Avaliando a Eficiência da Transdução e o Alvo Celular por Peptídeos Penetrantes Celulares no Pulmão do Camundongo

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho integrado para avaliar a eficiência da transdução e a especificidade celular de peptídeos penetrantes celulares, utilizando o peptídeo ciclizado R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) como exemplo. O fluxo de trabalho combina FACS de fração pareada seguido de sequenciamento de RNA de célula única, citometria de fluxo em camundongos repórter AT2 e imagem confocal com pilha z para confirmar o engajamento do alvo peptídico associado a AT2.

Resumo

Peptídeos penetrantes celulares (CPPs) são peptídeos curtos (5–30 aminoácidos) capazes de atravessar membranas celulares e entregar cargas macromoleculares sem a necessidade de reagentes de transfecção. No entanto, definir a seletividade celular in vivo requer validação no nível do tipo celular. Um fluxo de trabalho integrado é apresentado para avaliar a eficiência de transdução de um CPP ciclizado marcado com Cy5.5, cR11A, dentro de células epiteliais alveolar tipo II (AT2) após injeção intravenosa retroorbital em camundongos. Os pulmões foram coletados em 15 ou 60 minutos após a injeção e analisados usando leituras complementares, incluindo a separação celular ativada por fluorescência por fração pareada (FACS) para isolar suspensões unicelulares pulmonares Cy5,5⁺ e Cy5,5⁻, seguidas por sequenciamento de RNA unicelular, citometria de fluxo de células únicas pulmonares provenientes de Sftpc-CreERT2^(+/−); Ratos repórteres de LSL-GFP^(+/−) AT2 para quantificar eventos de GFP⁺/Cy5.5⁺, e imagens confocais de pilha z de criosseções pulmonares para confirmar a colocalização de cR11A-Cy5.5 com sinal associado a AT2. Esse protocolo fornece evidências concordantes de engajamento do tipo celular usando múltiplas leituras complementares e fornece uma estrutura reprodutível para avaliar o direcionamento específico das células para CPPs, com modificações para diferentes órgãos-alvo.

Introdução

Peptídeos penetrantes celulares (CPPs) são peptídeos de 5 a 30 aminoácidos que podem atravessar membranas celulares e facilitar a entrega intracelular de cargas macromoleculares em uma forma intacta e totalmente funcional, sem a necessidade de reagentes de^{transfecção 1,2}. Trabalhos anteriores usando metodologias combinatórias de exibição de fagos in vitro e in vivo identificaram um peptídeo cardíaco de 12 aminoácidos (APWHLSSQYSRT) que é absorvido especificamente pelos cardiomiócitos em apenas 5^{min 3,4}. Para investigar seu mecanismo de transdução, foi realizada uma varredura alanina, levando à descoberta de duas variantes, S7A e R11A (APWHLSSQYSAT), que inesperadamente apresentaram enriquecimento pulmonar in vivo. e, por isso, foram denominadas peptídeos direcionantes para pulmão (LTPs⁾⁵. Além disso, a adição de lisina N-terminal e a ciclização cabeça-cauda geraram uma versão cíclica de R11A (cR11A) com estabilidade sérica significativamente melhorada e absorção intracelular marcadamente aprimorada em comparação com seu equivalente^{linear 5}.

