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Artigo de método

Um Framework Multimodal para Avaliar Coculturas de Organoides de Tumor de Cólon Derivados de Pacientes e Células Imunes

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DOI:

10.3791/71204

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3 de setembro de 2026

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1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de organoides de tumor de cólon derivados de pacientes em co-cultura com linfócitos autólogos, seguido pelo tratamento com moléculas terapêuticas de pequeno porte e inibidores de pontos de controle imunológico para avaliar a reatividade de células T e a eficácia do tratamento.

Resumo

Os linfócitos T desempenham um papel fundamental na imunoterapia contra o câncer, e compreender suas interações com tumores é essencial para o desenvolvimento de novas imunoterapias. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho passo a passo para o estabelecimento de organoides derivados de pacientes com câncer colorretal (PDOs) a partir do nosso biobanco e para o desenvolvimento de sistemas de co-cultivo autólogos de PDOs com linfócitos T. Utilizando coloração com Annexina V NIR e caspase-3 clivada, padronizamos protocolos de citometria de fluxo para coloração de superfície e intracelular, a fim de avaliar a reatividade e a citotoxicidade dos linfócitos T, bem como a eliminação de organoides tumorais. Além da análise baseada em citometria de fluxo, o protocolo inclui abordagens metodológicas para ensaios funcionais, como ensaios ELISpot para quantificar a secreção de granzima B e perfurina, e imagem de células vivas para monitorar ao longo do tempo a eliminação tumoral mediada por linfócitos T por meio da detecção de apoptose baseada na Annexina V. Este fluxo de trabalho detalha ainda a configuração das condições de co-cultivo, incluindo a incorporação de inibidores-alvo e inibidores de pontos de controle imunológico em regimes de monoterapia e terapia combinada. São fornecidas orientações para a seleção e aplicação de marcadores imunológicos e associados ao tumor, incluindo CD137 para reatividade de linfócitos T, CD107a para desgranulação de linfócitos T, caspase-3 para apoptose tumoral e Ki67 para proliferação tumoral. Em conjunto, este artigo fornece uma estrutura abrangente e reprodutível para o estabelecimento de organoides de câncer colorretal, cultura e expansão de linfócitos T autólogos, configuração de co-cultivo, perturbações terapêuticas e análises posteriores utilizando citometria de fluxo, ELISpot, microscopia confocal e imagem de células vivas.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, apesar dos avanços na detecção precoce e nas terapias multimodais1. Um dos grandes desafios para a melhoria dos desfechos em pacientes é a ausência de modelos pré-clínicos que recapitulem com precisão a arquitetura complexa, a heterogeneidade intratumoral, as interações tumor-imunes e as respostas terapêuticas observadas no CCR humano2,3,4,5,6. Modelos convencionais, incluindo modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs, na sigla em inglês) e xenografias derivadas de pacientes (PDXs, na sigla em inglês), avançaram significativamente na pesquisa do CCR, mas apresentam limitações notáveis. Os GEMMs frequentemente não conseguem capturar a diversidade dos tumores humanos e são desenvolvidos em microambientes murinos que diferem substancialmente da fisiologia humana. Da mesma forma, os modelos PDX preservam aspectos da heterogeneidade tumoral, mas são caros, demorados, dependem de camundongos imunodeficientes e têm limitações na investigação de respostas imunes específicas do ser humano, devido às diferenças entre espécies7,8. Além disso, restrições cada vez maiores ao uso de pequenos animais enfatizam a necessidade de alternativas mais relevantes ao ser humano e eticamente sustentáveis.

Nos últimos anos, os organoides derivados de pacientes (ODPs) surgiram como uma plataforma transformadora para a pesquisa translacional do câncer. Os organoides de CCR gerados a partir de espécimes cirúrgicos frescos ou biópsias preservam as características histológicas, genéticas e fenotípicas dos tumores primários, incluindo a diversidade clonal e os estados celulares responsivos à terapia. Essas propriedades tornam os ODPs ferramentas valiosas para modelagem de doenças, genômica funcional, descoberta de biomarcadores e medicina personalizada7,8,9,10,11. Importante, a incorporação de componentes imunes humanos em sistemas de organoides ampliou ainda mais sua utilidade. O cultivo conjunto de organoides de CCR com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou subpopulações imunes modificadas permite investigar as interações tumor-imunes, mecanismos de evasão imune, apresentação de antígenos e respostas à imunoterapia em um sistema fisiologicamente relevante12. Tais modelos permitem a avaliação de inibidores de pontos de controle, terapias com CAR-T/TCR e anticorpos biespecíficos, ao mesmo tempo que fornecem informações sobre biomarcadores preditivos e mecanismos de resistência.

Além da imunoterapia, os organoides de CCR tornaram-se cada vez mais importantes para triagem de fármacos e aplicações em oncologia de precisão. Culturas derivadas de pacientes podem ser testadas contra agentes quimioterápicos e terapias direcionadas para prever respostas individuais ao tratamento, com diversos estudos demonstrando correlações entre as respostas dos organoides e os desfechos clínicos. Esses sistemas fornecem, portanto, uma alternativa escalável e centrada no paciente aos métodos convencionais baseados em animais10,13,14,15,16,17,18.

Aqui, é apresentado um protocolo viável e escalonável para o estabelecimento de organoides de CCR derivados de pacientes e sua integração com sistemas de co-cultura imune para pesquisas translacionais e pré-clínicas. Tecidos tumorais são dissociados enzimaticamente e incorporados em uma matriz extracelular tridimensional sob condições de crescimento otimizadas que preservam a heterogeneidade tumoral e a diferenciação de linhagem. Os organoides estabelecidos podem ser expandidos, criopreservados, manipulados geneticamente e utilizados em aplicações posteriores, incluindo caracterização molecular, estudos de perturbação por fármacos e perfilagem imune. Além disso, a co-cultura com PBMCs permite a avaliação da citotoxicidade mediada por células imunes, sensibilidade ao bloqueio de pontos de controle imunológico e ativação imune específica ao tumor.

