Análise Quantitativa Micro-CT do Parênquima Pulmonar e Remodelação das Vias Aéreas em um modelo de Furão de Fibrose Pulmonar

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para usar micro-CT para avaliar quantitativamente as características da fibrose pulmonar induzida por bleomicina em um modelo de furão. Esse modelo de furão demonstra forte potencial translacional para entender a fibrose pulmonar e testar novas terapias.

Resumo

A fibrose pulmonar (PF) é uma doença pulmonar crônica e progressiva caracterizada por lesão alveolar repetitiva que leva ao espessamento do parênquimato, cicatrizes e comprometimento respiratório. Modelos atuais de roedores, especialmente aqueles que utilizam bleomicina (BLEO), têm relevância translacional limitada para a fibrose pulmonar idiopática humana (IPF) devido a diferenças anatômicas, como a ausência de bronquíolos respiratórios. Para enfrentar essa limitação, desenvolvemos um modelo de fibrose pulmonar em animais grandes em furões, que possuem bronquíolos respiratórios semelhantes aos humanos. Furões selvagens de três meses receberam instilação intratraqueal de BLEO. Os pulmões foram coletados 8 semanas após o tratamento para tomografia microcomputada (micro-CT) e avaliação histológica. Devido à resolução espacial limitada da tomografia computorizada multidetector (MDCT) na visualização das pequenas vias aéreas do furão, pulmões excisados foram fotografados ex vivo usando um microscanner CT sob pressões controladas nas vias aéreas (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) para simular condições expiratórias e inspiratórias.

Imagens por microtomografia computadorizada revelaram diferenças estruturais distintas entre pulmões normais e tratados com BLEO. Pulmões normais apresentaram baixa atenuação e arquitetura preservada, enquanto pulmões tratados com BLEO apresentaram atenuação marcadamente aumentada compatível com fibrose. Características características da doença pulmonar fibrótica humana, incluindo favo de mel com espaços císticos, septos interlobulares espessados e opacidades de vidro moído indicativas de alterações fibróticas ou inflamatórias precoces. Utilizando análise quantitativa de micro-TC, observou-se que as vias aéreas nos pulmões de furão tratados com BLEO apresentaram redução significativa da expansão radial, do alongamento longitudinal e da variação de volume em ambas as pressões aplicadas. Além disso, a análise pareada por gerações revelou espessamento significativo das paredes das vias aéreas em regiões com fibrose visualmente aparente. A avaliação histológica, incluindo a coloração tricroma de Masson, confirmou extensa deposição de colágeno e fibrose.

Este estudo demonstra que furões tratados com BLUO desenvolvem características radiológicas, mecânicas e histopatológicas semelhantes à fibrose pulmonar humana. Além disso, a micro-TC permite avaliação de alta resolução da distribuição fibrótica, dinâmica das vias aéreas e alterações no volume pulmonar. Esses achados destacam o potencial do furão como modelo translacional para estudar a patogênese da fascite plantar e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A fibrose pulmonar (PF) é uma doença pulmonar intersticial crônica e progressiva na qual lesão alveolar repetida leva ao espessamento parênquimato, fibrose e disfunção respiratória^{progressiva 1}. A fibrose pulmonar pode ser induzida por diversas exposições, incluindo medicamentos, toxinas ambientais, infecções, doenças autoimunes subjacentes, ou pode ser^{idiopática 1}. Embora medicamentos tenham sido desenvolvidos para retardar a progressão da doença, especialmente em pacientes com fibrose pulmonar idiopática (FPI), a fibrose pulmonar permanece incurável, com uma taxa de sobrevivência de 3 a 5 anos após o diagnóstico ^1,2. Na maioria dos casos, o único tratamento definitivo é o transplante de pulmão; Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas opções terapêuticas mais eficazes.

A bleomicina é um medicamento comumente usado em humanos para o tratamento de malignidades; no entanto, seu uso é limitado pela toxicidade pulmonar, que pode rapidamente evoluir para fibrose^{pulmonar 3}. Após a descoberta desse efeito colateral, a bleomicina foi usada em pesquisas para desenvolver modelos animais de fibrose pulmonar. Os camundongos têm sido comumente usados para esse propósito ^4,5,6 com vários métodos de administração de Bleomicina, incluindo instilação intraintraqueal^{e intratraqueal 7,8}. Embora a fibrose se forme nesses modelos, nenhum deles abrange todas as características cardomais da fibrose pulmonar observada em^humanos. Modelos de fibrose pulmonar em roedores não refletem características-chave da doença avançada, incluindo a formação de cistos em favo de mel e a bronquiolização dos alvéolos^{distais 9}. Além disso, estudos mostraram que a lesão pulmonar induzida pela bleomicina começa a se resolver espontaneamente em roedores aproximadamente 28 dias após o tratamento^{com bleomicina 10}. Além disso, nenhum dos agentes comprovados como inibidores da fibrose nesses modelos teve efeito equivalente em humanos, limitando nossas opções^{terapêuticas 11}.

