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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Em peixes-zebra, a mollugina em doses seguras (≤200 µg/mL) esteve associada à melhora da regeneração da cauda, acompanhada por alterações na expressão gênica relacionada à apoptose, marcadores inflamatórios, atividade de enzimas antioxidantes e marcadores associados a macrófagos. Esses achados sugerem que a mollugina pode modular a resposta local à lesão durante a regeneração da cauda em peixes-zebra.
A molugina é um composto natural de naftoquinona com atividades anti-inflamatória e antioxidante descritas, embora seu papel na regeneração tecidual permaneça parcialmente compreendido. Neste estudo, utilizou-se um modelo de amputação da cauda de peixe-zebra para investigar os efeitos da molugina na reparação de feridas e nas respostas imunes e redox associadas. Embriões de peixe-zebra foram tratados com molugina nas concentrações de 22 µg/mL, 66 µg/mL e 200 µg/mL após lesão da cauda. O tratamento com molugina foi associado a uma recuperação melhorada da área da cauda de maneira dose-dependente, acompanhada pela redução da expressão de genes relacionados à apoptose e supressão de mediadores pró-inflamatórios, incluindo IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 e NF-κB1. Paralelamente, a molugina restaurou as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase. A imagem de fluorescência em peixes-zebra Tg(mpeg1:GFP) mostrou um efeito tempo-dependente da molugina sobre o acúmulo de macrófagos, sem redução aparente em 24 h, mas com diminuição da área positiva para macrófagos em 48 h nos grupos de 66 e 200 µg/mL em comparação com o grupo modelo lesionado. A análise de qRT-PCR mostrou ainda redução na expressão do marcador associado ao fenótipo M1 iNOS e aumento na expressão do marcador associado ao fenótipo M2 arginase-1. Em conjunto, esses achados sugerem que a molugina pode favorecer a regeneração da cauda em peixe-zebra em associação com alterações nos marcadores inflamatórios, de estresse oxidativo, relacionados à apoptose e associados a macrófagos. Estudos adicionais são necessários para definir os mecanismos celulares e moleculares subjacentes.
A regeneração tecidual é um processo fisiológico crítico pelo qual os organismos reparam danos, envolvendo uma regulação complexa da proliferação celular, diferenciação e manutenção da homeostase microambiental1. Entre os modelos de vertebrados, o peixe-zebra emergiu como um sistema fundamental para o estudo dos mecanismos de reparação de feridas, devido à sua notável capacidade regenerativa. Em particular, a regeneração da nadadeira caudal no peixe-zebra envolve a coordenação espaço-temporal de múltiplos eventos biológicos, incluindo a regulação da inflamação, o equilíbrio da resposta oxidativa e o controle da apoptose2,3. Nos últimos anos, as atividades farmacológicas de produtos naturais tornaram-se um ponto central na pesquisa em medicina regenerativa. Compostos naftoquinônicos, em particular, têm sido amplamente estudados devido aos seus diversos efeitos biológicos4. A molugina é um composto naftoquinônico derivado de plantas da família Rubiaceae e demonstrou atividades anti-inflamatória, antioxidante e reguladora do ciclo celular em estudos anteriores5,6. No entanto, seu mecanismo de ação na regeneração tecidual permanece pouco claro, e seu potencial papel na modulação do microambiente inflamatório e na polarização de células imunes exige investigação sistemática.
Após uma lesão, a inflamação é rapidamente ativada e influencia diretamente a reparação tecidual. Um sinalização inflamatória moderada é essencial para a remoção do tecido necrótico e para a iniciação do programa de regeneração, enquanto uma cascata inflamatória excessiva pode agravar o estresse oxidativo e levar à fibrose tecidual7. As citocinas, incluindo IL-1β, IL-6 e TNF-α, aumentam acentuadamente após a lesão e são acompanhadas pela ativação da sinalização TLR4/NF-κB, resultando em respostas inflamatórias amplificadas e remodelação tecidual8,9. A molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e o ligante quimioquínico CC 2 (CCL-2) também estão elevados após a lesão e estão associados ao recrutamento aumentado de neutrófilos e macrófagos para os tecidos danificados10. Notavelmente, o desequilíbrio oxidativo agrava ainda mais os danos teciduais, e atividades reduzidas da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT) indicam capacidade antioxidante prejudicada2,11.
