Este artigo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível de bioinformática e de célula única para explorar associações entre a expressão da mieloperoxidase (MPO) e características imunes/mieloides no câncer de mama. Como as análises são baseadas em conjuntos de dados públicos e métodos in silico, os resultados são interpretados como exploratórios e geradores de hipóteses.
Artigo de investigação
Associação da Expressão de MPO com o Microambiente Imune no Câncer de Mama: Perspectivas de Análises Bioinformáticas e de Célula Única
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer de mama continua sendo uma causa importante de mortalidade relacionada ao câncer, e fluxos de trabalho computacionais exploratórios podem ajudar a priorizar marcadores associados ao sistema imunológico para investigação adicional. Aqui, utilizamos dados transcriptômicos em larga escala do atlas do genoma do câncer de carcinoma invasivo de mama (TCGA-BRCA) e o conjunto de dados público de sequenciamento de célula única GSE161529 para examinar as associações entre a expressão da mieloperoxidase (MPO), desfechos clínicos, infiltração imune, metilação, anotações de reguladores upstream, padrões de expressão em nível de célula única, resultados de sensibilidade à supressão virtual, recuperação de interações droga-gene e anotações de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET). A expressão de MPO foi menor nos tecidos de câncer de mama do que nos tecidos não tumorais adjacentes. Expressão mais elevada de MPO esteve associada a um intervalo livre de progressão mais longo, enquanto suas associações com sobrevida global e sobrevida específica para a doença não foram estatisticamente significativas. A análise da curva característica de operação do receptor (ROC) sugeriu separação entre tumor e tecido normal no conjunto de dados público analisado, mas isso não deve ser interpretado como validação diagnóstica clínica. Análises de desconvolução imune e enriquecimento indicaram que a expressão de MPO acompanhou principalmente características transcricionais relacionadas ao sistema imune e a linhagem mieloide, em vez de estabelecer uma regulação intrínseca tumoral do microambiente imune. Em resolução de célula única, o sinal de MPO foi escasso, com apenas 85 células positivas para MPO detectadas antes da expansão baseada em vizinhança de k-vizinhos mais próximos (KNN). O sinal detectável de MPO e os escores associados a MPO foram interpretados com cautela, pois podem ser influenciados pela baixa expressão, incerteza na anotação de tipos celulares, eventos de dropout, dupletos ou RNA ambiental. In silico o knockdown virtual sugeriu alterações transcricionais candidatas relacionadas a imunidade e inflamação, mas esses resultados foram considerados exploratórios e requerem validação. A recuperação de interações droga-gene baseada no banco de dados de interações droga-gene (DGIdb) e a anotação ADMET foram utilizadas apenas como anotações químicas preliminares e não foram interpretadas como evidência terapêutica. No geral, este estudo fornece um fluxo de trabalho in silico reprodutível para gerar hipóteses sobre características imunes/mieloides associadas à MPO no câncer de mama, as quais requerem validação em coortes externas e confirmação experimental.
Introdução
O câncer de mama é uma neoplasia imunorrelacionada altamente heterogênea1. A progressão da doença, o risco de recorrência e metástase e a resposta ao tratamento estão estreitamente associados à composição e ao estado funcional do microambiente imunológico tumoral (TIME)2. Apesar da otimização contínua das estratégias de tratamento abrangentes, alguns pacientes ainda apresentam progressão ou recorrência, destacando a necessidade urgente de identificar biomarcadores moleculares que caracterizem o estado do TIME e apoiem a estratificação de risco, além de elucidar seus mecanismos subjacentes.
A mieloperoxidase (MPO) é uma peroxidase contendo heme predominantemente expressa em neutrófilos e, em menor grau, em monócitos e macrófagos. Por meio da geração de ácido hipocloroso e outros oxidantes reativos, a MPO contribui para a defesa antimicrobiana, mas também pode promover lesão tecidual oxidativa e inflamação crônica. No câncer, a significância biológica da MPO parece ser dependente do contexto3. Por um lado, o estresse oxidativo mediado pela MPO tem sido implicado na carcinogênese e na progressão tumoral por meio de danos ao DNA, oxidação de lipídios e proteínas, sinalização inflamatória e remodelação do microambiente tumoral4,5,6. Por outro lado, a infiltração de células inatas imunes ou mieloides positivas para MPO tem sido associada a um prognóstico favorável ou à atividade imune antitumoral em certos contextos tumorais7,8,9. Essas descobertas aparentemente conflitantes sugerem que a significância clínica e biológica da MPO pode depender do tipo de tumor, estágio da doença, fonte celular da MPO e da composição imune do microambiente tumoral. No entanto, o padrão de expressão e a relevância prognóstica da MPO no câncer de mama, particularmente no nível de única célula, ainda não foram completamente caracterizados.
O microambiente imunológico tumoral (TIME) contém compartimentos heterogêneos de linhagem mieloide, linfóide, estromal e epitelial10. A MPO está classicamente associada aos neutrófilos e a outras células da linhagem mieloide, e sinais relacionados à MPO em perfis tumorais em massa podem, portanto, refletir a composição de células imunes, e não a atividade intrínseca das células tumorais10. No câncer de mama, a distribuição do sinal de MPO em conjuntos de dados em massa e de célula única, sua associação com estimativas de infiltração imune e os limites de reprodutibilidade de análises computacionais subsequentes permanecem insuficientemente caracterizados. Este estudo, portanto, trata a MPO como um marcador associado ao sistema imunológico para o desenvolvimento de fluxos de trabalho exploratórios, e não como um regulador causal comprovado do TIME ou um alvo terapêutico validado. Em comparação com análises de expressão diferencial em uma única coorte ou estimativas de infiltração imune em uma única plataforma, um fluxo de trabalho integrado que combine transcriptômica em massa, desconvolução imune, anotação de metilação, mapeamento de célula única e perturbação computacional pode fornecer uma visão exploratória mais ampla do contexto imune associado ao gene. Essa abordagem é útil para priorizar marcadores candidatos e gerar hipóteses testáveis, especialmente quando conjuntos de dados experimentais ainda não estão disponíveis. No entanto, essa integração computacional não pode, por si só, determinar a origem celular, causalidade, atividade farmacológica ou utilidade clínica. Com o avanço de grandes coortes públicas de câncer e tecnologias transcriptômicas de célula única, abordagens de bioinformática podem ser utilizadas para explorar associações entre expressão gênica, desfechos clínicos, composição de células imunes e estados transcricionais tanto em nível populacional quanto em nível de célula única11. Métodos de perturbação computacional baseados em redes regulatórias gênicas de célula única podem ainda fornecer informações geradoras de hipóteses sobre a sensibilidade transcricional associada ao gene12,13. Portanto, este estudo teve como objetivo caracterizar o padrão de expressão, associação com sobrevida, contexto imune/mieloide, perfil de metilação, distribuição em célula única e perfil exploratório de perturbação computacional da MPO no câncer de mama. O fluxo de trabalho geral é apresentado na Figura 1.
Protocolo
Aquisição a partir do banco de dados TCGA
Os dados de sequenciamento de RNA e informações clínicas para a coorte de carcinoma invasivo de mama do TCGA (TCGA-BRCA) foram obtidos no portal Genomic Data Commons14. Os dados de RNA-seq do fluxo de trabalho STAR no formato de transcritos por milhão (TPM) foram extraídos juntamente com as anotações clínicas correspondentes. Amostras de RNA-seq sem informações clínicas correspondentes foram excluídas. Para as análises baseadas em expressão, os valores de TPM foram transformados como log2(TPM + 1). A expressão de MPO foi extraída utilizando o símbolo gênico MPO e o ID do gene Ensembl ENSG00000005381.8. Para análises que exigiam agrupamento em MPO-alto e MPO-baixo, apenas amostras tumorais do TCGA-BRCA foram incluídas, e amostras normais adjacentes foram excluídas da atribuição de grupo. As amostras tumorais foram divididas de acordo com o valor mediano da expressão de MPO transformada por log2(TPM + 1) entre as amostras tumorais do TCGA-BRCA. Amostras com expressão de MPO maior ou igual à mediana foram atribuídas ao grupo MPO-alto, enquanto amostras abaixo da mediana foram atribuídas ao grupo MPO-baixo. Essa estratégia de agrupamento baseada na mediana foi utilizada para análise de sobrevida, análise de expressão diferencial, análise de enriquecimento, agrupamento por metilação e comparações de enriquecimento de células imunes, salvo indicação em contrário. As características clínico-patológicas, incluindo sexo, idade, etnia, estágio patológico T, grau histológico, subtipo PAM50, estágio patológico, status do tumor e desfechos de sobrevida, incluindo sobrevida global (OS), intervalo livre de progressão (PFI) e sobrevida específica para a doença (DSS), foram analisadas utilizando o R versão 4.2.1.
