template. Deve ser observada uma faixa distinta em torno de 337 pb para LentiCrispr_V2 e 357 pb para bibliotecas LentiGuide. Uma faixa superior não específica de aproximadamente 500 pb também pode estar presente e deve ser excluída do processamento a jusante.
   7. Carregue 12 μL (10 μL de produto PCR + 2 μL de corante de carga) do produto interno de PCR para visualizar as bandas, carregue o restante do produto PCR em poços fundidos ou adjacentes designados para extração em gel. Minimize a espessura da agarose para maximizar a recuperação do DNA. Evite expor excessivamente as linhas de extração do gel enquanto visualiza para minimizar o dano ao DNA induzido pelos raios UV durante a excisão do gel.
   8. Purifique produtos de PCR a partir do gel de agarosa usando um kit específico de extração de gel (por exemplo, NucleoSpin Gel e PCR Clean-up) seguindo as instruções do fabricante. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Armazene os produtos de PCR a -20 °C.
      NOTA: Uma concentração mínima de >20 ng/μL após a extração do gel é necessária para o sequenciamento adequado. Se o rendimento necessário não puder ser alcançado mesmo com três reações internas de PCR paralelas, isole novo gDNA e repita o processo.

Reagente	Volume por reação
dNTP (10 mM cada)	2 μL
Polimerase de fúsio	1 μL
Buffer GC 6'	20 μL
Primer da mistura de atraso frontal (10 μM)	5 μL
Primer de índice reverso (10 μM)	5 μL
PCR Externa	5 μL
Água livre de nuclease	62 μL
Total	100 μL

Tabela 5: Reagentes necessários para a segunda/PCR interna.

Número do ciclo	Desnaturalização	Recozimento	Extensão
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tabela 6: Condições de PCR para a segunda PCR/interna.

9. Sequenciamento

1. Determine o número necessário de leituras mapeadas com base na cobertura da biblioteca definida no início da tela. Assumindo uma eficiência de mapeamento de 60%–70%, solicite um número maior de leituras totais para compensar a perda de leitura. Para uma cobertura de 1000× da biblioteca EPIKOL, são necessários ~8 milhões de leituras mapeadas, correspondendo a 10–12 milhões de leituras totais.
2. Realize o controle de qualidade das bibliotecas de sequenciamento usando Tapestation ou Bioanalyzer antes do sequenciamento para confirmar o tamanho e a integridade da biblioteca.
3. Poole bibliotecas de sequenciamento de diferentes amostras antes do sequenciamento, pois elas são codificadas exclusivamente com primers de indexação.
4. Confirme os requisitos de estrutura de leitura (orientação R1/R2) e desmultiplexação com a funcionalidade de sequenciamento. O sequenciamento pareado 2× 150 bp é sugerido no Illumina HiSeq, Novaseq ou em uma plataforma de sequenciamento compatível com Illumina. Considere solicitar pelo menos 5% de spik-in PhiX para melhorar a diversidade de sequenciamento.

