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Artigo de método

Análise Quantitativa Micro-CT do Parênquima Pulmonar e Remodelação das Vias Aéreas em um modelo de Furão de Fibrose Pulmonar

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DOI:

10.3791/71220

⸱

31 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics and Human Development, College of Human Medicine, Michigan State University, 2Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Corewell Health, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Iowa, 4Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 5Department of Medicine, College of Human Medicine, Michigan State University, 6Department of Radiology, University of Iowa

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para usar micro-CT para avaliar quantitativamente as características da fibrose pulmonar induzida por bleomicina em um modelo de furão. Esse modelo de furão demonstra forte potencial translacional para entender a fibrose pulmonar e testar novas terapias.

Resumo

A fibrose pulmonar (PF) é uma doença pulmonar crônica e progressiva caracterizada por lesão alveolar repetitiva que leva ao espessamento do parênquimato, cicatrizes e comprometimento respiratório. Modelos atuais de roedores, especialmente aqueles que utilizam bleomicina (BLEO), têm relevância translacional limitada para a fibrose pulmonar idiopática humana (IPF) devido a diferenças anatômicas, como a ausência de bronquíolos respiratórios. Para enfrentar essa limitação, desenvolvemos um modelo de fibrose pulmonar em animais grandes em furões, que possuem bronquíolos respiratórios semelhantes aos humanos. Furões selvagens de três meses receberam instilação intratraqueal de BLEO. Os pulmões foram coletados 8 semanas após o tratamento para tomografia microcomputada (micro-CT) e avaliação histológica. Devido à resolução espacial limitada da tomografia computorizada multidetector (MDCT) na visualização das pequenas vias aéreas do furão, pulmões excisados foram fotografados ex vivo usando um microscanner CT sob pressões controladas nas vias aéreas (0 cmH2O e 25 cmH2O) para simular condições expiratórias e inspiratórias.

Imagens por microtomografia computadorizada revelaram diferenças estruturais distintas entre pulmões normais e tratados com BLEO. Pulmões normais apresentaram baixa atenuação e arquitetura preservada, enquanto pulmões tratados com BLEO apresentaram atenuação marcadamente aumentada compatível com fibrose. Características características da doença pulmonar fibrótica humana, incluindo favo de mel com espaços císticos, septos interlobulares espessados e opacidades de vidro moído indicativas de alterações fibróticas ou inflamatórias precoces. Utilizando análise quantitativa de micro-TC, observou-se que as vias aéreas nos pulmões de furão tratados com BLEO apresentaram redução significativa da expansão radial, do alongamento longitudinal e da variação de volume em ambas as pressões aplicadas. Além disso, a análise pareada por gerações revelou espessamento significativo das paredes das vias aéreas em regiões com fibrose visualmente aparente. A avaliação histológica, incluindo a coloração tricroma de Masson, confirmou extensa deposição de colágeno e fibrose.

Este estudo demonstra que furões tratados com BLUO desenvolvem características radiológicas, mecânicas e histopatológicas semelhantes à fibrose pulmonar humana. Além disso, a micro-TC permite avaliação de alta resolução da distribuição fibrótica, dinâmica das vias aéreas e alterações no volume pulmonar. Esses achados destacam o potencial do furão como modelo translacional para estudar a patogênese da fascite plantar e avaliar novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A fibrose pulmonar (PF) é uma doença pulmonar intersticial crônica e progressiva na qual lesão alveolar repetida leva ao espessamento parênquimato, fibrose e disfunção respiratóriaprogressiva 1. A fibrose pulmonar pode ser induzida por diversas exposições, incluindo medicamentos, toxinas ambientais, infecções, doenças autoimunes subjacentes, ou pode seridiopática 1. Embora medicamentos tenham sido desenvolvidos para retardar a progressão da doença, especialmente em pacientes com fibrose pulmonar idiopática (FPI), a fibrose pulmonar permanece incurável, com uma taxa de sobrevivência de 3 a 5 anos após o diagnóstico 1,2. Na maioria dos casos, o único tratamento definitivo é o transplante de pulmão; Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas opções terapêuticas mais eficazes.