Recuperação Pública de Imagens de Imunohistoquímica
Imagens representativas de imuno-histoquímica de mieloperoxidase (MPO) de tecido mamário normal adjacente e tecido de câncer de mama foram utilizadas como referências qualitativas em nível proteico. Essas imagens não foram incluídas nas análises morfométricas quantitativas ou estatísticas. As áreas delimitadas indicam regiões mostradas em maior aumento. As barras de escala indicam 100 µm nas imagens de 20× e 50 µm nas imagens de 40×.
Análise de correlação de expressão
O conjunto de dados TCGA-BRCA foi utilizado para examinar genes que variam conjuntamente com a expressão de MPO no câncer de mama. Foram calculados coeficientes de correlação de Pearson em todo o genoma entre MPO e genes codificadores de proteínas, e os 30 genes com maior correlação positiva e os 30 com maior correlação negativa foram selecionados para visualização. Para análises de correlação envolvendo múltiplos genes testados, os valores de p nominais foram ajustados utilizando o método da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg. A rede de interação proteína-proteína (PPI) associada a MPO foi construída utilizando a ferramenta de busca para recuperação de genes/proteínas interagentes (banco de dados STRING), mantendo-se para visualização pares de proteínas com escores de interação superiores a 0,4015.
Análise de enriquecimento funcional
Genes diferencialmente expressos (GDEs) foram identificados comparando os grupos de tumores MPO-alto e MPO-baixo do TCGA-BRCA utilizando limiares de |log2FC| > 1 e valor de p ajustado por Benjamini-Hochberg < 0,05. A análise de enriquecimento funcional dos GDEs foi realizada utilizando o pacote R clusterProfiler versão 4.4.4, incluindo análises de processo biológico, componente celular e função molecular da ontologia genética (GO) e análises de vias da Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas (KEGG)16,17,18,19,20. Os termos GO e KEGG enriquecidos foram considerados significativos quando o valor de p ajustado foi < 0,05.
A análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) foi realizada utilizando uma lista de genes pré-ordenada com base em estatísticas de expressão diferencial entre os grupos MPO-alto e MPO-baixo. A coleção de vias canônicas C2 do MSigDB c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, correspondente ao MSigDB v2022.1.Hs e contendo 3.050 conjuntos de genes, foi utilizada21,22. Os termos enriquecidos foram considerados significativos de acordo com valor-p ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05, valor-q FDR < 0,25 e |pontuação de enriquecimento normalizada| > 1. Quando aplicável, os escores Z para os termos significativamente enriquecidos foram calculados utilizando o pacote GOplot para visualização.
Análise do enriquecimento de células imunes em tumores
Os componentes imunes e estromais na coorte TCGA-BRCA foram avaliados utilizando o algoritmo ESTIMATE implementado no pacote R estimate versão 1.0.13. Dados de expressão transformados por log2(TPM + 1) foram utilizados como entrada, e os escores imune, estromal e ESTIMATE foram calculados para cada amostra tumoral. O TIMER/TIMER2.0 foi utilizado para avaliar as associações entre a expressão de MPO e os níveis estimados de infiltração das principais populações de células imunes na coorte TCGA-BRCA, incluindo células B, células T CD8+, células T CD4+, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas23,24,25. Os resultados baseados no TIMER foram interpretados como estimativas de infiltração imune derivadas do recurso online correspondente. Para a análise de enriquecimento de células imunes em 24 tipos de células imunes, a análise de enriquecimento de conjunto de genes de amostra única (ssGSEA) foi implementada utilizando o pacote R GSVA versão 1.46.026. A matriz de assinatura de células imunes LM22 utilizada para a desconvolução baseada no CIBERSORT de 22 tipos de células imunes está disponível na Tabela Suplementar 1. As correlações entre a expressão de MPO e os escores de enriquecimento de células imunes foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação de postos de Spearman. As diferenças nos escores de enriquecimento de células imunes entre os grupos de tumores definidos como MPO-alto e MPO-baixo com base na mediana foram comparadas utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon. Para análises envolvendo múltiplos tipos de células imunes, os valores de p foram ajustados utilizando o método de taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg.
Metilação do DNA do gene MPO
Padrões de metilação de DNA no locus MPO foram avaliados utilizando o MethSurv. Valores beta de metilação de CpG e associações com sobrevida para TCGA-BRCA foram obtidos a partir da plataforma MethSurv. Os sítios de CpG relacionados ao MPO selecionados foram visualizados, e suas associações com desfechos de sobrevida foram avaliadas utilizando as saídas de análise de sobrevida fornecidas pelo MethSurv27. Para análises envolvendo múltiplos sítios de CpG, os valores-p foram ajustados entre os sítios de CpG relacionados ao MPO testados utilizando o método de taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg. Essas análises de metilação foram interpretadas como anotações epigenéticas exploratórias.
Construção da rede PPI e análise de correlação de genes relacionados a neutrófilos
Para examinar a associação entre MPO e a biologia relacionada aos neutrófilos, foi realizada uma análise de rede sistemática. Um conjunto de genes composto por mediadores estabelecidos da ativação de neutrófilos e processos inflamatórios associados foi compilado a partir da literatura atual. A lista completa de genes relacionados aos neutrófilos está disponível na Tabela Suplementar 2. Os símbolos gênicos foram harmonizados com os símbolos oficiais, entradas duplicadas foram removidas e os genes disponíveis foram intersectados com a matriz de expressão TCGA-BRCA antes da análise STRING/PPI, priorização de genes centrais (hub) e análise de correlação entre MPO e genes centrais. A rede de interação proteína-proteína (PPI) entre esses genes foi construída utilizando o banco de dados STRING (versão 11.5), com um limiar médio de pontuação de interação de confiança (>0,40). Os genes centrais dessa rede foram priorizados algoritmicamente com base na centralidade de grau, que quantifica o número de interações diretas por nó. Os 20 principais genes com as pontuações de grau mais altas foram selecionados para análise de correlação subsequente.
Posteriormente, os perfis de expressão desses genes centrais e da MPO foram extraídos do conjunto de dados transcriptômicos TCGA-BRCA. A associação entre a MPO e cada gene central foi avaliada estatisticamente utilizando a correlação de postos de Spearman. Para caracterizar os padrões de correlação entre os próprios genes centrais, foi calculada uma matriz de correlação de Spearman aos pares em todas as amostras tumorais. Essas análises de correlação forneceram a base quantitativa para visualizações subsequentes, incluindo o gráfico de bala das correlações entre MPO e genes centrais e o diagrama de cordas/mapa de calor que retrata os padrões de correlação entre os genes centrais.
Previsão de fatores de transcrição e miRNAs reguladores superiores que direcionam MPO
O banco de dados KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, o banco de dados ChIP (http://chip-atlas.org/)30,31 e o banco de dados GTRD32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) foram utilizados para prever os TFs alvo do MPO. Além disso, o banco de dados TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/) foi utilizado para prever os sítios de ligação de miRNA potenciais que direcionam o MPO. Diagramas de Venn foram gerados utilizando o site MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34.