10. Visão geral da análise de sequenciamento para EPIKOL

1. Use o pipeline de análise MAGeCK para analisar arquivos FASTQ de extremidade^{pareada 24}. Organize cada réplica biológica como um arquivo de entrada individual.
2. Use o arquivo de entrada sgRNA do EPIKOL, compatível com o MAGeCK, como biblioteca de referência (fornecido na Tabela Suplementar 4) e aplique a função de contagem para quantificar leituras de sgRNA de arquivos FASTQ individuais para criar arquivos brutos de contagem para cada réplica e condição.
   1. Normalize cada arquivo de contagem usando a normalização de leituras por milhão (RPM) para verificar a qualidade e distribuição de cada amostra, visualizando os gráficos normalizados de contagem^{de sgRNA 14}.
3. Execute uma segunda função de contagem para mesclar contagens em um único arquivo usando a normalização da mediana com as configurações padrão.
4. Execute a função -test para identificar mudanças em nível de gene usando arquivos de contagem bruta mesclados. Para avaliar o desempenho na triagem,_{compare as} amostras finais de T com as amostras de T₀ e verifique a distribuição dos sgRNAs de controle não direcionados e de genes essenciais.
   NOTA: É fundamental avaliar a diminuição dos genes de controle positivo em cada braço de rastreamento para avaliar o desempenho da triagem. Espera-se que haja variabilidade biológica entre as réplicas no braço de triagem tratado com medicamentos, já que a exposição a medicamentos pode causar diferenças estocásticas na resposta celular. Essa variabilidade é inerente aos exames de quimiorresistência e não indica necessariamente baixa qualidade de tela. Portanto, durante o hit-calling, pelo menos três repetições biológicas devem ser analisadas juntas, e os hits devem ser determinados como genes que possuem pelo menos 6 sgRNAs efetivos de um total de 10.
5. Para identificar alterações induzidas por medicamentos nas abundâncias de sgRNA e nos efeitos em nível gênico, compare amostras tratadas com T_final e Taxol com T_final DMSO, usando o grupo DMSO como controle.
6. Aplique um corte de taxa de falsa descoberta (FDR) de FDR < 0,05 para identificar genes esgotados no grupo de tratamento e revelar os genes que contribuem para a aptidão ou resistência das células resistentes ao Taxol.

Resultados

Para estudar reguladores epigenéticos da quimiorresistência no TNBC, o protocolo geral usando a linha celular SUM159PT é mostrado na Figura 1. Primeiramente, os valores de IC₁₀ e IC₅₀ de Taxol em células SUM159PT foram determinados tratando as células com concentrações crescentes de Taxol (Figura 2A). Um método de escalonamento de dose foi utilizado para gerar células SUM159PT resistentes a Taxol. Após vários meses, uma mudança nos valores de IC50 ilustra o estabelecimento bem-sucedido de um fenótipo resistente usando esse protocolo em comparação com células controle que foram conduzidas em paralelo sem exposição ao Taxol (Figura 2B).

Figura 1: Esquema da triagem EPIKOL em células SUM159PT resistentes a Taxol. Fluxo geral de trabalho de triagem de EPIKOL nas células SUM159PT resistentes a Taxol geradas. A figura foi criada com BioRender.com Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Uma vez estabelecidas as células resistentes, vários experimentos foram realizados para caracterizar suas mudanças fenotípicas e moleculares. As capacidades de proliferação das células resistentes sob tratamento com Taxol foram avaliadas com um ensaio de formação de colônias em comparação com células parentais. Como visto na Figura 2C,D, as células resistentes mantêm sua capacidade proliferativa sob tratamento com Taxol, enquanto as células parentais não conseguem sobreviver. Este ensaio é uma das etapas importantes na caracterização de células resistentes e demonstra como a capacidade proliferativa sob tratamento medicamentoso pode ser avaliada entre células parentais e resistentes.

Como parte da caracterização das células resistentes, o sequenciamento de RNA foi realizado em células parentais e resistentes para analisar as mudanças transcriptômicas associadas à quimiorresistência (Figura 2E). Entre os genes mais aumentados em células resistentes estava o ABCB1, seguido por outros transportadores ABC, incluindo ABCB4 e ABCA5. A regulação positiva da expressão de ABCB1 foi validada com reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), e isso ilustra como as mudanças na expressão gênica candidata podem ser validadas usando qPCR (Figura 2F).