Furões domésticos (Mustela putorius furo) são cada vez mais usados em pesquisas biomédicas respiratórias devido às suas semelhanças anatômicas com o sistema respiratório^{humano 12}. Além disso, são suscetíveis a patógenos respiratórios semelhantes que infectam humanos, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV) e a gripe, mostrando suas semelhanças^{fisiológicas 12}. Modelos furão de bleomicina demonstram bronquiolização, formação de focos fibróticos e a presença de células aberrantes semelhantes a basaloides (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)⁹. Uma única dose de bleomicina induziu fibrose pulmonar sustentada em furões, com fisiologia restritiva e anormalidades pulmonares fibróticas persistindo por pelo menos 22 semanas¹³. Esse achado difere substancialmente do modelo amplamente utilizado de bleomicina de camundongo, onde a fibrose geralmente é autolimitada e começa a se resolver após aproximadamente 28 dias, com regressão substancial ocorrendo entre 6 e 8 semanas, sugerindo que o modelo do furão pode recapitular melhor a natureza crônica e progressiva da fibrose pulmonar humana. Além disso, furões têm sido recentemente usados em pesquisas sobre fibrose cística, uma doença sistêmica que afeta mais comumente o sistema respiratório, devido à sua semelhança com os humanos^. Portanto, esses animais podem servir como modelos melhores para PF do que modelos anteriores de roedores.

Este estudo atual teve como objetivo desenvolver um modelo animal de fibrose pulmonar que se assemelhe mais à condição humana. Administramos bleomicina intratraqueal a furões domésticos. Após 8 semanas, esses furões apresentaram alterações radiográficas e histológicas semelhantes às observadas em humanos com fibrose pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Michigan State University (Aprovação do protocolo animal nº PROTO202300066). Os protocolos de cuidado animal e experimentais foram aprovados pela Michigan State University e realizados em conformidade com os padrões institucionais para o uso ético de animais em pesquisas.

1. Instilação broncoscópica de bleomicina em furões

1. Adquira furões machos com idade entre 3 e 4 meses. O peso médio de um furão macho nessa idade deve ser aproximadamente 0,9–1,6 kg. Abrigue os animais a 21 °C com umidade de 40% a 50%.
2. Administre gás isoflurano de 3%–5% ao furão usando uma máquina de anestesia vaporizadora de precisão.
3. Mantenha a anestesia cobrindo o nariz do furão com um cone nasal, e continue administrando gás isoflurano em uma concentração de 3%–5%.
4. Quando o furão estiver adequadamente sedado e reclinado, inicie a broncoscopia usando um broncoscópio de 2,7 mm de diâmetro externo.
5. Injete uma mistura de bleomicina (2 U/kg de peso corporal) e soro fisiológico pelo canal de trabalho na traqueia distal para permitir a dispersão difusa da bleomicina. Certifique-se de que o volume total injetado não exceda 1 mL. Devolva os furões às respectivas unidades e monitore por 8 semanas.
   NOTA: A instalação não deve levar mais que dois minutos para ser concluída.
6. Administre isoflurano usando uma máquina de anestesia de gás vaporizador de precisão. Cubra o nariz do furão com um cone nadal e administre 1%–5% de isoflurano até que ele fique reclinado. Continue com a exposição a gases até que a aparente morte clínica possa ser confirmada. Administrar solução de eutanásia intravenosa em uma dose de 90 mg/kg e monitorar os sinais vitais até a confirmação da morte.
7. Colhe os pulmões 8 semanas após o tratamento para tomografia microcomputadorizada (micro-CT) e avaliação histológica.

2. Imagens micro-CT de alta resolução dos pulmões de furão

1. Prepare o tecido pulmonar excisado para imagem, removendo tecido e sangue extrínsecos pela incisão da veia cava inferior para permitir o escoamento sanguíneo. Realize a tomografia imediatamente após preparar os pulmões.
2. Obtenha imagens tomográficas micro-CT usando um sistema micro-CT com as seguintes configurações de aquisição de imagem: 90 keV, 88 μA, ajuste de potência com filtro colimador de raios X de cobre de 60 μm e alumínio de 500 μm, usando campo de visão (FOV) de 72 mm com resolução isotrópica de imagem de 144 μm.
3. Adquirir um total de 5 imagens em tempos padrão de pórtico de 18 s usando um protocolo automatizado de costura para sobrepor, costurar e rejeitar fatias duplicadas para criar uma imagem final costurada para análise de tubulação de vias aéreas; isso resultará em um FOV cilíndrico de 68 mm de diâmetro x 186 mm de profundidade total de imagem costurada (plano Z) a resolução voxel de 144 μm, permitindo a captura completa de todo o bloco pulmão de furão ex vivo .
   1. Repita este protocolo de imagem para cada conjunto de pulmões de furão ex vivo em pressões pulmonares de 0_{cmH 2}O e 25 cmH₂O.
   2. Use um sistema de monitoramento de pressão conectado diretamente ao pulmão para controlar e manter a pressão das vias aéreas com precisão durante a imagem.
   3. Acople o medidor de pressão a uma fonte de fluxo de ar regulada para permitir o ajuste contínuo da pressão intrapulmonar.
   4. Antes da imagem, ajuste o sistema para o nível de pressão desejado (0 cmH₂O ou 25 cmH₂O) e infle o pulmão usando um fluxo de ar constante.
   5. Durante a imagem, use o medidor de pressão para fornecer feedback em tempo real sobre a pressão das vias aéreas e compensar quaisquer pequenas flutuações de pressão usando a fonte de fluxo de ar.

