Análise Quantitativa 3D Não Destrutiva do Ligamento Periodontal Residual em Premolares Humanos Extraídos Usando Escaneamento Intraoral

Resumo

Este protocolo detalha um método digital 3D quantitativo e não destrutivo para avaliar ligamentos periodontal residuais em dentes extraídos. Utilizando escaneamento intraoral e software de engenharia reversa, estabelecemos um fluxo de trabalho ex vivo para avaliação periodontal, fornecendo uma base metodológica para comparar técnicas de extração em pesquisas pré-clínicas.

Resumo

O replantio intencional de dentes é um tratamento valioso para preservar dentes naturais com lesões endodônticas. Seu sucesso depende criticamente da viabilidade e integridade estrutural do ligamento periodontal residual (PDL). Métodos tradicionais de avaliação, como a seção histológica ou a fotografia bidimensional, são destrutivos ou limitados por erros de projeção. Para enfrentar essas limitações, este protocolo apresenta um método quantitativo e não destrutivo para avaliar PDL residual usando escaneamento intraoral de alta precisão. Os dentes extraídos foram corados para visualizar o tecido PDL e escaneados tridimensionalmente para gerar modelos digitais de alta fidelidade. Os dados foram analisados usando software de engenharia reversa, onde uma região de interesse foi definida e a cobertura residual de PDL foi quantificada por meio de limiar de cor. Essa abordagem calculou a área real de cobertura 3D do PDL sem comprometer a amostra biológica. Para avaliar a sensibilidade e utilidade desse protocolo, ele foi aplicado para comparar extrações minimamente invasivas (IM) usando periotomas com extrações convencionais de pinças. A análise digital revelou que o método MI preservou significativamente mais tecido PDL (61,99%) do que o método convencional (50,46%). Além disso, um ensaio subsequente de viabilidade celular corroborou os achados digitais, demonstrando atividade metabólica significativamente maior no grupo MI. Por fim, esse trabalho estabelece um fluxo de trabalho de prova de conceito para avaliação quantitativa ex vivo de PDL, fornecendo uma base metodológica robusta para comparar técnicas de extração em pesquisas pré-clínicas.

Introdução

A replantação intencional de dentes é cada vez mais reconhecida como uma modalidade viável de tratamento de último recurso para preservar dentes naturais que, de outra forma, seriam considerados sem esperança. É indicado para o manejo de lesões periapicais persistentes, perfurações inacessíveis do canal ou lesões reabsortivas extensas que não podem ser tratadas de forma não^{cirúrgica 1,2}. O procedimento padrão envolve a extração intencional do dente afetado, seguida de inspeção visual extraoral, intervenção terapêutica (incluindo resseção da raiz, preparação e obturação da raiz) e subsequente replantio no alvéolo^{original 1,2}.

A presença e integridade do tecido viável do ligamento periodontal (PDL) na superfície radicular são os fatores prognósticos mais críticos que determinam o padrão de cicatrização após a replantação do^{dente 3,4}. Uma barreira de PDL saudável e intacta é essencial para restabelecer a mobilidade fisiológica e prevenir complicações como reabsorção de reposição (anquilose) ou reabsorção inflamatória das raízes. No entanto, a avulsão de um dente a partir do alvéolo alveolar, seja traumática ou intencional, interfere inerentemente na ligação das fibras PDL e corta o suprimento^{neurovascular 5}. Consequentemente, a reconstrução biológica da PDL é crucial para a cicatrização periodontal dos dentes^{replantados 3}. Pesquisas extensas estabeleceram que maximizar a vitalidade e o volume do tecido residual de PDL durante procedimentos clínicos extraorais constitui um fator prognóstico crítico, e sua importância para a sobrevivência funcional a longo prazo dos dentes replantados está bem documentada na literatura ^6,7.

Considerando que a extração interfere inerentemente na fixação da PDL, a escolha da técnica de extração influencia diretamente o volume e a viabilidade do tecido residual de PDL restante na superfície radicular. A extração convencional com pinça aplica forças rotacionais e de tração que podem esmagar a PDL contra o osso alveolar ou arrancá-la por atrito. Para minimizar esse trauma, foram desenvolvidos métodos de extração minimamente invasivos (IM). Estudos anteriores relataram que os métodos de MI podem reduzir significativamente o trauma cirúrgico no periodônio dos dentes^afetados. Técnicas que utilizam periotomas para cortar a ligação do PDL, ou sistemas de extração vertical que evitam forças de alavanca, foram desenvolvidas para preservar o PDL residual na superfície radicular. Por exemplo, relatos de casos documentaram melhorias nos resultados clínicos na replantação intencional de dentes e na extrusão cirúrgica quando sistemas de MI foram^{empregados 9,10}. Esses achados sugerem que minimizar os traumas de extração pode melhorar a retenção do tecido residual de PDL na superfície radicular.

