Uma série de derivados de acetamida à base de triazol e oxadiazol foi sintetizada e avaliada como inibidores de urease e α-glicosidase. O composto 8c apresentou a maior inibição da ureasa, enquanto o 9e superou a acarbose contra a α-glucosidase. Estudos de ligação à BSA e in silico confirmaram suas propriedades semelhantes às de medicamentos, identificando ambos os compostos como candidatos promissores a liderar.
Artigo de investigação
Síntese, avaliação biológica e estudos em sílico de novas acetamidas à base de triazol e oxadiazol como inibidores de urease e α-glicosidase
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo investigou o potencial terapêutico dos novos derivados de acetamida baseados em 1,2,4-triazol e 1,3,4-oxadiazol como inibidores de alvo duplo da urease e da α-glucosidase, duas enzimas implicadas em distúrbios gastrointestinais e diabetes tipo 2, respectivamente. Uma abordagem integrada que combina síntese orgânica em múltiplos passos, avaliação biológica in vitro , acoplamento molecular, previsão ADME in silico e análise da teoria funcional da densidade (DFT) foi empregada para identificar compostos líderes potentes com propriedades farmacocinéticas favoráveis. A partir do ácido benzoico, uma série de derivados de 1,2,4-triazol (8a–c) e derivados de 1,3,4-oxadiazol (9d–f) portando metades substitutas de acetamida foram sintetizados com sucesso. Todos os compostos apresentaram atividade inibitória contra ambas as enzimas-alvo. O composto 8c foi o inibidor de urease mais potente (IC₅₀ = 6,14 ± 1,06 μM), enquanto o composto 9e apresentou a inibição de α-glicasse mais forte (IC₅₀ = 27,29 ± 0,41 μM), superando o inibidor de referência acarbose (IC₅₀ = 38,25 ± 0,12 μM). Análises computacionais apoiaram os achados experimentais: as previsões do ADME indicaram propriedades favoráveis semelhantes às de medicamentos, e o acoplamento molecular demonstrou fortes interações de ligação, com o composto 8a apresentando a maior afinidade para α-glucosidase (−7,165 kcal/mol) e o composto 9e mostrando a ligação mais forte à urease (−7,30 kcal/mol). Os cálculos da DFT correlacionaram ainda mais a atividade biológica com propriedades eletrônicas, revelando lacunas de energia relativamente pequenas do HOMO–LUMO para os compostos mais ativos, 8c (0,14831 a.u.) e 9e (0,14302 a.u.). Coletivamente, esses achados identificam os compostos 8c e 9e como andaimes promissores para o desenvolvimento de inibidores de próxima geração de urease e α-glucosidase.
Introdução
Os heterocíclicos já foram relatados em muitos medicamentos existentes, e os heterociclos representam uma classe importante de inibidores enzimáticos usados no tratamento de doenças metabólicas einfecciosas. Entre os heterociclos, os 1'3'4-oxadiazoles estão entre os mais estudados em descoberta de fármacos e foram relatados como agentes antivirais, antibacterianos, anticancerígenos, hipotensos, neuroprotetores, anticonvulsivantes eantituberculares 2, 3,4,5. Da mesma forma, derivados de 1'2'4-triazol também demonstraram atividades anticonvulsivas, antibacterianas, antivirais, antituberculosas, antidiabéticas, antiinflamatórias, antiproliferativas, antioxidantes, antimaláricas e inibitóriasda ureasa. 6,7. Compostos contendo acetamida possuem um forte perfil farmacológico e têm sido usados como intermediários sintéticos na química heterocíclica, bem como antidiabéticos, agentes anticoagulantes e quimiosensibilizantes, tornando-os estruturas principais atraentes para a descoberta defármacos 8,9.
Esforços significativos têm sido direcionados ao desenvolvimento de inibidores multialvo de α-glucosidase e ureasa. A inibição da α-Glucosidase atrasa a digestão e absorção de carboidratos de carboidratos, reduzindo assim os níveis de glicose no sangue pós-prandiais em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. Inibidores atuais, como a acarbose, são eficazes, mas estão associados a efeitos colaterais gastrointestinais, o que cria a necessidade de inibidores estruturalmente diversos10,11. A urease decompõe a ureia em amônia e dióxido de carbono. A reação permite que a bactéria Helicobacter pylori, que causa úlceras e torna o hospedeiro mais suscetível ao câncer gástrico, sobreviva no estômago e, portanto, a urease é um alvo importante no desenvolvimento de medicamentos antiúlceras. A O objetivo terapêutico é o desenvolvimento de novos inibidores para ambas as enzimas 9,12.
No entanto, apesar dos estudos disponíveis sobre andaimes de 1'2'4-triazol e 1'3'4-oxadiazol, poucos estudos foram relatados relacionados aos derivados de acetamida 1'2'4-triazol e 1'3'4-oxadiazol contendo uma metade de tioéter como inibidores duplos de α-glucosidase eurease. Seu comportamento de ligação a proteínas e caracterização computacional também receberam atenção limitada nesse contexto. Aqui, Propomos que a fusão do triazol ou oxadiazol com fragmentos de acetamida substituídos na mesma estrutura molecular resultaria em um perfil inibitório enzimático satisfatório com propriedades fisicoquímicas aceitáveis.
Para testar essa hipótese, uma série de derivados de acetamida à base de 1,2,4-triazol (8a–c) e derivados de acetamida à base de 1,3,4-oxadiazol (9d–f) foram sintetizados e avaliados quanto à sua atividade inibitória contra α-glicasas e urease. As interações de ligação dos compostos mais ativos (8a, 8c e 9e) com a albumina sérica bovina (BSA) foram investigadas por espectroscopia de fluorescência, determinação de constantes de ligação e análise termodinâmica. Além disso, foram realizados cálculos de acoplamento molecular, previsão ADME e teoria da função da densidade (DFT) para investigar seus modos de ligação, propriedades farmacocinéticas e características eletrônicas.