Descrevemos ainda protocolos para o processamento de tecidos, avaliação da qualidade de organoides, análise citométrica de fluxo, imagem de imunofluorescência e monitoramento imunológico baseado em ELISpot. Em conjunto, esses sistemas baseados em organoides fornecem uma plataforma eticamente sustentável e clinicamente relevante para o estudo da biologia do CCR, resistência terapêutica, heterogeneidade tumoral e respostas à imunoterapia. Avanços contínuos na engenharia de organoides e na integração do microambiente continuam a posicionar esses modelos como um pilar fundamental da pesquisa futura sobre CCR e oncologia de precisão.

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Protocolo

Todos os pacientes forneceram consentimento informado conforme o protocolo aprovado pelo IRB do Biobanco do Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center (Einstein IRB# 2021-13730). O suporte para coordenação clínica e regulatória foi fornecido pelo Cancer Clinical Trials Office (CCTO). Os tecidos tumorais foram coletados após ressecção cirúrgica e revisão patológica de rotina, e então processados para fixação em formalina, geração de organoides derivados do paciente ou criopreservação em DMEM com 20% de FBS e 10% de DMSO. Todos os preparos de reagentes estão na Table 1.

1. Estabelecimento de cultura de organoides tumorais a partir de tecido de biópsia ou ressecção (4 h)

  1. Coloque o tecido tumoral recém-obtido em uma placa de Petri estéril e lave-o com o tampão de lavagem para organoides 5 vezes, cada vez por 5 min sob gelo. Usando uma lâmina de barbear estéril ou agulhas finas, dissecione o tecido em pequenos cubos de aproximadamente 1–2 mm3.
    NOTA: Mantenha o tecido úmido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada durante a dissecação para prevenir o ressecamento.
  2. Transfira os fragmentos de tecido dissecados para um tubo Falcon de 15 mL, lave uma vez com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e centrifugue a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente (TA). Descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, transfira os cubos de tecido para uma placa de 6 poços estéril ou uma placa de Petri de 35 mm.
  3. Usando tesoura estéril, angular e autoclavada, pique o tecido em pedaços ainda menores. Usando Colagenase/Hialuronidase 1X suave, dilua 1 mL em 9 mL de DPBS. Adicione 10 µL de Y-27632 (inibidor de ROCK) e 20 µL de Primocin.
  4. Adicione a solução de dissociação pré-aquecida ao tubo de 15 mL contendo os fragmentos de tecido. Revesta novamente a ponteira P1000 antes de pipetar para cima e para baixo para agitar os fragmentos de tecido.
  5. Incubar o tubo de 15 mL em um 37 °C banho-maria agitado por 30 min, invertendo a cada 10 min. Deixe os fragmentos de tecido sedimentarem, transfira a maior parte da solução de digestão para um novo tubo e centrifugue a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Adicione 1 mL de DMEM ao tubo de 15 mL original e pipete vigorosamente com uma ponteira revestida de P1000 para dissociar mecanicamente os fragmentos de tecido e liberar cryptas adicionais.
  7. Verifique o progresso ao microscópio para monitorar se o tecido está se dissociando em células isoladas ou pequenos aglomerados. Transfira 10–20 µL do seu DMEM com fragmentos de tecido para uma placa de Petri e examine ao microscópio para identificar criptas.
    NOTA: O tempo de incubação varia conforme o tipo de amostra. Para biópsias, o tempo de incubação é 15–30 min, e para ressecções cirúrgicas, é 45–60 min.
  8. Uma vez detectados os criptos (ou após 30 min para biópsias/60 min para ressecções), interrompa a digestão com um volume igual de meio basal gelado e centrifugue a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  9. Lave o pellet com DPBS para ressuspendê-lo, em seguida centrifugue novamente. Opcionalmente, transfira a suspensão para um tubo cônico e centrifugue em 300 x g por 5 min a RT para centrifugar as células.
    NOTA: Para CRC, a lise de RBC geralmente não é necessária.
  10. Se o pellet apresentar coloração vermelha, lise os eritrócitos incubando em 5 mL de tampão de lise de hemácias por 15 min à temperatura ambiente. Após a lise, encher imediatamente o tubo com PBS e centrifugar novamente.
  11. Lave o pellet uma vez com DPBS. Centrifugar em 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, depois descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um pequeno volume de meio. Conte as células vivas utilizando um hemocitômetro com exclusão por azul de tripano ou um contador automático de células
  12. Resuspenda as células em Matrigel gelado (matriz da membrana basal) (Opcional: concentração de ~1,5–3 x 104 células por 10 µL meio). Misture a suspensão celular com matriz da membrana basal utilizando ponteiras largas e frias (alguns laboratórios utilizam uma proporção de 1:1 de matriz da membrana basal para meio completo de organoides).
    NOTA: Mantenha a matriz da membrana basal e todas as misturas gelo-frio para prevenir a polimerização prematura.
  13. Placa ~50 µL domos da mistura de matriz de célula–membrana basal em cada poço de uma placa pré-aquecida e estéril placa de cultivo de 24 poços. Incubar a placa em 37 °C por 10–12 min para permitir que a matriz da membrana basal se solidifique em formato de cúpula (coloque a placa de cabeça para baixo).
  14. Após a solidificação da matriz da membrana basal, vire a placa na posição vertical. Adicione cuidadosamente 500 µL/well de meio PDO contendo inibidor Rock (1:1000) e Primocin (1:500).
    NOTA: Utilize Primocin em todos os meios de cultura até que um banco de biobanco de organoides congelados seja estabelecido para prevenir contaminação.
  15. Substitua o meio dos organoides duas vezes por semana com meio de organoides completo e fresco. Monitore regularmente o crescimento dos organoides sob microscópio.