As LTPs têm potencial para fornecer terapias precisas para populações epiteliais pulmonares distales, incluindo células epiteliais alveolares tipo II (AT2). Essas células são críticas para a manutenção da homeostase dos surfactantes e atuam como progenitoras da regeneração^{alveolar 6}. No entanto, um grande desafio no desenvolvimento da LTP é a avaliação rigorosa da seletividade celular in vivo. A biodistribuição em nível de órgão sozinha não pode distinguir transdução celular verdadeira de sinal vascular, retenção extracelular ou depuração fagocítica e, portanto, deve ser complementada por medições resolvidas por células^{únicas 7}. Para resolver essa limitação, esse fluxo de trabalho integra atribuição transcriptômica de célula única, citometria de fluxo baseada em repórter e imagem confocal z-stack para gerar evidências em nível celular de engajamento peptídico além dos indicadores de fluorescência ou biodistribuição em^{nível de órgãos 8,9}.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho reproduzível e multi-leitura para validar a eficiência da transdução in vivo e a especificidade celular do cR11A marcado com Cy5.5 no pulmão distal, com foco nas células AT2 após a injeção retroorbital. O protocolo define a identidade celular associada a peptídeos usando leituras complementares e independentes, incluindo a separação celular ativada por fluorescência por fração pareada (FACS) (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻), seguida de sequenciamento de RNA unicelular para mapear populações associadas a peptídeos, avaliação quantitativa da captação em pulmões repórteres de AT2 via citometria de fluxo, e imagens confocais em pilha z de criosseções pulmonares para confirmar a colocalização de cR11A-Cy5.5 com sinal associado a AT2. Esse protocolo pode ser facilmente adaptado a outros LTPs ou vetores de entrega e aplicado aos sistemas pulmonares ou de órgãos para avaliar a especificidade celular dos CPPs em desenvolvimento. É particularmente adequado para aplicações que exigem validação do direcionamento da CPP in vivo em nível celular, em vez de avaliação apenas do acúmulo em nível de órgão.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Mayo Clinic e aprovados sob o protocolo número A00006842-22-R25. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal e garantir o manuseio ético em conformidade com as regulamentações nacionais e institucionais relevantes. As ferramentas de pesquisa usadas para esse protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Animais

1. Use camundongos adultos de sexo misto C57BL/6J (6–8 semanas de idade) obtidos do The Jackson Laboratory (Cepa #000664).
2. Para quantificação específica de AT2, use Sftpc-CreERT2^(+/+) (Deformação Jax #028054) cruzada com LSL-GFP^(+/+) (Deformação Jax #007906) para gerar Sftpc-CreERT2^(+/−); Mouse repórter ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. Camundongos domésticos em gaiolas ventiladas individualmente. Garanta que todos os protocolos de animais sejam aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal.
4. Realizar indução de tamoxifeno em Sftpc-CreERT2^(+/−); Camundongos ^{LSL-GFP(+/−).} Quando os camundongos tiverem ≥6 semanas de idade, administre 100 mg/kg de tamoxifeno dissolvido em óleo de milho via gávage oral por três doses ao longo de 7 dias. Realize experimentos pelo menos 2 semanas após a dose final para permitir a máxima eficiência de recombinação.

2. Preparação de reagentes e equipamentos

1. Prepare anestesia (mistura funcional cetamina/xilazina).
   1. Prepare uma solução de trabalho de 5 mL: cetamina (1 mL de 50 mg/mL), xilazina (50 μL de 100 mg/mL) e soro fisiológico estéril (3,95 mL).
   2. Administre 1 μL/g de peso corporal via .injeção intraperitoneal (dose final: 10 mg/kg de cetamina e 1 mg/kg de xilazina).
2. Preparar peptídeo (cR11A-Cy5.5).
   1. Obtenha CPPs como pós liofilizados. Armazene os pós a −20 °C por até 2 anos ou como soluções de estoque em DMSO a −80 °C por até 6 meses em tubos protegidos contra a luz. Evite ciclos de congelamento-degelo e minimize a exposição à luz. Prepare uma solução de 10 mM de cR11A-Cy5.5 em DMSO.
   2. Pese o rato, calcule a dose e dilua o estoque para 1 mg/kg em água sem nuclease até um volume final de 100 μL por camundongo.
3. Prepare o buffer de digestão (fresco; mantenha no gelo).
   1. Prepare um tampão digestivo contendo 2 mg/mL de Dispase II, 0,1 mg/mL de DNase I, DMEM/F12 e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.
   2. Use 3 mL por mouse.
4. Prepare um tampão de lavagem enzimática proteasa inespecífica (mantenha no gelo).
   1. DMEM/F12 contendo 0,05 mg/mL de DNase I e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.
   2. Use 10 mL por mouse.
5. Prepare o tampão de lise de glóbulos vermelhos (mantenha no gelo).
   1. Dilua 10× de buffer de lise para 1× com PBS.
   2. Use 2 mL por amostra.
6. Prepare o tampão de perfusão.
   1. Use DMEM/F12 gelado (10 mL por mouse).
7. Prepare o buffer de lavagem.
   1. Use DMEM/F12 com 2% de FBS.
8. Pré-resfrie as centrífugas a 4 °C.