Protocolo
Todos os reagentes eram de grau analítico e usados sem purificação adicional. O progresso da reação foi monitorado por cromatografia de camada fina (TLC) em gel de sílica usando n-hexano/acetato de etila (7:3–6:4, v/v), com pontos visualizados sob luz ultravioleta. Salvo indicação em contrário, todas as reações foram realizadas sob atmosfera ambiente. Os compostos sintetizados foram caracterizados por espectroscopia de transformada de Fourier no infravermelho (FTIR), RMN de 1H e RMN de 13C. Os espectros de RMN de 1H e 13C foram registrados em CDCl₃ a 600 MHz e 150 MHz, respectivamente, e deslocamentos químicos foram relatados em ppm em relação ao sinal residual do solvente. A via sintética é representada na Figura 1. Os dados completos de caracterização fisicoquímica para todos os compostos sintetizados são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
Síntese do benzoato de etil (1)
Ácido benzóico (50 g, 0,41 mol) foi colocado em um frasco de fundo arredondado de 500 mL, e etanol absoluto (150 mL) foi adicionado. Ácido sulfúrico concentrado (6 mL) foi adicionado gota a gota como catalisador sob agitação magnética contínua. A mistura de reação era aquecida sob refluxo a 78 °C por 4–6 horas usando um condensador resfriado a água. O progresso da reação foi monitorado pela TLC. Após a conclusão, a mistura era resfriada até a temperatura ambiente e neutralizada com carbonato de sódio aquoso saturado até que o pH atingisse 7–8. A mistura de reação foi transferida para um funil separador, e a camada orgânica foi coletada, lavada com água destilada e seca sobre sulfato de sódio anidro. Após a filtração, o benzoato de etil (1) foi usado diretamente na etapa seguinte, sem purificação adicional (Figura 1).
Síntese de benzohidrazida (2)
O benzoato de etílico (1; 0,41 mol) foi dissolvido em etanol absoluto (100 mL), e hidrazina hidratada (80%, 25 mL, excesso) foi adicionada sob agitação contínua. A mistura de reação era aquecida sob refluxo a 78 °C por 4–5 horas em ar usando um condensador resfriado a água. O progresso da reação foi monitorado pela TLC. Após a conclusão, o precipitado cristalino branco da benzohidrazida (2) foi coletado por filtração, lavado com etanol frio, secado até peso constante em temperatura ambiente e usado em etapas sintéticas subsequentes (Figura 1).
Síntese de 5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-tiol(3)
Benzohidrazida (2; 10 g, 0,073 mol) e hidróxido de potássio (4,12 g, 0,073 mol) foram colocados em um frasco de fundo arredondado de 250 mL contendo etanol (30 mL). A mistura foi aquecida sob refluxo a 78 °C por 10 minutos usando um condensador refrigerado a água. O dissulfeto de carbono (CS₂; 5 mL, 0,083 mol) foi então adicionado, e o refluxo foi continuado por mais 3–4 horas. O progresso da reação foi monitorado pela TLC. Após a conclusão, a mistura de reação era transferida para água destilada e aquecida com agitação contínua. Ácido clorídrico diluído foi adicionado gota a gota até que o pH atingisse 5, resultando na precipitação do composto (3) (Figura 1). O precipitado era coletado por filtração, lavado cuidadosamente com água destilada fria, seco até peso constante e pesado para determinar o rendimento. O composto foi caracterizado por espectroscopia FTIR, RMN de 1H e RMN de 13C.
Síntese de 4,5-difenil-4H-1,2,4-triazola-3-tiol(4)
Benzidraida (2; 5 g, 0,037 mol) e fenilisotiocianato (4 mL, 0,037 mol) foram colocados em um frasco de fundo arredondado de 100 mL equipado com um condensador refrigerado a água. A mistura de reação foi aquecida sob refluxo a 78 °C até que a formação do intermediário tiosemicarbazida estivesse completa, conforme confirmado pelo TLC usando n-hexano/acetato de etila (7:3, v/v). Hidróxido de potássio (2 g, 0,036 mol), dissolvido em etanol (20 mL), foi então adicionado, e o refluxo continuou até a formação do composto (4), conforme confirmado pela TLC. A mistura de reação foi transferida para água destilada, aquecida com agitação contínua e acidificada com ácido clorídrico diluído até pH 5 para precipitar o composto (4) (Figura 1). O precipitado foi coletado por filtração, lavado cuidadosamente com água destilada fria, seco até peso constante e caracterizado por espectroscopia FTIR, RMN de 1H e RMN de 13°C.
Síntese de intermediários de bromoacetamida 7(a–f)
Cada derivado substituído da anilina 5(a–f) (1 equiv.) foi dissolvido em clorofórmio e resfriado em um banho de gelo para manter a temperatura da reação entre 0 e 5 °C. Bromocetila brometo (6, ≥98%, 1 equivalente) foi adicionado gota em gota com mexer contínuo. Durante a reação, foi adicionada uma solução aquosa de carbonato de sódio a 18% conforme necessário para manter o pH da reação entre 9 e 10, neutralizando o ácido bromídico gerado. Após a adição completa do brometo de bromoacetil, a mistura de reação era deixada aquecer até a temperatura ambiente e misturada até que a TLC confirmasse o consumo completo do material inicial. Os intermediários resultantes de bromoacetamida 7(a–f) foram coletados por filtração, lavados com água destilada fria, secos até peso constante e usados diretamente na etapa sintética subsequente, sem purificação adicional (Figura 1).
Síntese de derivados de acetamida à base de triazol 8(a–c)
Derivado de triazol (4; 0,5 g, 0,002 mol) foi dissolvido em N, N-dimetilformamida (10 mL) em um frasco de fundo arredondado de 50 mL. O intermediário apropriado de bromoacetamida (7a, 7b ou 7c; 0,002 mol, 1 equiv.) foi adicionado com agitação contínua, seguido por hidreto de sódio (0,05 g, 0,002 mol) para promover a alquilação S. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24–48 horas, com o progresso da reação monitorado pelo TLC. Ao concluir, a mistura de reação era despejada em água gelada para induzir precipitação. O precipitado foi coletado por filtração, lavado cuidadosamente com água fria, seco e caracterizado por espectroscopia FTIR, RMN de 1H e RMN de 13°C (Figura 1).
Síntese de derivados de acetamida à base de oxadiazol 9(d–f)
Derivado de oxadiazol (3; 0,5 g, 0,002 mol) foi dissolvido em N, N-dimetilformamida (10 mL) em um frasco de fundo arredondado de 50 mL. O intermediário correspondente de bromoacetamida, 7d, 7e ou 7f (0,002 mol, 1 equiv.), foi adicionado, seguido pelo hidreto de sódio (0,05 g, 0,002 mol) para facilitar a alquilação S. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24–48 horas, com progresso monitorado pelo TLC. Ao finalizar, a mistura era despejada em água gelada para precipitar o produto. O precipitado foi coletado por filtração, lavado cuidadosamente com água fria, seco e caracterizado por espectroscopia FTIR, RMN de 1H e RMN de 13°C (Figura 1).
Ensaio de inibição de α-glucosidase
A atividade inibitória da α-glicosidase foi avaliada misturando 50 μL da solução amostrada de teste com 100 μL de solução de α-glucosidase (0,35 U/mL) preparada em tampão fosfato (pH 6,8). A mistura de reação foi incubada a 37 °C por 10 minutos, depois 100 μL de 1,5 mM de p-nitrofenil-α-D-glipirospinósido foram adicionados como substrato. Após nova incubação a 37 °C por 20 minutos, a reação foi encerrada com a adição de 1 mL de carbonato de sódio (Na₂CO₃). A absorvância foi medida em 400nm 14. Acarbose foi usado como controle positivo. A mistura de reação sem o composto de teste servia como controle negativo, enquanto a mistura de reação sem a enzima era usada como blank.