A bleomicina é um medicamento comumente usado em humanos para o tratamento de malignidades; no entanto, seu uso é limitado pela toxicidade pulmonar, que pode rapidamente evoluir para fibrosepulmonar 3. Após a descoberta desse efeito colateral, a bleomicina foi usada em pesquisas para desenvolver modelos animais de fibrose pulmonar. Os camundongos têm sido comumente usados para esse propósito 4,5,6 com vários métodos de administração de Bleomicina, incluindo instilação intraintraqueale intratraqueal 7,8. Embora a fibrose se forme nesses modelos, nenhum deles abrange todas as características cardomais da fibrose pulmonar observada emhumanos. Modelos de fibrose pulmonar em roedores não refletem características-chave da doença avançada, incluindo a formação de cistos em favo de mel e a bronquiolização dos alvéolosdistais 9. Além disso, estudos mostraram que a lesão pulmonar induzida pela bleomicina começa a se resolver espontaneamente em roedores aproximadamente 28 dias após o tratamentocom bleomicina 10. Além disso, nenhum dos agentes comprovados como inibidores da fibrose nesses modelos teve efeito equivalente em humanos, limitando nossas opçõesterapêuticas 11.

Furões domésticos (Mustela putorius furo) são cada vez mais usados em pesquisas biomédicas respiratórias devido às suas semelhanças anatômicas com o sistema respiratóriohumano 12. Além disso, são suscetíveis a patógenos respiratórios semelhantes que infectam humanos, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV) e a gripe, mostrando suas semelhançasfisiológicas 12. Modelos furão de bleomicina demonstram bronquiolização, formação de focos fibróticos e a presença de células aberrantes semelhantes a basaloides (KRT7+/KRT17+/KRT5–/TP63+)9. Uma única dose de bleomicina induziu fibrose pulmonar sustentada em furões, com fisiologia restritiva e anormalidades pulmonares fibróticas persistindo por pelo menos 22 semanas13. Esse achado difere substancialmente do modelo amplamente utilizado de bleomicina de camundongo, onde a fibrose geralmente é autolimitada e começa a se resolver após aproximadamente 28 dias, com regressão substancial ocorrendo entre 6 e 8 semanas, sugerindo que o modelo do furão pode recapitular melhor a natureza crônica e progressiva da fibrose pulmonar humana. Além disso, furões têm sido recentemente usados em pesquisas sobre fibrose cística, uma doença sistêmica que afeta mais comumente o sistema respiratório, devido à sua semelhança com os humanos. Portanto, esses animais podem servir como modelos melhores para PF do que modelos anteriores de roedores.

Este estudo atual teve como objetivo desenvolver um modelo animal de fibrose pulmonar que se assemelhe mais à condição humana. Administramos bleomicina intratraqueal a furões domésticos. Após 8 semanas, esses furões apresentaram alterações radiográficas e histológicas semelhantes às observadas em humanos com fibrose pulmonar.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Michigan State University (Aprovação do protocolo animal nº PROTO202300066). Os protocolos de cuidado animal e experimentais foram aprovados pela Michigan State University e realizados em conformidade com os padrões institucionais para o uso ético de animais em pesquisas.

1. Instilação broncoscópica de bleomicina em furões

  1. Adquira furões machos com idade entre 3 e 4 meses. O peso médio de um furão macho nessa idade deve ser aproximadamente 0,9–1,6 kg. Abrigue os animais a 21 °C com umidade de 40% a 50%.
  2. Administre gás isoflurano de 3%–5% ao furão usando uma máquina de anestesia vaporizadora de precisão.
  3. Mantenha a anestesia cobrindo o nariz do furão com um cone nasal, e continue administrando gás isoflurano em uma concentração de 3%–5%.
  4. Quando o furão estiver adequadamente sedado e reclinado, inicie a broncoscopia usando um broncoscópio de 2,7 mm de diâmetro externo.
  5. Injete uma mistura de bleomicina (2 U/kg de peso corporal) e soro fisiológico pelo canal de trabalho na traqueia distal para permitir a dispersão difusa da bleomicina. Certifique-se de que o volume total injetado não exceda 1 mL. Devolva os furões às respectivas unidades e monitore por 8 semanas.
    NOTA: A instalação não deve levar mais que dois minutos para ser concluída.
  6. Administre isoflurano usando uma máquina de anestesia de gás vaporizador de precisão. Cubra o nariz do furão com um cone nadal e administre 1%–5% de isoflurano até que ele fique reclinado. Continue com a exposição a gases até que a aparente morte clínica possa ser confirmada. Administrar solução de eutanásia intravenosa em uma dose de 90 mg/kg e monitorar os sinais vitais até a confirmação da morte.
  7. Colhe os pulmões 8 semanas após o tratamento para tomografia microcomputadorizada (micro-CT) e avaliação histológica.