Os macrófagos atuam como reguladores-chave do microambiente inflamatório, e sua polarização funcional impacta significativamente o processo regenerativo12. Os macrófagos M1 estão associados à expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e à atividade inflamatória, enquanto os macrófagos M2 expressam a arginase-1 (Arg-1) e estão ligados à reparação tecidual13,14. A polarização dos macrófagos é influenciada por citocinas locais, estresse oxidativo e sinais relacionados à apoptose. Nesse contexto, a rede reguladora da apoptose composta por proteínas da família da linfoma de células B-2 (Bcl-2) e caspase-3 não apenas afeta a sobrevivência celular no local da lesão, mas também modula indiretamente o comportamento quimiotático das células imunes por meio da liberação de sinais "find-me"15. Portanto, explorar estratégias de intervenção que modulam simultaneamente as respostas inflamatórias, o estresse oxidativo e a polarização dos macrófagos pode ajudar a melhorar a regeneração tecidual.
Compostos naturais demonstraram vantagens únicas na modulação desses processos biológicos. Estudos recentes confirmaram que substâncias naftoquinônicas, devido às suas estruturas conjugadas, possuem potencial para eliminar radicais livres; seu núcleo benzoquinônico pode afetar vias de sinalização sensíveis à oxirredução por meio de mecanismos de transferência de elétrons16,17. Relatou-se que a mollagina atenua respostas inflamatórias na colite induzida por DSS, com redução na produção de citocinas pró-inflamatórias e diminuição da expressão de TLR4 nos tecidos colônicos18. A mollagina também demonstrou inibir a sinalização TAK1-NF-κB/MAPK e ativar a via Keap1-Nrf2 em macrófagos6; no entanto, seu impacto na polarização de macrófagos e na rede apoptose–antiapoptose em um modelo de ferida in vivo ainda não foi elucidado. Além disso, os efeitos biológicos dependentes da dose da mollagina e seu papel regulador durante o processo de regeneração permanecem por ser sistematicamente esclarecidos.
O presente estudo investigou os efeitos da Mollugina em um modelo de regeneração da nadadeira caudal de peixe-zebra. Especificamente, analisamos o crescimento da cauda, a expressão gênica relacionada à apoptose, a sinalização inflamatória, a atividade de enzimas antioxidantes e as respostas associadas a macrófagos após o tratamento com Mollugina. Nossos resultados sugerem que o tratamento com Mollugina está associado à melhoria da regeneração da cauda e a alterações em múltiplos marcadores de resposta à lesão neste modelo de peixe-zebra.
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Todos os procedimentos com animais seguiram o Guia do Conselho Nacional de Pesquisas para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Geral de Fuzhou (número de aprovação 202408002).
Reprodução de peixe-zebra
Todos os experimentos foram realizados utilizando peixe-zebra (Danio rerio) mantidos em condições laboratoriais padrão. Peixes-zebra selvagens da linhagem AB foram utilizados para o ensaio de toxicidade e para o ensaio de regeneração por amputação da cauda. Peixes-zebra Tg(mpeg1:GFP) foram utilizados especificamente para a imagem de macrófagos. Tg(mpeg1:GFP) é uma linhagem repórter de macrófagos na qual a expressão de GFP marca células da linhagem de macrófagos sob o controle do promotor mpeg1, expresso em macrófagos. Todas as linhagens de peixe-zebra foram mantidas a 28,5 °C sob um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h. Apenas embriões morfologicamente normais foram utilizados nos experimentos. Em todos os experimentos, os embriões foram incubados em solução-tampão de Danieau, preparada com reagentes de grau analítico, incluindo NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O e HEPES ajustado a pH 7,2.
Preparação do fármaco e determinação de segurança
Mollugin (40 mg) foi dissolvido em 1 mL de DMSO para gerar uma solução estoque de 40 mg/mL. A solução estoque foi inicialmente diluída 1:10 em tampão Danieau, obtendo-se 4 mg/mL, seguida de nova diluição para 22, 66 e 200 µg/mL para os tratamentos. Para determinar a concentração segura máxima, embriões da linhagem AB com 48 horas pós-fecundação (hpf) tiveram as corionas removidas e foram desinfetados com hipoclorito de sódio a 0,003% antes de serem distribuídos em placas de 6 poços (n=20, três poços por grupo). Os embriões foram incubados com Mollugin (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL ou 360 µg/mL) em meio E3 durante 48 h a 28,5 °C. A sobrevivência foi monitorada em microscópio estereoscópico, e a concentração mais alta com viabilidade de embriões ≥90% foi definida como o limite superior seguro para experimentos subsequentes.