Todos os experimentos foram realizados em triplicado, e os resultados são expressos como a média ± desvio padrão (DS). A porcentagem de inibição da atividade α-glucosidase foi calculada usando a seguinte equação(1)14:
(1)
onde As representa a absorvância da solução da amostra de teste, Ab é a absorvância do reagente em branco (sem α-glucosidase), e A0 é a absorvância do controle negativo (sem a amostra). Os valores do IC50 foram determinados testando concentrações compostas variando de 3,125 a 100 μM. A análise de regressão não linear foi realizada usando software padrão de gráficos.
Ensaio de inibição da urease
A atividade inibitória da urease foi determinada usando um método modificado de Berthelot. A mistura de reação consistia em 300 μL da solução amostrada de teste, 200 μL de solução de urease de feijão jack e 200 μL de 25 mM de ureia. A mistura foi incubada em banho-maria a 37 °C por 30 minutos. Após a incubação, foram adicionados 500 μL de uma solução reveladora de cor contendo 10 g/L de fenol e 50 g/L de nitroprussídeo de sódio, seguidos por 500 μL de uma segunda solução contendo 5% (v/v) de hipoclorito de sódio e 5 g/L de hidróxido de sódio. A mistura de reação foi então incubada por mais 15–30 minutos para permitir o desenvolvimento da cor.
A absorção da solução foi medida em 625 nm contra um reagenteem branco 15. A tioureia foi usada como controle positivo, a mistura de reação sem o composto de teste como controle negativo, e a mistura sem a enzima urease como branco. Todos os experimentos foram realizados em triplicado (n = 3), e os resultados são expressos como valores médios ± desvio padrão (S.D.). A porcentagem de inibição foi calculada usando a seguinte fórmula matemática (2)15:
(2)
onde A0 é a absorvância do controle (sem inibidor) e As é a absorvância da amostra de teste (com inibidor). Gráficos e análise de regressão não linear para determinar os valores IC50 foram realizados usando software padrão de plotagem de dados.
Ensaio de ligação BSA
As interações de ligação entre a albumina sérica bovina (BSA) e os compostos sintetizados foram investigadas usando espectroscopia de extinção por fluorescência. Uma solução de estoque de BSA de 10 μM foi preparada em tampão de fosfato de 20 mM (pH 7,4). Para cada experimento de titulação, 1,0 mL da solução de BSA foi misturado com 2,0 mL de tampão de fosfato em uma cuveta de quartzo. A solução foi ajustada por adições sucessivas de alíquotas de 5 μL do composto de teste (1,5 mM em metanol). Espectros de emissão de fluorescência foram registrados na faixa de comprimentos de onda de 300–400 nm após excitação em 295 nm, com a emissão máxima observada em aproximadamente 336 nm. As medições de fluorescência foram realizadas usando um espectrofotômetro de fluorescência equipado com software padrão de aquisição de fluorescência, com larguras de fendas de excitação e emissão definidas para 10 nm e 2,5 nm, respectivamente. Para determinar os parâmetros termodinâmicos da ligação, incluindo a energia livre de Gibbs (ΔG), entalpia (ΔH) e entropia (ΔS), os experimentos de titulação foram repetidos em 298, 308 e 313 K.
Para investigar o mecanismo de têmpera por fluorescência, os dados experimentais foram analisados usando a equação de Stern–Volmer (Equação 3)16:
(3)
onde F, 0 e F representam, respectivamente, as intensidades de fluorescência da BSA na ausência e presença do quencher; Kq é a constante da taxa de têmpera bimolecular; τ0 é a vida média de vida de BSA na ausência de um quencher; KSV é a constante de têmpera de Stern-Volmer; e [Q] é a concentração do quencher. A constante de ligação (Kb) e o número de sítios de ligação (n) foram posteriormente determinados ao plotar o logaritmo duplo de acordo com a Equação (4)16:
(4)
Além disso, a variação padrão de energia livre de Gibbs (ΔG°), a mudança padrão da entalpia (ΔH°) e a mudança padrão de entropia (ΔS°) que regem a interação de ligação foram calculadas usando as relações de Van't Hoff e Gibbs-Helmholtz expressas nas Equações (5) e (6)17:
ΔG∘ = -RT Ln Kb (5)
(6)
onde R é a constante universal do gás e T é a temperatura absoluta em Kelvin.
Acoplamento molecular
Todas as simulações de modelagem molecular e acoplamento foram realizadas usando a Schrödinger Suite (interface Maestro), com acoplamento feito usando o módulo Glide. As estruturas cristalinas da α-glucosidase (PDB ID: 5NN8) e da urease (PDB ID: 4H9M) foram recuperadas do Banco de Dados de Proteínas RCSB. As estruturas proteicas foram preparadas usando o Assistente de Preparação de Proteínas, removendo ligandos cocristalizados, moléculas de água e heteroátomos não essenciais, adicionando resíduos e laços ausentes, atribuindo ordens corretas de ligações e adicionando átomos de hidrogênio polar. Os estados de protonação e tautoméricos foram atribuídos no pH fisiológico (7,0 ± 2,0) usando o módulo Epik. As estruturas proteicas preparadas foram subsequentemente submetidas a minimização de energia contida com o campo de força OPLS para aliviar os confrontos estéricos.
As estruturas bidimensionais dos compostos 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f), juntamente com os inibidores de referência acarbose e tioureia, foram preparadas usando o módulo LigPrep. Ordens de ligação, estereoquímica e estados de ionização no pH fisiológico foram otimizados, e as conformações tridimensionais resultantes dos ligantes foram minimizadas em energia usando o campo de força OPLS.
Grades receptoras foram geradas usando a ferramenta Geração de Grade de Receptores, com as caixas de grade centralizadas nos ligantes nativos cocristalizados para definir os sítios ativos. As dimensões da grade foram definidas para 25 × 25 × 25 Å para ambas as proteínas. A grade da urease estava centrada em x = −38,76, y = −44,14 e z = 66,88, enquanto a grade da α-glicosidase estava centrada em x = 21,14, y = −7,56 e z = 24,37.
Os cálculos de acoplamento eram realizados usando o modo de extra-precisão (XP) do Glide com amostragem flexível de ligandos. Múltiplas poses de ligação foram geradas para cada ligante, e a pose com a menor pontuação de acoplamento Glide foi selecionada para análise posterior. O protocolo de acoplamento foi validado reacoplando os ligantes cocristalizados em suas respectivas grades receptoras. Valores de desvio raiz-médio-quadrático (RMSD) de ≤2,0 Å confirmaram a confiabilidade e reprodutibilidade do protocolo de acoplamento.