3. Administração retroorbital de cR11A-Cy5.5

1. Anestesie o rato usando a solução ativa de cetamina/xilazina. Confirme anestesia adequada pela ausência de retirada do membro em resposta ao aperto no dedo do pé.
2. Injete 100 μL de cR11A-Cy5,5 (1 mg/kg) via injeção intravenosa retroorbital usando uma seringa de insulina.
3. Inicie o temporizador e mantenha o mouse em uma almofada térmica sob monitoramento adequado por 15 ou 60 minutos.

4. Colheita e perfusão pulmonar

1. Eutanasie o camundongo de acordo com protocolos aprovados (por exemplo, inalação de CO₂ seguida de luxação cervical). Coloque o rato em posição deitada e borrife o tórax com 70% de etanol.
2. Abra a cavidade torácica para expor o coração e os pulmões.
3. Faça uma incisão no átrio direito para permitir a drenagem durante a perfusão.
4. Insira uma agulha de 26 G presa a uma seringa de 10 mL contendo DMEM/F12 gelado no ventrículo direito. Mantenha a incisão auricular direita aberta durante toda a perfusão para permitir a drenagem.
5. Perfunda manualmente sem bomba de seringa, injetando lenta e constantemente 10 mL de DMEM/F12 ao longo de aproximadamente 1-2 minutos. Mantenha baixa pressão durante a injeção e evite excesso de inflação ou vazamento visível do pulmão pela parede ventricular. Continue até que os pulmões fiquem uniformemente pálidos.

5. Inflação pulmonar e digestão

1. Anule a traqueia com cateter intravenoso 20G e fixe com sutura de seda 3-0. Injete 1 mL de buffer digestivo com uma seringa de 1 mL para inflar os pulmões.
2. Disseca os pulmões como uma única unidade intacta e transfere imediatamente para um prato pré-resfriado de 100 mm sobre gelo.
3. Separe os lobos pulmonares e transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de tampão de digestão a frio (um pulmão por tubo).
4. Incube a 4 °C por 20 horas em um balancim giratório (10–15 rpm).
   NOTA: Consulte Janas PP. et ^al.10 para a metodologia detalhada.

6. Dissociação de tecidos

1. Coloque um penador de célula de 100 μm sobre um tubo cônico de 50 mL e pré-umede com 1 mL de lavagem enzimática proteásica inespecífica.
2. Transfira o tecido pulmonar para o peneiro e dissocie suavemente usando um desentupidor de seringa estéril.
3. Enxágue com um buffer de lavagem enzimática protease inespecífica de 10 mL.
4. Centrifuge a 130 × g por 15 minutos a 4 °C.
5. Resuspenda o pellet em 2 mL de tampão de lise de 1× glóbulos vermelhos por 90 s em temperatura ambiente.
6. Extingua a lise com tampão de lavagem de 10 mL.
7. Filtre por uma peneira de 40 μm e enxágue com buffer de lavagem.
8. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
9. Ressuspender células em 500–1.000 μL PBS + 2% FBS (≥1 × 10⁶ células/mL).
10. Passe por uma tampa de filtro de 35 μm até um tubo FACS.
    NOTA: Consulte Konishi S. et ^al.11 para uma metodologia detalhada.

7. Ordenação FACS por frações pareadas

1. Realize a ordenação usando um citômetro de fluxo.
2. Use pulmões injetados com PBS como controle negativo para definir a porta Cy5.5.
3. Aplique o padrão de limitação: exclusão de detritos, singletes e células Cy5.5⁺.
4. Separe as populações de Cy5,5⁺ e Cy5,5⁻ em tubos separados.

8. preparação da amostra de scRNA-seq

1. Mantenha as amostras separadas no gelo.
2. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C e ressuspenda em um tampão de 500 μL.
3. Prossiga somente se a viabilidade estiver ≥80%.
4. Prepare bibliotecas e sequenciamento conforme necessário.

9. Citometria de fluxo em camundongos repórter AT2

1. Prepare suspensões de célula única pulmonar conforme descrito nas Seções 5–6.
2. Tinga com um corante vivo/morto (1:1.000) por 30 minutos (protega da luz).
3. Lave e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
4. Filtre e mantenha as amostras no gelo.
5. Adquira dados em um citômetro de fluxo.
6. Realize gating para identificar células, selecionar singletos, excluir células mortas e definir populações de GFP e Cy5.5.
   1. Quantifique os eventos GFP⁺/Cy5,5⁺ como uma porcentagem das células GFP⁺.

