Avaliando a Rigidez Intrínseca da Aorta Murina Usando Miografia de Pinos: Um Quadro Translacional para Interrogar a Influência do Meio Circulante

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a rigidez intrínseca da parede aórtica (módulo elástico) por meio da miografia por pinos e abordagens para investigar o papel potencial do meio circulante na modulação da rigidez intrínseca da parede aórtica.

Resumo

O endurecimento da aorta é um fator de risco independente para doenças cardiovasculares e outras condições crônicas, incluindo declínio cognitivo, disfunção renal, comprometimento visual e redução da função glicose-insulina. In vivo, a rigidez aórtica é comumente avaliada usando técnicas baseadas em tonometria ou ultrassom que visualizam formas de onda arterial ou segmentos arteriais longitudinais, respectivamente. No entanto, medições in vivo são influenciadas por múltiplos fatores — como pressão arterial e entrada autonômica — que limitam a percepção mecanicista sobre como e por que a rigidez aórtica muda. Modelos murinos pré-clínicos, que permitem a aquisição direta de tecido aórtico, oferecem uma estrutura experimental única para avaliar tanto a rigidez aórtica in vivo quanto as propriedades mecânicas intrínsecas da aorta, livres de variáveis fisiológicas confusas. Esses modelos também permitem a interrogação direta do meio circulante (ou seja, o acúmulo de moléculas bioativas circulantes na corrente sanguínea) e seu papel na modulação da rigidez aórtica ao longo do espectro translacional pré-clínico a clínico. Alterações no meio circulante emergiram como uma base mecanicista chave do endurecimento da aorta em diversas condições — incluindo o envelhecimento primário e o envelhecimento prematuro associado ao câncer e terapias contra o câncer — tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos, além de mediar os efeitos das intervenções. Este artigo fornece um guia passo a passo para avaliar: (1) rigidez aórtica intrínseca (módulo elástico) em modelos murinos pré-clínicos, e (2) a contribuição do meio circulante (e seus constituintes) para o endurecimento aórtico utilizando bioamostras pré-clínicas e clínicas.

Introdução

O endurecimento da aorta é um fator de risco independente para doenças cardiovasculares e outras doenças^{crônicas 1,2}. A avaliação da rigidez aórtica in vivo pode carecer de resolução mecanicista, dado os processos fisiológicos integrativos que regulam a rigidez da aorta in vivo (por exemplo, pressão arterial e entrada autonômica⁾². Assim, a avaliação da rigidez intrínseca da aorta (ou seja, rigidez da parede aórtica/módulo elástico) ex vivo usando miografia por pinos permite a oportunidade de avaliação direta da rigidez aórtica, independentemente das variáveis fisiológicas de^{confusão 2}. Além disso, o uso de uma abordagem experimental ex vivo permite a interrogação de potenciais mecanismos moleculares que podem mediar o endurecimento da parede aórtica. Em contraste com outros métodos estabelecidos para avaliação da rigidez arterial ex vivo, como miografia por pressão, testes planares biaxiais e sistemas de miógrafo cíclico/pulsátil, que dependem da modelagem de sistemas fisiológicos (por exemplo, pressão intraluminal e hemodinâmica pulsátil), a miografia por pinos permite a avaliação direta da rigidez da parede aórtica via força isométrica, sob ambientes altamente controlados que não exigem modelagem in vivo.

O meio circulante (ou seja, o acúmulo de moléculas bioativas na corrente sanguínea), que entra em contato direto e frequente com a aorta, é comumente alterado em contextos de endurecimento aórtico (por exemplo, envelhecimento cronológico/primário e envelhecimento precoce, como em sobreviventes de câncer ou modelos de sobrevivência ao câncer)^3,4. Estabelecemos, usando bioamostras pré-clínicas (murinas) e clínicas (humanas) (plasma e soro), que o ambiente circulante contribui diretamente para o endurecimento aórtico tanto no^{envelhecimento primário 4} quanto no^{envelhecimento prematuro 3}. Além disso, estabelecemos um arcabouço experimental para determinar a(s) contribuição(s) direta(s) de constituintes selecionados dentro do meio circulante na mediação de seu efeito sobre o endurecimento ^{aórtico 3,5,6}. Aqui, delineamos e descrevemos as abordagens experimentais passo a passo para avaliar a rigidez intrínseca da aorta e a contribuição do meio circulante (e seus constituintes) para o endurecimento aórtico usando miografia por pinos, e fornecemos resultados representativos (com figuras e citações).