Análise de célula única de MPO
O conjunto de dados específico GSE161529 origina-se do Gene Expression Omnibus (GEO). A pré-processamento dos dados realizou primeiro uma filtragem em nível celular para excluir células de baixa qualidade—aquelas que atendiam a qualquer um dos seguintes critérios: expressão de genes mitocondriais superior a 25%, contagem total de identificadores moleculares únicos (UMI) abaixo de 5000 ou menos de 2500 genes detectados. Posteriormente, foram corrigidas a contaminação por RNA ambiental e os efeitos técnicos de lote35. A análise de componentes principais (PCA) foi realizada para redução da dimensionalidade e avaliação da similaridade celular, seguida por UMAP para agrupamento e visualização celular. Em seguida, com base nos genes marcadores típicos das células, os diferentes agrupamentos foram anotados em tipos celulares11. O conjunto de genes associados à MPO utilizado para pontuação de assinatura em única célula está fornecido no Arquivo Suplementar 1. Antes da pontuação, os símbolos gênicos foram harmonizados para os símbolos oficiais, entradas duplicadas foram removidas e os genes disponíveis foram intersectados com a matriz de expressão do GSE161529. AUCell, Seurat AddModuleScore e ssGSEA foram utilizados para calcular as pontuações associadas à MPO por célula. As pontuações obtidas pelos três métodos foram normalizadas por escore Z, escalonadas para uma faixa comparável e integradas para gerar uma pontuação composta associada à MPO para análises descritivas posteriores. Redes de interação entre células foram analisadas para comparar os padrões inferidos de comunicação ligante–receptor envolvendo células tumorais epiteliais estratificadas pelo sinal associado à MPO e diversos tipos celulares parceiros. Essas saídas foram interpretadas como padrões descritivos de comunicação, e não como evidência de que células que expressam MPO mediam diretamente a comunicação intercelular.
Extinção virtual em célula única de MPO e análise de enriquecimento de vias usando scTenifoldKnk
O silenciamento virtual de célula única de MPO foi realizado integrando Seurat e scTenifoldKnk. Após controle padrão de qualidade (200–6.000 genes por célula; fração mitocondrial < 10%), os dados foram normalizados por logaritmo, e 2.000 genes altamente variáveis foram selecionados para redução de dimensionalidade e agrupamento. Para enriquecer contextos relevantes para MPO, foram mantidas células com pontuação nos 50% superiores para um módulo de genes mieloide/neutrófilo. A partir dessas células, um subconjunto de vizinhança de MPO foi definido expandindo-se a partir de sementes positivas para MPO usando k = 40 vizinhos mais próximos no espaço do PCA. O subconjunto expandido não foi tratado como uma população puramente positiva para MPO, e nenhuma conclusão sobre proporção de tipos celulares foi feita a partir dessa etapa de expansão por KNN. Esse subconjunto foi submetido à análise de silenciamento virtual por meio do scTenifoldKnk, utilizando a união dos genes altamente variáveis e MPO (expressos em ≥25 células) como conjunto de genes. Genes significativamente perturbados foram identificados (FDR < 0,05, ajustado por BH). Os genes resultantes foram analisados adicionalmente quanto ao enriquecimento funcional em Processos Biológicos GO e vias KEGG (q < 0,05).
Recuperação exploratória de interações fármaco-gene e anotação ADMET
O DGIdb foi consultado para obter registros preliminares de interações droga-gene ou químico-gene associadas ao MPO. Como as listas de interações derivadas de bancos de dados podem incluir entradas apoiadas por tipos heterogêneos de evidência e podem não corresponder diretamente a agentes terapêuticos clinicamente acionáveis, os compostos recuperados foram tratados como anotações exploratórias, e não como candidatos prioritários a tratamento. Posteriormente, utilizaram-se o SwissADME e o ADMETlab para resumir as propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e toxicológicas previstas. Essas anotações in silico foram usadas para fornecer um contexto preliminar à interpretação em nível de composto e para destacar a necessidade de curadoria farmacológica, toxicológica e clínica adicional antes que qualquer relevância terapêutica possa ser considerada36.
Resultados
Padrões de expressão de MPO e associações exploratórias de sobrevida no câncer de mama
Para descrever os padrões de expressão de MPO em conjuntos de dados de câncer, analisamos dados de RNA-seq de MPO do conjunto de dados pan-câncer do TCGA e observamos expressão de MPO mais baixa em tecidos tumorais de carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma invasivo da mama (BRCA), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSC), cromófobo renal (KICH), carcinoma hepatocelular do fígado (LIHC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC), adenocarcinoma pancreático (PAAD), adenocarcinoma da próstata (PRAD) e carcinoma da tireoide (THCA), e expressão mais alta de MPO em adenocarcinoma de cólon (COAD), carcinoma papilar renal (KIRP) e outros tecidos (Figura 2A). Em seguida, avaliamos as associações entre a expressão de MPO e os desfechos clínicos em cada tipo de câncer. Na coorte TCGA-BRCA, comparações pareadas e não pareadas mostraram expressão de MPO mais baixa no tecido tumoral do que no tecido normal/adjacente (Figura 2B,C). Após estratificar as amostras tumorais do TCGA-BRCA utilizando o valor de corte mediano da expressão tumoral de MPO, a análise de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com expressão mais alta de MPO tiveram um intervalo livre de progressão mais longo (Razão de Risco (HR) = 0,67, p = 0,028) (Figura 2D). A sobrevida global (OS) (p = 0,296; Figura Suplementar 1A) e a sobrevida específica para a doença (DSS) (p = 0,18; Figura Suplementar 1B) não foram estatisticamente significativas. A curva ROC tumor versus normal sugeriu separação entre os grupos de tecidos neste conjunto de dados (Figura 2E), mas essa análise não deve ser interpretada como validação diagnóstica clínica. Essa discriminação exploratória pode ser influenciada pela fonte da amostra normal, efeitos de lote, pureza tumoral e diferenças na composição tecidual. A expressão de MPO também foi associada ao estádio patológico T (Figura 2F) e à distribuição do subtipo PAM50 (Figura 2G). Imagens representativas de imuno-histoquímica (IHC) de MPO de tecido mamário normal adjacente e tecido de câncer de mama foram incluídas como referências qualitativas no nível proteico (Figura 2H). As áreas destacadas indicam regiões mostradas em maior aumento. As imagens de visão geral em 20× incluem barras de escala de 100 µm, enquanto as imagens com maior aumento em 40× incluem barras de escala de 50 µm.
Análise de correlação e enriquecimento de MPO na coorte TCGA-BRCA coorte
A análise de correlação de Pearson identificou os 30 genes com maior correlação positiva com MPO, que mostraram upregulação coordenada ao longo do gradiente de expressão de MPO (Figura 3A), enquanto os 30 genes com maior correlação negativa exibiram um padrão de expressão inverso (Figura 3B). Ao nível de vias, a expressão de MPO esteve significativa e positivamente associada a várias pontuações de assinatura relacionadas ao tumor, incluindo a assinatura de resposta inflamatória (r = 0,41; Figura 3C), marcadores de EMT (r = 0,264; Figura 3D) e a pontuação do conjunto de genes relacionados à espécies reativas de oxigênio (ROS) (r = 0,415; Figura 3E), sugerindo que a expressão de MPO acompanha estados transcripcionais inflamatórios/oxidativos e semelhantes ao mesenquimal na coorte TCGA-BRCA.
A agrupamento não supervisionado de genes associados a MPO estratificou ainda mais os tumores em padrões de expressão que se alinharam com anotações clínicas, incluindo estágio patológico T e subtipos intrínsecos PAM50 (Figura 3F). Para explorar a possível conectividade entre genes associados a MPO, construímos uma rede de interação proteína-proteína (PPI) utilizando o STRING, revelando um módulo interconectado entre vários genes correlacionados com MPO (Figura 3G). Na rede PPI, ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 e KRT18 apresentaram alta conectividade naquele módulo derivado da correlação. Esses resultados identificam genes que variam conjuntamente com a expressão de MPO, mas não estabelecem a patogênese relacionada a MPO nem a direcionalidade. A análise de expressão diferencial entre os grupos com alta e baixa expressão de MPO revelou diferenças transcriptômicas resumidas no gráfico de volcão (Figura 3H). Um total de 1.159 genes superexpressos e 854 genes subexpressos foram identificados, fornecendo insumos para análises de enriquecimento subsequentes.
Em seguida, investigamos a relevância funcional dos genes diferencialmente expressos (GDEs) entre os grupos com alta e baixa expressão de MPO utilizando o pacote clusterProfiler no R. A análise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) indicou que esses GDEs estavam predominantemente envolvidos em processos biológicos relacionados à imunidade, incluindo a regulação da sinalização de receptores de superfície celular relacionados à resposta imune e imunidade mediada por linfócitos, com enriquecimento também observado em componentes celulares como o complexo do receptor de células T e funções moleculares relacionadas à atividade de ativador de receptor (Figura 4A). De forma consistente, a análise de vias KEGG destacou vias associadas à imunidade e inflamação, incluindo interação citocina–receptor de citocina, sinalização de quimiocinas, sinalização do receptor de células T, citotoxicidade mediada por células natural killer, diferenciação de Th1/Th2 e Th17, sinalização NF-κB, imunodeficiência primária e rede imunológica intestinal para produção de IgA (Figura 4B).