Figura 2: Geração de células resistentes e sua caracterização. (A) Esquema mostrando a geração de células de SUM159PT resistentes a Taxol usando o método de aumento de dose. (B) Curva de resposta à dose mostrando a diferença entre os valores de IC50 das células parentais e das células resistentes geradas. IC50 parental = 6 nM e IC50 resistente a Taxol = 355,4 nM. (C) Ensaio de formação da colônia na presença de Taxol. (D) Quantificação das áreas de colônia em (C.) Análise bidirecional da variância (ANOVA) com o teste post hoc de Tukey foi aplicada usando o Prism 8 (GraphPad Software). Os níveis de significância foram definidos como *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Gráficos vulcânicos mostrando genes diferencialmente expressos em células Taxol-Res em comparação com células parentais, com cortes de LFC>2 e p<0,001. (F) validação qPCR da expressão de mRNA ABCB1 em células parentais e Taxol-Res. Valores P determinados pelo teste t de Student bidirecionado em comparação com o grupo controle; **P < 0,01. O Painel A foi criado com BioRender.com. A figura do painel E foi modificada com permissão de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Após mostrar superexpressão de ABCB1 e outros transportadores ABC em células resistentes a Taxol e considerando o amplo espectro de substrato de ABCB1, foi avaliada a presença do fenótipo MDR. Para isso, células resistentes a Taxol foram tratadas com múltiplos fármacos que são substratos conhecidos do transportador ABCB1 e possuem diferentes mecanismos de ação, e sua sensibilidade ao medicamento foi avaliada (Figuras 3A,B). Em consonância com o perfil de expressão observado pelo transportador ABC, células resistentes a Taxol também apresentaram resistência a Doxorubicina e Vincristina, confirmando a presença do perfil MDR e ilustrando como o fenótipo de resistência a múltiplos fármacos pode ser avaliado funcionalmente.

O fenótipo MDR é um desafio para a abordagem de triagem baseada em CRISPR, EPIKOL, já que a biblioteca requer seleção de puromicina para enriquecer as células transduzidas. Como a puromicina pode ser bombeada para fora das células pelo fluxo de fármacos mediado por ABCB1, a seleção da puromicina pode não ser eficiente em células resistentes (Figura 3C). Assim, células não transduzidas podem sobreviver à seleção, confundindo os resultados da triagem.

Para resolver essa limitação, o processo de seleção de células quimioresistentes com perfil MDR foi otimizado antes da triagem do EPIKOL. O verapamilo, um inibidor ABCB1 de primeira geração, foi usado para bloquear o effluente de fármacos mediado pelo transportador ABC, permitindo assim o acúmulo intracelular de agentes quimioterapêuticos ou puromicina (Figura 3D). Embora o verapamil isolado não tenha afetado a viabilidade celular, ele restaurou a sensibilidade dos medicamentos quando combinado com agentes quimioterapêuticos (Figura 3E,F). De forma semelhante, curvas de eliminação da puromicina combinadas com doses não tóxicas de verapamil demonstraram que a inibição do ABCB1 restaura a sensibilidade à puromicina (Figuras 3G,H). Isso garante que as células que sobrevivem à seleção sejam aquelas que são transduzidas com sucesso, em vez de células que escapam da seleção devido ao efluxo de fármacos impulsionado por ABCB1. Estabelecer um fluxo de trabalho eficaz de seleção em células quimioresistentes é crucial para resultados confiáveis de triagem EPIKOL.

Figura 3: Fenótipo de resistência a múltiplos medicamentos e efeito do verapamil em células resistentes. Curvas de resposta à dose que mostram a diferença entre os valores de IC50 das células parentais e geradas resistentes com (A) Doxorubicina, (B) Vincristina, (C) Puromicina. (D) Esquema mostrando a seleção de células de SUM159PT resistentes ao Taxol com e sem verapamil. A figura foi criada com BioRender.com. (E) Ensaio de viabilidade celular com células Taxol-Res para determinar a concentração ideal de verapamil com Taxol. (F) O verapamil resensibiliza as células resistentes ao Taxol para o Taxol. (G) O verapamilo não altera a resposta das células parentais à puromicina. (H) O verapamil restaura a sensibilidade à puromicina nas células Taxol-Res. Os painéis A, B e F foram reutilizados com permissão de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Para encontrar novos reguladores da quimiorresistência no TNBC, foi realizada uma triagem com EPIKOL com células de SUM159PT resistentes ao Taxol, conforme ilustrado na Figura 4A. Como as células resistentes crescem mais lentamente do que as células^{parentais 17}, os níveis de duplicação populacional foram monitorados durante toda a triagem, tanto nos grupos tratados com Taxol quanto nos grupos tratados com DMSO, para determinar o tempo necessário para atingir 16 duplicações populacionais (Figura 4B). Assim, a triagem com EPIKOL para o grupo tratado com DMSO foi concluída aproximadamente no dia 35, enquanto o grupo tratado com Taxol foi cultivado por mais 15 dias para atingir o mesmo nível de duplicação populacional.