As conformações de ligação dos complexos acoplados foram visualizadas usando o PyMOL (versão 3.1)18. Interações proteína–ligante, incluindo ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos e interações eletrostáticas, foram analisadas usando o Visualizador19 do Discovery Studio.
Análise da teoria do funcional da densidade (DFT)
Todos os cálculos da teoria da função da densidade (DFT) foram realizados usando a Gaussiana 09, e as geometrias moleculares otimizadas e os orbitais moleculares de fronteira foram visualizados usando o GaussView 5. Os derivados sintetizados à base de acetamida à base de triazol e oxadiazol, 8(a–c) e 9(d–f), foram submetidos à otimização geométrica na fase aquosa usando o funcional híbrido de três parâmetros Lee–Yang–Parr (B3LYP) de Becke, em conjunto com o conjunto de base 6-311+G(d,p) 20. Os efeitos dos solventes foram incorporados usando o Modelo de Contínuo Polarizável Semelhante ao Condutor (CPCM)21. Cálculos de frequência vibracional foram posteriormente realizados no mesmo nível teórico para confirmar que todas as estruturas otimizadas correspondiam aos verdadeiros mínimos locais na superfície de energia potencial, como indicado pela ausência de frequências imaginárias.
Para entender as transições eletrônicas e a estabilidade cinética dos compostos sintetizados, foram calculadas as energias do orbital molecular mais ocupado (EHOMO) e do orbital molecular desocupado mais baixo (ELUMO). A diferença de energia orbital molecular fronteira (ΔE = ELUMO - EHOMO) FOI DETERMINADA PARA CADA DERIVADA PARA AVALIAR SUA REATIVIDADE QUÍMICA E ESTABILIDADE CINÉTICA, COM UMA DIFERENÇA DE ENERGIA MENOR INDICANDO MAIOR REATIVIDADE.
Além disso, descritores globais de reatividade química — incluindo dureza química (η), suavidade (S), potencial químico (μ), eletronegatividade (X) e índice de eletrofilicidade (w) — foram calculados a partir das energias orbitais de fronteira usando as seguintes equações operacionaispadrão 22:
(7)
(8)
(9)
(10)
As propriedades eletrônicas computadas e os descritores globais foram sistematicamente comparados entre as séries para estabelecer relações estrutura-atividade (SARs) que refletam seus perfis observados de α-glicosidase e inibidores da ureasa.
Além disso, mapas de potencial eletrostático molecular (MESP) foram gerados e visualizados usando VESTA para mapear a distribuição de carga entre as estruturas moleculares otimizadas. As superfícies MESP permitiram a identificação de regiões eletrofílicas (deficientes em elétrons, preferidas por ataque nucleofílico) e nucleofílicas (ricas em elétrons, favorecidas por ataques eletrofílicos). Essa distribuição de potencial eletrostático foi, em última análise, correlacionada com as interações específicas de ligação não covalente, como ligações de hidrogênio e contatos eletrostáticos, observadas nas simulações de acoplamento molecular.
Análise do ADME
Para avaliar a semelhança com medicamentos e as propriedades biofarmacêuticas dos derivados sintetizados à base de triazol e oxadiazol da acetamida 8(a–c) e 9(d–f), foi realizada uma análise in silico de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME). As representações simplificadas do sistema de entrada molecular de entrada de linha (SMILES) de todos os compostos sintetizados, juntamente com os inibidores de referência acarbose e tioureia, foram geradas usando um pacote de software de modelagem molecular e submetidas ao servidor webSwissADME 23.
Os parâmetros físico-químicos calculados incluíam peso molecular (MW), lipofilicidade (logP), área superficial polar topológica (TPSA), número de doadores de ligações de hidrogênio (HBD), número de aceitadores de ligações de hidrogênio (HBA) e número de ligações rotativas (RB).
As propriedades farmacocinéticas foram avaliadas prevendo a absorção gastrointestinal (GI) e a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB). Além disso, os compostos foram avaliados quanto à conformidade com a regra dos cinco de Lipinski e outros critérios estabelecidos de semelhança com medicamentos para estimar sua biodisponibilidade oral. Por fim, a pontuação de acessibilidade sintética (SA) foi calculada para cada composto em uma escala que varia de 1 (fácil de sintetizar) a 10 (muito difícil de sintetizar). Os perfis previstos de ADME e semelhança de fármacos dos compostos sintetizados foram comparados com os dos inibidores de referência para avaliar seu potencial como candidatos principais ao desenvolvimento de fármacos.
Resultados
Química e caracterização de compostos sintetizados
Os derivados alvo à base de acetamida à base de triazol e oxadiazol foram sintetizados de acordo com a via sintética mostrada na Figura 1. Os compostos desejados foram obtidos com rendimentos bons a excelentes (69%–87%) como sólidos cristalinos brancos a amarelos. Sua pureza foi confirmada por TLC, determinação do ponto de fusão e análises espectroscópicas. Espectros representativos de RMN que confirmam os grupos funcionais característicos dos compostos sintetizados são mostrados na Figura 2. Os espectros apresentaram as bandas de absorção esperadas correspondentes aos grupos funcionais amida carbonila (C=O), N–H, C=N, C–S e aromáticos C–H, apoiando a síntese bem-sucedida dos derivados alvo.
Espectros representativos de RMN da H1 são apresentados na Figura 3. Os espectros mostraram ressonâncias características para o próton amida NH, prótons aromáticos, ligador de metileno e substituintes metilos, que eram consistentes com as estruturas propostas. Espectros representativos de RMN 13C são mostrados na Figura 4. As ressonâncias de carbono observadas confirmaram a presença de carbonila, aromático, metileno e carbonos heterocíclicos esperados para os derivados sintetizados. Compostos representativos incluíam 8a (rendimento de 87%), 8c (rendimento aproximadamente de 80%–85%) e 9e (rendimento de 69%). Dados completos de caracterização fisicoquímica e espectros de RMN para todos os compostos sintetizados são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
Inibição α-Glucosidase
As atividades inibitórias da α-glucosidase dos compostos sintetizados são resumidas na Tabela 1. Todos os compostos inibiram a α-glucosidase em diferentes graus. O composto 9e apresentou a maior atividade inibitória, com um valor IC50 de 27,29 ± 0,41 μM, seguido pelo composto 8a (33,15 ± 0,07 μM) e composto 8c (40,93 ± 0,59 μM). Os compostos 8b, 9d e 9f apresentaram inibição comparativamente mais fraca, com valores IC50 de 108,19 ± 0,18 μM, 108,10 ± 0,03 μM e 94,44 ± 0,25 μM, respectivamente. O composto 9e apresentou maior potência inibitória do que o inibidor de referência acarbose (IC50 = 38,25 ± 0,12 μM), enquanto o composto 8a apresentou atividade comparável. Os perfis de inibição dependentes da concentração são apresentados na Figura 5.