Para integrar ainda mais a direcionalidade da expressão com termos funcionais, o gráfico GO foi utilizado para calcular escores Z em nível de termo com base nos valores |log2FC| dos genes diferencialmente expressos (DEG), o que novamente destacou programas transcripcionais enriquecidos em funções imunes, tais como resposta imune humoral, imunidade mediada por leucócitos/linfócitos, ativação da resposta imune e transdução de sinal (Figura 4C). A análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA), baseada na lista classificada de genes, também mostrou enriquecimento de vias do sistema imunológico, incluindo sistema imunológico adaptativo, interação citocina–receptor de citocina e desgranulação de neutrófilos (Figura 4D–G). Como MPO é um gene associado a mieloides/neutrófilos, esses enriquecimentos são interpretados como evidência de que amostras com alta expressão de MPO exibem sinais transcripcionais imunes/mieloides mais fortes, e não como evidência de que o próprio MPO remodela o microambiente imunológico.
Correlação entre a expressão de MPO e a infiltração de células imunes no câncer de mama
Avaliamos a relação entre a expressão de MPO e as características do microambiente tumoral na coorte TCGA-BRCA. A aplicação do algoritmo ESTIMATE revelou correlações positivas significativas entre a expressão de MPO e o escore ESTIMATE (R = 0,347, p < 0,001), escore imune (R = 0,361, p < 0,001) e escore estromal (R = 0,232, p < 0,001) (Figura 5A). A distribuição desses escores entre as amostras é mostrada na Figura 5B. A análise utilizando o recurso TIMER/TIMER2.0 indicou que a expressão de MPO estava associada aos níveis estimados de infiltração das principais populações de células imunes, incluindo células B, células T CD8+, neutrófilos, células T CD4+, macrófagos e células dendríticas na coorte TCGA-BRCA (Figura 5C). Esse padrão de associação foi avaliado adicionalmente utilizando escores de enriquecimento de células imunes baseados em ssGSEA para 24 tipos de células imunes. Após a correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg, a expressão de MPO mostrou associações positivas com múltiplos escores de enriquecimento de células imunes, incluindo células T, células B, células citotóxicas, subconjuntos de células dendríticas, macrófagos, subconjuntos de células T auxiliares, células T reguladoras, células T CD8+, células NK, mastócitos e neutrófilos (Figura 5D). Esses achados são interpretados como associações com a composição imune, e não como evidência de que a MPO controla diretamente a infiltração de células imunes. Um mapa de calor foi gerado para visualizar os padrões de enriquecimento de células imunes em nível de amostra na coorte TCGA-BRCA (Figura 5E). Em seguida, comparamos os escores de enriquecimento de células imunes estimados por ssGSEA entre grupos de tumores definidos como MPO-alto e MPO-baixo com base na mediana. Diversos escores de enriquecimento de células imunes diferiram entre os dois grupos, incluindo células dendríticas ativadas (aDC), células B, células T CD8+, células citotóxicas, neutrófilos, células T, Tregs, células Th1, células Th2, células Th17, células T γδ, células T auxiliares foliculares (TFH), células com genes altamente variáveis (HVG), células T efetoras de memória, células T centrais de memória e células T auxiliares (Figura 5F,G). Além disso, foi realizada uma desconvolução baseada no CIBERSORT utilizando a matriz de assinatura LM22 para estimar as frações relativas de 22 tipos de células imunes, e os padrões resultantes de composição celular imune são apresentados na Figura 5H.
Análise da metilação de DNA de MPO na coorte TCGA-BRCA
Usando o mesmo valor de corte mediano da expressão de MPO no tumor, as amostras do TCGA-BRCA foram agrupadas em grupos MPO-alto e MPO-baixo, e os padrões de metilação de DNA foram visualizados para cada grupo (Figura 6A). Sítios CpG selecionados dentro do locus MPO mostraram associações com sobrevida na análise MethSurv, incluindo cg22331200, cg14619064 e cg11151395 (Figura 6B–G). Esses resultados relacionados à metilação foram interpretados como anotações epigenéticas exploratórias e requerem validação independente antes que conclusões prognósticas ou mecanicistas possam ser estabelecidas.
Associação entre a expressão de MPO e redes gênicas relacionadas a neutrófilos no câncer de mama
A coorte TCGA-BRCA foi utilizada para examinar a associação entre a expressão de MPO e genes relacionados a neutrófilos. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) baseada no STRING foi construída para genes associados a neutrófilos, e os genes centrais foram priorizados de acordo com a topologia da rede (Figura 7A). Os 20 principais genes centrais foram subsequentemente avaliados quanto à sua correlação com a expressão de MPO. Conforme mostrado no gráfico de bala, MPO exibiu predominantemente correlações positivas com múltiplos mediadores relacionados a neutrófilos, com associações mais fortes observadas para componentes de sinalização quimiocina/imunidade inata, como CCL5, CCL2 e TLR2, bem como TLR4, CXCR4, TNF e MMP9 (Figura 7B).
Para caracterizar mais detalhadamente o padrão de co-regulação entre esses genes centrais, visualizamos suas relações par a par usando um diagrama de acordes e um mapa de calor de correlação, o que revelou extensas correlações positivas entre genes no módulo central, consistente com um programa transcripcional inflamatório/associado a neutrófilos coordenado (Figura 7C,D). Em conjunto, esses resultados indicam que uma expressão mais elevada de MPO é acompanhada por expressão coordenada de uma rede gênica relacionada a neutrófilos no câncer de mama.
Anotação de fator de transcrição candidato para MPO
Para explorar fatores de transcrição candidatos potencialmente associados à MPO, foram consultadas e cruzadas fontes públicas de fatores de transcrição, incluindo KnockTF, ChIP-Atlas e GTRD. Os fatores de transcrição candidatos foram ainda resumidos por meio de análise de priorização baseada em rede e análise de correlação. Um resumo gráfico é apresentado na Figura Suplementar 2, e os resultados completos em formato tabular estão fornecidos no Arquivo Suplementar 2. Como essas bases de dados integram evidências de contextos experimentais heterogêneos, a sobreposição entre bancos de dados e o grau na rede foram utilizados apenas para anotação e priorização dos candidatos. Esses resultados não foram interpretados como evidência funcional de regulação transcricional direta da MPO no câncer de mama. Fatores candidatos, incluindo MYC, são, portanto, apresentados como anotações exploratórias suplementares, e não como reguladores upstream validados.
Agrupamento de células individuais e análise descritiva da comunicação célula a célula estratificada por sinal de MPO
Para anotar os tipos celulares, realizamos inicialmente uma análise de expressão específica por agrupamento com base em marcadores canônicos para cada linhagem. Os níveis médios de expressão e a porcentagem de células que expressam esses genes-chave nos diferentes agrupamentos são apresentados, apoiando a anotação subsequente (Figura 8A). Assim, os agrupamentos celulares anotados são visualizados em um gráfico de projeção e aproximação em variedade uniforme (UMAP), no qual cada população é codificada por cores de acordo com seu tipo identificado, incluindo células dendríticas plasmocitoides, células endoteliais, células mioepiteliais, células epiteliais em divisão, plasmócitos, células T citotóxicas, células tumorais epiteliais, células B, células T CD4 ativadas, monócitos–macrófagos, fibroblastos e células T convencionais (Figura 8B). O mapa de calor exibe os níveis de expressão de genes selecionados nos agrupamentos celulares (C1-C8). Cada linha representa um gene e cada coluna representa um agrupamento celular. O gradiente de cor indica os níveis de expressão, sendo o vermelho associado à alta expressão e o azul à baixa expressão. O dendrograma à esquerda agrupa genes com padrões de expressão semelhantes (Figura 8C). A pontuação associada à MPO foi calculada por célula utilizando o conjunto de genes associados à MPO fornecido no Arquivo Suplementar 1. AUCell, Seurat AddModuleScore e análise de enriquecimento de conjunto de genes de amostra única (ssGSEA) foram utilizados para calcular as pontuações por célula. As pontuações obtidas pelos três métodos foram normalizadas por Z-score, ajustadas para uma faixa comparável e integradas para gerar uma pontuação composta associada à MPO para análises descritivas posteriores (Figura 8D).