10. Fixação e crioproteção

1. Enche os pulmões com 1 mL de PFA a 4% e fixe a traqueia.
2. Fixe com 10 mL de 4% de PFA durante a noite a 4 °C.
3. Lave com PBS (3×).
4. Incube 15% de sacarose durante a noite.
5. Transfira para 30% de sacarose por ~48 horas.

11. Embedding e criosseção

1. Prepare os moldes criogênicos com OCT e posicione os pulmões e embutida em OCT.
2. Congele usando nitrogênio líquido. Armazene a ˗80 °C.
3. Corte a 10 μm após o equilíbrio. Seca ao ar durante a noite.

12. Imagem e análise

1. Lave as seções com PBS (3×).
2. Monte com um médio DAPI.
3. Adquira pilhas confocais Z.
4. Use as configurações de imagem apropriadas.
5. Realize reconstrução 3D.
6. Quantifique a colocalização usando limiares consistentes.
   Métodos opcionais:
   Esses métodos opcionais não estão incluídos no fluxo de trabalho representativo, mas podem ser incorporados para permitir a diminuição ou análise da população de células imunes CD45⁺, que constitui uma grande proporção das células^{pulmonares 12}.
   NOTA: Use a depleção ou exclusão CD45⁺ quando a análise for focada em populações pulmonares não imunes, pois essas etapas removem ou separam os sinais de absorção das células imunológicas e alteram a composição celular da amostra. A coloração CD45 também pode ser usada para analisar separadamente a população de células imunes CD45⁺.

13. População celular de CD45⁺

1. Após a dissociação do tecido (Passo 6), use um anticorpo CD45 conjugado a uma esfera magnética (Miltenyi Biotech 130-052-301) ou um anticorpo CD45 conjugado a um fluoróforo compatível com Cy5.5, GFP e a coloração viva/morta, por exemplo CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tinga por 20 minutos a 4°C no escuro.
2. Se realizar a depleção das esferas magnéticas CD45, siga as instruções do fabricante para uso da coluna de Depleção de Linhagem (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) e prossiga com a Separação de Células Magnéticas (MACS) (Miltenyi Biotech). Depois, prossiga para a ordenação FACS por frações pareadas (passo 7).
3. Se estiver realizando a depleção do CD45 usando um anticorpo conjugado fluorescente, lave primeiro a suspensão celular com tampão de lavagem para remover o excesso de anticorpo. Depois, prossiga para o passo 7. Após estabelecer portas para excluir doublets e detritos (Passo 7.3), insira uma porta adicional para excluir a população CD45⁺ . Depois, prossiga para o Passo 7.4.

14. Analisar a população celular CD45⁺ durante a citometria de fluxo

1. Após o Passo 9.3, use um anticorpo CD45 conjugado a um fluoróforo compatível com Cy5.5, GFP e a coloração viva/morta, por exemplo CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tinga por 20 minutos a 4°C no escuro.
2. Lave a suspensão celular com tampão de lavagem para remover o excesso de anticorpos. Depois, prossiga para o passo 9.4. Após estabelecer portas para excluir doublets e detritos (Passo 9.6), insira uma porta adicional para excluir a população CD45⁺ antes de fechar para estabelecer as populações ^GFP+ e Cy5.5^{+ 12}.

Resultados

A aplicação bem-sucedida deste protocolo deve gerar evidências concordantes a partir de três leituras complementares: scRNA-seq de fração pareada, citometria de fluxo baseada em repórter e imagem confocal z-stack.

Na análise de scRNA-seq de frações pareadas, frações de células únicas pulmonares Cy5,5⁻ e Cy5,5⁺ foram recuperadas após administração sistêmica de cR11A-Cy5,5 e analisadas separadamente. A visualização UMAP identificou as principais populações de células pulmonares, incluindo compartimentos imunológico, endotelial, epitelial e mesenquimatose (Figuras 1A, B). Embora as células imunes representassem a população dominante em ambas as frações ordenadas, a fração Cy5,5⁺ mostrou enriquecimento relativo dos compartimentos não imunes, incluindo células epiteliais (Figura 1C). A análise de subconjuntos epiteliais mostrou uma representação maior de células AT2 na fração Cy5,5⁺ do que na fração Cy5,5⁻, enquanto as células AT1 permaneceram baixas em ambas as frações (Figura 1D). Esses resultados indicam que o scRNA-seq de fração pareada pode identificar o enriquecimento de células AT2 dentro da fração pulmonar cR11A-Cy5.5–positiva.