Após o sequenciamento, o pipeline de análise MAGeCK foi usado para combinar o efeito dos sgRNAs que visam o mesmo gene e revelar as mudanças em nível gênico após o knockout²⁴. A biblioteca EPIKOL inclui sgRNAs direcionados a genes essenciais como controles positivos; a primeira etapa de controle de qualidade foi avaliar se esses sgRNAs estavam esgotados conforme esperado. Gráficos em cascata ilustram as mudanças de dobra Log2 de genes essenciais em diferentes comparações (Figura 4C–E). Quando amostras finais de condições tratadas com DMSO ou Taxol foram comparadas com o ponto inicial, quase todos os genes essenciais foram esgotados ao serem eliminados, indicando desempenho eficaz na tela (Figura 4C,D). No entanto, essa diminuição não é claramente observada quando as duas amostras finais (tratadas com DMSO e tratadas com Taxol) foram comparadas entre si, como esperado, já que genes essenciais são necessários para a sobrevivência celular em ambas as condições (Figura 4E).

Uma visualização alternativa dos resultados da tela é o gráfico do vulcão, que exibe as variações de dobra Log2 juntamente com significância estatística (o valor p ou valores FDR). No rastreamento EPIKOL realizado em células resistentes a Taxol, múltiplos genes controle positivos foram identificados como significativamente esgotados, o que reforça ainda mais a confiabilidade do rastreamento, já que a depleção dos sgRNAs direcionados a genes controle positivos ilustra um controle de qualidade típico de uma triagem bem-sucedida (Figura 4F). Além dos controles genéticos essenciais, a biblioteca EPIKOL inclui sgRNAs de controle positivo específicos para contexto, direcionados a vários genes transportadores ABC. Como esperado, as contagens normalizadas de sgRNAs ABCB1 em diferentes grupos destacaram a significativa depleção dos sgRNAs que direcionam ABCB1, especificamente no grupo tratado com Taxol (Figura 4G). No geral, isso demonstra como mudanças em nível de sgRNA podem ser interpretadas para identificar genes candidatos associados à resposta a medicamentos.

Figura 4: A triagem do EPIKOL resulta em células resistentes a Taxol e gráficos de exemplo. (A) Esquema do protocolo de tela EPIKOL. (B) Nível de Duplicação de População (PDL) das células Taxol-Res. (C–E) Gráficos em cascata mostrando resultados da triagem com EPIKOL em células Taxol-Res, destacando genes essenciais, grupo tratado com DMSO comparado ao ponto de tempo inicial no painel C, grupo tratado com Taxol em comparação ao ponto de tempo inicial no painel D, grupo tratado com Taxol comparado ao grupo tratado com DMSO no painel E. (F) Gráfico vulcão mostrando Log2FoldAlterações dos genes em amostras tratadas com Taxol em comparação com o ponto de tempo inicial. Genes que possuem p<0,05 foram coloridos e marcados. Esse número foi modificado em relação a uma publicação^{anterior 17}. (G) Leituras por milhão (rpm) de 10 diferentes grafos de sgRNA ABCB1 do EPIKOL. O Painel A foi criado com BioRender.com. O Painel E foi reutilizado com permissão de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela suplementar 1: Tabela de solução de problemas.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Cálculo de Título Viral e MOI.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 3: lista de sgRNA da biblioteca EPIKOL.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Primers usados na preparação da biblioteca de sequenciamento EPIKOL. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As abordagens de triagem agrupada baseadas em CRISPR-Cas9 estão bem estabelecidas em diferentes contextos celulares. No entanto, a triagem em células quimioresistentes apresenta desafios distintos e requer otimização adicional. Como as células quimiorresistentes servem como modelos valiosos para estudar as vulnerabilidades de tumores quimiorresistentes, é importante abordar essas limitações nas estratégias de triagem para identificar de forma confiável reguladores genéticos ou epigenéticos da quimiorresistência.