Potencial de inibição da urease
As atividades inibitórias da urease dos compostos sintetizados são resumidas na Tabela 1. O composto 8c apresentou a maior inibição de ureasa, com um valor IC50 de 6,14 ± 1,06 μM, seguido pelos compostos 9e (8,14 ± 0,71 μM) e 8a (12,25 ± 0,42 μM). Esses compostos demonstraram maior atividade inibitória do que o inibidor de referência tioureia (IC50 = 21,25 ± 0,15 μM). Os compostos 8b, 9d e 9f estavam menos ativos, com valores de IC50 variando de 82,15 a 103,05 μM. As curvas de inibição correspondentes dependentes da concentração são mostradas na Figura 5.
Ligação BSA
Os parâmetros de têmpera por fluorescência são resumidos na Tabela 2. Para compostos 8a e 9e, a constante de Stern–Volmer (Ksv) aumentava com o aumento da temperatura, enquanto a constante de têmpera (Kq) ultrapassava o limite máximo controlado por difusão (2 ×10 10 M⁻1 s⁻1), indicando um mecanismo misto de têmpera estática e dinâmica. Em contraste, o composto 8c apresentou valores de Ksv decrescentes com o aumento da temperatura, mantendo valores de Kq acima do limite controlado por difusão, indicando predominantemente têmpera estática. A análise termodinâmica mostrou valores negativos de ΔH e ΔS para o composto 8a, sugerindo que as ligações de hidrogênio e as interações de van der Waals predominaram durante a ligação. Valores positivos de ΔH e ΔS obtidos para compostos 8c e 9e indicaram que as interações hidrofóbicas foram a principal força motriz. A análise de afinidade de ligação realizada em 298 K demonstrou que o composto 8a apresentou a maior constante de ligação (Kb = 3,92 × 105 M⁻1), seguido pelo composto 8c (1,54 × 104 M⁻1) e composto 9e (6,78 × 101M⁻1). Os espectros de fluorescência e os gráficos de Stern–Volmer são apresentados nas Figuras 6, Figura 7, Figura 8, Figura 9, Figura 10 e Figura 11.
Análise de acoplamento
Os resultados do acoplamento molecular estão resumidos na Tabela 3. O protocolo de acoplamento foi validado reacoplando os ligantes co-cristalizados em seus respectivos locais de ligação, obtendo valores RMSD ≤2,0 Å, confirmando assim a confiabilidade do protocolo de acoplamento (Figura Suplementar 1).
Com base na atividade biológica e nos escores de acoplamento, os compostos 8a, 8c e 9e foram selecionados para análise detalhada de interação. Poses representativas de acoplamento dentro do sítio ativo α-glucosidase são apresentadas na Figura 12A–D. O composto 8a apresentou a maior pontuação de acoplamento (−7,165 kcal/mol), seguido pelos compostos 8c (−6,80 kcal/mol) e 9e. Esses compostos estabeleceram interações de ligações de hidrogênio com resíduos catalíticos chave, incluindo D282, D404, D616, R600, S523 e H674.
Poses representativas de acoplamento dentro do local ativo da urease são mostradas na Figura 12E–H. O composto 8c estabeleceu ligações de hidrogênio com A636, Q635 e R439, enquanto o composto 9e formou uma extensa rede de ligações de hidrogênio envolvendo E493, D494, H593, R609 e A636. O composto 8a também demonstrou interações favoráveis com resíduos do sítio catalítico. No geral, a análise de acoplamento apoiou os resultados experimentais da inibição.
Estudos sobre DFT
Os descritores quânticos químicos calculados são resumidos na Tabela 4. As distribuições orbitais moleculares fronteiriças e os mapas de potencial eletrostático molecular dos compostos de referência são apresentados na Figura 13, enquanto as análises correspondentes para os compostos sintetizados são mostradas nas Figuras 14 e 15.
Entre os compostos sintetizados, 9e apresentou a menor diferença de energia HOMO–LUMO (0,14302 u.a.), seguida por 8c (0,14831 a.u.) e 8a (0,15788 a.u.). Os mapas de potencial eletrostático molecular identificaram regiões ricas e deficientes em elétrons que podem contribuir para interações intermoleculares. Os descritores de reatividade global calculados, incluindo potencial de ionização, afinidade elétrona, eletronegatividade, potencial químico, dureza, suavidade e índice de eletrofilicidade, estão listados na Tabela 4. Compostos da série 9 apresentaram lacunas HOMO–LUMO menores e maior eletrofilicidade do que os derivados correspondentes da série 8.
Análise do ADME
As propriedades farmacocinéticas previstas são resumidas na Tabela 5. Todos os compostos sintetizados atenderam aos principais critérios de semelhança com medicamentos. Os derivados da série 9 não apresentavam violações de Lipinski, enquanto cada composto da série 8 apresentava uma violação. Todos os compostos foram previstos como apresentando alta absorção gastrointestinal, sem permeabilidade da barreira hematoencefálica e contagens aceitáveis de doadores e aceitadores de ligações de hidrogênio. As pontuações de biodisponibilidade foram consistentemente previstas em 0,55. As pontuações de acessibilidade sintética variaram de 5,70 a 6,39, indicando complexidade sintética moderada.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os conjuntos de dados e materiais de apoio gerados durante este estudo foram depositados no repositório Zenodo e estão publicamente disponíveis em https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952.