No entanto, apesar do consenso clínico sobre os benefícios da extração atraumática, há evidências diretas limitadas que quantifiquem a extensão do tecido residual de PDL preservado ao usar métodos de MI em comparação com técnicas convencionais. Essa lacuna de conhecimento decorre em grande parte das limitações das metodologias de avaliação disponíveis. Pesquisas existentes empregam predominantemente métodos subjetivos ou destrutivos de avaliação para avaliar o PDL residual na superfície radicular. A seção histológica permanece o padrão para a análise^{celular 11}, mas é inerentemente destrutiva, tornando a amostra inutilizável para estudos posteriores. Alternativamente, a coloração combinada com fotografia bidimensional (2D) tem sido usada para caracterizar o PDL¹² residual. No entanto, esses métodos são inadequados para quantificar o tecido residual de PDL de toda a superfície radicular. Uma fotografia 2D não pode mapear com precisão a área superficial de uma raiz tridimensional complexa e curva; inevitavelmente, isso introduz erros de projeção e distorção, levando a quantificações imprecisas.

Nos últimos anos, a tecnologia de escaneamento digital intraoral avançou significativamente, oferecendo alta precisão e aquisição rápida de dados. O método digital já foi empregado em estudos anteriores para medir impressões e alterações de tecidos moles, ou para avaliar o desgaste dos dentes em jovens¹³ anos. As aplicações até se expandiram para análises volumétricas complexas, como a avaliação do inchaço facial em cirurgia oral¹⁴. Essas tecnologias permitem a criação de modelos tridimensionais (3D) de alta fidelidade que podem ser manipulados e medidos em softwares de engenharia reversa, oferecendo uma solução potencial para análise quantitativa não destrutiva. No entanto, até o momento, a possível aplicação da varredura intraoral para avaliar o PDL residual dos dentes extraídos ainda não foi explorada.

O objetivo geral desse protocolo é estabelecer um fluxo de trabalho padronizado e não destrutivo que combine coloração biológica com varredura intraoral de alta precisão e engenharia reversa 3D. Ao criar modelos digitais de alta fidelidade com mapas de superfície texturizados por cor, esse método permite uma medição mais objetiva e reprodutível do PDL residual em toda a superfície da raiz. Este estudo aplica o fluxo de trabalho proposto para comparar a cobertura residual de PDL de duas técnicas de extração, a extração por MI assistida por periotoma versus a extração convencional com pinças, em pré-molares humanos. Hipotetiza-se que o método MI preserva uma proporção maior da cobertura residual de PDL do que o método convencional.

Importante destacar que esse protocolo é projetado estritamente como uma ferramenta de pesquisa ex vivo para ambientes laboratoriais ou pré-clínicos. O procedimento envolve tingimento, secagem ao ar, escaneamento digital e segmentação baseada em software, com um tempo total de análise incompatível com o uso intraoperatório durante replantação intencional, onde o tempo extraoral deve ser minimizado. Consequentemente, esse método é adequado para (i) comparar a eficácia preservadora de PDL de diferentes técnicas de extração sob condições controladas; (ii) treinamento e calibração em ambientes educacionais; e (iii) estudos de validação que vinculam métricas de cobertura de PDL digitais a resultados biológicos. Sua aplicabilidade a dentes com múltiplas raízes e anatomias complexas requer investigação adicional.

Protocolo

O protocolo de pesquisa foi realizado em conformidade com as diretrizes do Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da Universidade de Pequim (PKUSSIRB-202054022).

1. Seleção de pacientes e alocação de grupos

1. Selecionar pacientes que necessitam de extração de pré-molares para fins ortodônticos. Certifique-se de que os pré-molares atendam aos critérios de inclusão com a ausência de cárie ou doença periodontal.
2. Exclua pacientes com pressão alta, diabetes, histórico de tabagismo, ou aqueles com menos de 16 anos ou mais de 45 anos.
3. Alocar aleatoriamente os pré-molares em dois grupos experimentais: o Grupo Controle (extração convencional) e o Grupo Minimamente Invasivo (MI) (extração assistida por periotoma).
4. Atribuir aleatoriamente os dentes de cada grupo à via de análise de varredura 3D ou à via de validação biológica (CCK-8), garantindo que amostras independentes sejam usadas para cada método de avaliação.