2. Imagens micro-CT de alta resolução dos pulmões de furão

  1. Prepare o tecido pulmonar excisado para imagem, removendo tecido e sangue extrínsecos pela incisão da veia cava inferior para permitir o escoamento sanguíneo. Realize a tomografia imediatamente após preparar os pulmões.
  2. Obtenha imagens tomográficas micro-CT usando um sistema micro-CT com as seguintes configurações de aquisição de imagem: 90 keV, 88 μA, ajuste de potência com filtro colimador de raios X de cobre de 60 μm e alumínio de 500 μm, usando campo de visão (FOV) de 72 mm com resolução isotrópica de imagem de 144 μm.
  3. Adquirir um total de 5 imagens em tempos padrão de pórtico de 18 s usando um protocolo automatizado de costura para sobrepor, costurar e rejeitar fatias duplicadas para criar uma imagem final costurada para análise de tubulação de vias aéreas; isso resultará em um FOV cilíndrico de 68 mm de diâmetro x 186 mm de profundidade total de imagem costurada (plano Z) a resolução voxel de 144 μm, permitindo a captura completa de todo o bloco pulmão de furão ex vivo .
    1. Repita este protocolo de imagem para cada conjunto de pulmões de furão ex vivo em pressões pulmonares de 0cmH 2O e 25 cmH2O.
    2. Use um sistema de monitoramento de pressão conectado diretamente ao pulmão para controlar e manter a pressão das vias aéreas com precisão durante a imagem.
    3. Acople o medidor de pressão a uma fonte de fluxo de ar regulada para permitir o ajuste contínuo da pressão intrapulmonar.
    4. Antes da imagem, ajuste o sistema para o nível de pressão desejado (0 cmH₂O ou 25 cmH₂O) e infle o pulmão usando um fluxo de ar constante.
    5. Durante a imagem, use o medidor de pressão para fornecer feedback em tempo real sobre a pressão das vias aéreas e compensar quaisquer pequenas flutuações de pressão usando a fonte de fluxo de ar.