2. Isolamento de PBMCs humanos do sangue (2 h)

  1. Aliquotar 5 mL de Histopaque em tubos estéreis de 15 mL, equilibrar à temperatura ambiente e aplicar cuidadosamente um volume igual de sangue humano fresco (até 5 mL) por cima. Aplicar lentamente o sangue ao longo da parede do tubo sobre o Ficoll sem perturbar a interface; manter o volume total ≤10 mL por tubo.
    NOTA: Manter camadas distintas de Ficoll e sangue antes da centrifugação para uma separação ideal.
  2. Se utilizar vários tubos, balanceá-los adequadamente na centrífuga. Evitar misturar ou agitar. A interface sangue–Ficoll deve permanecer intacta.
  3. Centrifugar a 1500 x g por 15 min à temperatura ambiente. Utilizar configuração de freio 0 para evitar a interrupção do gradiente. Após a centrifugação, camadas distintas se formarão: a) camada inferior de hemácias, b) camada intermediária de PBMC (camada de buffy coat) e c) camada superior de plasma. Aspirar e descartar cuidadosamente o plasma até que a camada de buffy coat fique visível.
    NOTA: Manusear o tubo com cuidado para não perturbar a camada de PBMC.
  4. Utilizando uma pipeta estéril nova, aspirar cuidadosamente a camada de buffy coat que contém os PBMCs e transferir as células para um novo tubo estéril de 15 mL. Para remover Ficoll e plaquetas, lavar as células duas vezes com 10 mL de PBSA (PBS + 0,1% BSA) por centrifugação a 1000 x g por 7 min à temperatura ambiente, descartando cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem.
  5. Para remover plaquetas residuais, lavar uma vez com PBSA, centrifugar a 200 x g por 7 min à temperatura ambiente. Descartar cuidadosamente o sobrenadante. Se o pellet apresentar coloração vermelha, realizar a lise de hemácias incubando em 5 mL de tampão de lise de hemácias a 37 °C por 5 min, depois lavar com PBSA e centrifugar a 200 x g por 7 min à temperatura ambiente.
  6. Resuspender o pellet de PBMCs em 2 mL de DPBS ou meio de cultura e determinar a contagem de células viáveis utilizando azul de tripano com um hemocitômetro ou contador celular automatizado. Se não forem usados imediatamente, criopreservar os PBMCs a 5–10 x 106 células/mL em 90% de FBS e 10% de DMSO. Congelar gradualmente a –80 °C durante a noite, depois transferir para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
  7. Expansão de PBMCs (7–12 dias):
    1. Pelotizar as células por centrifugação a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente. Resuspender a 5 x 105 células/poço em meio de expansão de linfócitos T e ativar com um coquetel de CD3/CD28.
    2. Estimular as células com 500 UI/mL de IL-2 e incubá-las por 3 dias. No dia 3, misturar e contar as células, depois expandir a cultura adicionando meio de expansão de linfócitos T suplementado com IL-2.
    3. Ajustar as células a 1–2,5 x 10^5 células/mL em meio completo de expansão de linfócitos T, incubá-las por 2 dias e monitorar a viabilidade a cada 2–3 dias durante a expansão.
      NOTA: Substituir por meio completo fresco e aquecido a cada 2–3 dias (não exceder >3 dias). Os PBMCs podem ser criopreservados em meio de congelamento de linfócitos T para uso futuro.