Figura 1: Rota sintética para a preparação de derivados de acetamida à base de triazol e oxadiazol. Esquema de reação que ilustra a síntese dos compostos intermediários e finais 8(a–c) e 9(d–f). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Espectros de RMN do composto 8a. (A) espectrode RMN 1 H do composto 8a. (B) espectrode RMN 13 C do composto 8a. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Espectros de RMN do composto 8c. (A) Espectro RMN 1H do composto 8c. (B) Espectro RMN 13C do composto 8c. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Espectros de RMN do composto 9e. (A) Espectro RMN 1H do composto 9e. (B) Espectro RMN 13C do composto 9e. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Atividades inibitórias dos compostos sintetizados contra α-glucosidase e ureasa. (A) Porcentagem de inibição de α-glicosidase e urease pelos compostos 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f) em comparação com os inibidores de referência acarbose e tioureia, respectivamente. (B) IC50 valores dos mesmos compostos contra α-glucosidase e urease. Os dados são apresentados como média ± DS (n = 3). A significância estatística foi determinada em relação ao inibidor de referência correspondente (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001; ns = não significativo). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 6: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) pelo composto 8a. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 8a em 298 K. (B) Plots de Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) pelo composto 8b. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 8b em 298 K. (B) Plots de Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) pelo composto 8c. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 8c em 298 K. (B) Gráficos Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) por composto 9d. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 9d em 298 K. (B) Plots de Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) pelo composto 9e. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 9e em 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Análise de têmpera por fluorescência da albumina sérica bovina (BSA) pelo composto 9f. (A) Espectros de emissão de fluorescência de BSA (3,33 × 10⁻6 M) após adição incremental do composto 9f em 298 K. (B) Plots de Stern–Volmer obtidos em 298, 308 e 313 K. (C) Gráfico duplo-logarítmico de log[(F₀ − F)/F] versus log Q. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Modos de ligação dos inibidores de referência e compostos sintetizados selecionados nos sítios ativos α-glucosidase e urease. (A) Posição de ligação da acarbose no sítio ativo da α-glucosidase. (B) Pose de ligação do composto 8a. (C) Pose de ligação do composto 8c. (D) Postura de ligação do composto 9e. (E) Postura de ligação de tioureia dentro do sítio ativo da urease. (F) Postura de ligação do composto 8a. (G) Postura de ligação do composto 8c. (H) Postura de ligação do composto 9e. As ligações de hidrogênio são representadas por linhas amarelas tracejadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 13: Orbitais moleculares de fronteira e mapas de potencial eletrostático molecular (MEP) dos inibidores de referência. (A) Acarbose. (B) Thiourea. As superfícies do orbital molecular ocupado mais alto (HOMO), do orbital molecular desocupado mais baixo (LUMO) e do MEP são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 14: Orbitais moleculares de fronteira e mapas de potencial eletrostático molecular (MEP) das derivadas do triazóli. (A) Composto 8a. (B) Composto 8b. (C) Composto 8c. As superfícies HOMO, LUMO e MEP são mostradas para cada composto. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 15: Orbitais moleculares de fronteira e mapas de potencial eletrostático molecular (MEP) das derivadas do oxadiazol. (A) Composto 9d. (B) Composto 9e. (C) Composto 9f. As superfícies HOMO, LUMO e MEP são mostradas para cada composto. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
| Códigos | Urease | α-Glucosidase | ||
| Inibição (%) em 0,5 mM | IC50 (μM) | Inibição (%) em 0,5 mM | IC50 (μM) | |
| 3 | 67,54 ± 1,03 | 41,51 ± 0,01 | 63,09 ± 0,25 | 79,12 ± 0,43 |
| 4 | 62,51 ± 0,42 | 45,14 ± 0,14 | 65,26 ± 0,55 | 70,28 ± 0,42 |
| 8a | 95,22 ± 1,55 | 12.25 ± 0.42 | 95,01 ± 0,57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62,64 ± 1,01 | 82,15 ±1,48 | 38,02 ± 1,71 | 108,19 ± 0,18 |
| 8c | 99,39 ± 0,27 | 06.14 ± 1.06 | 90,51 ± 0,01 | 40,93 ± 0,59 |
| 9d | 47,51 ± 1,01 | 103,05 ± 0,54 | 39,08 ± 0,25 | 108,10 ± 0,03 |
| 9e | 98,57 ± 0,04 | 08.14 ± 0.71 | 91,55 ± 0,34 | 27,29 ± 0,41 |
| 9f | 58,07 ± 1,68 | 85,15 ± 0,12 | 43,15 ± 0,42 | 94,44 ± 0,25 |
| Thiourea | 96,24 ± 0,16 | 21,25 ± 0,15 | - | - |
| Acarbose | - | - | 92,23 ± 0,14 | 38,25 ± 0,12 |
Tabela 1: Atividades inibitórias dos compostos sintetizados contra α-glucosidase e ureasa. Valores de IC50 e inibição percentual dos compostos 8(a–c) e 9(d–f) em comparação com os inibidores de referência acarbose e tioureia. Os dados são apresentados como média ± DS (n = 3). Abreviações: IC50 = concentração inibitória metade máxima; DS = desvio padrão.
| Composto | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol. K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3,92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6,49 x104 | 0.85 | 4,33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6,49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6,95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2,41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4,84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6,78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7,93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4,69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2,99 x105 | 1.41 | 1,67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1,54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
Tabela 2: Constantes de ligação e parâmetros termodinâmicos para as interações de compostos selecionados com a albumina sérica bovina (BSA). Constante de ligação (Kb), número de sítios de ligação (n), constante de têmpera de Stern–Volmer (Ksv), constante de taxa de têmpera bimolecular (Kq), energia livre de Gibbs (ΔG), variação da entalpia (ΔH) e alteração da entropia (ΔS) para compostos 8a, 8c e 9e determinados em 298, 308 e 313 K. Abreviações: BSA = albumina sérica bovina; Kb = constante de ligação; n = número de sítios de ligação; Ksv = constante de têmpera de Stern–Volmer; Kq = constante da taxa de têmpera bimolecular; ΔG = Energia livre de Gibbs; ΔH = mudança de entalpia; ΔS = mudança de entropia.
| Compostos | Alfa Glucosidase (kcal/mol) | Urease (kcal/mol) |
| Acarbose | −6,90 | - |
| Thiourea | - | −5,80 |
| 3 | −4,35 | −4,50 |
| 4 | −4,10 | −4,30 |
| 8a | −7,165 | −7,624 |
| 8b | −5,20 | −5,45 |
| 8c | −6,80 | −7,10 |
| 9d | −5,10 | −5,35 |
| 9e | −6,70 | −7,30 |
| 9f | −5,00 | −5,25 |
Tabela 3: Escores de acoplamento molecular dos compostos sintetizados contra α-glicosidase e urease. Escores de acoplamento (kcal/mol) dos compostos 8(a–c) e 9(d–f), juntamente com os inibidores de referência acarbose e tioureia, contra α-glucosidase e urease. Abreviações: kcal/mol = quilocalorias por mol.
| Ligando | Momento dipolo (Debye) | HOMO | LUMO | Energia | Ionização | Afinidade eletrônica (eV) | Electro- negatividade χ (eV) | Electro- potencial químico μ (eV) | Dureza η (eV) | Suavidade | Electro- Filícia |
| (a.u.) | (a.u.) | Lacuna (ΔE Gap) | Potencial (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| Acarbose | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| Thiourea | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
Tabela 4: Descritores da teoria do funcional da densidade (DFT) dos compostos sintetizados. Descritores químicos quânticos calculados dos compostos 8(a–c) e 9(d–f), juntamente com os compostos de referência acarbose e tioureia, incluindo energias HOMO e LUMO, gap de energia HOMO–LUMO (ΔE), potencial de ionização (IP), afinidade eletrônica (EA), eletronegatividade (χ), potencial químico (μ), dureza química (η), suavidade química (S), momento dipolar (D) e índice de eletrofilicidade (ω). Abreviações: DFT = teoria da função da densidade; HOMO = orbital molecular mais ocupado; LUMO = orbital molecular desocupado mais baixo; ΔE = lacuna energética HOMO–LUMO; IP = potencial de ionização; EA = afinidade elétrona; χ = eletronegatividade; μ = potencial químico; η = dureza química; S = suavidade química; D = momento dipolar; ω = índice de eletrofilicidade.