3. Processamento de imagens e segmentação

  1. Carregue os volumes de imagens micro-CT reconstruídos no formato DICOM, que são convertidos para um formato de iniciativa de tecnologia informática de neuroimagem (NIfTI), no pipeline de segmentação das vias aéreas.
  2. Defina a região de interesse (ROI) na imagem micro-CT cortando manualmente fatias axiais na extremidade superior para excluir o tubo e outros insertos traqueais (ver Figura 1A).
  3. Realize a segmentação das vias aéreas usando o algoritmo automatizado de congelar e crescer15,16 descrito nos seguintes passos principais.
    1. Coloque uma semente dentro da traqueia na fatia axial mais alta dentro do ROI; criar um array de imagens vazio com tamanho de imagem de entrada para representar o volume inicial confiante das vias aéreas (CAV) com todos os voxels atribuídos a '0'; e adicione o voxel semente ao CAV definindo seu valor como '1'.
    2. Defina um limiar inicial conservador de intensidade micro-CT t = -1000 HU para segmentação do lúmen das vias aéreas.
    3. Crie um array de imagens vazio com tamanho de imagem de entrada para representar o volume proibido (FV) com todos os voxels inicializados em '0'.
    4. Repetir a segmentação iterativa até que a convergência da segmentação do lúmen das vias aéreas seja definida por uma das duas bandeiras: 1) toda a faixa de limiar (-1000 a -600 HU) é verificada, ou 2) todos os voxels '0' adjacentes a '1' na imagem CAV são marcados como '1' na imagem FV.
      1. Calcule a árvore central da linha central doCAV 17 e identifique os pontos finais do ramoterminal 18.
      2. Aplique limiar binário na imagem micro-CT no valor atual de t e calcule o novo volume conectado ao lúmen18 com CAV como sementes sobre a região limiar (valor voxel ≤ t), excluindo FV.
      3. Para cada ponto final CAV, calcule os voxels associados dentro do novo volume de lúmen, excluindo os CAVs que estão mais próximos desse ponto final do que de quaisquer outros extremos CAV.
      4. Detectar o ponto final do CAV com um grande volume de vóxels associados (>150 vóxeis, equivalente a 0,5 mm3) como possíveis sítios de vazamento no novo volume de lúmen.
      5. Confirme um possível vazamento de lúmen usando os critérios automatizados definidos em Nadeem et al.15.
      6. Remova quaisquer vazamentos no volume de lúmens excluindo o volume da subárvore distal às raízes de vazamento, e adicione voxels ao redor das raízes de vazamento para aumentar a FV usando os algoritmos descritosanteriormente 15.
      7. Atribua o volume de lúmens removido por vazamento para atualizar o CAV usando os algoritmosdescritos anteriormente 15.
      8. Incremente o limiar t por '1'.
      9. Vá para o passo 3.3.4.
  4. Realize o cálculo de uma árvore central de via aérea com um vóxel de espessura usando um algoritmo automatizado previamentevalidado 17 , descrito nos seguintes passos principais.
    1. Insira a árvore segmentada da via aérea como uma imagem binária NIfTI.
    2. Calcule a árvore central inicial da via aérea usando uma abordagem de caminho de custo mínimo medialmentepreferida 17 , descrita nos passos principais a seguir.
      1. Criar um array de imagens esqueléticas vazias com tamanho de imagem de entrada com todos os voxels atribuídos a '0'; Adicione a semente automatizada do passo 3.3.1 como o voxel esqueleto inicial com valor '1'.
      2. Crie um array de imagens vazio com o tamanho da imagem de entrada com todos os voxels atribuídos a '0' para representar a imagem marcada do volume das vias aéreas.
      3. Identifique o voxel no volume não marcado das vias aéreas que está mais distante do esqueleto atual e calcule o caminho de custo mínimo medialmente preferido conectando esse ponto ao esqueleto atual usando o algoritmo descritoanteriormente 17.
      4. Adicione o caminho resultante como um novo ramo esquelético ao array de imagens do esqueleto e atualize o volume marcado pela via aérea aplicando dilatação local adaptativa à escala ao longo do ramo, conforme descritoanteriormente 17.
      5. Repita os passos 3.4.2.3–3.4.2.2.4 até que o volume marcado das vias aéreas esteja preenchido.
    3. Pode ramos topológicos espúrios preservando as verdadeiras linhas centrais das vias aéreas usando uma estratégia de seleção local baseada em escala no comprimento dos ramos, conforme descritoanteriormente 17.
    4. Elimine os pontos simples19 na linha central da via aérea que não sejam extremidades de ramificação (ou seja, aqueles adjacentes a mais de um voxel central) para garantir consistência topológica e manter uma linha central com espessura de um único voxel.
  5. Realize segmentação do parênquima pulmonar em microimagens dos pulmões de furão a 0cmH 2O.
    1. Delinee manualmente o parênquima pulmonar em cada quinto corte de imagem coronal usando algoritmos computacionais e interfaces gráficas embutidas noITK-SNAP 20.
      NOTA: O contraste de intensidade micro-CT entre o parênquima pulmonar e o fundo ao redor no estado de inflação 25cmH 2Ofoi insuficiente, impedindo a segmentação confiável do volume pulmonar.
    2. Aplique interpolação de imagem para gerar uma segmentação do parênquima pulmonar em fatias intermediárias de imagem.
    3. Realizar uma revisão secundária de controle de qualidade para garantir a continuidade estrutural da segmentação parênquimata ao longo das direções axial e sagital.
    4. Exclua o lúmen das vias aéreas e as regiões da parede do parênquima pulmonar usando uma dilatação local baseada em escamas do volume do lúmen e, em seguida, subtraia o volume dilatado do parênquima pulmonar.
  6. Quantificar medidas mecânicas das viasaéreas 21.
    1. Quantifique a expansão radial relacionada à respiração de vias aéreas individuais medindo mudanças na área da seção transversal do lúmen das vias aéreas (CSA) espacialmente correspondida entre os volumes pulmonares inspiratórios (inflação2H 2O) e expiratórios (0cmH 2O). Calcule a expansão radial em um ramo das vias aéreas b, denotada por Δar-R(b), como:
      figure-protocol-1(1)
      onde,CSA ins(b) e CSAexp(b) denotam o lúmen das vias aéreas CSA nos volumes pulmonares inspiratórios e expiratórios. A CSA em b é calculada usando traço de linha radial e métodos de half-max localmente adaptativos sobre a metade central do ramo b22.
    2. Quantifique o alongamento longitudinal relacionado à respiração de vias aéreas individuais da seguinte forma:
      figure-protocol-2(2)
      onde Lins(b) e Lexp(b) denotam comprimentos de caminho geodésico do ramo das vias aéreas b nos volumes pulmonares inspiratórios e expiratórios, respectivamente. O comprimento do caminho geodésico de um ramo é calculado traçando o caminho central da carina até a extremidade distal doramo 21.
  7. Quantifique medidas baseadas em intensidade do parênquima pulmonar.
    1. Visualize espacialmente a distribuição micro-CT da intensidade do parênquima pulmonar em furões saudáveis e fibróticos, gerando uma "representação de volume 3D de olhar" do volume do parênquima pulmonar no contexto da árvore das vias aéreas. Realize o efeito de observação usando mapeamento de transparência definido por intensidade micro-CT e codificação por cores. Aplique o mesmo mapeamento de transparência e escalas de codificação por cores tanto nos pulmões saudáveis quanto nos fibróticos de furão. Os passos a seguir são aplicados para gerar a renderização de volume 3D com look-through.
      1. Use o Slicer3D 23 para abrir a imagem tridimensional (3D) do NIfTI da segmentação das rotas aéreas a 0cmH 2O de inflação como uma "Segmentação".
      2. Gerar uma representação 3D das vias aéreas usando o módulo Segmentations . Selecione o volume das vias aéreas como entrada e, na aba Representações , clique em Criar na opção Superfície Fechada .
      3. Importe a imagem de intensidade micro-CT com parênquima pulmonar separado para o 3D Slicer como Volume. Nesta imagem, os valores originais de intensidade micro-CT são preservados para voxels pulmonares, enquanto todos os voxels não pulmonares recebem um valor de -2000 HU.
      4. Configure o mapeamento de cor e transparência para intensidades parênquimas pulmonares usando o módulo Volume Rendering . Valores de intensidade do mapa de -1500 HU, -600 HU, 0 HU e 1500 HU para preto, verde, amarelo e vermelho, com opacidades de 0, 0,15, 0,3 e 1, respectivamente.
    2. Use o algoritmo desenvolvido neste estudo para estimar a fração de tecido doente dentro do parênquima pulmonar, analisando a distribuição de intensidade observada pela micro-TC. O método assume que os valores de intensidade das regiões parênquimas saudáveis seguem uma distribuição gaussiana. Em contraste, regiões fibróticas, com intensidades caracteristicamente mais altas, distorcem a gaussianidade do lado direito do histograma observado. Realize essa tarefa nos passos a seguir.
      1. Calcule o histograma para imagem isolada do parênquim pulmonar no passo 3.7.1.3 com 50 bins na faixa de intensidade de -1500 HEU a 500 HU.
      2. Calcule a média da distribuição Gaussiana alvo como modo do histograma e derive o parâmetro de desvio padrão usando os valores de intensidade à esquerda do modo no histograma.
      3. Quantifique o volume do tecido fibrótico como a área excedente no lado direito do histograma observado que está acima da curva de distribuição Gaussiana esperada definida pelos parâmetros de média e desvio padrão obtidos no passo 3.7.2.2.
      4. Calcule a fração do tecido doente como a razão entre o volume do tecido fibrótico e a contagem total de histogramas representando o volume da região parênquima.