3. Co-cultura de organoides (4 dias):

  1. Preparação e controle de qualidade:
    1. Garanta que os organoides estejam saudáveis, livres de contaminação e fenotipicamente caracterizados antes do co-cultivo. Obtenha PBMCs de doadores consentidos ou de fontes comerciais e confirme a viabilidade e o fenótipo básico antes do uso.
    2. Determine se os PBMCs serão usados frescos, repousados ou pré-ativados, e se são autólogos ou alogênicos. Avalie a viabilidade dos organoides, uniformidade de tamanho e expressão de marcadores antes do co-cultivo.
    3. Valide a viabilidade dos PBMCs e a composição imunológica basal (marcadores CD3, CD4, CD8, NK, monócitos), registre os metadados do doador.
  2. Isolamento de organoides para co-cultivo com PBMCs:
    1. Remova o meio de cultura e adicione solução de recuperação celular pré-aquecida em cada poço para dissolver a matriz extracelular e liberar os organoides. Resuspenda suavemente os organoides com uma pipeta de ponteira larga e incube brevemente até que a matriz se dissolva e os organoides sejam liberados.
    2. Transfira a suspensão para um tubo de coleta, adicione 0,5 M de EDTA se necessário e ajuste o volume com tampão balanceado. Centrifugue para obter o pellet de organoides, descarte o sobrenadante, lave com meio basal contendo suplementos (HEPES e Glutamax) e antibióticos, e centrifugue novamente para reobter o pellet.
    3. Resuspenda os organoides em meio de cultura completo, plaque em uma placa tratada para cultura de tecidos e permita recuperação por aproximadamente 24 h antes de qualquer processamento adicional.
  3. Recuperação paralela de PBMCs:
    1. Descongele rapidamente PBMCs criopreservados usando prática padrão e dilua-os imediatamente em meio de expansão de células T pré-aquecido para minimizar o choque osmótico.
      NOTA: Alguma perda celular é típica durante o descongelamento; o pré-aquecimento do meio melhora a recuperação.
    2. Centrifugue os PBMCs descongelados a 400 x g para obter o pellet celular, remova o meio de congelamento e incube brevemente em meio de expansão de células T contendo benzonase para reduzir a agregação celular e melhorar a qualidade da suspensão monocelular.
    3. Lave e reobtenha o pellet de PBMCs em meio de expansão fresco, depois resuspenda em meio de cultura de células T suplementado com citocinas (por exemplo, IL-2) para suportar viabilidade e recuperação. Plaque os PBMCs em uma placa de múltiplos poços para um período de repouso noturno antes do co-cultivo.
  4. Preparação pré-co-cultivo (1 dia antes do co-cultivo):
    1. Opcionalmente, trate os organoides com uma citocina imunoestimulatória (por exemplo, IFN-γ) antes do co-cultivo para potencializar as vias de apresentação de antígenos.
    2. Prepare a placa de co-cultivo com pelo menos 24 h de antecedência revestindo os poços com um anticorpo coestimulatório (por exemplo, anti-CD28) e armazene a 4 °C. Antes do uso, remova o anticorpo não ligado e lave os poços duas vezes com DPBS.
  5. Dissociação de organoides em células únicas (dia do experimento de co-cultivo):
    1. Colete os organoides pré-estimulados, obtenha o pellet e remova o sobrenadante, depois resuspenda no reagente enzimático de dissociação (por exemplo, TrypLE), juntamente com quaisquer células aderentes, para recuperar a população celular completa.
    2. Incube com mistura suave e monitore microscopicamente até que a maioria dos organoides se dissocie em células únicas ou pequenos agregados, evitando digestão excessiva.
    3. Interrompa o reagente de dissociação com tampão, obtenha o pellet celular, remova o sobrenadante e ressuspenda em meio de cultura de células T para contagem e mistura.
  6. Contagem celular e preparação para co-cultivo:
    1. Misture suavemente a suspensão celular e determine o número de células viáveis usando um hemocitômetro ou contador automatizado com corante de viabilidade. Ajuste a razão tumor–PBMC para a densidade desejada no meio de células T.
    2. Prepare os PBMCs obtendo o pellet, ressuspendendo em meio fresco e determinando a contagem de células viáveis. Lave e ressuspenda os PBMCs em meio de cultura de células T suplementado com citocinas (por exemplo, IL-2) e anticorpos imunomoduladores opcionais (por exemplo, anti-PD-1), conforme necessário.
  7. Realize o co-cultivo:
    1. Combine células tumorais dissociadas e PBMCs na razão desejada de efetor:alvo. Lave os poços revestidos com anti-CD28 antes de adicionar as células, evitando o ressecamento dos poços.
    2. Plaque a mistura de organoides e PBMCs no volume necessário para o ensaio e incube em condições padrão de cultura. Renove ou divida os cultivos conforme necessário durante o experimento.
  8. Desenho experimental e controles (para estratégia de tratamento):
    1. Use o sistema de co-cultivo para avaliar como fármacos (por exemplo, inibidores de pontos de controle ou moléculas pequenas) modulam as respostas de PBMCs a organoides tumorais.
    2. Inclua réplicas biológicas (várias linhagens de organoides e doadores de PBMCs) e réplicas técnicas (pelo menos três poços por condição).
    3. Inclua controles: apenas organoides, apenas PBMCs (veículo ou ativado), organoides + PBMCs (veículo), organoides + fármaco e PBMCs + fármaco.
  9. Modelos típicos de pontos temporais de co-cultivo:
    1. Analise os co-cultivos aos 24, 48 e 72 h após o início para avaliar ativação imune, proliferação, secreção de citocinas, apoptose e morte celular tumoral.
    2. Avalie marcadores precoces de ativação e secreção de citocinas em 24 h, e avalie citotoxicidade, proliferação e marcadores de ativação/esgotamento em 48–72 h usando citometria de fluxo, imagens ou ensaios de viabilidade.
      NOTA: Pontos temporais posteriores (por exemplo, dias 5–7) podem ser incluídos para avaliar ativação crônica, esgotamento imune ou respostas a longo prazo aos fármacos.
  10. Coloração por imunofluorescência de organoides:
    1. Lave as lâminas em PBS por 5 min e fixe-as em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min à temperatura ambiente (RT). Após a fixação, lave as lâminas em PBS duas vezes por 5 min cada.
      NOTA: Mantenha os organoides hidratados durante todo o processo de coloração. As lâminas podem ser armazenadas em PBS à RT por até 3 h, se necessário, mas evite armazenamento prolongado em PBS.
    2. Permeabilize os organoides com Triton X-100 a 0,1–0,5% em PBS por 15–20 min à RT para permitir coloração intracelular e nuclear, preservando a estrutura dos organoides.
      NOTA: Evite superpermeabilização, pois pode danificar a estrutura dos organoides. A permeabilização adequada garante coloração uniforme do citoplasma e núcleo, preservando a morfologia para imagens.
    3. Lave as lâminas duas vezes com tampão IF 1x e bloquee com BSA a 1–10% (ou soro compatível com a espécie) em tampão IF por 60–120 min à RT para reduzir coloração inespecífica.
      NOTA: O BSA é adequado para bloqueio geral, mas o soro compatível com a espécie é recomendado para coloração de marcadores específicos, para reduzir ligação inespecífica e melhorar a especificidade do sinal.
    4. Lave as lâminas três vezes (5 min cada) e incube com anticorpos primários (10–50 µg/mL) em tampão de bloqueio com 1% de soro, durante a noite a 4 °C em câmara umidificada.
      NOTA: Cubra as lâminas com parafilm para evitar evaporação e otimize a concentração do anticorpo primário por titulação, para obter coloração específica com fundo mínimo.
    5. Lave as lâminas em IF 1x por 3 x 5 min.
      NOTA: A lavagem deve ser otimizada para cada coloração de anticorpo. Se mais de um anticorpo primário for usado simultaneamente, a lavagem deve ser padronizada.
    6. Incube as lâminas com anticorpos secundários conjugados a fluoróforos (1:200–1:500 em tampão de bloqueio com 1% de soro) em câmara umidificada durante a noite a 4 °C ou por 2 h à RT no escuro.
      NOTA: Após adicionar o anticorpo secundário, realize todos os passos subsequentes no escuro para evitar fotobranqueamento dos fluoróforos.
    7. Lave as lâminas com tampão IF 1x (2 x 5 min), seguido por PBS (5 min). Incube com DAPI (1 µg/mL) e anticorpos conjugados a AlexaFluor-594 (20 µg/mL) em tampão de bloqueio com 5% de soro por 1 h à RT no escuro, depois lave com PBS (3 x 5 min).
    8. Adicione meio de montagem às lâminas e cubra com lamínula, invertendo cuidadosamente a lamínula sobre a lâmina para evitar bolhas de ar. Alternativamente, se usar meio de montagem contendo DAPI, omita a coloração com DAPI. Use meio de montagem rígido para aplicações de digitalização de lâminas.
    9. Deixe as lâminas secarem à temperatura ambiente por uma hora, armazene a –20 °C e visualize usando microscopia confocal ou digitalizador de lâminas.