Protocolo

Machos do tipo selvagem C57BL/6J jovens adultos (4 meses de idade) foram usados durante todo o estudo. A hospedagem e os procedimentos envolvendo camundongos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais do Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado (IACUC).

1. Preparação de solução fisiológica fria (CPSS)

1. Prepare a solução de caldo de Ringer Ca²⁺ em 1 L de_{diH 2}O e armazene a 4 °C (Tabela 1).
2. Adicione 13,9 g de MOPS em 100 mL de_{diH 2}O para preparar a solução de estoque tampão MOPS e armazene a 4 °C.
3. Adicione 0,186 g de EDTA em 100 mL de_{diH 2}O para preparar a solução de estoque de EDTA, pH a 8,0 e armazene em temperatura ambiente.
4. Prepare soluções de stock CPSS preparadas acima e os produtos químicos listados abaixo (Tabela 2). Leve o volume total para 2 L com_{diH 2}O, pH para 7,4 a 34 °C e filtre o CPSS através de um filtro ≤ 0,45 μm. Distribua em tubos cônicos de 50 mL e armazene em -20 °C.

2. Dissecação da aorta do camundongo (Figura 1, Figura 2 e Figura 3)

1. Anestesie o camundongo com isoflurano inalado (2,5%) e coloque-o em posição dorsal reclinada (Figura 1A-C).
2. Uma vez que o camundongo esteja sob o plano cirúrgico de anestesia, colete sangue realizando uma punção cardíaca e complete o método de eutanásia secundária por toracotomia bilateral (Figura 1B–C).
3. Em seguida, remova cuidadosamente a aorta do arco aórtico para a aorta abdominal (Figuras 1D–F).
4. Coloque a aorta no CPSS e remova todo o tecido adiposo conjuntivo e perivascular usando as Tesouras Molas Vannas da Fine Science Tools (2,5 mm) (Figuras 2A–E).
5. Corte cuidadosamente três segmentos aórticos de 1 mm de largura na região torácica, logo abaixo do arco aórtico (Figura 3).
6. Coloque os dois segmentos aórticos de 1 mm em um tubo de 1,5 mL preenchido com CPSS e armazene em -80 °C até experimentos de miografia por pino de tensão-deformação. Armazene o^{terceiro segmento} adequadamente para medições histológicas subsequentes, conforme descrito abaixo.

3. Experimentos de miografia de pinos por tensão e deformação

NOTA: O Sistema de Miografia por Pinos será usado para realizar testes in vitro da rigidez aórtica (Figuras 4 e Figuras 5).