A geração de linhagens celulares quimioresistentes pode ser complicada e depende muito do agente quimioterapêutico utilizado. Embora as células possam se adaptar facilmente a certos medicamentos, podem ser altamente suscetíveis a outros²⁵. Portanto, é importante determinar os valores específicos de linhagem celular de IC50 antes do protocolo de geração de linhagens celulares resistentes. Nos casos em que as células não toleram a exposição ao nível de IC50 ao medicamento em várias viagens, é possível começar com uma concentração menor do medicamento (por exemplo, IC10-20) (ver Protocolo seção ¹⁾¹⁷. Como a aquisição de resistência é um evento estocástico, vários poços/placas de células podem ser tratados ao mesmo tempo para aumentar a probabilidade de obtenção de células resistentes. É crucial caracterizar de forma abrangente a população celular resistente a medicamentos obtida para descrever as mudanças transcricionais e fenotípicas durante o procedimento de escalonamento de dose em comparação com seu estado ingênuo. Abordagens globais de perfilamento, como RNA-seq, podem ser empregadas para identificar genes diferencialmente expressos em relação à linha parental. Funcionalmente, a resistência adquirida a medicamentos deve ser validada com ensaios de viabilidade e proliferação celular para demonstrar que células resistentes mantêm a sobrevivência sob condições de tratamento farmacológico citotóxicas para as células parentais. Além disso, as possíveis mudanças em sua capacidade proliferativa e taxa de crescimento devem ser medidas em comparação com a linhagem celular parental para calcular seus respectivos PDLs. Como se sabe que a resistência adquirida ao Taxol é mediada, ao menos em parte, pelo effluente de fármacos mediado pelo ABC, a expressão dos principais transportadores ABC (por exemplo, ABCB1) deve ser avaliada nos níveis de mRNA e proteína usando qPCR e Western bloting, podendo ser complementada por dados transcriptômicos. Com base no perfil de expressão do transportador ABC, a presença do fenótipo MDR deve ser considerada e a resistência a outros agentes quimioterapêuticos deve ser avaliada. Em nosso estudo anterior, caracterizamos as linhas celulares resistentes ao Taxol e identificamos o ABCB1 como um dos genes mais aumentados, e argumentamos que a resistência multirrogativa mediada por ABCB1 pode causar falha na seleção^{de puromicina 17}. Portanto, após a geração de células resistentes, a expressão dos transportadores ABC e do fenótipo MDR devem ser avaliadas antes de qualquer procedimento de transfecção.

O método de aumento de dose oferece vantagens em relação aos protocolos de exposição a medicamentos em doses elevadas, pois as células podem ser criopreservadas a cada etapa antes do aumento da dose, proporcionando flexibilidade e protegendo contra a perda de culturas. Além disso, a escalonação gradual da dose permite a aquisição de fenótipos de resistência ao longo do tempo, possibilitando a evolução adaptativa; em contraste com o tratamento agudo de alta dose, que resulta na seleção de subpopulações resistentes pré-existentes. Sua progressão gradual permite que os pesquisadores escolham deliberadamente o nível de resistência desejado para parar a seleção e avaliem as propriedades do fenótipo resultante. Além disso, as etapas intermediárias da escalada da dose poderiam ser aproveitadas para estudar mecanismos de resistência adquirida de forma temporal. De acordo com a questão biológica subjacente, diferentes níveis de resistência poderiam ser obtidos para estudar tanto mecanismos adaptativos iniciais com níveis de resistência mais baixos quanto fenótipos de resistência estáveis e totalmente estabelecidos em células mais resistentes. Além disso, limiares de resistência clinicamente relevantes variam substancialmente dependendo do medicamento, da linhagem celular e da taxa intrínseca de proliferação; portanto, o cronograma de aumento da dose pode variar de acordo (em nosso caso, a geração de células resistentes ao Taxol levou aproximadamente 6 meses). De acordo com essa lógica, estabelecemos dois níveis diferentes de resistência com células SUM159PT em nosso estudo anterior e comparamos suas características distintas e^{compartilhadas 17}. Portanto, recomendamos que os pesquisadores definam a faixa de IC50 alvo do medicamento de interesse de acordo com a relevância clínica e biológica.