4. Protocolo de citometria de fluxo e coloração intracelular para organoides

  1. Aspire cuidadosamente o meio de cultura de organoides e lave suavemente os organoides uma vez com PBS 1x para remover o meio residual e proteínas séricas. Libere os organoides da matriz extracelular utilizando solução de recuperação ou PBS frio e pipete suavemente para romper a matriz, minimizando ao máximo o estresse de cisalhamento.
  2. Transfira a suspensão de organoides para um tubo de centrífuga, centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante. Re-suspenda o pellet de organoides em 250–500 µL de solução de TrypLE 0,05% para dissociação enzimática. Incube a 37 °C para digestão eficiente das junções célula-célula.
    NOTA: A cada 5 min, misture suavemente a suspensão batendo levemente no tubo e pipetando para cima e para baixo, e monitore ao microscópio até obter uma suspensão de células únicas sem digestão excessiva.
  3. Passe a suspensão celular através de um filtro celular de 40 µm para remover agregados. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min a 4 °C e re-suspenda em PBS 1x sem tampão de Ca2+/Mg2+.
  4. Conte as células e ajuste para ~1 x 106 células/mL em tampão de marcação. Incube com bloqueador de Fc (1:200) e corante de viabilidade (por exemplo, Live/Dead Blue, 1:1000–1:3000) para reduzir a ligação não específica e identificar células vivas/mortas.
  5. Incube as células por 30 min à temperatura ambiente (RT) no escuro, depois lave uma vez com PBS 1x e uma vez com tampão de marcação.
  6. Prepare o coquetel de anticorpos de superfície misturando cada anticorpo na sua diluição de trabalho otimizada em tampão de marcação e calcule os volumes totais usando os valores titulados em µL/teste para a mistura mestra.
    NOTA: Se o seu painel contiver múltiplos fluorocromos baseados em polímeros (por exemplo, Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet ou corantes Brilliant Blue), inclua o Brilliant Stain Buffer (BSB) no coquetel de anticorpos para reduzir interações entre fluorocromos e melhorar a resolução do sinal. Adicione o BSB de acordo com as instruções do fabricante (geralmente concentração final 1x), misture suavemente e prepare uma mistura mestra para todas as amostras (~10% de volume extra). Proteja da luz e mantenha na gelo até o uso.
  7. Adicione o coquetel de anticorpos e incube por 30–50 min à temperatura ambiente no escuro. Lave com tampão de marcação e PBS (sem Ca2+/Mg2+), depois centrifugue a 500 x g por 5 min. Prepare a solução de fixação/permeabilização de trabalho diluindo o concentrado com o diluente. Por exemplo, 1 parte de concentrado: 3 partes de diluente (obtendo concentração 1x ou conforme especificado).
  8. Adicione a solução de fixação/permeabilização para re-suspender completamente as células (~100–200 µL por 1 milhão de células) e incube por 15–20 min à temperatura ambiente ou a 2–8 °C, protegido da luz. Após o tempo de fixação, lave as células com tampão de permeabilização 1x. Descarte o sobrenadante. Repita a lavagem pelo menos uma vez (às vezes duas vezes) para remover o fixador em excesso.
  9. Prepare um coquetel de marcação intracelular diluindo anticorpos conjugados com fluoróforos em concentrações otimizadas em tampão de permeabilização 1x. Adicione o coquetel de anticorpos intracelulares às células permeabilizadas, incluindo anticorpos direcionados a citocinas, fatores de transcrição ou proteínas fosforiladas, conforme necessário.
  10. Incube as células por 2 h à temperatura ambiente no escuro.
    NOTA: Se necessário, o tempo de incubação pode ser reduzido ao mínimo recomendado pelo fabricante ou realizado durante a noite a 4 °C no escuro, sem afetar a qualidade da marcação.
  11. Lave as células duas vezes com tampão de permeabilização 1x e uma vez com tampão de marcação, depois re-suspenda o pellet em 250–300 µL de tampão de marcação.
  12. Passe a suspensão através de um filtro de 40 µm para obter uma suspensão de células únicas e mantenha as amostras na gelo ou a 4 °C, protegidas da luz, até a análise. Evite armazenamento prolongado das amostras marcadas e analise-as no citômetro o mais rapidamente possível após a marcação.
  13. Utilize um citômetro de fluxo com lasers e filtros apropriados compatíveis com os fluoróforos. Configure os controles de compensação, incluindo amostras individualmente marcadas e controles de fluorescência menos um (FMO).
  14. Adquira pelo menos 50.000–100.000 eventos por amostra para análise estatística robusta. Analise os dados utilizando software como FlowJo, FCS Express ou equivalente. Aplique o gate em células vivas e únicas. Analise a expressão de marcadores de superfície e intracelulares.
    NOTA: Titule cada conjugado de anticorpo-fluoróforo utilizando diluições seriadas para identificar a concentração ótima que forneça sinal máximo, fundo mínimo e separação clara das populações.