Citometria de fluxo foi usada para quantificar o sinal cR11A-Cy5.5 dentro de células AT2 definidas pelo repórter. O gate representativo incluiu seleção de células totais por FSC-A/SSC-A, dois portões singlete sequenciais, gate de célula viva e GFP final versus. Análise Cy5.5 (Figura 2A–E). Na amostra controle, os eventos GFP⁺/Cy5,5⁺ foram mínimos, estabelecendo o limiar de fluorescência de fundo. Após a administração de cR11A-Cy5.5, os eventos de resposta pós-resposta para GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 aumentaram para 7,99% aos 15 minutos e 7,41% aos 60 minutos após a injeção neste conjunto de dados representativo (Figura 2E). Esses resultados apoiam o sinal detectável de cR11A-Cy5.5 em células repórter-positivas AT2 in vivo.

A imagem confocal z-stack fornece validação espacial da fluorescência associada a peptídeos em seções de tecido pulmonar. Um controle não repórter foi incluído para avaliar a fluorescência de fundo e mostrou sinal mínimo nos canais GFP e Cy5.5. Nos pulmões repórteres AT2 tratados com cR11A-Cy5.5, a fluorescência de Cy5.5 foi detectada próxima a células de glóter positivo para GFP⁺ AT2, e o canal de colocalização gerado por Imaris identificou sobreposição entre os sinais de GFP e Cy5.5 (Figura 3A). A análise representativa de colocalização de Imaris mostrou 89,6% e 86,8% de colocalização dentro do compartimento GFP⁺ AT2 em 15 minutos e 60 minutos, respectivamente (Figura 3B).

Resultados subótimos podem incluir alta fluorescência de fundo de Cy5.5 em amostras controle, baixa recuperação de células epiteliais, baixa viabilidade celular ou fraca separação dos eventos GFP⁺/Cy5.5⁺. Esses problemas normalmente indicam perfusão incompleta, perturbação excessiva dos tecidos, compensação inadequada ou limiares de imagem inconsistentes.