Esta análise de interação célula–célula comparou os padrões inferidos de comunicação ligante–receptor entre grupos celulares estratificados por sinal associado à MPO, incluindo a rede de interações, os mapas de calor de padrões de sinalização, o gráfico de bolhas de sinalização de saída e o gráfico de bolhas de sinalização de entrada (Figura 8E–H). Como o sinal de MPO era escasso ao nível de célula única e sua distribuição aparente entre os tipos celulares anotados pode ser afetada por dropout, RNA ambiental, dupletos e incerteza na anotação, esses gráficos de comunicação devem ser interpretados como resultados descritivos do fluxo de trabalho. Eles não demonstram que as células que expressam MPO mediem ou controlem a comunicação intercelular. Sinal de MPO detectável foi observado em um número limitado de células, incluindo células tumorais epiteliais anotadas e monócitos–macrófagos (Figura 8I). Considerando que a MPO está classicamente associada às linhagens neutrófilas/mieloides, esse padrão requer validação em conjuntos de dados independentes de célula única ou por métodos experimentais ortogonais.
Análise de sensibilidade exploratória do scTenifoldKnk baseada em células MPO-positivas esparsas
Várias amostras do 10x Genomics foram integradas, seguidas por normalização e seleção de genes altamente variáveis (HVG), redução de dimensionalidade baseada em PCA, construção de um grafo de k-vizinhos mais próximos e agrupamento Louvain. Padrões canônicos de expressão de genes marcadores entre os clusters foram resumidos usando um DotPlot, auxiliando a subsequente anotação de tipos celulares (Figura 9A). A visualização UMAP mostrou as populações celulares anotadas em nível individual no conjunto de dados integrado (Figura 9B). Marcadores canônicos de linhagem (por exemplo, EPCAM e KRT8/KRT18 para células epiteliais; PTPRC para células imunes; MS4A1 para linfócitos B; LST1/S100A8/S100A9 para células mieloides; PECAM1 para células endoteliais; e COL1A1 para linhagens de fibroblastos/músculo liso) exibiram padrões de expressão específicos por cluster, corroborando a anotação de tipos celulares (Figura 9C). Gráficos de barras empilhadas estratificados por amostra indicaram que cada amostra continha múltiplos clusters, com variação limitada entre lotes (Figura 9D).
A expressão de MPO era relativamente escassa no conjunto de dados de célula única, com apenas 85 células positivas para MPO detectadas inicialmente (Figura 9E). Dado esse número limitado, a expansão do vizinhança baseada em KNN foi utilizada apenas para definir um subconjunto local de vizinhança de MPO para análise exploratória de sensibilidade. Esse subconjunto expandido não deve ser interpretado como uma população puramente positiva para MPO, pois pode incluir células vizinhas com expressão de MPO baixa ou indetectável. Dentro desse subconjunto de vizinhança de MPO, foi realizado o silenciamento virtual de MPO utilizando o scTenifoldKnk como uma análise computacional de sensibilidade. O gráfico de vulcão resultante, a análise de deslocamento de variedade, a visualização do alinhamento de variedade, os resultados de enriquecimento GO/KEGG e os genes com maior deslocamento (Figura 9F-N) destacaram programas transcricionais candidatos relacionados à apresentação de antígenos, ativação de mieloides/linfócitos, produção de citocinas e vias relacionadas ao fagossomo. Esses resultados devem ser interpretados como saídas exploratórias de sensibilidade transcricional, e não como evidência direta de que MPO regula mecanicamente essas vias no câncer de mama. Conjuntos de dados independentes de célula única e validação experimental ortogonal, como imunohistoquímica, citometria de fluxo, qPCR ou ensaios funcionais, serão necessários para confirmar essas observações.
Recuperação exploratória de interações droga-gene e anotação de ADMET
Como uma extensão exploratória da análise centrada na MPO, informações sobre interações droga-gene foram recuperadas do DGIdb. Um resumo gráfico é apresentado na Figura Suplementar 3, e os resultados em nível de composto são fornecidos na Tabela Suplementar 3. A consulta ao DGIdb retornou um conjunto heterogêneo de entradas químicas associadas à MPO, incluindo compostos com plausibilidade clínica limitada ou perfis toxicológicos desfavoráveis. Portanto, esses compostos derivados de bases de dados não foram considerados candidatos terapêuticos para câncer de mama com base na análise atual. Informações relacionadas à ADMET foram resumidas para fornecer uma anotação preliminar das propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e toxicológicas previstas. A recuperação de compostos baseada em banco de dados e a anotação ADMET não são equivalentes à priorização clínica de fármacos. Assim, esses resultados servem apenas como anotações químicas em nível de triagem e ilustram a necessidade de filtragem cuidadosa farmacológica, toxicológica e clínica antes que qualquer composto possa ser considerado para investigação terapêutica. Os principais achados deste estudo concentram-se na associação entre a expressão da MPO e características transcricionais relacionadas ao sistema imunológico/mieloide.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados transcriptômicos e clínicos do TCGA-BRCA foram obtidos do portal Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; baixados em 26 de agosto de 2025; versão/liberação de dados 202208). O conjunto de dados de única célula GSE161529 foi obtido do Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). Nenhum novo dado de sequenciamento foi gerado neste estudo. Os scripts de análise estão disponíveis publicamente em https://github.com/tengfeitcm/MPO.
Figura 1: Fluxograma do processo de coleta e análise de dados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Padrões de expressão de MPO e associações exploratórias de sobrevida no câncer de mama. (A) Os níveis de expressão de MPO foram analisados em 33 tipos distintos de câncer e nos tecidos normais adjacentes utilizando o banco de dados TCGA. (B) Amostras não pareadas foram selecionadas do conjunto de dados TCGA-BRCA para analisar a expressão de mRNA de MPO em tecidos de câncer de mama e tecidos normais. (C) Amostras pareadas foram selecionadas do conjunto de dados TCGA-BRCA para analisar a expressão de mRNA de MPO em tecidos de câncer de mama e tecidos normais. (D) Análise de Kaplan-Meier do PFI em pacientes estratificados pelo valor mediano de corte da expressão tumoral de MPO na coorte TCGA-BRCA. (E) Curva ROC exploratória avaliando a discriminação entre tumor e tecido normal com base na expressão de MPO no conjunto de dados transcriptômicos públicos analisado. (F) Expressão de MPO nas diferentes fases patológicas T. (G) Expressão de MPO entre os subtipos moleculares PAM50, com as etiquetas dos subtipos indicadas. (H) Imagens representativas de imuno-histoquímica (IHC) para MPO em tecido mamário normal adjacente e tecido de câncer de mama. As áreas destacadas indicam regiões mostradas em maior aumento. As imagens gerais em 20× incluem barras de escala de 100 µm, enquanto as imagens com maior aumento em 40× incluem barras de escala de 50 µm. Essas imagens são apresentadas como referências qualitativas ao nível proteico e não foram utilizadas para análise morfométrica quantitativa ou análise estatística. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de correlação e expressão diferencial associada ao MPO no câncer de mama. (A) Os 30 principais genes codificantes positivamente correlacionados com a expressão de MPO no nível de mRNA, com base nos coeficientes de correlação de Pearson obtidos a partir da base de dados TCGA. (B) Os 30 principais genes codificantes negativamente correlacionados com a expressão de MPO no nível de mRNA, com base nos coeficientes de correlação de Pearson. (C) Gráficos de dispersão ilustrando as correlações de Spearman entre MPO e genes regulados positivamente pela resposta inflamatória. (D) Gráficos de dispersão ilustrando as correlações de Spearman entre MPO e genes regulados positivamente por marcadores de EMT. (E) Gráficos de dispersão ilustrando as correlações de Spearman entre MPO e genes regulados positivamente por ERO. (F) Mapa de calor dos agrupamentos gênicos associados ao MPO com base na significância clínica (estágio T e PAM50). (G) Rede de interação de proteínas (PPI) prevista utilizando a base de dados STRING para proteínas associadas ao MPO. (H) Gráfico de volcão dos genes diferencialmente expressos entre os grupos de tumores com alta e baixa expressão de MPO, definidos pela mediana, na coorte TCGA-BRCA. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 4: Análise de enriquecimento de MPO em câncer de mama. (A) Análise de enriquecimento da Ontologia Genética dos 2.013 genes diferencialmente expressos entre os grupos com alto e baixo MPO. (B) Análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dos 2.013 genes diferencialmente expressos. (C) Visualização integrada do enriquecimento da Ontologia Genética combinando termos enriquecidos com a direção da expressão diferencial e valores de |log2FC|. (D) Gráfico representativo de enriquecimento GSEA para um conjunto de genes relacionados ao sistema imunológico associado ao MPO; o nome do conjunto de genes, o escore de enriquecimento normalizado e o valor-q FDR são mostrados no painel. (E) Gráfico representativo de enriquecimento GSEA para um conjunto adicional de genes relacionados ao sistema imunológico associado ao MPO; o nome do conjunto de genes, o escore de enriquecimento normalizado e o valor-q FDR são mostrados no painel. (F) Gráfico representativo de enriquecimento GSEA para um conjunto adicional de genes relacionados ao sistema imunológico associado ao MPO; o nome do conjunto de genes, o escore de enriquecimento normalizado e o valor-q FDR são mostrados no painel. (G) Gráfico representativo de enriquecimento GSEA para um conjunto adicional de genes relacionados ao sistema imunológico associado ao MPO; o nome do conjunto de genes, o escore de enriquecimento normalizado e o valor-q FDR são mostrados no painel. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Correlação entre enriquecimento por células imunes e expressão de MPO no câncer de mama. (A) Gráficos de dispersão mostrando as correlações entre a expressão de MPO e o escore ESTIMATE, escore imune e escore estromal. (B) Gráficos de caixa mostrando as diferenças nos escores ESTIMATE, imune e estromal entre os grupos de tumores com alta e baixa expressão de MPO definidos pela mediana. (C) Análise baseada no TIMER/TIMER2.0 mostrando as associações entre a expressão de MPO e a infiltração estimada das principais populações de células imunes. (D) Gráfico de pirulito mostrando as correlações de Spearman entre a expressão de MPO e os escores de enriquecimento estimados por ssGSEA para 24 tipos de células imunes. Os valores de p provenientes de múltiplas correlações de células imunes foram ajustados utilizando o método de taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg. (E) Mapa de calor ilustrando os padrões de enriquecimento por células imunes em nível de amostra na coorte TCGA-BRCA. (F) Gráficos de caixa mostrando o primeiro conjunto de diferenças nos escores de enriquecimento por células imunes estimados por ssGSEA entre os grupos de tumores com alta e baixa expressão de MPO definidos pela mediana; as comparações entre grupos foram realizadas utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon com correção de Benjamini–Hochberg. (G) Gráficos de caixa mostrando o segundo conjunto de diferenças nos escores de enriquecimento por células imunes estimados por ssGSEA entre os grupos de tumores com alta e baixa expressão de MPO definidos pela mediana; as comparações entre grupos foram realizadas utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon com correção de Benjamini–Hochberg. (H) Gráfico de barras empilhadas mostrando as frações de células imunes estimadas pelo CIBERSORT com base na matriz de assinatura LM22 para 22 tipos de células imunes nos grupos de tumores com baixa e alta expressão de MPO definidos pela mediana. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise de metilação de DNA do gene MPO em câncer de mama. (A) Mapa de calor mostrando os padrões de metilação de MPO nos grupos definidos pela mediana como MPO-alto e MPO-baixo. (B) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg27456487. (C) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg02668773. (D) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg07110356. (E) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg11151395. (F) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg14619064. (G) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o significado prognóstico da metilação no sítio cg22331200. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise das correlações entre MPO e genes relacionados a neutrófilos no nível de mRNA utilizando o banco de dados TCGA. (A) Visualização da rede de interação proteica, mostrando as interações entre a proteína central e outras proteínas. (B) Análise de correlação dos 20 principais genes relacionados a neutrófilos com MPO, exibindo os coeficientes de correlação e as distribuições dos valores-P para diferentes genes. (C) Diagrama de cordas das correlações entre os 20 principais genes relacionados a neutrófilos, representando visualmente a intensidade e a direção das associações gênicas. (D) Mapa de calor de correlação dos 20 principais genes relacionados a neutrófilos, mostrando os coeficientes de correlação e os níveis de significância por meio de gradientes de cor e marcadores estatísticos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 8: Agrupamento em nível de célula única e análise de comunicação célula-célula associada à MPO no conjunto de dados de células únicas de câncer de mama. (A) DotPlot dos genes marcadores canônicos ao longo dos agrupamentos para a anotação de tipos celulares. (B) Visualização UMAP das populações celulares anotadas. (C) Mapa de calor dos genes marcadores selecionados ao longo dos agrupamentos celulares. (D) DotPlot que resume os escores associados à MPO ao longo dos tipos celulares anotados, calculados usando AUCell, ssGSEA e Seurat AddModuleScore com base no conjunto de genes fornecido no Arquivo Suplementar 1. (E) Rede de interação célula-célula mostrando a comunicação entre células tumorais epiteliais estratificadas pelo sinal associado à MPO e outros tipos celulares; a largura da aresta representa a intensidade da interação e o tamanho do nó reflete a atividade geral de interação. (F) Mapas de calor mostrando os padrões de sinalização de saída e entrada entre os tipos celulares. (G) Gráfico de bolhas das vias de sinalização de saída das células tumorais epiteliais estratificadas pelo sinal associado à MPO em direção a outros tipos celulares. (H) Gráfico de bolhas das vias de sinalização de entrada provenientes de outros tipos celulares em direção às células tumorais epiteliais estratificadas pelo sinal associado à MPO. (I) Distribuição da expressão de MPO ao longo dos tipos celulares anotados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 9: Análise do atlas de célula única e análise exploratória de silenciamento virtual da saída de sensibilidade à MPO. (A) DotPlot mostrando a expressão dos genes marcadores canônicos entre os agrupamentos de células únicas; o tamanho do ponto representa a porcentagem de células que expressam cada marcador, e a intensidade da cor representa o nível médio de expressão. (B) Visualização UMAP das populações de células únicas anotadas, em que cada cor representa um tipo celular distinto ou agrupamento. (C) Visualização UMAP da expressão de genes marcadores-chave, mostrando a distribuição da expressão dos genes marcadores para tipos celulares, incluindo células mieloides. (D) Gráfico de barras empilhadas das proporções de agrupamentos celulares entre as amostras. (E) Visualização UMAP da expressão do gene MPO. (F) Gráfico de violino mostrando as métricas de controle de qualidade do sequenciamento de célula única. (G) Gráfico de agrupamento de genes marcadores-chave. (H) DotPlot dos genes marcadores canônicos no nível do agrupamento. (I) Gráfico de vulcão dos genes alterados na análise de sensibilidade de silenciamento virtual. (J) Gráfico de dispersão de deslocamento versus significância. (K) Gráfico de setas de alinhamento de variedade. (L) Análise de enriquecimento GO BP dos genes provenientes da saída do silenciamento virtual. (M) Análise de enriquecimento de vias KEGG dos genes provenientes da saída do silenciamento virtual. (N) Os 20 principais genes com maior deslocamento na variedade após a exclusão da MPO. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 1: Análises adicionais de sobrevida para MPO na coorte TCGA-BRCA. (A,B) Este arquivo contém análises suplementares de sobrevida de Kaplan-Meier para (A) sobrevida global e (B) sobrevida específica para a doença, estratificadas pelo valor mediano de expressão tumoral de MPO. Essas análises são fornecidas como análises suplementares de desfecho para a Figura 2D e não foram estatisticamente significativas na coorte atual.Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Anotação exploratória de fatores de transcrição candidatos para MPO. (A) Diagrama de Venn mostrando a interseção de fatores de transcrição candidatos de três recursos públicos de fatores de transcrição. (B) Resultado da comparação da expressão de MYC. (C) Mapa de calor de correlação de fatores de transcrição com rótulos de linhas e colunas. (D) Resultado da correlação MPO–MYC. (E) Resultado da análise de sobrevida de MYC. (F) Resultado ROC de MYC. As saídas relacionadas a MYC são mostradas apenas como anotações suplementares de fatores de transcrição candidatos e não são utilizadas para sustentar conclusões mecanicistas sobre reguladores upstream.Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Resultado exploratório da recuperação de drogas e genes do DGIdb para MPO. Nós cinzas representam o gene MPO, nós laranjas representam as entradas recuperadas de pequenas moléculas e as linhas conectantes indicam relações droga–gene previstas por banco de dados.