5. Análise de apoptose baseada em Annexina V por citometria de fluxo:

  1. Controles e reagentes essenciais:
    1. Controle não corado: Estabelece a linha de base da autofluorescência celular, permitindo discriminar o sinal verdadeiramente positivo do fundo.
    2. Controles de coloração simples: Necessários para cada fluoróforo no painel, para permitir a compensação adequada (citometria convencional) ou a separação espectral (citometria espectral). Eles garantem a separação precisa dos sinais entre os canais.
    3. Controles de fluorescência-menos-um (FMO): Essenciais para definir as portas de populações fracas ou transicionais. Eles ajudam a evitar a superestimação de eventos fracamente positivos.
    4. Controle positivo para apoptose: Uma amostra deliberadamente induzida à apoptose (por exemplo, células tratadas com estauropolina) valida que o ensaio detecta com confiabilidade eventos apoptóticos.
    5. Controles de isotipo: Não são úteis para a própria Annexina V, já que sua ligação é específica ao fosfolipídio e não mediada por anticorpos. No entanto, podem ser incluídos para anticorpos adicionais de marcadores de superfície, se necessário.
      NOTA: Utilize tampão de ligação de Annexina V contendo íons cálcio, pois a ligação da Annexina V depende de cálcio; use um tampão comercial ou validado equivalente.
    6. Um corante de viabilidade impermeável à membrana (por exemplo, PI, 7-AAD, DAPI ou corantes fixáveis para células mortas) é usado para distinguir células apoptóticas precoces de células apoptóticas tardias/necróticas. Escolha um corante compatível com os lasers do citômetro de fluxo e com as condições de fixação.
  2. Procedimento de coloração:
    1. Recolha as células em co-cultura centrifugando as placas a 500 x g durante 5 min. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante para remover o meio de cultura e os detritos flutuantes. Lave as células duas vezes com tampão de coloração frio (por exemplo, PBS com 1–2% de FBS) para reduzir a coloração de fundo e remover proteínas interferentes.
    2. Se marcadores de linhagem ou subpopulações forem necessários (por exemplo, CD8 para PBMCs, marcador de células-tronco tumorais como Lgr5 em células tumorais), incube as células com coquetéis de anticorpos por 30–45 min à temperatura ambiente em agitador suave, protegidas da luz. A coloração de superfície nesta etapa preserva a integridade dos antígenos e permite análise específica por compartimento.
    3. Lave as células duas vezes: primeiro com tampão de coloração frio para remover anticorpos não ligados, seguido por tampão de ligação de Annexina V (por exemplo, BioLegend nº de cat. 422201) para garantir a disponibilidade de cálcio. Ajuste a concentração celular para aproximadamente 1 x 106 células/mL no tampão de ligação.
    4. Adicione 5 µL do reagente de Annexina V conjugado com fluoróforo a 100 µL de suspensão celular por amostra. O fluoróforo escolhido deve ser espectralmente compatível com os demais corantes do painel.
    5. Contracoloração com um corante de viabilidade, como PI, 7-AAD ou DAPI. Para PI e DAPI, as diluições ideais geralmente variam de 1:1000 a 1:60.000, dependendo do instrumento e da intensidade do laser, e devem ser determinadas empiricamente. Corantes de viabilidade fixáveis são preferíveis se for necessária fixação posterior.
    6. Resuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo e incube por 20–40 min à temperatura ambiente no escuro. O tempo ideal de incubação deve ser determinado empiricamente, pois incubações excessivas podem aumentar a ligação inespecífica ou falsos positivos.
    7. Adicione 200 µL de tampão de ligação de Annexina V a cada poço (mínimo de 100 µL se as amostras forem altamente concentradas). Isso fornece volume suficiente para citometria de fluxo e mantém as condições do tampão durante a aquisição. Adquira as amostras imediatamente em um citômetro de fluxo calibrado, garantindo que as configurações de voltagem estejam otimizadas para separar claramente populações negativas e positivas.
  3. Estratégia recomendada de portas:
    1. Utilize gráficos de dispersão para frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) para eliminar detritos pequenos e agregados grandes, mantendo apenas células íntegras. Aplique o gate FSC-A versus FSC-H (ou FSC-W) para remover dupletos e agregados, assegurando que apenas células únicas sejam analisadas.
    2. Com base no corante de viabilidade, exclua células mortas fortemente positivas, se apropriado. Alternativamente, inclua o corante nos quadrantes de análise de Annexina V. Use marcadores de superfície para distinguir PBMCs (por exemplo, CD45+) de células tumorais (por exemplo, EpCAM+ ou outro marcador específico de tumor). Isso permite a quantificação específica por compartimento da apoptose.
    3. Dentro de cada compartimento selecionado, plote Annexina V versus corante de viabilidade para gerar quatro populações: a) Annexina V− / Corante− = Células viáveis; b) Annexina V+ / Corante− = Células apoptóticas precoces; c) Annexina V+ / Corante+ = Células apoptóticas tardias ou necróticas; d) Annexina V− / Corante+ = Células primariamente necróticas ou artefatos (a serem interpretados com cautela).
    4. Subdivida ainda mais os PBMCs em subpopulações (por exemplo, linfócitos T CD4, linfócitos T CD8, células NK, monócitos) para examinar os perfis de apoptose em populações imunes específicas.