Está bem estabelecido que a retirada da pressão do medicamento pode levar à perda de quimiorresistência, já que as células podem reprogramar seu epigenoma e^{transcriptoma 25}. Por essa razão, recomenda-se avaliar a estabilidade do fenótipo de resistência ao longo de vários meses. Se as células tendem a voltar ao estado sensível após a retirada do medicamento, células resistentes podem ser cultivadas na presença da dose de manutenção, tipicamente correspondente à concentração final do medicamento usada durante a geração da resistência, para preservar seu fenótipo de resistência. Embora modelos de linhagens celulares quimioresistentes in vitro sejam práticos, reproduzíveis e amplamente usados para estudar quimiorresistência adquirida, eles podem não recapitular totalmente a heterogeneidade fenotípica observada em tumores de pacientes e carecem do microambiente tumoral, interações imunes e heterogeneidade espacial ^3,4,25. Além disso, a passagem prolongada durante a geração de resistência pode causar alterações genéticas e epigenéticas que divergem daquelas observadas em amostras de pacientes, potencialmente limitando a relevância translacional dos acertos identificados. Portanto, genes e mecanismos candidatos identificados por meio deste protocolo devem ser ainda validados em sistemas experimentais clinicamente mais relevantes, como modelos de co-cultura, organoides derivados de pacientes ou estudos in vivo. O EPIKOL oferece vantagens com sua natureza focada se se forem realizadas triagens complementares nesses modelos, onde o número máximo de células que podem ser obtidas é inerentemente limitado.

Células quimioresistentes frequentemente crescem mais lentamente do que seus parentais, o que pode representar um desafio prático para triagens genômicas que exigem grandes populações celulares para manter a cobertura da biblioteca. Bibliotecas focadas como o EPIKOL oferecem a vantagem de realizar uma triagem com menos material de partida enquanto proporcionam maior profundidade de sgRNA por gene, melhorando assim a sensibilidade e a reprodutibilidade dentro do espaço alvo definido. No entanto, por design, o EPIKOL captura apenas mecanismos de resistência epigenética e não cobre contribuidores não epigenéticos para a quimiorresistência. A escolha da biblioteca, portanto, deve ser guiada por experimentos anteriores e pela questão biológica específica. Os usuários dessas bibliotecas devem estar cientes das limitações das bibliotecas focadas e devem interpretar os resultados dentro do escopo da biblioteca.