| Composto | HA | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | LogP de Consenso | Absorção GI | Permeabilidade BBB | Violações de Lipinski | Pontuação de Biodisponibilidade | Pontuação SA |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | Alto | Não | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | Alto | Não | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | Alto | Não | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | Alto | Não | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | Alto | Não | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | Alto | Não | 0 | 0.55 | 5.73 |
Tabela 5: Propriedades previstas de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) dos compostos sintetizados. Propriedades fisicoquímicas, farmacocinéticas e de semelhança com medicamentos previstas dos compostos 8(a–c) e 9(d–f) foram geradas usando o servidor web SwissADME. Abreviações: ADME = absorção, distribuição, metabolismo e excreção; MW = peso molecular; LogP = octanol/coeficiente de partição de água; TPSA = área topológica da superfície polar; RB = ligações rotativas; HBA = aceitador de ligação de hidrogênio; HBD = doador de ligação de hidrogênio; GI = gastrointestinal; BBB = barreira hematoencefálica; SA = acessibilidade sintética.
Figura suplementar 1: Validação de acoplamento através do reacoplamento de ligantes nativos. (A) Superposição do ligante co-cristalizado (pose de referência) e da acarbose reacoplada ao sítio ativo da α-glucosidase (PDB ID: 5NN8), demonstrando alinhamento próximo das conformações de ligação. (B) Pose de ligação da tioureia dentro do local ativo da urease (PDB ID: 4H9M), usada para validação de acoplamento do sistema de urease, mostrando a preservação das interações chave dentro do bolso catalítico. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Dados de caracterização fisicoquímica e espectros completos de RMN de 1H e 13C dos compostos 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f).Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo sintetizou uma série de derivados de acetamida à base de triazol e oxadiazol e avaliou suas propriedades estruturais, biológicas, computacionais e farmacocinéticas. Caracterização espectroscópica por HRMS, análise elementar, RMN de 1H e RMN de 13C confirmaram a síntese bem-sucedida das moléculas-alvo. As mudanças químicas observadas, padrões de acoplamento e ressonâncias de carbono foram consistentes com as estruturas propostas. Sinais característicos de amida NH, ressonâncias de metileno, distribuições de prótons aromáticos e sinais de carbono quaternário confirmaram ainda mais a incorporação bem-sucedida das partes acetamida substituídas tanto nos andaimes triazol quanto oxadiazol. Os rendimentos sintéticos geralmente altos obtidos para esses derivados demonstram a eficiência da via sintética e sugerem que essas estruturas heterocíclicas são suscetíveis a modificações estruturais adicionais.
Foi observada uma clara influência do padrão de substituintes na atividade inibitória da ureasa. O composto 8c, contendo um substituente 2,6-dimetil, apresentou a maior atividade inibitória da urase, seguido pelos compostos 8a (2,3-dimetil) e 9e (2,5-dimetil), identificando essas moléculas como candidatos promissores a liderança. Uma tendência semelhante foi observada contra α-glucosidase, com o composto 9e apresentando a inibição mais forte, enquanto os compostos 8a e 8c também demonstraram atividade considerável. Como os compostos 8a e 8c diferem apenas nas posições dos substituintes metilados no anel aromático, enquanto o composto 9e difere tanto no padrão de substituição quanto no andaime heterocíclico, esses achados sugerem que tanto o padrão de substituição metilo quanto a arquitetura do andaime contribuem para a atividade biológica dentro dessa série. A atividade superior do composto 8c pode refletir uma orientação mais favorável dentro do sítio ativo da enzima, enquanto a forte atividade do composto 9e sugere uma contribuição adicional do andaime oxadiazol juntamente com o padrão de substituição 2,5-dimetil. Essas observações são consistentes com relatos anteriores indicando que efeitos estéricos decorrentes da substituição fenil podem influenciar a ligação do local ativo em inibidores enzimáticos baseados em triazol eoxadiazol 24,25,26,27. No entanto, estabelecer uma relação estrutura–atividade definitiva exigirá a avaliação de uma série maior de derivadas regioisoméricas.
A análise das interações entre os compostos mais ativos e a albumina sérica bovina (BSA) por meio de têmpera por fluorescência e análise termodinâmica demonstrou que os compostos 8a e 9e seguiam um mecanismo misto de têmpera estática/dinâmica, enquanto o composto 8c apresentou predominantemente têmpera estática. Parâmetros termodinâmicos indicaram que a ligação do composto 8a era principalmente impulsionada por ligações de hidrogênio e interações de van der Waals, enquanto interações hidrofóbicas predominavam na ligação dos compostos 8c e 9e. O composto 8a apresentou a maior afinidade por BSA, com uma constante de ligação de 3,92 × 105 M⁻1 e uma energia livre de Gibbs de ligação negativa favorável. Esses achados indicam formação estável do complexo proteína–ligante e sugerem o potencial de transporte mediado por albumina sob condições fisiológicas.
Os achados experimentais foram ainda mais apoiados por estudos de acoplamento molecular, que demonstraram que os compostos 8a, 8c e 9e adotaram conformações favoráveis de ligação nos sítios ativos tanto da α-glucosidase quanto da urease. Esses compostos formaram ligações de hidrogênio com resíduos-chave, incluindo D282, A284, D404, R600, D616 e H674 na α-glicosidase e A636, Q635, R439 e A440 na urease. Interações semelhantes já foram relatadas anteriormente para inibidores enzimáticos estruturalmenterelacionados 28,29. A maior discrepância entre a pontuação de acoplamento e a atividade experimental foi observada para o composto 8a, que apresentou a pontuação de acoplamento mais favorável contra α-glucosidase (−7,165 kcal/mol), enquanto o composto 9e apresentou a maior potência inibitória in vitro (IC50 = 27,29 μM). Essa diferença não é inesperada porque as pontuações de acoplamento estimam a ligação de ligantes dentro de uma estrutura proteica relativamente rígida e não consideram fatores como solubilidade do ligante, flexibilidade conformacional, desolvação, dinâmica proteica ou outros efeitos da fase de solução que influenciam valores experimentalmente determinados do IC50. Consequentemente, as diferenças entre a afinidade prevista de ligação e a atividade biológica medida representam uma limitação reconhecida do acoplamento molecular, e não uma contradição entre resultados computacionais e experimentais. No geral, os dados de acoplamento e inibição enzimática identificam consistentemente os compostos 8a, 8c e 9e como os derivados mais promissores desta série.