Figura 1: O scRNA-seq de fração pareada identifica o enriquecimento do epitélio alveolar na fração pulmonar cR11A-Cy5.5–positiva. As suspensões de célula única pulmonar foram classificadas em frações de Cy5,5⁻ e Cy5,5⁺ após a injeção retroorbital de cR11A-Cy5,5, e cada fração foi analisada por sequenciamento de RNA de célula única. (A) Gráficos UMAP mostram agrupamentos de tipos celulares em frações pareadas de um mouse representativo. (B) A sobreposição UMAP mostra a distribuição das células Cy5.5⁻ e Cy5.5⁺. As regiões circuladas em (A) e (B) indicam o compartimento epitelial destacado para análise de subconjuntos epiteliais. (C) Populações imunes são altamente prevalentes em ambas as frações, representando mais de 80% de cada uma. Comparado à fração Cy5,5⁻, a fração Cy5,5⁺ contém uma proporção maior de populações endoteliais, epiteliais e mesenquimatos, indicando captação de cR11A dentro dessas populações. (D) Dentro da população epitelial, as células AT2 estão mais fortemente representadas na fração Cy5,5⁺ do que na fração Cy5,5⁻, enquanto as células AT1 permanecem baixas em ambas as frações. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Validação por citometria de fluxo da captação de cR11A-Cy5.5 nos pulmões repórter AT2. Ratos repórteres AT2 foram administrados cR11A-Cy5.5 por injeção intravenosa retroorbital, e os pulmões foram colhidos em 15 ou 60 minutos após a injeção para preparação de célula única. O gating representativo é mostrado para amostras de controle de veículo PBS (Ctrl) e cR11A-Cy5.5: (A) células foram selecionadas por FSC-A/SSC-A, (B, C) singlets foram direcionadas por exclusão de duplos por dispersão, (D) células vivas foram identificadas por exclusão de corante de viabilidade e (E) GFP (relator AT2) versus isso. O Cy5.5 foi usado para quantificar eventos GFP⁺/Cy5.5⁺. Neste conjunto de dados representativo, os eventos AT2 de GFP⁺/Cy5.5⁺ foram aproximadamente 8% tanto em 15 minutos quanto em 60 minutos após a administração de cR11A-Cy5.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Imagem confocal e análise de colocalização da Imaris da captação de cR11A-Cy5.5 nos pulmões repórteres AT2. (A) Campos representativos são mostrados para pulmões repórteres AT2 tratados com controle não repórter (Ctrl) e cR11A-Cy5.5, colhidos em 15 ou 60 minutos após a injeção para criossecção e imagem confocal por pilha z. Sinal GFP (verde) marca células AT2, e fluorescência cR11A-Cy5.5 (vermelho) indica sinal associado a peptídeos. O painel "Coloc" exibe pixels ou objetos classificados como colocalizados pelo Imaris (amarelo), e imagens mescladas ilustram sobreposição espacial entre os dois canais. O controle não relator foi incluído para avaliar a fluorescência de fundo nos canais GFP e Cy5.5. (B) A quantificação da colocalização dentro do compartimento GFP⁺ AT2 mostra que 89,6% e 86,8% do sinal GFP colocalizaram com cR11A-Cy5,5 em 15 minutos e 60 minutos, respectivamente. Esses dados indicam sobreposição robusta com células GFP⁺ AT2 em ambos os pontos temporais, apoiando o engajamento preferencial do compartimento AT2 in vivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo identifica o direcionamento peptídico em populações celulares específicas usando múltiplas leituras independentes operando em resoluções complementares: mapeamento em nível de transcriptoma (scRNA-seq de fração pareada), medição baseada em eventos quantitativos (citometria de fluxo repórter) e confirmação espacial (pilhas z confocais). Juntas, essas abordagens reduzem ambiguidades comuns inerentes a estudos baseados em biodistribuição em fluorescência ou em massa no nível do órgão, como fluorescência vascular de confusão ou retenção extracelular, bem como a incapacidade de atribuir sinal associado a peptídeos para populações celulares específicas^{do pulmão 7}.

Vários passos exigem atenção especial. A qualidade da perfusão afeta fortemente a fluorescência de fundo e o desempenho da triagem a jusante; perfusão suficiente é caracterizada por uma aparência uniforme, branco-marfim, de todos os lobos pulmonares, enquanto a perfusão incompleta pode elevar o sinal de Cy5.5 em compartimentos não alvo. Para dissociação tecidual, a digestão a frio prolongada (4 °C, 20 h) é usada em vez das condições típicas de digestão (37 °C, 1–2 h) para preservar populações epiteliais e melhorar a recuperação das células frágeis, especialmente células alveolares tipo I (AT1)¹⁰. As células AT1 são facilmente perdidas durante o isolamento porque sua morfologia grande e fina as torna altamente sensíveis à digestão mecânica. Além das práticas laboratoriais padrão, incluindo digestão consistente, compensação, controle e limiar, a análise de colocalização 3D ajuda a determinar se o sinal peptídico se sobrepõe ao sinal do repárter AT2, em vez de depender apenas da sobreposição de fluorescência^{bidimensional 13}.

Pode ser considerado um passo de depleção de células imunes CD45⁺ antes da quantificação do scRNA-seq ou citometria de fluxo. As células imunes constituem uma grande proporção das populações celulares pulmonares e podem absorver CPPs como parte de uma resposta imune típica a partículas estranhas. Para quantificar com mais precisão a captação de CPP em populações não imunes, incluindo compartimentos endoteliais, epiteliais e mesenquimatos, a depleção celular CD45⁺ pode melhorar a sensibilidade. Isso pode ser alcançado usando depleção baseada em esferas antes da separação ou excluindo células CD45⁺ durante a análise de citometria^{de fluxo 12}. No entanto, essa modificação deve ser usada seletivamente porque remove a informação de absorção das células imunes e altera a composição celular da amostra analisada.