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: A matriz de assinatura de células imunes LM22 utilizada na análise de desconvolução de células imunes baseada no CIBERSORT para 22 tipos de células imunes. Os símbolos gênicos foram harmonizados, entradas duplicadas foram removidas e os genes disponíveis foram intersectados com as matrizes de expressão correspondentes do TCGA-BRCA ou GSE161529 antes da análise subsequente.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 2: A lista de genes relacionados aos neutrófilos utilizada para análise STRING/PPI, priorização de genes centrais e análise de correlação entre MPO e genes centrais. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 3: Resultados exploratórios da recuperação de interações droga–gene no DGIdb e anotações ADMET para MPO. Este arquivo contém registros de interações químico-gênicas associadas a MPO recuperados do DGIdb, bem como anotações previstas em nível de composto relacionadas a propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e toxicidade. Esses resultados são fornecidos apenas como anotações químicas preliminares e não devem ser interpretados como listas de candidatos terapêuticos. Eles não comprovam inibição de MPO, ligação ao alvo, especificidade do ligante, seletividade, segurança, eficácia terapêutica ou adequação clínica. Os valores nesta tabela representam parâmetros previstos de propriedades físico-químicas e semelhantes a fármacos para os compostos listados. A massa molecular é expressa em gramas por mol (g/mol). Os valores de aceptores e doadores de ligação de hidrogênio indicam os números previstos de aceptores e doadores de ligações de hidrogênio, respectivamente. O coeficiente de partição octanol–água de Moriguchi indica a lipofilicidade prevista. As violações da regra de Lipinski indicam o número de critérios da regra dos cinco de Lipinski não satisfeitos por cada composto. O escore de biodisponibilidade representa a pontuação prevista relacionada à biodisponibilidade oral, e a área superficial topológica refere-se à área superficial polar topológica prevista.Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Lista de genes associados à MPO utilizada para pontuação de assinatura em célula única com AUCell, Seurat AddModuleScore e ssGSEA. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Resultados exploratórios de anotação de fatores de transcrição e miRNAs candidatos para MPO. Este arquivo contém resultados de anotação de fatores de transcrição e miRNAs candidatos derivados de bancos de dados com base em recursos públicos, incluindo KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD e TargetScan. Essas anotações são fornecidas apenas para priorização exploratória de candidatos e não devem ser interpretadas como evidência funcional de regulação ascendente de MPO no câncer de mama.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo apresenta uma análise exploratória baseada em conjunto de dados público e um fluxo de trabalho in silico para investigar associações entre a expressão de MPO e características imunes/mieloides no câncer de mama. As análises do TCGA-BRCA mostraram que a expressão de MPO era menor em tecidos tumorais do que em tecidos não tumorais adjacentes e que uma expressão mais elevada de MPO estava associada a um intervalo livre de progressão mais longo. No entanto, a sobrevida global e a sobrevida específica para a doença não foram estatisticamente significativas. Portanto, a expressão de MPO não deve ser interpretada como um biomarcador prognóstico robusto ou estabelecido com base nas evidências atuais. Estudos futuros devem avaliar a MPO utilizando modelos de regressão de Cox multivariáveis ajustados por variáveis clínico-patológicas estabelecidas, coortes de validação independentes e análises estratificadas por subtipos.
Em comparação com a análise convencional de expressão diferencial de uma única coorte ou a estimativa de infiltração imune baseada em uma única plataforma, este fluxo de trabalho centrado em MPO integra transcriptômica em massa, enriquecimento imune, anotação de metilação, mapeamento em nível de célula única e perturbação virtual para fornecer uma visão exploratória mais ampla das características imunes/mieloides associadas a MPO. No entanto, este fluxo de trabalho permanece complementar, e não um substituto, à validação em coortes externas, à validação espacial ou em nível proteico e aos ensaios experimentais de perturbação.
Os resultados de infiltração imune e enriquecimento devem ser interpretados como contexto imune associado à MPO, e não como remodelação imune induzida pela MPO. A MPO é predominantemente expressa em neutrófilos e outras células da linhagem mieloide37. Portanto, correlações positivas entre a expressão de MPO e escores ESTIMATE, escores imunes, escores de enriquecimento de células imunes, genes relacionados a neutrófilos, vias de citocinas, assinaturas de apresentação de antígenos ou vias de desgranulação de neutrófilos são biologicamente plausíveis e podem refletir, em grande parte, diferenças na abundância de células imunes/mieloides em amostras tumorais brutas. Essa interpretação é consistente com estudos anteriores que mostram que a infiltração de neutrófilos positivos para MPO está associada a um prognóstico favorável no câncer de mama e que a MPO tem sido implicada na função de células dendríticas e na inflamação tecidual mediada por linfócitos T38,39. Dados de RNA-seq em bulk não permitem determinar se a MPO possui atividade intrínseca nas células tumorais ou se o sinal observado reflete principalmente células imunes infiltradas. Conjuntos de dados independentes de sequenciamento em nível de única célula, perfis espaciais, imuno-histoquímica, citometria de fluxo ou modelos experimentais baseados em perturbação seriam necessários para esclarecer a origem celular e a função.
A análise de célula única fornece informações descritivas adicionais, mas permanece limitada pela detecção esparsa de MPO. Inicialmente, apenas 85 células positivas para MPO foram detectadas antes da expansão do entorno baseada em KNN. Embora a expansão KNN tenha permitido uma análise de sensibilidade de células no entorno transcricional local de células positivas para MPO, este procedimento pode incluir células que não expressam diretamente MPO. Assim, a saída de eliminação virtual do scTenifoldKnk deve ser interpretada como uma análise computacional exploratória de sensibilidade, e não como evidência de regulação de vias mediada por MPO40. Será necessário validar os resultados em conjuntos de dados independentes de câncer de mama de célula única e em ensaios experimentais ortogonais antes que conclusões mecanicistas possam ser estabelecidas.
A análise do fator de transcrição também deve ser interpretada com cautela. A sobreposição das previsões do KnockTF, GTRD e ChIP-Atlas, seguida pela priorização baseada em grau, pode indicar fatores de transcrição candidatos, mas não é capaz de estabelecer a regulação transcricional funcional do MPO no câncer de mama. Por isso, MYC e outros fatores candidatos foram mantidos apenas como anotações exploratórias. Como a atividade do fator de transcrição é altamente dependente do contexto e pode variar conforme o subtipo tumoral, composição celular, plataforma do ensaio e estratégia de pré-processamento, seria necessária uma validação específica do contexto antes que qualquer fator candidato pudesse ser atribuído a um papel regulador upstream. Essa validação deveria incluir ChIP-qPCR ou ChIP-seq, ensaios de promotor com repórter e perturbação do fator de transcrição seguida pela medição da expressão de MPO.
A recuperação de interações droga-gene e a anotação ADMET também devem ser interpretadas com cautela. O DGIdb pode retornar associações químico-gênicas heterogêneas, incluindo compostos que não são ligantes seletivos da MPO e que podem ter plausibilidade clínica limitada ou propriedades toxicológicas desfavoráveis36. As previsões ADMET fornecem anotações químicas preliminares, mas não estabelecem interação com o alvo, potência, seletividade, segurança ou eficácia terapêutica41. Portanto, os resultados atuais em nível de composto não devem ser usados para inferir potencial terapêutico. Uma avaliação translacional significativa exigiria um conjunto curado de inibidores ou sondas farmacologicamente relevantes da MPO, comparação com compostos conhecidos que atingem a MPO e validação por meio de ensaios bioquímicos, celulares e farmacológicos. O papel dependente do contexto e potencialmente dual da MPO no câncer também deve ser considerado ao interpretar descobertas relacionadas a fármacos. A MPO pode contribuir para processos que promovem tumores por meio de estresse oxidativo, geração de oxidantes reativos, danos ao DNA, inflamação crônica e remodelação do microambiente tumoral. Ao mesmo tempo, a expressão da MPO em conjuntos de dados tumorais brutos pode refletir a infiltração por neutrófilos ou outras células imunes mieloides, o que, em alguns contextos, pode estar associado a um microambiente imunologicamente ativo e a desfechos clínicos mais favoráveis39,42. A interpretação biológica da MPO, portanto, depende do tipo tumoral, da origem celular, da fase da doença e da composição das células imunes.