3. Processamento de imagens e segmentação

1. Carregue os volumes de imagens micro-CT reconstruídos no formato DICOM, que são convertidos para um formato de iniciativa de tecnologia informática de neuroimagem (NIfTI), no pipeline de segmentação das vias aéreas.
2. Defina a região de interesse (ROI) na imagem micro-CT cortando manualmente fatias axiais na extremidade superior para excluir o tubo e outros insertos traqueais (ver Figura 1A).
3. Realize a segmentação das vias aéreas usando o algoritmo automatizado de congelar e crescer^15,16 descrito nos seguintes passos principais.
   1. Coloque uma semente dentro da traqueia na fatia axial mais alta dentro do ROI; criar um array de imagens vazio com tamanho de imagem de entrada para representar o volume inicial confiante das vias aéreas (CAV) com todos os voxels atribuídos a '0'; e adicione o voxel semente ao CAV definindo seu valor como '1'.
   2. Defina um limiar inicial conservador de intensidade micro-CT t = -1000 HU para segmentação do lúmen das vias aéreas.
   3. Crie um array de imagens vazio com tamanho de imagem de entrada para representar o volume proibido (FV) com todos os voxels inicializados em '0'.
   4. Repetir a segmentação iterativa até que a convergência da segmentação do lúmen das vias aéreas seja definida por uma das duas bandeiras: 1) toda a faixa de limiar (-1000 a -600 HU) é verificada, ou 2) todos os voxels '0' adjacentes a '1' na imagem CAV são marcados como '1' na imagem FV.
      1. Calcule a árvore central da linha central do^{CAV 17} e identifique os pontos finais do ramo^{terminal 18}.
      2. Aplique limiar binário na imagem micro-CT no valor atual de t e calcule o novo volume conectado ao lúmen¹⁸ com CAV como sementes sobre a região limiar (valor voxel ≤ t), excluindo FV.
      3. Para cada ponto final CAV, calcule os voxels associados dentro do novo volume de lúmen, excluindo os CAVs que estão mais próximos desse ponto final do que de quaisquer outros extremos CAV.
      4. Detectar o ponto final do CAV com um grande volume de vóxels associados (>150 vóxeis, equivalente a 0,5 mm³) como possíveis sítios de vazamento no novo volume de lúmen.
      5. Confirme um possível vazamento de lúmen usando os critérios automatizados definidos em Nadeem et ^al.15.
      6. Remova quaisquer vazamentos no volume de lúmens excluindo o volume da subárvore distal às raízes de vazamento, e adicione voxels ao redor das raízes de vazamento para aumentar a FV usando os algoritmos descritos^{anteriormente 15}.
      7. Atribua o volume de lúmens removido por vazamento para atualizar o CAV usando os algoritmos^{descritos anteriormente 15}.
      8. Incremente o limiar t por '1'.
      9. Vá para o passo 3.3.4.
4. Realize o cálculo de uma árvore central de via aérea com um vóxel de espessura usando um algoritmo automatizado previamente^{validado 17} , descrito nos seguintes passos principais.
   1. Insira a árvore segmentada da via aérea como uma imagem binária NIfTI.
   2. Calcule a árvore central inicial da via aérea usando uma abordagem de caminho de custo mínimo medialmente^{preferida 17} , descrita nos passos principais a seguir.
      1. Criar um array de imagens esqueléticas vazias com tamanho de imagem de entrada com todos os voxels atribuídos a '0'; Adicione a semente automatizada do passo 3.3.1 como o voxel esqueleto inicial com valor '1'.
      2. Crie um array de imagens vazio com o tamanho da imagem de entrada com todos os voxels atribuídos a '0' para representar a imagem marcada do volume das vias aéreas.
      3. Identifique o voxel no volume não marcado das vias aéreas que está mais distante do esqueleto atual e calcule o caminho de custo mínimo medialmente preferido conectando esse ponto ao esqueleto atual usando o algoritmo descrito^{anteriormente 17}.
      4. Adicione o caminho resultante como um novo ramo esquelético ao array de imagens do esqueleto e atualize o volume marcado pela via aérea aplicando dilatação local adaptativa à escala ao longo do ramo, conforme descrito^{anteriormente 17}.
      5. Repita os passos 3.4.2.3–3.4.2.2.4 até que o volume marcado das vias aéreas esteja preenchido.
   3. Pode ramos topológicos espúrios preservando as verdadeiras linhas centrais das vias aéreas usando uma estratégia de seleção local baseada em escala no comprimento dos ramos, conforme descrito^{anteriormente 17}.
   4. Elimine os pontos simples¹⁹ na linha central da via aérea que não sejam extremidades de ramificação (ou seja, aqueles adjacentes a mais de um voxel central) para garantir consistência topológica e manter uma linha central com espessura de um único voxel.
5. Realize segmentação do parênquima pulmonar em microimagens dos pulmões de furão a 0_{cmH 2O}.