Várias limitações desse fluxo de trabalho devem ser consideradas. A fluorescência Cy5.5 identifica o sinal associado ao peptídeo, mas não distingue, por si só, o peptídeo internalizado do sinal aderente à membrana ou pericelular. O scRNA-seq de fração pareada também é afetado pela dissociação tecidual, recuperação celular, limiares de triagem e a abundância relativa de cada população celular pulmonar. Portanto, populações raras como células basais ou ionócitos podem estar sub-representadas ou ser ignoradas. A citometria de fluxo de camundongos repórter oferece uma atribuição de tipos celulares mais forte, mas requer uma linha repórter apropriada ou um painel de anticorpos validado. Além disso, um controle de veículo usando camundongos repórter definiria melhor a colocalização de fundo dentro das células GFP⁺ AT2 em ensaios de imagem. A interpretação, portanto, deve se basear em evidências concordantes entre scRNA-seq, citometria de fluxo e imagem confocal, em vez de qualquer leitura única.

Esse fluxo de trabalho é modular e pode ser adaptado a fluoróforos alternativos, linhas de camundongos repórter, regimes de dosagem ou pontos de tempo de colheita. Para estudos que desenvolvem CPPs específicas de células ou órgãos adicionais, o design de scRNA-seq de fração pareada pode ser aplicado com modificações em outros órgãos (por exemplo, fígado, rim ou cérebro). Esse protocolo oferece uma abordagem eficiente para comparar populações associadas a peptídeos dentro de um único órgão do mesmo animal, melhorando assim a interpretabilidade e reduzindo a variabilidade entre animais. Aplicações futuras incluem triagem de CPPs adicionais, teste de conjugados CPP–carga, comparação de desenhos de peptídeos lineares e cíclicos, e aplicação do fluxo de trabalho a modelos de doenças nos quais a arquitetura do tecido ou a abundância celular-alvo é alterada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Usado para identificação ou exclusão de células CD45+
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Strain #000664	Camundongos selvagens do tipo selvagem usados para experimentos
CD45 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301	Usado para depleção magnética de células CD45+
Cell counter	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Contagem automatizada de células
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Incubação de células
Confocal microscope	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Usado para aquisição de imagens z-stack
cR11A-Cy5.5 peptide	Mayo Clinic Proteomics Core	Custom synthesis; no catalog number	CPP fluorescentemente marcado usado para entrega in vivo
Cryostats	Leica Biosystems	Leica CM1950	Usado para seção de tecido
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Enzima usada para digestão de tecido pulmonar
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Buffer de dissociação e lavagem celular
DNase I	Roche	10104159001	Reduz o aglomeramento de células mediado por DNA
FACS cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4 laser system	Usado para classificação de células Cy5.5+ e Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	Adicionado aos buffers para melhorar a viabilidade celular
FlowJo software	FlowJo	Version 10.10.0	Análise de dados de citometria de fluxo
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Version 10	Análise estatística e plotagem
Imaris software	Oxford Instruments	Version 9.9.1	Visualização 3D e análise de colocalização
Incubated orbital shaker	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Usado para digestão de tecido
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	Usado para separação magnética de células (MACS)
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
Live/dead fixable yellow dead cell stain kit	Invitrogen	L34968	Usado para coloração de viabilidade em citometria de fluxo
Live/dead fixable yellow dead cell stain kit	Invitrogen	L34968
LSL-GFP reporter mice	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Linha Cre-indutive de relatório GFP
LSL-GFP reporter mice	The Jackson Laboratory	Strain #007906
Microcentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R	Centrifugação de amostra
Microcentrifuge	Eppendorf	EPP-5427R
Mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139	Contratinta nuclear para imagem
Mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139
Nuclease-free water	Qiagen	175034992
Oral gavage needle	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Buffer de lavagem geral
PBS	Gibco	10010-023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Previne contaminação bacteriana
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Pelletagem celular em temperatura controlada
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Saline	Baxter	2F7124
Sftpc-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	Strain #028054	Linha Cre indutível específica de AT2
Sftpc-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	Strain #028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter mice	In-house breeding	Gerado pelo cruzamento de camundongos Sftpc-CreERT2(+/+) com camundongos LSL-GFP(+/+)	Usado para rotulagem GFP específica de AT2
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 reporter mice	In-house breeding	Gerado pelo cruzamento de camundongos Sftpc-CreERT2(+/+) com camundongos LSL-GFP(+/+)
Silk suture	Look	SP117
Single-cell RNA sequencing service	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Preparação de biblioteca e sequenciamento
Single-cell RNA sequencing service	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
Water bath incubator	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Incubação controlada de temperatura
Water bath incubator	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xylazine (Rompun)	Dechra	NADA #047-956