2. Procedimentos de extração dentária

1. Realize todas as extrações sob anestesia local padrão.
2. Método A: Extração convencional (Grupo de controle)
   1. Realize a separação gengival ao redor do pescoço do dente.
   2. Posicione as pinças dentárias na área cervical da coroa dentária.
   3. Aplique forças rotacionais até que o dente fique afrouxado. Remova o dente do alvéolo usando a pinça.
3. Método B: Extração minimamente invasiva (grupo MI)
   1. Realize separação gengival.
      ATENÇÃO: Manuseie o periotoma com cuidado para evitar lesões nos tecidos moles ou quebra de instrumentos.
   2. Insira um periotomo no espaço PDL o mais fundo possível, alcançando pelo menos dois terços do comprimento da raiz.
   3. Corte circunferencialmente as fibras de PDL ao redor da raiz usando o periotoma. Solte o dente.
   4. Puxe verticalmente o dente para fora do alveolar usando uma pinça dentária.

3. Preparação e coloração da amostra

1. Imediatamente após a extração, enxágue os dentes com soro fisiológico estéril por 10 minutos para remover sangue e detritos.
   ATENÇÃO: O azul de toluidina é um produto químico perigoso. Use equipamentos de proteção individual adequados (luvas, óculos) ao manusear.
2. Tinga a superfície da raiz mergulhando o dente em uma solução azul de toluidina a 0,1% (preparada em soro soral tamponado com fosfato, PBS) por 40 minutos para visualizar o tecido PDL.
3. Enxágue com soro por 10 minutos para remover a solução de corante e seque suavemente a superfície com uma seringa tripla para remover o excesso de umidade.
   NOTA: Espera-se que a superfície da raiz apresente uma coloração azul-púrpura uniforme, enquanto o cemento exposto deve permanecer sem manchas, apresentando um bege claro.

4. 3D Digitalização

1. Calibre o scanner digital intraoral conforme as instruções do fabricante para garantir uma precisão de 0,02 mm.
2. Fixe a coroa do dente usando pinças hemostáticas para evitar obstruir a visão da superfície da raiz.
3. Varrer toda a superfície da raiz sob condições padrão de varredura. Realize uma varredura complementar da coroa para completar o modelo 3D.
4. Use o software proprietário do scanner para exportar os dados de varredura digital como um arquivo de objeto 3D (OBJ) de alta resolução e pacote de dados associado; a imagem da textura é salva em formato JPG.
   NOTA: A pré-visualização da varredura ao vivo deve exibir uma malha contínua e de alta densidade, sem furos ou artefatos na superfície da raiz. A imagem da textura deve distinguir claramente as regiões manchadas de azul da superfície da raiz não manchada.

5. 3D reconstrução de modelos e análise quantitativa

1. Pré-processamento de imagem
   1. Calibração de limiar
      1. Importe o mapa de texturas JPG para um software de edição de imagens. Converta a imagem para tons de cinza de 8 bits.
      2. Abra a ferramenta Limiar (Imagem > Ajustar > Limiar) e inspecione o histograma para registrar o valor mínimo em escala de cinza, capturando todos os pixels PDL manchados de azul. Determine o limiar mínimo em escala de cinza usando três observadores independentes.
   2. Importe o mapa de texturas JPG original para o software de edição de imagens. Navegue para selecionar > faixa de cores. Escolha o modo Sombras e defina Faixa para 65 e Tolerância para 20% (calibrado a partir dos dados do limiar 5.1.1).
      NOTA: Verifique se todas as regiões de PDL tingidas de azul estão totalmente selecionadas e que nenhuma superfície radicular não manchada está incluída.
   3. Copie as regiões selecionadas, manchadas de azul, e cole em uma nova camada branca para gerar uma máscara binária (azul para PDL, branco para raiz nua). Salve a imagem de textura processada para sobrescrever o arquivo JPG original.
2. Medição quantitativa
   1. Importar o modelo 3D processado para o software de engenharia reversa.
   2. Use Polígonos > Trim para definir a Região de Interesse (ROI) e excluir tecidos gengivais e periapical. Definir o limite superior do ROI a 2 mm abaixo da junção de esmalte de cimento (CEJ). Exclua o 3 mm apical da análise.
   3. Selecione as "regiões azuis aprimoradas" dentro do ROI. Após a seleção, o tecido residual de PDL é acentuado em vermelho.
   4. Navegue até Análise > Compute > Área de Cálculo para calcular a área total de superfície do ROI e a área de superfície das regiões azuis (PDL residual).
   5. Calcule a porcentagem de cobertura PDL usando a Equação 1:
      Cobertura de PDL (%) = (Área de PDL Residual/Área Total de ROI) x 100
3. Visualização
   1. Capture imagens das quatro superfícies radiculares (bucal, lingual, mesial e distal) perpendiculares ao eixo do dente para avaliação visual detalhada.

6. Validação biológica (ensaio de viabilidade celular)

NOTA: Esta seção descreve as etapas de validação realizadas em um subconjunto de amostras (n = 8 por grupo) para corroborar a análise digital.

1. Imediatamente após a extração, coloque os dentes em um tubo centrífugo estéril contendo meio de cultura pré-aquecido (37 °C).
2. Transporte as amostras para o laboratório em uma caixa de gelo a 4°C em até 1 hora. Use o Meio Eagle Modificado da Dulbecco, suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina para transporte da amostra e testes de viabilidade celular.
3. Enxágue os dentes com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) em um armário de biossegurança imediatamente após a chegada.
4. Raspe cuidadosamente o tecido PDL do terço médio da raiz (ROI é definido por sonda periodontal graduada) usando uma lâmina de bisturi estéril em temperatura ambiente dentro de 10 minutos após a chegada para maximizar a viabilidade celular.
5. Digere o tecido coletado com 0,25% de tripsina-EDTA por 30 minutos. Centrifuge a suspensão da célula a 120 × g por 5 minutos à temperatura ambiente (22–25 °C) para obter o precipitado contendo a célula.
   NOTA: Após a centrifugação, um pellet branco discernível deve se formar no fundo do tubo. Se não houver pellet, a amostra deve ser recentrifugada a 120 × g por mais 1 minuto.
6. Resuspenda o precipitado em uma mistura de solução de 600 μL Kit de Contagem de Células (CCK-8) e meio em uma proporção de 1:10 (v/v), preparada conforme as instruções do fabricante.
7. Aliquota essa suspensão a 200 μL por poço em uma placa de 96 poços (3 réplicas técnicas por amostra). Incube a placa a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO2 por 3 horas.
8. Transfira 50 μL do sobrenadante de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
9. Meça a absorvância (Densidade Óptica, OD) a 450 nm usando um leitor de microplaca. Registre os valores médios do OD para comparação estatística.
   ATENÇÃO: (i) Colete a solução de mancha de azul-toluidina e enxágue os resíduos como resíduos químicos perigosos e descarte-os conforme as diretrizes institucionais de segurança química; (ii) Tratar tecido de PDL, bisturis usados e resíduos de cultura celular como resíduos biológicos perigosos (Nível de Biossegurança 1) e autoclavá-los ou incinerá-los conforme protocolos institucionais de biossegurança; (iii) Descarte EPIs (luvas, pontas de pipeta, papel toalha) em recipientes designados para riscos biológicos.

7. Análise estatística e validação metodológica

1. Coleta de dados: Compile os dados quantitativos, incluindo a área total da superfície radicular (mm²), a área total colorida (mm²) da análise 3D, a porcentagem de cobertura de PDL (%) e os valores de OD do ensaio biológico.
2. Teste de normalidade: Avalie a distribuição de dados para normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk.
3. Comparação de grupos:
   1. Compare a cobertura de PDL e os valores de OD entre os grupos MI e Contrôle.
   2. Use um teste Student t sem pareamento para dados normalmente distribuídos ou um teste Mann-Whitney U para dados não distribuídos normalmente.
   3. Calcule o tamanho do efeito (d de Cohen) para determinar a magnitude da diferença.
4. Análise metodológica de robustez:
   1. Realize uma análise de regressão linear com "Área de Superfície Raiz" como variável independente e "Cobertura PDL" como variável dependente.
   2. Calcule o coeficiente de correlação de Pearson (r) para avaliar se o método de medição é tendencioso pelo tamanho do dente. Uma correlação não significativa (P > 0,05) indica robustez.
5. Análise de confiabilidade:
   1. Gerar gráficos de violino combinados com plots de caixa para visualizar a densidade de probabilidade e as características de distribuição dos dados.
   2. Compare o formato e a concentração da distribuição dos dados entre os grupos.
6. Testes de confiabilidade intra-observadores e inter-observadores:
   1. Selecione aleatoriamente 16 amostras do conjunto total de dados (8 por grupo) para avaliação de confiabilidade.
   2. Para repetibilidade intra-observador, repita o procedimento completo de segmentação e medição nas mesmas 16 amostras em intervalos de uma semana, totalizando dois ensaios.
   3. Para concordância entre observadores, forneça treinamento padronizado para dois observadores independentes adicionais sobre o protocolo de segmentação.
   4. Faça com que os três observadores realizem independentemente a definição de ROI, o limiar de cor e o cálculo de área nas mesmas 16 amostras.
   5. Calcule o Coeficiente de Correlação Intraclasse ICC(A,1) com intervalos de confiança de 95% para quantificar a concordância absoluta tanto para comparações intra-observadores quanto entre observadores. Valores do ICC >0,90 como excelentes, 0,75–0,90 como bons, 0,50–0,75 como moderados e <0,50 como ruins.
   6. Realize a análise de Bland-Altman para todas as comparações par a par. Calcule a diferença média (viés) e os limites de concordância de 95% (diferença média +/- 1,96 DS). Um resultado pareado não significativo no teste t pareado (P > 0,05) indica viés sistemático desprezível.
7. Software: Realize todas as análises estatísticas usando o software apropriado. Considere P < 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