   1. Delinee manualmente o parênquima pulmonar em cada quinto corte de imagem coronal usando algoritmos computacionais e interfaces gráficas embutidas no^{ITK-SNAP 20}.
      NOTA: O contraste de intensidade micro-CT entre o parênquima pulmonar e o fundo ao redor no estado de inflação 25_{cmH 2O}foi insuficiente, impedindo a segmentação confiável do volume pulmonar.
   2. Aplique interpolação de imagem para gerar uma segmentação do parênquima pulmonar em fatias intermediárias de imagem.
   3. Realizar uma revisão secundária de controle de qualidade para garantir a continuidade estrutural da segmentação parênquimata ao longo das direções axial e sagital.
   4. Exclua o lúmen das vias aéreas e as regiões da parede do parênquima pulmonar usando uma dilatação local baseada em escamas do volume do lúmen e, em seguida, subtraia o volume dilatado do parênquima pulmonar.
6. Quantificar medidas mecânicas das vias^{aéreas 21}.
   1. Quantifique a expansão radial relacionada à respiração de vias aéreas individuais medindo mudanças na área da seção transversal do lúmen das vias aéreas (CSA) espacialmente correspondida entre os volumes pulmonares inspiratórios (inflação_{2H 2O}) e expiratórios (0_{cmH 2}O). Calcule a expansão radial em um ramo das vias aéreas b, denotada por Δ_ar-R(b), como:
      (1)
      onde,_{CSA ins}(b) e CSA_exp(b) denotam o lúmen das vias aéreas CSA nos volumes pulmonares inspiratórios e expiratórios. A CSA em b é calculada usando traço de linha radial e métodos de half-max localmente adaptativos sobre a metade central do ramo b²².
   2. Quantifique o alongamento longitudinal relacionado à respiração de vias aéreas individuais da seguinte forma:
      (2)
      onde L_ins(b) e L_exp(b) denotam comprimentos de caminho geodésico do ramo das vias aéreas b nos volumes pulmonares inspiratórios e expiratórios, respectivamente. O comprimento do caminho geodésico de um ramo é calculado traçando o caminho central da carina até a extremidade distal do^{ramo 21}.
7. Quantifique medidas baseadas em intensidade do parênquima pulmonar.
   1. Visualize espacialmente a distribuição micro-CT da intensidade do parênquima pulmonar em furões saudáveis e fibróticos, gerando uma "representação de volume 3D de olhar" do volume do parênquima pulmonar no contexto da árvore das vias aéreas. Realize o efeito de observação usando mapeamento de transparência definido por intensidade micro-CT e codificação por cores. Aplique o mesmo mapeamento de transparência e escalas de codificação por cores tanto nos pulmões saudáveis quanto nos fibróticos de furão. Os passos a seguir são aplicados para gerar a renderização de volume 3D com look-through.
      1. Use o Slicer^{3D 23} para abrir a imagem tridimensional (3D) do NIfTI da segmentação das rotas aéreas a 0_{cmH 2}O de inflação como uma "Segmentação".
      2. Gerar uma representação 3D das vias aéreas usando o módulo Segmentations . Selecione o volume das vias aéreas como entrada e, na aba Representações , clique em Criar na opção Superfície Fechada .
      3. Importe a imagem de intensidade micro-CT com parênquima pulmonar separado para o 3D Slicer como Volume. Nesta imagem, os valores originais de intensidade micro-CT são preservados para voxels pulmonares, enquanto todos os voxels não pulmonares recebem um valor de -2000 HU.
      4. Configure o mapeamento de cor e transparência para intensidades parênquimas pulmonares usando o módulo Volume Rendering . Valores de intensidade do mapa de -1500 HU, -600 HU, 0 HU e 1500 HU para preto, verde, amarelo e vermelho, com opacidades de 0, 0,15, 0,3 e 1, respectivamente.
   2. Use o algoritmo desenvolvido neste estudo para estimar a fração de tecido doente dentro do parênquima pulmonar, analisando a distribuição de intensidade observada pela micro-TC. O método assume que os valores de intensidade das regiões parênquimas saudáveis seguem uma distribuição gaussiana. Em contraste, regiões fibróticas, com intensidades caracteristicamente mais altas, distorcem a gaussianidade do lado direito do histograma observado. Realize essa tarefa nos passos a seguir.
      1. Calcule o histograma para imagem isolada do parênquim pulmonar no passo 3.7.1.3 com 50 bins na faixa de intensidade de -1500 HEU a 500 HU.
      2. Calcule a média da distribuição Gaussiana alvo como modo do histograma e derive o parâmetro de desvio padrão usando os valores de intensidade à esquerda do modo no histograma.
      3. Quantifique o volume do tecido fibrótico como a área excedente no lado direito do histograma observado que está acima da curva de distribuição Gaussiana esperada definida pelos parâmetros de média e desvio padrão obtidos no passo 3.7.2.2.
      4. Calcule a fração do tecido doente como a razão entre o volume do tecido fibrótico e a contagem total de histogramas representando o volume da região parênquima.