As propriedades eletrônicas dos compostos mais ativos foram investigadas mais a fundo por análises de orbitais moleculares de fronteira (FMO) e potencial eletrostático molecular (MEP). Compostos com menores lacunas de energia HOMO–LUMO geralmente apresentaram maior reatividade eletrônica, consistente com estudos anteriores de DFT em derivados estruturalmente relacionados à base de triazol eoxadiazol 30. Entre os compostos sintetizados, 8a, 8c e 9e apresentaram lacunas de energia HOMO–LUMO relativamente pequenas, indicando características favoráveis de transferência de elétrons. Seus mapas MEP revelaram regiões distintas ricas e deficientes em elétrons, com os compostos 8c e 9e apresentando regiões nucleofílicas particularmente pronunciadas que podem contribuir para suas interações enzimáticas favoráveis e atividades biológicas. Os descritores de reatividade global apoiaram ainda mais os achados experimentais e computacionais. O composto 9e apresentou uma combinação favorável de potencial de ionização, afinidade eletrônica, suavidade e índice de eletrofilicidade, enquanto os compostos 8a e 8c apresentaram valores de suavidade comparativamente altos, consistentes com suas fortes atividades inibitórias. A maior eletrofilicidade e suavidade observadas na série 9, especialmente no composto 9e, podem contribuir para interações mais fortes com resíduos catalíticos e aumento da atividade biológica.
In silico O perfil ADME dos compostos 8(a–c) e 9(d–f) previu características farmacocinéticas favoráveis, incluindo alta absorção gastrointestinal, semelhança aceitável com o medicamento e biodisponibilidade oral satisfatória. Nenhuma grande responsabilidade do ADME foi identificada dentro dos parâmetros avaliados. Coletivamente, os dados biológicos in vitro , a análise de ligação ao BSA, o acoplamento molecular, os cálculos de DFT e as previsões in silico do ADME apoiam a investigação contínua desses derivados de acetamida à base de triazol e oxadiazol como inibidores duplos de urease e α-glucosidase.
Em conjunto, esses achados identificam os compostos 8a, 8c e 9e como candidatos promissores para o desenvolvimento de derivados de acetamida à base de triazol e oxadiazol que visam a urease e a α-glucosidase. Os dados combinados espectroscópicos, biológicos, de ligação BSA, acoplamento molecular, DFT e ADME fornecem uma base sólida para estudos futuros. Investigações adicionais devem incluir simulações de dinâmica molecular para avaliar a estabilidade proteína–ligante ao longo do tempo, estudos cinéticos enzimáticos para determinar o mecanismo de inibição e extensão da análise de ligação ao BSA para os derivados restantes. Por fim, serão necessários estudos in vivo para validar os promissores achados in vitro e in silico e para avaliar ainda mais o potencial terapêutico dessa série de compostos.
Divulgações
O autor declara que não há conflito de interesses
Agradecimentos
O autor expressa seu agradecimento à Faculdade de Farmácia Clínica da Universidade Al Baha, Arábia Saudita.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1-Naftilammina | Merck | 106148 | Ammina aromatica utilizzata per la preparazione di analoghi sostituiti |
| 2,5-Dimetilanilina | Sigma-Aldrich | D146706 | Ammina aromatica utilizzata per la sintesi di derivati sostituiti |
| 3,4-Dimetilanilina | Alfa Aesar | A15416 | Ammina aromatica utilizzata per la preparazione di analoghi strutturali |
| Acido Benzoico | Sigma-Aldrich | 242381 | Materiale di partenza per la sintesi di intermedio benzoidrazida |
| Bromoacetil Bromuro | Sigma-Aldrich | B17601 | Reattivo elettrofilo utilizzato nella sintesi di intermedi bromoacetammide |
| Disolfuro di Carbonio | Sigma-Aldrich | 289116 | Reattivo chiave per la ciclizzazione al sistema dell'anello osadiazolo |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C2432 | Solvente utilizzato nei processi di estrazione e purificazione |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvente aprotico polare utilizzato nelle reazioni di derivatizzazione e sostituzione |
| Difenilamimina | Sigma-Aldrich | D23802 | Ammina aromatica utilizzata nella sintesi di composti derivati |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per generare stati di ionizzazione del ligando a pH 7.0; RRID: N/A |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7023 | Solvente di reazione per esterificazione e formazione di idrazida |
| Acetato di Etile | Sigma-Aldrich | 270989 | Componente di fase mobile polare nell'analisi TLC e estrazione |
| Gaussian 09, Revisione D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (software) | Software utilizzato per calcoli DFT (HOMO-LUMO, MESP, descrittori di reattività globale); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (software) | Usato per la visualizzazione di strutture ottimizzate ed energie orbitali; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Software di docking utilizzato per la generazione di griglie del recettore e docking molecolare extra-precision (XP); RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, versione 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (software) | Usato per l'analisi di regressione IC50 e valutazione statistica dei dati di inibizione enzimatica; RRID:SCR_002798 |
| Idrazina | Sigma-Aldrich | 225819 | Reattivo utilizzato per la conversione di estere in benzoidrazida |
| L(+)-Glutammina | Sigma-Aldrich | G3126 | Reattivo utilizzato negli studi di valutazione biologica |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per l'ottimizzazione della struttura del ligando e generazione di conformatori 3D; RRID:SCR_016746 |
| Idruro di Litio | Sigma-Aldrich | 201049 | Catalizzatore utilizzato per l'attivazione del gruppo tiolo nelle reazioni di sostituzione |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Suite di modellazione molecolare utilizzata per la preparazione e visualizzazione delle strutture proteina/ligando; RRID:SCR_016748 |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvente utilizzato nella purificazione e preparazione dei saggi biologici |
| n-Esano | Merck | 104391 | Componente di fase mobile non polare nell'analisi TLC |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (campo di forza) | Campo di forza utilizzato per la minimizzazione energetica delle strutture di proteina e ligando; RRID: N/A |
| Isotiocianato di Fenile | Merck | 807028 | Reattivo utilizzato nella sintesi di derivati triazolici |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per il perfezionamento della struttura del recettore prima del docking; RRID:SCR_016749 |
| Idrossido di Sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Base utilizzata per l'aggiustamento del pH e la neutralizzazione della reazione |
| Acido Solforico | BDH | 10276 | Catalizzatore acido utilizzato nella fase di esterificazione in condizioni di reflusso |
| Trimetilammina | Riedel-de Haen | 22129 | Base organica utilizzata durante la sintesi di derivati sostituiti |
| VESTA, versione 3.5.8 | Momma & Izumi (sviluppatori); distribuito gratuitamente | N/A (software) | Usato per la visualizzazione del potenziale elettrostatico molecolare (MESP) e delle mappe di superficie HOMO-LUMO; RRID: N/A |
Referências
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