Construção do modelo de amputação e regeneração da cauda
Para estudos de regeneração, embriões selvagens AB de 48 hpf foram anestesiados com tricaina a 0,03% preparada em meio para embriões e posicionados lateralmente sob um estereomicroscópio. Antes da amputação da cauda, os embriões foram mantidos em tampão de Danieau. Realizou-se uma amputação transversal padronizada da cauda com orientação estereomicroscópica. A linha de amputação foi posicionada imediatamente posterior à ponta da notocorda, utilizando-se a extremidade posterior da notocorda como marco anatômico. O dobramento da nadadeira caudal distal a esse marco foi removido com um microbisturi para garantir um nível de lesão consistente entre os espécimes. Imediatamente após a amputação (0 h), imagens foram adquiridas com um microscópio estereofluorescente. Após a amputação, os embriões foram transferidos para o meio de tratamento correspondente à base de E3 para o ensaio de regeneração. As soluções trabalhadoras de mollugina foram preparadas pela diluição da solução estoque de mollugina em meio E3 até concentrações finais de 22, 66 e 200 µg/mL. A mollugina foi administrada por exposição em banho durante o período de regeneração. Para igualar a exposição ao veículo, o grupo controle não lesionado e o grupo modelo lesionado foram mantidos em meio E3 contendo 0,5% de DMSO, correspondente à concentração final de DMSO no grupo com 200 µg/mL de mollugina. Os embriões foram mantidos em placas de 6 poços a 28,5 °C por 2 dias, com renovação diária do meio de tratamento correspondente à base de E3. A regeneração foi documentada por meio de imagens aos 24 e 48 h após a amputação, sob luz branca e configurações de fluorescência, para avaliar o crescimento da cauda e a distribuição de macrófagos. As medições das imagens foram realizadas no ImageJ.
Para a quantificação da regeneração, a área da cauda recuperada foi medida como uma área absoluta em µm2 e não foi normalizada em relação ao tamanho do embrião ou ao tamanho original da cauda. Para minimizar a variabilidade, todos os embriões foram amputados no mesmo marco anatômico imediatamente posterior à ponta da notocorda, e o mesmo marco foi utilizado para definir a região de medição entre os grupos. As regiões de interesse foram delineadas manualmente no ImageJ com base no contorno da cauda, e a análise foi realizada por um pesquisador cego em relação aos grupos de tratamento. Para a quantificação da área positiva para macrófagos, imagens de fluorescência GFP de embriões Tg(mpeg1:GFP) foram analisadas no ImageJ. A região de lesão/regeneração da cauda foi definida manualmente como a região de interesse, utilizando o mesmo marco anatômico aplicado na medição da área da cauda. As imagens foram convertidas para escala de cinza de 8 bits, e a fluorescência de fundo foi subtraída utilizando-se os mesmos parâmetros de correção de fundo para todas as imagens dentro do mesmo experimento. Um limiar fixo de fluorescência foi então aplicado uniformemente a todas as imagens dentro de cada experimento para identificar os sinais associados a macrófagos GFP-positivos. A área positiva para macrófagos foi calculada como a área GFP positiva acima do limiar dentro da ROI definida. As medições basearam-se na área positiva para fluorescência, e não na intensidade da fluorescência ou na contagem manual de células. Todas as análises de imagem foram realizadas por um pesquisador cego em relação aos grupos de tratamento.
Extração de RNA e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
Após a conclusão do ensaio de regeneração, embriões de cada condição experimental foram coletados e agrupados (pelo menos 20 embriões por grupo) para análise de RNA. Para cada condição, uma réplica biológica consistiu em uma amostra agrupada contendo pelo menos 20 embriões do mesmo grupo experimental. Três réplicas biológicas independentes, agrupadas, foram preparadas para cada condição e utilizadas para análise estatística. O RNA total foi isolado após homogeneização mecânica em um reagente extrator de RNA à base de fenol/guanidina. A qualidade e a concentração do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente por meio da medição das razões A260/A280. O cDNA foi sintetizado utilizando um kit comercial de transcrição reversa. A amplificação por PCR foi realizada com reagentes SYBR Green. As condições de ciclagem do qRT-PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e anelamento/extensão a 60 °C por 30 s. Foram mensurados os níveis de expressão de genes relacionados à apoptose (caspase-3 e Bcl-2), inflamação (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 e ICAM1) e fenótipo de macrófago (iNOS e arginase-1). A β-actina foi utilizada como gene de referência. As variações na expressão gênica foram determinadas pelo método 2−ΔΔCt. As informações sobre os primers estão listadas na Tabela 1.