Os achados de metilação do DNA no locus MPO também foram considerados exploratórios. Os sítios CpG selecionados mostraram associações com sobrevida na análise MethSurv, mas esses resultados exigem validação independente antes que conclusões prognósticas ou mecanicistas possam ser estabelecidas. A regulação epigenética do MPO pode interagir com a ligação de fatores de transcrição e com a regulação em nível da cromatina, mas tais interações permanecem especulativas na ausência de dados funcionais sobre cromatina ou de perturbação43.
As implicações clínicas da expressão de MPO devem ser interpretadas com cautela. Os resultados atuais não estabelecem MPO como um biomarcador clinicamente acionável nem como um marcador que possa atualmente orientar decisões de imunoterapia no câncer de mama. Em vez disso, MPO pode refletir um contexto imunológico relacionado a mieloides/neutrófilos dentro do microambiente tumoral. Em estudos futuros, a expressão de MPO poderá ser avaliada em conjunto com marcadores estabelecidos relacionados à imunoterapia, incluindo linfócitos tumorais infiltrantes, expressão de PD-L1, expressão gênica de pontos de controle imunológico, subtipo molecular e assinaturas imunes validadas. Essas análises devem incluir coortes independentes, modelos multivariáveis e conjuntos de dados de resposta ao tratamento antes que MPO possa ser considerado para estratificação de pacientes ou tomada de decisões em imunoterapia.
Várias etapas do fluxo de trabalho são essenciais para a reprodutibilidade, incluindo o pré-processamento consistente dos dados do TCGA-BRCA, o agrupamento baseado na mediana apenas em tumores MPO-alto/MPO-baixo, limiares estatísticos pré-definidos e correção para testes múltiplos, algoritmos de enriquecimento de células imunes e conjuntos de assinaturas, controle de qualidade e anotação de célula única, expansão baseada em KNN do microambiente MPO e o tratamento exploratório dos resultados de silenciamento virtual e do DGIdb/ADMET. Alterações nesses parâmetros podem afetar os resultados e a interpretação posteriores; portanto, devem ser relatadas e reproduzidas com cuidado. Para solução de problemas, saídas inconsistentes devem ser verificadas mediante análise da origem da amostra, normalização da expressão, ponto de corte para agrupamento, correção para testes múltiplos, conjuntos de assinaturas de células imunes, controle de qualidade e anotação de célula única, definição do microambiente KNN, limiares de silenciamento virtual, pontos de corte para enriquecimento e registros heterogêneos de compostos no DGIdb/ADMET.
Várias limitações deste estudo devem ser reconhecidas. Primeiramente, este estudo foi baseado em análises retrospectivas de bancos de dados públicos utilizando o TCGA-BRCA e dados de célula única disponíveis publicamente, podendo, portanto, ser afetado por heterogeneidade da coorte, diferenças na origem das amostras, efeitos de lote, anotação clínica incompleta e diferenças na composição tumoral. Em segundo lugar, os achados atuais derivam principalmente de associações transcriptômicas e análises in silico, e carecem de validação experimental direta. Assim, as associações observadas entre expressão de MPO, características imunes/mieloides, anotações de metilação, candidatos a fatores de transcrição e resultados de silenciamento virtual não devem ser interpretadas como mecanismos causais. Terceiro, a detecção de MPO no conjunto de dados de célula única foi escassa, com apenas 85 células positivas para MPO detectadas antes da expansão do microambiente baseada em KNN. O subconjunto expandido do microambiente de MPO pode incluir células com expressão baixa ou indetectável de MPO e não deve ser considerado uma população puramente positiva para MPO. Quarto, como a MPO está predominantemente associada a neutrófilos e outras células da linhagem mieloide, sinais relacionados à MPO em dados de RNA-seq em massa podem ser confundidos pela abundância de células imunes, pureza tumoral e composição celular, em vez de refletir atividade intrínseca das células tumorais. Por fim, a recuperação de interações droga-gene baseada no DGIdb e a anotação ADMET foram apenas anotações químicas exploratórias. Esses resultados não estabelecem inibição da MPO, ligação ao alvo, seletividade, segurança, eficácia terapêutica ou adequação clínica. Estudos futuros utilizando coortes independentes, validação espacial ou em nível proteico e experimentos funcionais são necessários para confirmar a relevância biológica e clínica desses achados.
Em resumo, as análises atuais de conjuntos de dados públicos apoiam uma associação entre a expressão de MPO e características transcricionais imunes/mieloides no câncer de mama, sendo a maior expressão de MPO associada a um intervalo livre de progressão mais longo na coorte analisada. Os achados permanecem exploratórios e geradores de hipóteses. Eles não estabelecem que a MPO regula causalmente o microambiente imune tumoral, que MYC regula funcionalmente a MPO ou que os compostos recuperados têm relevância terapêutica. As principais contribuições deste estudo são um fluxo de trabalho computacional reproduzível e um conjunto de hipóteses testáveis que exigem validação em coortes externas e confirmação experimental.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho. Uma ferramenta de edição baseada em IA foi utilizada apenas para auxiliar no aprimoramento e na legibilidade da língua inglesa durante a revisão do manuscrito. A ferramenta não foi usada no delineamento do estudo, na análise de dados, na geração de figuras, na interpretação dos resultados, na seleção de referências ou na elaboração de conclusões científicas. Todas as análises, resultados, interpretações, referências e texto final foram cuidadosamente verificados, revisados e aprovados pelos autores, que assumem total responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Fundo de Pesquisa Científica do Hospital do Centro Aeroespacial (YN202530).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CellChat | Pacote R/Código aberto | https://github.com/sqjin/CellChat | Análise de comunicação célula-célula |
| ChIP-Atlas | Banco de dados público | https://chip-atlas.org/ | Triagem de alvos de fatores de transcrição; atualização de 2021 |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | Análise de enriquecimento GO/KEGG; v4.4.4 |
| Cytoscape | Consortium Cytoscape | https://cytoscape.org/ | Visualização de redes e análise de topologia |
| DGIdb | Universidade de Washington/Banco de dados público | https://www.dgidb.org/ | Recuperação de interações droga-gene |
| GDC/TCGA-BRCA | Instituto Nacional do Câncer | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Fonte de dados transcriptômicos em massa e clínicos |
| Gene Expression Omnibus: GSE161529 | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | Fonte de conjunto de dados de célula única |
| GSEA/MSigDB | Instituto Broad | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | Análise de enriquecimento de conjunto de genes e referência de conjuntos de genes; Versão 3.0 |
| GSVA | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/GSVA/ | Pontuação relacionada à variação de conjuntos de genes/ssGSEA; Versão 1.46.0 |
| GTRD | Banco de dados público | http://gtrd.biouml.org/ | Triagem de alvos de fatores de transcrição; 2021 |
| KnockTF | Banco de dados público | http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html | Recurso de perturbação de fatores de transcrição; Versão 2.0 |
| R | Fundação R para Computação Estatística | https://www.r-project.org/ | Ambiente de computação estatística |
| scTenifoldKnk | Pacote R/Código aberto | https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk | Análise de silenciamento virtual |
| Seurat | Pacote R/Código aberto | https://satijalab.org/seurat/ | Pré-processamento e agrupamento de células únicas |
| STRING | ELIXIR/Banco de dados público | https://string-db.org/ | Análise de interação proteína-proteína; v11 |
| SwissADME | Instituto SIB Suíço de Bioinformática | http://www.swissadme.ch/ | Avaliação de semelhança a fármacos; versão 2017/ferramenta web |
| TIMER | Recurso web público | https://timer.cistrome.org/ | Análise de infiltração imune; TIMER2.0 |
| UCSC Xena ou portal TCGA vinculado | UCSC | https://xenabrowser.net/ | Acesso e validação exploratórios de dados |
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