Resultados

Dos cinco furões, os pulmões excisados de um furão saudável e de um furão fibrótico foram fotografados usando um micro-tomotomotomografia computadorizada sob pressões controladas das vias aéreas de 0_{cmH 2}O e 25 cmH₂O para simular as inflações pulmonares expiratórias e inspiratórias, respectivamente.

A Figura 1 ilustra os resultados intermediários do pipeline de processamento de imagem para a imagem micro-CT (Figura 1A) de um pulmão de furão ex vivo a 0_{cmH 2}O de pressão. A Figura 1B apresenta resultados intermediários da segmentação do volume da árvore das vias aéreas ao longo das iterações e parâmetros de limiar correspondentes em uma imagem micro-CT de um pulmão de furão excisado inflado a 0_{cmH 2}O. A Figura 1B demonstra a eficácia do algoritmo FG em capturar vias aéreas menores por meio de relaxamento de parâmetros em iterações posteriores. A Figura 1C ilustra os resultados da detecção da árvore da linha central das vias aéreas antes e depois da poda de ramos espúrios.

Foi observado que, além da quinta geração, o número de vias aéreas detectadas nos pulmões fibróticos é notavelmente menor do que aquelas detectadas na geração correspondente no pulmão saudável (Figura 2A). Especificamente, 161 ramificações das vias aéreas foram detectadas no pulmão saudável além da quinta geração, enquanto apenas 91 vias aéreas foram detectadas nos pulmões fibróticos ao longo das gerações correspondentes. Em geral, as paredes das vias aéreas eram mais espessas nos pulmões fibróticos em comparação com os pulmões saudáveis (Figura 2B). A análise computacional revelou um aumento significativo na espessura da parede das vias aéreas normalizada pelo diâmetro do lúmen em regiões com fibrose visualmente aparente em comparação com regiões pareadas no pulmão saudável.

Pulmões fibróticos apresentaram pequenos espaços de ar cístico de paredes espessas, consistentes com penteamento de mel, espessamento de septos interlobulares e regiões de opacidade do vidro despolido. Opacidades do vidro espoliado referem-se a regiões do pulmão onde tecido pulmonar espessado e espaços aéreos parcialmente preenchidos fazem com que a área pareça turva e cinza nas imagens de tomografia. Foi observado que pulmões fibróticos apresentavam valores de intensidade CT mais altos no parênquima, correspondentes às regiões fibróticas. A Figura 3A apresenta uma "representação 3D do volume do parênquima segmentado do pulmão juntamente com a árvore segmentada das vias aéreas. Os valores de intensidade da microtomografia computada sobre o parênquima nos pulmões de furão fibróticos (-502 ± 238 HU) foram significativamente maiores (p < 0,001) do que os do pulmão saudável do furão (-588 ± 167 HU). A análise de elevação de intensidade regional (Figura 3B) mostrou que o pulmão fibrótico tem 27,8% de volume parênquimatose com intensidade da tomografia computarizada elevada (indicada pela área roxa no histograma). Em comparação, o pulmão saudável apresenta apenas 1,24% do volume parênquimatose com intensidade elevada da tomografia computorizada.

Uma comparação visual da mecânica das vias aéreas entre pulmões normais e doentes ilustra a distribuição dos biomarcadores mecânicos respiratórios das vias aéreas em pulmões de furão saudáveis e fibróticos entre os ramos das vias aéreas (Figura 4). Uma expansão radial das vias aéreas de 66,8% ± 9,8% foi observada nos pulmões saudáveis dos furões, significativamente maior (p < 0,001) do que nos pulmões dos furões fibróticos (32,4% ± 7,6%). Uma diferença significativa (p < 0,001) no alongamento longitudinal das vias aéreas também foi observada entre pulmões de furão saudáveis (35,7% ± 5,3%) e fibróticos (16,0% ± 4,9%).