Dosagens de atividade de SOD e CAT
Os níveis de SOD e CAT foram utilizados para avaliar o estado antioxidante após lesão na cauda. Após 48 h da amputação, peixes-zebra de cada grupo foram coletados e homogeneizados em PBS frio. Após centrifugação, os extratos clarificados foram utilizados para a medição de SOD e CAT com kits comerciais de dosagem de atividade. A atividade de SOD foi medida utilizando um kit de dosagem baseado em WST-1, conforme as instruções do fabricante. As amostras foram adicionadas em placas de ensaio de 96 poços juntamente com os padrões, e a absorbância foi lida em um leitor de microplacas. As atividades enzimáticas foram obtidas a partir das curvas padrão. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM) de pelo menos três experimentos independentes. Para o ensaio de toxicidade, cada experimento independente consistiu em um lote de embriões, com 20 embriões por grupo e poços em triplicata. Para a análise de imagem da regeneração e da imagem de macrófagos em peixes-zebra Tg(mpeg1:GFP), embriões individuais foram utilizados como unidades de medida, analisando-se 10 embriões por grupo. Para a análise de qRT-PCR, uma réplica biológica consistiu em uma amostra agrupada contendo pelo menos 20 embriões do mesmo grupo experimental, sendo analisadas três réplicas biológicas agrupadas e independentes por condição. Para a análise da atividade de SOD e CAT, cinco réplicas biológicas agrupadas e independentes foram analisadas por condição. As diferenças entre os grupos foram analisadas por ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey. As análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism. Diferenças com p < 0,05 foram consideradas significativas.
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Determinação da toxicidade e da dose segura
Para investigar os efeitos da mollugina, realizamos inicialmente testes de toxicidade. Os resultados indicaram que a mortalidade de embriões de peixe-zebra permaneceu baixa em concentrações de até 200 µg/mL, enquanto foi observado aumento da mortalidade em concentrações acima de 200 µg/mL (Tabela 2). Portanto, a dose segura mais alta foi determinada como sendo 200 µg/mL, enquanto as doses baixa e média foram estabelecidas em 22 e 66 µg/mL, ...
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Neste trabalho, examinamos os efeitos da Mollugin na regeneração da cauda de peixe-zebra. Dentro da faixa de doses testada, o tratamento com Mollugin esteve associado à melhora da recuperação da área da cauda após lesão, juntamente com alterações na expressão de genes relacionados à apoptose, marcadores inflamatórios, atividade de enzimas antioxidantes e marcadores associados a macrófagos.
O peixe-zebra, como um modelo proeminente para estudos de regeneração, exibe regeneração da cauda que env...
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Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
O presente estudo foi patrocinado pela Comissão de Saúde da Província de Fujian, China (Concessão nº 2022QNA085).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de tecidos de 6 poços | Corning | 3516 | |
| Kit de ensaio de catalase (CAT) | Instituto de Bioengenharia Nanjing Jiancheng | A007-1-1 | |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Leitor de microplacas CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Tampão de Danieau’s – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentração final no tampão de Danieau’s: 0,6 mM. |
| Tampão de Danieau’s – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentração final no tampão de Danieau’s: 5 mM; pH ajustado para 7,2. |
| Tampão de Danieau’s – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentração final no tampão de Danieau’s: 0,7 mM. |
| Tampão de Danieau’s – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentração final no tampão de Danieau’s: 0,4 mM. |
| Tampão de Danieau’s – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentração final no tampão de Danieau’s: 58 mM. |
| Dissulfóxido de dimetila (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Meio embrionário E3 | Preparado em laboratório (receita padrão) | N/A | Receita padrão. |
| Primeres gênero-específicos para qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actina) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, EUA | N/A | Versão 8,0. |
| Software ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde (NIH) | N/A | Versão 1,52n. |
| Molugina (≥98%, CLAE) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Composto ativo extraído de Rubia cordifolia, dissolvido em DMSO a 40 mg/mL e diluído para 22, 66 e 200 µg/mL no meio E3. |
| Homogeneizador de tecidos motorizado | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (ou equivalente) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7,4 |
| Sistema de PCR em tempo real (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Microcentrífuga refrigerada | SCILOGEX | CF1524R | |
| Pipetas livres de RNA | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Reagente de extração de RNA baseado em fenol/guanidina. |
| Tubos de microcentrífuga livres de RNase, 1,5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Microsscópio estereoscópico de fluorescência SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Microsscópio estereoscópico de fluorescência utilizado para imagens de larvas Tg(mpeg1:GFP) e quantificação da agregação de macrófagos. |
| Solução de hipoclorito de sódio | McLean, EUA | N/A | Solução de trabalho a 0,003%. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Microsscópio estereoscópico SZX16 | Olympus | SZX16 | Utilizado para observações morfológicas, avaliação de toxicidade e amputação da nadadeira caudal de larvas. |
| Kit de ensaio de superóxido dismutase total (T-SOD) | Instituto de Bioengenharia Nanjing Jiancheng | A001-3 | |
| Peixe-zebra transgênico Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (ou colônia própria) | N/A | Linhagem repórter de macrófagos. |
| Tricaina metanosulfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Solução de trabalho a 0,03%. |
| Água destilada ultrapura livre de DNase/RNase | Invitrogen | 10977023 | |
| Peixe-zebra selvagem, linhagem CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | Embriões fertilizados e larvas foram obtidos de estoque reprodutivo adulto. |
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