1. Primeiro, pré-aqueça as câmaras a 37 °C contendo aproximadamente 6 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) e descongele segmentos aórticos congelados de 1 mm.
   NOTA: Soluções fisiológicas alternativas de sal que sejam devidamente oxigenadas e controladas pelo pH também podem ser usadas, conforme descrito^{anteriormente 7}.
2. Uma vez obtido 37 °C, siga o protocolo de calibração do fabricante.
   1. Coloque a ponte de calibração no miógrafo para que a barra de balanço T não toque o pino conectado ao transdutor de força da câmara de miografia do pino.
   2. Certifique-se de que o pino do transdutor de força não esteja sujeito a nenhuma força. Quando a força relativa estiver estável, coloque um peso de 2 g na ponte em T para que a barra de equilíbrio em T agora aplique ~2 g de força no pino transdutor de força.
   3. Confirme que a leitura de força está entre 9,71–9,91 mN. Se sim, a calibração está concluída.
3. Determinar a leitura de referência do micrômetro e registrar o valor (ou seja, leitura inicial).
   1. Sob um escopo de dissecação, determine a distância micrométrica de base na qual os dois pinos paralelos estão quase se tocando (Figura 4).
      NOTA: Não permita que os dois pinos se toquem, pois isso pode causar danos ou perturbar o transdutor de força dentro da câmara do miógrafo.
4. Sob um microscópio de dissecação, coloque um segmento aórtico de 1 mm sobre os dois pinos e registre a largura do segmento usando micro calibres (Figura 6A). Depois, conecte a unidade da câmara à interface do sistema de miografia de pinos.
   NOTA: Aumente a largura do pino para exercer tensão no segmento da aorta enquanto monta a aorta para fixá-la nos dois pinos, o que impede que o segmento da aorta seja deslocado.
5. Se a tensão for aplicada na aorta e a câmara tiver sido conectada e montada no sistema de miografia de pinos, retorne o microposicionador à "posição inicial" conforme determinado no passo 3.3 acima.
6. Pré-estiramento completo da aorta.
   1. Estique a aorta aumentando a distância entre os dois pinos em 1 mm a partir da posição inicial do microposicionador (Figura 6B).
   2. Em seguida, relaxe a aorta retornando os pinos à leitura inicial do microposicionador. Realize essa sequência de esticar e relaxar três vezes (Figura 6A).
      NOTA: Após a última sequência de alongamento-relaxamento, o microposicionador deve voltar à leitura inicial.
7. Na interface do sistema de miografia por pinos, leitura de força zero para cada câmara em uso (Figura 7).
8. Inicie o experimento de tensão-deformação.
   1. Aumente a leitura da força para aproximadamente 1 mN ajustando o microposicionador (Figura 7).
   2. Após uma equilíbrio de força de ~1 mN (3–5 s), registre a nova leitura do microposicionador na força de ~1 mN e registre a primeira leitura da força.
   3. Aumente o microposicionador em 50 μm (ou seja, 5 cliques/hashes) e permita que o segmento da aorta seja esticado por 3 minutos. Após 3 minutos, recorde de força.
   4. Continue aumentando o microposicionador em 50 μm a cada 3 minutos e registre a força até atingir o "ponto de escoamento".
      NOTA: O ponto de cedência é a maior quantidade de força gerada antes que ocorram danos estruturais irreversíveis na aorta (ou seja, um rasgo ou ruptura na aorta, uma queda significativa na força).
   5. Confirme o ponto de escoamento esticando a aorta mais 50 μm após o ponto inicial de escoamento. Certifique-se de que o valor da força permaneça reduzido ou esteja ligeiramente acima do ponto de escoamento. Se o ponto de escoamento não for confirmado, continue com aumentos de 3 minutos até que o ponto de escoamento seja alcançado.
   6. Após a confirmação do ponto de rendimento, os experimentos são concluídos. Comece a análise agora.

4. Análise de experimentos de miografia de pinos por tensão-deformação para determinar o módulo elástico da região de colágeno e elastina