O fluxo de trabalho experimental estabelecido neste estudo demonstrou com sucesso um protocolo não destrutivo para a avaliação quantitativa do PDL residual em dentes extraídos. Conforme descrito no desenho experimental (Figura 1), o protocolo integrou procedimentos de extração clínica com aquisição digital e validação biológica. A aplicação da varredura digital intraoral, seguida pela engenharia reversa 3D, permitiu a reconstrução precisa da superfície radic...

Discussão

O sucesso do replantio intencional depende fundamentalmente da preservação de células viáveis de PDL na superfície radicular. Embora os métodos de extração de MI tenham sido clinicamente defendidos para reduzir^{traumas 8,9,10}, quantificar seu benefício biológico no tecido residual de PDL tem permanecido um desafio devido à falta de ferramentas de avaliação objetiva. Este estudo estabeleceu um pro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
96-well plate	Servicbio	CCP-96H	Placa de múltiplos poços para cultura celular e medição de absorbância
Biosafety cabinet	Thermo Fisher Scientific	1300 Series4 A2	Gabinete de segurança biológica classe II para procedimentos estéreis
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) solution	MedChemExpress	HY-K0301	Reagente de ensaio de viabilidade celular
Centrifuge	Ustc Zonkia Zcientific Instruments	SC-3610	Centrífuga de laboratório para precipitação celular
Culture medium	Gibco	DMEM 11965	Meio basal para transporte e incubação celular
Dental forceps	Jinzhong Surgical instruments	K0F130/K0F100	Instrumento padrão de extração dentária
Fetal bovine serum	Anhui Kangyuan Biotechnology Co., Ltd	KY-01003S	Suplemento de soro bovino fetal para meio de cultura
Graduated periodontal probe	Jinzhong Surgical instruments	K6F040	Auxilia na raspagem do PDL do terço médio da raiz
Hemostatic forceps	Jinzhong Surgical instruments	J31130	Ferramenta cirúrgica usada para fixar o dente durante a digitalização
Humidified incubator	Thermo Fisher Scientific	Forma	Incubadora de cultura celular mantida a 37°C com 5% CO2
Image editing software	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	Software para seleção de cores
Image editing software	Wayne Rasband, National Institutes of Health	ImageJ2 v2.14.0	Software para limite de cor
Intraoral digital scanner	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	Scanner óptico para aquisição de modelo digital 3D
Local anesthesia	Produits Dentaires Pierre Rolland	Primacaine Articaine	Agente anestésico dental (por exemplo, Articaine ou Lidocaína)
Microplate reader	Biotek	Elx808	Espectrofotômetro para medição de OD a 450 nm
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	Suplemento antibiótico para meio de cultura
Periotome	Carl Martin	LS529PT	Instrumento de extração minimamente invasivo
Reverse engineering software	Geomagic Inc.	Geomagic Studio 2013	Software de modelagem 3D para cálculo de área de superfície
Sterile centrifuge tube	Servicbio	EP-1500-J	Tubo plástico para coleta e processamento de amostras
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010	Buffer de lavagem para amostras biológicas
Sterile scalpel blade	Jiayuan Medical Devices	Sterile Scalpel Blade	Lâmina para raspagem do tecido PDL
Sterile sline	Servicbio	G4702-500ML	Solução salina para enxágue de dentes extraídos
Toluidine blue	General laboratory supplier	Toluidine blue (0.1% solution)	Corante biológico para visualização do ligamento periodontal
Trypsin	Gibco	25200056	Reagente enzimático para digestão de tecido