Imagens representativas de tomografia computadorizada foram obtidas usando um micro-scanner CT em duas pressões diferentes das vias aéreas (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) para cada pulmão. A Figura 5 ilustra as diferenças entre pulmões normais (Figura 5B,C) e tratados com BLUO (Figura 5E,F). Nos pulmões normais, as tomografias mostram arquitetura pulmonar típica com baixa atenuação e sem sinais de fibrose (Figuras 5B,C). Em contraste, os pulmões de furão tratados com BLIO apresentam alterações patológicas significativas, incluindo aumento da atenuação pulmonar, indicativa de fibrose tecidular (Figura 5E,F). Além disso, observa-se um favo de mel proeminente, caracterizado por espaços císticos e septos interlobulares espessados (Figura 5E,F). Opacidades do vidro espoliado (GGO), representando áreas de inflamação ou alterações fibróticas iniciais, também são visíveis nos pulmões tratados com BLEO (Figura 5E,F).

A análise histológica (Figura 6) confirmou remodelação substancial dos tecidos e fibrose nos pulmões de furão tratados com bleomicina. A coloração por hematoxilina e eosina (HE) revelou arquitetura alveolar preservada em pulmões normais (Figura 6A, C), enquanto pulmões fibróticos apresentaram extensa distorção estrutural, aumento da celularidade, espessamento da parede das vias aéreas e lesões fibróticas proeminentes (Figura 6B,D). A coloração tricromática de Masson também demonstrou deposição mínima de colágeno nas vias aéreas e parênquima dos pulmões normais (Figura 6E,G), enquanto pulmões fibróticos apresentaram acúmulo marcado de colágeno tanto nas vias aéreas (Figura 6F) quanto nas regiões parênquimatosas (Figura 6H). A análise quantitativa de imagem (Figura 6I,J) confirmou um aumento significativo na área positiva para colágeno em pulmões fibróticos em comparação com controles normais tanto nas vias aéreas quanto nos compartimentos parênquimatos (P < 0,0001), indicando extensa deposição extracelular da matriz e remodelação progressiva dos tecidos.