1. Usando as leituras de força obtidas no miógrafo, gera-se uma curva tensão-deformação usando as seguintes equações:
   Deformação (λ)=∆d/[d(i)]
   aqui d é o diâmetro e d_i é o diâmetro inicial e;
   Tensão (t)=λL/[2(HD)]
   onde L é a carga unidimensional, H é a espessura do meio intima e D é o comprimento do vaso. Uma vez geradas as curvas tensão-deformação, utilize-as para calcular as regiões de alta e baixa força conforme descrito^{anteriormente 8,9} (Figura 8).
2. Calcule a região de alta força (Região de Colágeno) (Figura 8B).
   1. Determine o módulo elástico da curva tensão-deformação à medida que a inclinação da regressão linear se ajusta aos quatro pontos finais da curva tensão-deformação. Para obter a medição de alta força a partir do gráfico tensão-deformação, siga os passos abaixo.:
      1. Clique com o botão direito em um ponto de dados no gráfico e selecione Selecionar dados > Adicionar > Insira nome da série: Módulo elástico.
      2. Valores da Série X: Selecione 4 pontos de dados dos valores de deformação. Esses devem ser os 3 pontos à medida que a força se aproxima do "ponto de cedência". Certifique-se de incluir o ponto de cedência como o quarto ponto.
      3. Valores da Série Y: Selecione 4 pontos de dados dos valores de tensão. Esses devem ser os 3 pontos à medida que a força se aproxima do "ponto de cedência". Certifique-se de incluir o ponto de cedência como o quarto ponto.
      4. Clique em OK e adicione Linha de Tendência > Equação de Exibição Linear > no gráfico > Exiba o valor R-quadrado no gráfico.
   2. A inclinação da equação é o módulo elástico de alta força. Certifique-se de que o valor R-quadrado seja ≥ 0,99 para que o módulo elástico seja preciso.
3. Calcule a região de baixa força (região da elastina) (Figura 8C)
   1. Determine os limites da região dominante em elastina (região de baixa força onde a curvatura é ~0) da curva tensão-deformação ajustando uma equação polinomial de sétima ordem aos dados (r² > 0,99) e então calculando as raízes da equação. Considere a primeira raiz, a fronteira entre a região de força muito baixa e a região da elastina, e a segunda raiz, a fronteira entre a região da elastina e o início do engajamento das fibras de colágeno.
   2. Depois, determine-se o módulo de elasticidade da região de baixa força como a inclinação de uma equação linear ajustada aos dados tensão-deformação entre as duas^{raízes 8,9}. Para obter isso:
      1. Faça uma planilha que contenha colunas conforme ilustrado na Tabela Suplementar 1.
      2. Transforme isso em um documento "txt" e abra no script R do software de código R "Modulus of Elasticity".
      3. Para usar os dados, verifique as inclinações normais – o grafo da^3ª derivada na saída R deve ter a forma de "M".
      4. Na aba de resultados , o valor numérico sob a coluna Inclinação é o módulo de elasticidade. Certifique-se de que o valor R-quadrado seja maior ou igual a 0,99 para que o módulo de elasticidade seja preciso.
      5. Para obter esse valor na planilha, selecione os valores de deformação (e seus valores correspondentes de tensão) entre a primeira e a segunda derivada obtidas na aba de resultados do código R .
      6. Siga os passos descritos na etapa 4.2 para obter a equação e o valor de R² no gráfico da planilha.

5. Avaliação do diâmetro da aorta e espessura da parede

1. Coloque o último segmento aórtico de 1 mm em um criomóleo preenchido com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Oriente o anel com o lúmen plano e centralizado na base do molde, com o eixo luminal perpendicular à superfície de corte para obter seções transversais.
2. Prepare um recipiente de 2-metilbutano resfriado em nitrogênio líquido e depois submerga o criomold em 2-metilbutano frio até que o OCT fique branco opaco.
3. Armazene o criomold a -80 °C até o corte. Ajuste a temperatura do criostato para a temperatura de corte OCT apropriada (≈-20 °C) e então monte o bloco congelado no suporte da amostra.
4. Uma vez fixado ao suporte, apare cuidadosamente o bloco mantendo a espessura em 7 μm até que apareça tecido.
5. Rotule uma lâmina com o ID do camundongo e corte 4–5 seções transversais do tecido aórtico com 7 μm de espessura.
6. Para transferir o tecido fatiado para as lâminas, coloque todas as seções cortadas no estágio do criostato (também chamado de estágio faca) antes de colocar a lâmina rotulada diretamente sobre elas.
7. Após a transferência concluída, a secagem ao ar desliza.
8. Seções de imagem sob ampliação de 10x em um microscópio de campo claro. Salve as imagens em formato JPG/TIFF com uma barra de escala na parte inferior da imagem.
9. Para análise, abra o ImageJ, vá em Arquivo > Abrir e selecione a imagem aórtica.
10. Quando a imagem aórtica estiver ativa, dê zoom na barra de escala usando o ícone Control + + e então use a ferramenta de linha para medir o comprimento da barra de escala. Para preencher o resultado, pressione Control + M. A medição calculada sob o comprimento é a medida da barra da balança.
11. Para calibrar o software, vá em Analisar > Ajustar Escala. Para a Distância em pixels, insira o comprimento da linha calculada pelo ImageJ no passo 8. Para a distância conhecida , insira o comprimento real da barra da escala e, em unidades, escreva a unidade de medida (μm, mm, cm, etc).
12. Marque a caixa global para calibrar automaticamente todas as imagens subsequentes. Note se a barra de escala nas outras imagens é diferente, ou se o ImageJ é fechado; se sim, é necessário recalibrar.
13. Para espessura da parede, use a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha perpendicular da borda luminal até a borda externa adventícia. Pressione Control + M para preencher automaticamente o comprimento na aba de resultados .
14. Repita o passo 5.13 para realizar medições em 6 posições espaçadas uniformemente ao redor da circunferência da aorta e registre cada valor.
15. Para calcular a espessura média por aorta de camundongo, faça a média de todas as espessuras obtidas de 4–5 amostras do mesmo camundongo.
16. Para medir o diâmetro luminal, selecione a ferramenta polígono e trace a borda luminal interna no sentido horário. Registre o perímetro (μm) pressionando Control + M.
17. Repita o traçado no sentido anti-horário, começando em outro ponto. Certifique-se de que os dois valores de circunferência estejam próximos um do outro e faça a média para esse anel aórtico.
18. Repita o passo 5.16 para as 4–5 amostras aórticas do mesmo camundongo e faça a média de todos os valores de circunferência.
19. Para calcular o diâmetro, use a equação: Diâmetro (μm) = Perímetro/3,14.