6. Ensaio ELISPOT para monitoramento de linfócitos T em culturas co-culturais de organoides (3 dias):

  1. No Dia 0, lave a placa de 96 poços com membrana de PVDF pré-revestida e ative-a. Armazene a 4 °C por 24 h de acordo com o kit de protocolo ELISpot para detecção do anticorpo/citocina de interesse.
  2. No Dia 1,
    1. Prepare os organoides como uma suspensão de células únicas conforme descrito na seção 3.5. Centrifugue a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT), em seguida, ressuspenda no meio CTL (fornecido com o kit CTL ELISpot). Descongele os PBMCs criopreservados ou utilize os PBMCs isolados frescos. Centrifugue os PBMCs a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Ressuspenda os PBMCs no meio do kit. Realize o co-cultivo misturando suavemente as células únicas dos organoides com os PBMCs numa proporção de 5:1. Adicione 200 µL/poço da mistura de co-cultivo a cada poço da placa de ensaio pré-ativada de 96 poços. Bata na placa com muito cuidado. Incube por 4 h a 37 °C. Após 4 h, retire cuidadosamente a placa de ensaio do incubador. Adicione os tratamentos aos poços designados, incluindo controles positivo e negativo apropriados.
      NOTA: A proporção entre organoides e PBMCs deve ser otimizada para obter um desenvolvimento ideal das manchas de citocinas e resultados de digitalização.
  3. No Dia 2,
    1. Após 24 h de incubação, siga o protocolo de coloração do fabricante. Inclua controles para coloração simples e dupla a fim de detectar e comparar o número de células que secretam os marcadores especificados. O tempo de incubação varia conforme a cor, e o desenvolvimento das manchas deve ser monitorado regularmente. Digitalize a placa conforme as instruções do fabricante. Plote e compare as manchas imunes secretadas.
      NOTA: Com base no delineamento experimental e nos marcadores de interesse, a relação entre as células semeadas e as manchas indica a expressão da citocina/anticorpo em coloração simples ou dupla.

7. Detecção em tempo real da apoptose utilizando Annexina V NIR e imagem de células vivas (3 dias):

Combinado com imagem automatizada de células vivas, o Annexin V NIR permite o monitoramento em tempo real e em alto rendimento da morte celular apoptótica para análise de resposta a fármacos e citotoxicidade.

  1. No Dia 0, prepare os organoides como uma suspensão de células únicas. Marque as células com um rastreador celular GFP. Semee as células únicas marcadas em 100 µL de meio completo por poço. Permita que as células adiram e formem aglomerados.
    NOTA: Utilize placas de fundo redondo de 96 poços, com superfície ultra-baixa de adesão. Densidades típicas iniciais (ajustar empiricamente): 5.000 células/poço, 10.000 células/poço. Inclua poços para controle negativo sem tratamento, controle de veículo e quaisquer tratamentos experimentais (em triplicata ou mais).
  2. No Dia 1, descongele PBMCs criopreservados ou utilize PBMCs recém-isolados. Centrifugue os PBMCs a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Re-suspenda os PBMCs em meio de expansão suplementado com IL-2 e incube-os no incubador.
  3. No Dia 2, marque os PBMCs com corante amarelo rastreador celular. Após a marcação, re-suspenda os PBMCs em RPMI. Remova cuidadosamente o meio dos organoides da placa. Realize a co-cultura misturando suavemente as células únicas dos organoides com os PBMCs numa proporção de 1:5. Adicione 200 µL de meio RPMI contendo PBMCs a cada poço da mistura de co-cultura. Toque levemente na placa e coloque-a no incubador.
    NOTA: Evite perturbar as células únicas dos organoides no fundo dos poços.
  4. Incube por 2–4 h a 37 °C. Após 4 h, remova cuidadosamente a placa do incubador.
  5. Prepare os poços com os fármacos, incluindo controles positivo e negativo apropriados. Reconstrua o reagente liofilizado de Anexina V NIR em 100 µL de meio completo ou PBS, misturando suavemente. Prepare um meio de tratamento 2x contendo Anexina V NIR na concentração final desejada multiplicada por dois (por exemplo, 1:100 para uma diluição final de 1:200) e assegure que o meio contenha ≥1 mM Ca2⁺.
  6. Adicione a diluição 1:200 de Anexina V NIR aos poços. Coloque a placa em um incubador para imagem em tempo real por 48–72 h.
    NOTA: A proporção organoide: PBMC deve ser otimizada para garantir interações célula-célula suficientes e respostas apoptóticas mensuráveis.
  7. Imagem e análise em tempo real
    1. Utilize uma objetiva de 4x ou 10x e adquira imagens no canal NIR para Anexina V NIR (mais canais adicionais, se houver multiplexação). Varra a placa a cada 4–6 h durante 24–72 h, conforme a duração do tratamento.
    2. Utilize um software de imagem em tempo real, como o IncuCyte CX3. Para quantificação básica, analise o canal NIR utilizando área total ou contagem de objetos; para cinética em nível de célula única, utilize os módulos de análise célula por célula ou análise de objetos. Se houver multiplexação (por exemplo, rastreador celular amarelo e GFP), consulte as notas sobre separação espectral.

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Resultados

Para começar, geramos organoides tumorais a partir de espécimes de diversos pacientes utilizando um fluxo de trabalho padronizado (Figura 1). Esses PDOs normalmente exigem 2 semanas de estabelecimento, após as quais podem ser expandidos e subcultivados para pesquisas adicionais. Deve-se observar que o tempo de estabelecimento e a geração de organoides variam entre os tecidos. Por exemplo, alguns tecidos precisam de tempo adicional para gerar os organoides, e alguns organoides precisam de mai...

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Discussão

Neste protocolo, foi descrito um método viável e reprodutível para gerar organoides derivados de pacientes (PDOs) e linfócitos T expandidos a partir do nosso repositório de biobanco. Também foram descritos em detalhes o arranjo de co-cultivo de PDOs com carcinoma colorretal (CRC) para nossas amostras de pacientes com diferentes mutações, juntamente com o regime de tratamento. Os resultados obtidos demonstraram o efeito do tratamento em modelos de co-cultivo.

O sistema de co-cultivo de organoid...