Uma grande barreira na triagem CRISPR de modelos quimioresistentes é o surgimento do fenótipo MDR impulsionado pela regulação de alta do transportador^{ABC 9,10}. Diferentes transportadores ABC mediam o vazamento de diferentes substratos. Uma vez gerada uma linhagem celular resistente a medicamentos, é importante avaliar se a resistência se estende a outros agentes quimioterapêuticos. A resistência à puromicina é causada principalmente pela superexpressão de ABCB1, e isso afeta o processo de seleção das abordagens de triagem CRISPR agrupadas, já que a maioria dessas bibliotecas carrega cassetes de seleção de puromicina para enriquecimento das células transduzidas. Aqui, utilizamos verapamil, um inibidor de ABCB1 de primeira geração, para facilitar o acúmulo intracelular de puromicina e eliminar seletivamente as células resistentes não transduzidas que, de outra forma, escapariam da seleção devido ao effluente de fármacos mediado por ABCB1. Como o verapamil se liga reversivelmente ao ABCB1, a função do ABCB1 é restaurada em poucas horas após a remoção do verapamil. Portanto, o verapamil não confere uma vulnerabilidade adicional às células resistentes durante a fase subsequente de tratamento medicamentoso da triagem. No entanto, várias limitações do verapamil devem ser reconhecidas. Como o verapamil é um inibidor dos canais de cálcio e outros transportadores, ele pode influenciar a fisiologia celular além da inibição de^{ABCB1 10}. Além disso, a concentração efetiva de verapamilo varia entre linhas celulares e modelos MDR, dependendo do nível de expressão de ABCB1 e da atividade de outros transportadores. Portanto, a concentração de verapamil deve ser otimizada para cada linhagem celular, e uma nova geração de inibidores de ABCB1 mais específicos para ABCB1 pode ser considerada caso efeitos fora do alvo sejam uma preocupação. Como outro passo crítico, a titeração viral deve ser realizada na própria célula resistente, e não nas contrapartes parentais, já que a infectividade e a seletividade frequentemente diferem para células resistentes.

Outra consideração importante é determinar a duração adequada do rastreio, já que células quimioresistentes frequentemente crescem mais lentamente do que seus equivalentes^{parentais 26}. Para levar em conta essa diferença, utilizamos cálculos de nível de duplicação populacional (seção 6 do Protocolo) para avaliar quando os grupos controle e de tratamento atingiram o limiar desejado de PDL. Portanto, as triagens podem ser interrompidas em dias diferentes, permitindo duplicações populacionais comparáveis e possibilitando uma interpretação mais segura dos efeitos do sgRNA no grupo tratado.

As PCRs de preparação de bibliotecas são consideravelmente importantes para a precisão da identificação de acertos a jusante. O viés introduzido por baixa entrada de gDNA e o aumento dos ciclos de PCR pode levar à amplificação de certas sequências de sgRNA, causando enriquecimentos ou depleções falsamente positivas. Para mitigar isso, recomendamos usar a maior quantidade possível de gDNA, seguir os números do ciclo de PCR oferecidos por este protocolo e executar reações paralelas para o pool antes do sequenciamento. Quando possível, a cobertura da biblioteca não deve ficar abaixo dos limites recomendados (>300× de cobertura) para garantir a detecção confiável de sgRNAs esgotados, em vez de uma queda estocástica de sgRNAs de baixa abundância devido à baixa cobertura.

Após o sequenciamento, utilizamos o framework de análise MAGeCK e realizamos várias análises de controle de qualidade e interpretação de dados a^{jusante 24}. Primeiro, a análise de componentes principais (PCA) foi usada para avaliar a distribuição e reprodutibilidade de réplicas biológicas (dados não mostrados, resultado do MAGeCK). O agrupamento replicado na PCA é esperado dentro de cada braço; No entanto, maior variabilidade no braço tratado pelo medicamento é uma característica comum dos testes de quimiorresistência, pois o medicamento pode induzir mudanças estocásticas. Se os controles positivo e negativo se comportarem como esperado em cada braço, essa variabilidade não impede a identificação de acertos verdadeiros-positivos. Em seguida, foi aplicada a normalização por milhão (RPM) das contagens de sgRNA nos pontos de tempo inicial e final para avaliar se os sgRNAs que visavam genes essenciais estavam esgotados conforme esperado¹⁴. Subsequentemente, a normalização mediana foi usada para agregar efeitos em nível de sgRNA, permitindo a identificação de depleções em nível^{gênico 24}. As pontuações de depleção em nível gênico foram visualizadas usando gráficos em cascata, que classificam genes dos mais esgotados aos mais enriquecidos. Alterações no número de cópias e poliploidia decorrentes da exposição prolongada a drogas podem confundir os resultados de triagem por meio de cortes Cas9 ineficientes ou^{excessivos de 27}. Embora o EPIKOL tenha como alvo reguladores da cromatina que geralmente não estão sujeitos a amplificações baseadas em Taxol, recomendamos avaliar o status de ploidia e as mudanças no número de cópias nas células resistentes antes da triagem. Se houver suspeita de alterações no número de cópias, ferramentas de correção computacional como CRISPRcleanR ou CERES podem ser aplicadas durante a análise MAGeCK.

Em triagens envolvendo dois braços experimentais, grupos controle e grupos de tratamento, são necessárias comparações diferentes para interpretar corretamente o desempenho da triagem e as dependências^{biológicas 17}. Comparações iniciais e finais são adequadas para avaliar o desempenho na tela, incluindo o comportamento esperado de genes essenciais e controles não direcionados. A comparação do ponto final do grupo controle (DMSO) com o ponto inicial permite a identificação dos genes necessários para o crescimento e aptidão das células resistentes na ausência de pressão do medicamento. Em contraste, a comparação de duas amostras finais, tratadas com medicamentos (Taxol) e controle (DMSO), revelam os genes específicos necessários para a resistência ao medicamento, e não para a aptidão geral. Deve-se notar que a comparação direta das duas amostras finais leva a uma distribuição desequilibrada dos controles genéticos essenciais, pois eles são necessários para a sobrevivência em ambos os grupos. Um método alternativo de visualização pode ser o gráfico de Vulcão, que mostra as variações de dobra log2 junto com valores de significância, permitindo a identificação de genes significativamente esgotados. Uma vez identificados os genes candidatos, as contagens normalizadas de sgRNAs e os gráficos de visualização são úteis para decidir os sgRNAs de melhor desempenho para ensaios de validação posteriores. Para a triagem do EPIKOL, recomendamos priorizar genes candidatos apoiados pelo comportamento concordante de pelo menos 6 de 10 sgRNAs, pois isso proporciona maior confiança nos efeitos em nível de gene.

Aqui, fornecemos um protocolo otimizado para realizar triagem de EPIKOL em linhagens celulares resistentes a Taxol que tenham aumento do ABCB1 e apresentado fenótipo MDR. Esse protocolo é amplamente aplicável a qualquer modelo quimiorresistente que apresente resistência cruzada à puromicina ou a outros antibióticos de seleção, permitindo assim a triagem CRISPR nessas células. Orientações práticas para os desafios técnicos mais comuns encontrados em todas as etapas do protocolo são fornecidas na Tabela Suplementar 1.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 mm plate	Corning	353003	Cultura celular
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Cultura celular
6 well plate	Corning	3506	Cultura celular
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	Para o Ensaio de Viabilidade Celular Luminoso CellTiter-Glo
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Para seleção
Ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Para o Ensaio de Viabilidade Celular Luminoso CellTiter-Glo
DMEM	Gibco		Cultura celular
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Cultura celular
FBS	Gibco	16140071	Cultura celular
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Cultura celular
HEK293T cells			Generosidade de Robert Weinberg (MIT, Boston, EUA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Cultura celular
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Cultura celular
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Cultura celular
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Para geração de linha celular estável Cas9
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone para clonagem gRNA
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	Para extração de DNA genômico
PBS	Gibco	10010023	Cultura celular
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cultura celular
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone para clonagem gRNA
Polyethylene glycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Para concentração de lentivírus
Polyethylenimine, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Para produção de lentivírus
Protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Para infecção por lentivírus
psPAX2	Addgene	# 12260	Para produção de lentivírus
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Para seleção
SUM159PT adherent cells			Generosidade de Robert Weinberg (MIT, Boston, EUA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Para geração e manutenção de células res
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054	Cultura celular
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Para seleção
VSV-G	Addgene	# 8454	Para produção de lentivírus