6. Módulo elástico aórtico mediado pelo meio circulante

NOTA: Para determinar se fatores circulantes ou compostos específicos alteram a rigidez intrínseca da aorta, anéis aórticos torácicos de camundongos naïfes de intervenção podem ser incubados ex vivo sob condições padrão definidas de cultura (37 °C, 5% CO₂, 20%_O2, umidificado) (Figura 9).

1. Dissecar a aorta torácica e cortar dois segmentos de anel de 1 mm por condição. Remova todo o tecido adiposo perivascular.
2. Em uma placa de 96 poços, incube os anéis aórticos em meio padrão, que consiste em DMEM + 1% de penicilina-estreptomicina.
3. Adicione tratamento experimental à mídia. Para plasma ou soro (plasma/soro não tratado pode ser usado para isso), use 10% do volume total do meio. Use plasma ou soro pré-clínico e clínico^{(humano) 3,4,6} (Figura 9).
4. Para estabelecer o papel causal de um fator circulante que demonstrou ser diferente entre os grupos de estudo, repita a exposição plasma/sérico enquanto corrige simultaneamente a diferença observada na concentração entre grupos (ou seja, normaliza a concentração do fator de interesse), determine o efeito direto do fator de interesse em uma concentração que represente a diferença média entre grupos, ou bloquear a sinalização do fator que se acredita ser responsável por mediar o efeito do meio circulante.
   NOTA: As duas últimas abordagens já foram executadas, respectivamente, com Trimetilamina-N-Óxido (TMAO⁾⁵ e com bloqueio do receptor para produtos finais avançados^{de glicação 3}.
5. Por elucidar o papel do excesso de estresse oxidativo relacionado ao superóxido ou das mitocôndrias
   estresse oxidativo específico relacionado ao superóxido neste sistema modelo, utilizam as seguintes concentrações respectivas ao incubar anéis da aorta: TEMPOL: 1 μM ^5,10 e MitoQ: 1 μM⁶.
6. Após 48–72 horas de incubação, carregue os anéis aórticos no miógrafo de pinos e siga os passos descritos acima.

Resultados

Endurecimento aórtico relacionado à idade

Para rigidez mecânica intrínseca, a força correspondente a cada intervalo de alongamento é registrada e usada nos cálculos. Nos cálculos discutidos anteriormente, gera-se curvas esforço-deformação e calcula-se o módulo elástico para a 1) região do colágeno e/ou 2) região de elastina dessas curvas, conforme descrito acima e originalmente mostrado por Gioscia-Ryan et^{al 9}. O módul...

Discussão

O uso da miografia por pinos para avaliação da rigidez intrínseca aórtica ex vivo oferece a oportunidade de avaliar a rigidez intrínseca aórtica independentemente de variáveis fisiológicas in vivo potencialmente confundidas, como pressão arterial e entrada autônoma². Além disso, essa abordagem experimental ex vivo oferece a oportunidade de rastrear potenciais mecanismos moleculares que podem estar na base das diferenças na rigidez intrín...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-methylbutane	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucose (Dextrose)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Monosodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (Na salt)	Sigma-Aldrich	M9024
Multi Pin Myography System	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE antibody	R&D System	AF1145
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT compound	Sakura	4583
Trimethylamine N-oxide (TMAO)	Sigma Aldrich	317594