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Resultados

Dos cinco furões, os pulmões excisados de um furão saudável e de um furão fibrótico foram fotografados usando um micro-tomotomotomografia computadorizada sob pressões controladas das vias aéreas de 0cmH 2O e 25 cmH2O para simular as inflações pulmonares expiratórias e inspiratórias, respectivamente.

A Figura 1 ilustra os resultados intermediários do pipeline de processamento de imagem para a ...

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Discussão

Este estudo descreve um protocolo que combina administração intratraqueal de bleomicina em furões com microtomografia computorizada ex vivo de alta resolução (micro-CT) para caracterizar características estruturais e mecânicas da fibrose pulmonar. A micro-TC pode detectar vias aéreas pequenas de até 0,2 mm e medir volumes, espessura das vias aéreas, densidade e morfologia. Aumento da densidade tecidual, perda de volume e heterogeneidade regional correspondem intimamente à histop...

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Divulgações

A MATK recebeu um honorário como consultora da InflaRx para participar do Conselho Consultivo IMV/ECMO para pacientes hospitalizados com COVID-19 em 5/2024. Essas taxas foram doadas para a Corewell Health Foundation.

Agradecimentos

Os autores declaram que foi recebido apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo. O financiamento para este estudo foi fornecido em parte pela bolsa do R01 HL153165-01A1 (para a X.P.L.) e pelo Fundo de Pesquisa Pediátrica do Hospital Infantil Helen DeVos.

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Materiais

```html
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL Luer locking syringeBD309628
10 mL Luer locking syringeBD303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheterEXELINT INTERNATIONAL CO.26751
3 mL Luer locking syringeBD309657
30 mL Luer locking syringeBD302832
5 mL Luer locking  syringeBD309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1" BD305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"BD305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1" BD305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-) Gibco14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheterCaphstion2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0Teleflex5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185HFisher Scientific50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solutionFisher ScientificAM7021
IsofluraneCovetrus11695-6777-2
Lubricant PM ointment AACE Pharmaceuticals71406-124-35Pomada ocular
MADgic 700 atomizerTeleflexMAD700
Manometer, Professional air pressure meterLeatonT168
Rodent ventilator model 683Harvard Apparatus, Inc. 55-3438
Sterile saline, 0.9%CellProDS0329
Veterinary pulse oximeteruPM60VUVMI
```

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