Figura 1: Processamento e segmentação de imagens em CT. (A) Seleção da região de interesse (ROI) em uma imagem micro-CT. A linha de corte foi selecionada manualmente para excluir o tubo e outros insertos traqueais usados para inflar os pulmões de furão excisados. (B) Resultados intermediários da segmentação da árvore das vias aéreas em uma imagem micro-CT de um pulmão de furão excisado inflado a 0_{cmH 2O}usando o algoritmo de congelar e crescer (FG). (C) Resultados da detecção da linha central antes e após a poda de ramos esqueléticos espúrios aplicados no volume de segmentação das vias aéreas a partir de uma imagem micro-CT de 0_{cmH 2O}. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise computacional da geração de árvores das vias aéreas. (A) O número de vias aéreas detectadas nos pulmões saudáveis versus os fibróticos. (B) Diferenças na espessura da parede das vias aéreas em pulmões saudáveis vs. fibróticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Visualização da intensidade micro-CT codificada por cor. (A) Uma visualização 3D de distribuições de intensidade micro-CT codificadas por cores ao longo do parênquima para pulmões de furão saudáveis e fibróticos a 0 cmH2O de inflação. (B) Histogramas de intensidade micro-CT de pulmões de furão saudáveis e fibróticos, com a área do histograma marcada em roxo indicando regiões de intensidades elevadas de TC com base em modelagem gaussiana. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Biomarcadores mecânicos respiratórios das vias aéreas para pulmões de furão saudáveis e fibróticos. Para cada biomarcador (A mostra a expansão radial das vias aéreas, B mostra o alongamento longitudinal das vias aéreas), foi aplicado um esquema normalizado de codificação por cores que abrange a faixa de μ_x ± 3σ_x, onde a média (μ_x) e o desvio padrão (σ_x) de cada métrica foram calculados em todos os ramos do pulmão saudável do furão. Veja o texto para resultados comparativos quantitativos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Imagens micro-CT demonstram extensa remodelação estrutural e perda de volume pulmonar aerado em pulmões de furões fibróticos induzidos por bleomicina. (A–F) Imagens micro-CT representativas adquiridas a uma pressão de inflação de 25 cm H₂O comparem furões controles saudáveis (A–C) com furões fibróticos tratados com bleomicina (D–F). Reconstruções tridimensionais (3D) renderizadas por volume (A,D) apresentam arquitetura pulmonar preservada e expansão homogênea em pulmões saudáveis (A), enquanto pulmões fibróticos (D) apresentam redução da expansão pulmonar e marcada distorção parênquima. As cáreas TC transversas (B,E) e coronal (C,F) destacam ainda mais as diferenças entre os grupos. Pulmões saudáveis apresentam parênquima uniformemente aerado com ramificação normal das vias aéreas e densidade tecidular mínima (B,C). Em contraste, pulmões fibróticos apresentam extensa opacação bilateral subpleural, predominante basilar, aumento da densidade parênquima, distorção arquitetônica e aumento do espaço aéreo cístico consistente com remodelação em forma de favo de mel (setas vermelhas) (E,F). Linhas amarelas tracejadas delimitam os limites pulmonares. Esses achados de imagem indicam remodelação fibrótica severa e uma redução substancial no volume pulmonar aerado funcional após a exposição à bleomicina a furões. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Validação da fibrose pulmonar induzida por BLEO. (A–H) Seções representativas de campo claro coloridas com hematoxilina e eosina (HE) demonstram diferenças entre pulmões normais (A,C) e pulmões fibróticos (B,D). Imagens de HE de baixa ampliação mostram arquitetura alveolar preservada nos pulmões normais (A) e extensa remodelação tecidular e lesões fibróticas nos pulmões fibróticos (B). Imagens de HE com maior ampliação destacam ainda mais a estrutura alveolar normal nos pulmões normais (C) e o aumento da celularidade, espessamento da parede das vias aéreas e distorção arquitetônica nos pulmões fibróticos (D). Imagens representativas em campo claro de seções pulmonares de furão coradas com tricromo de Masson demonstram deposição mínima de colágeno nas vias aéreas pulmonares normais (E) e parênquima (G), e aumento da deposição de colágeno (azul) nas vias respiratórias fibróticas pulmonares (F) e parênquima (H). (I,J) A quantificação da área positiva para colágeno revelou um aumento significativo na deposição de colágeno nos pulmões fibróticos em comparação com pulmões normais tanto nas regiões das vias aéreas (I) quanto no parênquima pulmonar (J). P < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Este estudo descreve um protocolo que combina administração intratraqueal de bleomicina em furões com microtomografia computorizada ex vivo de alta resolução (micro-CT) para caracterizar características estruturais e mecânicas da fibrose pulmonar. A micro-TC pode detectar vias aéreas pequenas de até 0,2 mm e medir volumes, espessura das vias aéreas, densidade e morfologia. Aumento da densidade tecidual, perda de volume e heterogeneidade regional correspondem intimamente à histopatologia. O objetivo principal era estabelecer a viabilidade e demonstrar que esse modelo de grande animal, juntamente com análises avançadas de imagem, pode capturar características radiológicas, das vias aéreas e histopatológicas que se assemelham à fibrose pulmonar humana. Várias etapas do protocolo são críticas para a reprodutibilidade e interpretabilidade. Primeiro, a instilação de bleomicina intratraqueal guiada broncoscopicamente permite a exposição difusa dos pulmões enquanto minimiza o acúmulo das vias aéreas proximais, uma limitação conhecida dos modelos de pequenos^{animais 4,7,11}. Essa abordagem provavelmente reduz a variabilidade na distribuição regional de lesões, o que é particularmente importante em pulmões maiores com ramificações mais complexas das vias aéreas. Segundo, selecionar um período pós-instilação de 8 semanas favorece a fibrose estabelecida em detrimento da inflamação aguda. Em modelos murinos, a fibrose induzida por bleomicina frequentemente se resolve parcialmente ao longo do tempo, limitando a relevância^{translacional 4,8,11}. Em contraste, os pulmões de furão neste estudo apresentaram características fibrísticas radiológicas e histológicas persistentes.

A inflação pulmonar controlada durante imagens ex vivo representa outro elemento crítico. Imagens em pressões padronizadas das vias aéreas (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) permitiram quantificar a expansão radial das vias aéreas e o estiramento longitudinal, reduzindo assim os efeitos de confusão do volume e da aderência pulmonar variáveis. Esses biomarcadores mecânicos das vias aéreas, derivados por algoritmos automatizados e gerações pareados, fornecem medidas objetivas da disfunção das vias aéreas que são difíceis de avaliar apenas com histologia^{convencional 15,21}.

Várias modificações no protocolo podem aumentar ainda mais a robustez. A dosagem de bleomicina pode ser ajustada ou administrada em doses baixas repetidas para melhor modelar a lesão epitelial crônica, que é central para os paradigmas atuais da patogênese da fibrose^{pulmonar 1,3}. Estratégias de instilação segmentária podem permitir comparações dentro do animal entre regiões fibróticas e relativamente preservadas. Do ponto de vista da imagem, a padronização cuidadosa da pressão das vias aéreas, condições de fixação e temperatura é essencial para minimizar a deformação tecidual durante a varredura ex vivo. Fibrose severa pode complicar a segmentação automatizada das vias aéreas devido à obliteração das vias aéreas e alta densidade tecidual; Portanto, o limiar adaptativo e o controle manual de qualidade continuam sendo complementos essenciais para os pipelines^{automatizados 15}.