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Divulgações

C.K. declara os seguintes conflitos de interesses, todos sem relação com este manuscrito: Loki Therapeutics (financiamento para pesquisa), Teiko (consultor), Seattle Genetics (consultor), Insights Driven Research (consultor), BMS (consultor), Guardant Health (consultor), OMNI Oncology (consultor), Exelixis (consultor), Nuvectis Pharma (consultor, medicamentos), Real CME (honorários). C.K. e N.T. são co-inventores do pedido de patente provisória dos EUA nº 63/746.435, arquivado em 17 de janeiro de 2025, o qual não tem relação com este manuscrito. Os demais autores não têm conflitos de interesses a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330). Agradecemos a Hillary Guzik, Rotem Alon, Jinghang Zhang, Swathi Swaminathan e Jacky Chuen pela assistência técnica. Os estudos de citometria de fluxo foram realizados utilizando um analisador Cytek Aurora financiado pelos National Institutes of Health (1S10OD026833-01) na Instalação Central de Citometria de Fluxo da Albert Einstein College of Medicine. As imagens confocais foram obtidas utilizando um microscópio Leica STELLARIS 8 financiado pelo NIH (1S10OD034397-01) na Instalação de Imagem Analítica da Albert Einstein College of Medicine. E.N., W.E. e C.K. foram apoiados por concessões do NIH: T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 e K12CA279871. Os financiadores não tiveram papel na elaboração do manuscrito.

Também agradecemos ao Instituto Ruth L. e David S. Gottesman para Pesquisa em Células-Tronco e Medicina Regenerativa pelos pesquisadores MM, NS e NT.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos, Reagentes e Anticorpos
Suplemento B27 sem vitamina A GIBCO C12587-010
Suplemento B27 GIBCO 17504-044 
N-acetilcisteína Sigma-Aldrich A9165-5G 
Nicotinamida Sigma-Aldrich N0636 
EGF recombinante humano Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
Prostaglandina E2 Cayman Cehmicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
Colagenase tipo II Sigma-Aldrich C6885 
Hialuronidase tipo IV Sigma-Aldrich H3506 
DMEM-F12 Avançado GIBCO 12634-028 
Penicilina/estreptomicina GIBCO 15070063
Ultraglutamina tipo I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
Meio de Congelamento de Cultura Celular Recovery GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
Soro humano, proveniente de plasma humano masculino AB Sigma-Aldrich H3667 
Benzonase Merck 70746-3 
Interferon gama recombinante humano Peprotech 300-02 
Dispase tipo II Sigma-Aldrich D4693 
Solução de Recuperação Celular Corning 354253
Primocin InvivogenInvivogen ANTPM1NC9141851
IL-2 humana recombinante (expressa em E. coli, sem carreador)Biolegend791906
IL-7 humana recombinante (expressa em E. coli, sem carreador)Biolegend569706
IL-15 humana recombinante (sem carreador)Biolegend570306
CD107a (LAMP-1) anti-humano PE/Cianina5Biolegend328656
CD137 (4-1BB) anti-humano Brilliant Violet 711™Biolegend309832
Anticorpo CD8a anti-humano Pacific Blue™Biolegend300928
CD3-APC/Cy7 anti-humanoBiolegend317342
CD4PerCP/Cianina5.5 anti-humano CD4Biolegend980810
Granzima B anti-humano/mouse Alexa Fluor® 647Biolegend515406
CD56-PE/Cy7 anti-humanoBiolegend985912
Anticorpo IFN-γ anti-humano PE/Dazzle™ 594Biolegend506530
CD274 (B7-H1, PD-L1) anti-humano PEBiolegend393608
Anticorpo purificado anti-humano CD28Biolegend302901
Anticorpo CD45 anti-humano Brilliant Violet 510™Biolegend304036
CD326 (EpCAM) anti-humano camundongo (conjugado com PE/Cy7)Biolegend324222
anti-Ki67Abcamab15580
Kit de Ensaio Caspase-3 NucView® 488 para Células VivasBiotium30029
Kit de Detecção de Apoptose FITC Anexina V com PIBiolegend640914
Anexina V PE/Cianina7Biolegend640950
Anexina V Incucyte® com Corante NIRSartorious4768
Kit de Coloração Fixável Azul para Células Mortas LIVE/DEAD™, para excitação UVInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
Cell Trace Far redThermo FischerC34564
CMFDA verdeMedChem ExpressHY-126561 
TruStain FcX™ humano (Solução de Bloqueio de Receptores Fc)Biolegend422302
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ Stain Buffer (BSA)BD Biosciences554657
Contas de CompensaçãoBiolegends424602
Corning® Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco’s, 1X sem cálcio e magnésioCorning20-031-CM
Corning® Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco’s, 1X com cálcio e magnésioCorning20-030-CV
Anticorpo anti-PD1 humano (nivolumabe)Merus/SelleckchemA2002
Dissulfeto de dimetilaFisher ScientificBP231-100 
DMEMGenesee25-500
Tampão de EDTAInvitrogen15575020
FBSVWR97068-075
PBSGenesee25-507
Parafomaldeído (PFA)Thermo Scientific Chemicals0473779L
Kit de Solução de Fixação/PermeabilizaçãoBD554714
Gastrina I HUMANAMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
Coquetel CD3/CD28 STEMCELL Technologies 10971
Meio de Expansão ImmunocultSTEMCELL Technologies 10981
ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPIInvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Chemicals215680025
Solução de azul de tripano, 0,4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
Equipamentos
Fluxocitômetro/Núcleo de FluxocitometriaCytek (Wuxi) BiosciencesNº do modelo N7-0021
Fluxocitômetro/Laboratório SinghInvitrogenATTUNE NXT (Nº do modelo 4486517
Microscópio ConfocalLeicaSTELLARIS 8
Sistema de análise de células vivasSartoriusIncucyte CX3

Referências

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