Esse método tem várias limitações. Mais notavelmente, o pequeno número de animais fotografados pela micro-CT limita a inferência estatística, e os achados devem ser interpretados como descritivos. Este trabalho foi elaborado como um estudo piloto para determinar a viabilidade de caracterizar um modelo de fibrose pulmonar induzido por bleomicina em furão, utilizando micro-CT quantitativa. Estudos futuros com coortes maiores serão necessários para validar esses achados e melhorar o poder estatístico. No entanto, a descrição mostra uma diferença perceptível nos biomarcadores de imagem e nas medições.

Além disso, embora amplamente utilizada, a fibrose induzida por bleomicina permanece um modelo de lesão impulsionada por toxinas e não recapitula totalmente a etiologia multifatorial da fibrose pulmonar idiopática, incluindo envelhecimento, suscetibilidade genética e exposições^{ambientais 3,6,11}. A imagem foi realizada ex vivo, impedindo avaliação direta da troca gasosa, contribuições vasculares e progressão longitudinal da doença. No entanto, a micro-CT ex vivo oferece resolução espacial superior e possibilita uma análise tridimensional detalhada de pequenas vias aéreas, algo que atualmente não é possível com a TC multidetector clínica em furões.

Apesar dessas limitações, esse protocolo oferece várias vantagens em relação aos modelos existentes. Furões possuem brônquiolos respiratórios e padrões de ramificação das vias aéreas que se assemelham mais aos humanos do que aos dos roedores, tornando-os particularmente adequados para estudar aspectos centrados nas vias aéreas da^{fibrose 6,12}. A combinação de uma anatomia das vias aéreas relevante para humanos com imagens quantitativas baseadas em micro-CT permite a avaliação simultânea da densidade parênquima, espessura da parede das vias aéreas, perda das vias aéreas e problemas na mecânica das vias aéreas. Essas características refletem padrões radiológicos observados na doença pulmonar fibrótica humana, incluindo penteamento de mel, espessamento do septo e heterogeneidade^{regional 1,2}.

A tomografia computadorizada de alta resolução (TCH) é uma modalidade de imagem fundamental para o diagnóstico e monitoramento longitudinal da fibrose pulmonar idiopática (FPI) na prática clínica. A HRCT baseia-se em princípios semelhantes à tomografia microcomputadorizada (micro-CT) e foi otimizada para detectar anomalias pulmonares parênquimas enquanto minimiza a exposição à radiação em^{pacientes de 24} anos. Importante destacar que os avanços na HRCT melhoraram a precisão diagnóstica a ponto de a biópsia pulmonar cirúrgica muitas vezes não ser mais necessária para o diagnóstico de IPF quando características de imagem estão^{presentes 25}. Achados radiográficos característicos da IPF, incluindo distorção arquitetônica, bronquiectasia por tração, penteamento de mel e espaços aéreos císticos, podem ser identificados por HRCT em pacientes. De acordo com essas observações clínicas, nosso modelo de furão demonstra distorção das vias aéreas e formação de espaço aéreo cístico detectável por micro-CT, fornecendo um fenótipo de imagem que se assemelha muito à doença humana.

Além da HRCT, a tomografia de coerência óptica endobrônquica (EB-OCT) surgiu como uma abordagem de imagem valiosa para avaliação de^{IPF 26}. EB-OCT é uma técnica minimamente invasiva que utiliza ondas de luz para gerar imagens tridimensionais e de alta resolução do pulmão periférico in vivo através de um broncoscópio^{padrão 26}. Semelhante à CRCT, a EB-OCT tem mostrado potencial para identificar remodelação fibrótica sem a necessidade de biópsia cirúrgica. A capacidade do nosso modelo de furão de desenvolver anomalias estruturais detectáveis por imagens baseadas em TC sugere que ele também pode ser bem adequado para avaliações futuras usando novas modalidades de imagem clínica, como EB-OCT.

Importante destacar que muitas terapias que atenuam a fibrose em modelos de roedores não demonstraram eficácia semelhante em humanos^. A abordagem descrita aqui pode ajudar a preencher essa lacuna translacional ao fornecer biomarcadores de imagem sensíveis e espacialmente resolvidos que refletem tanto estrutura quanto função. Tais biomarcadores podem ser usados para avaliar a resposta terapêutica além da carga global de colágeno, capturando melhorias regionais na mecânica das vias aéreas ou na remodelação parênquima.

Em conclusão, este estudo estabelece um protocolo viável para modelar a fibrose pulmonar em furões e para avaliar quantitativamente mudanças estruturais e mecânicas relacionadas à doença usando micro-CT. Embora preliminar, a abordagem destaca o potencial de combinar modelos de grandes animais com análises avançadas de imagem para aumentar a relevância translacional, aprimorar a compreensão mecanicista da fibrose pulmonar e apoiar a avaliação pré-clínica de novas estratégias terapêuticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Pomada ocular
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI