Um método baseado em fluorescência para visualizar a dinâmica de gotículas lipídicas e organelos durante a mitose em células hepatomáticas

Resumo

Esse protocolo permite a visualização reprodutível de gotículas lipídicas e a dinâmica dos organelos durante a mitose usando células hepatomáticas sincronizadas.

Resumo

Gotículas lipídicas intracelulares (LDs) são onipresentes em vários tipos celulares. Os LDs armazenam lipídios neutros como triacilglicerol e éster de colesterol e desempenham papéis importantes no metabolismo energético, sinalização e respostas ao estresse. Embora os LDs sejam reconhecidos como organelos intracelulares, seu comportamento durante a progressão do ciclo celular permanece incerto. Durante a mitose, vários organelos, incluindo mitocôndrias e o aparelho de Golgi, passam por extensas remodelações e subsequentes remontagens, levantando a questão se os LDs também passam por alterações dependentes do ciclo celular. Como os LDs podem servir como fontes de energia e centros de sinalização, esclarecer sua dinâmica durante a mitose é de particular importância. Para resolver isso, apresentamos um protocolo que combina a sincronização do ciclo celular com coloração fluorescente de LD em células hepatomas. As células são sincronizadas na fronteira G2/M usando uma abordagem baseada em inibidor da quinase 1 dependente de ciclina, liberadas no ciclo celular e coletadas em pontos de tempo específicos. Os LDs são então marcados com um corante lipídico neutro e visualizados por microscopia de fluorescência. Esse método oferece uma abordagem reprodutível para examinar a redistribuição da LD durante a mitose e pode ser aplicado amplamente a estudos de biologia dos organelos, regulação metabólica e fisiologia das células cancerígenas.

Introdução

O ciclo celular é um evento altamente orquestrado que garante a duplicação e segregação precisas do DNA cromossômico ^1,2, durante o qual organelos intracelulares são reorganizados^{dinamicamente 3}. Consiste em quatro fases principais: G1, S, G2 e M ^1,2. Durante a mitose, cromossomos duplicados se alinham no plano equatorial do fuso bipolar e são posteriormente transferidos para duas^{células-filhas 4}. Organelas como as mitocôndrias e o aparelho de Golgi passam por extensas remodelações durante a^mitose 5,6,7,8. Esses organelos fragmentaram-se em pequenas vesículas antes de serem distribuídos para as duas células-filhas, onde se reagrupam durante a progressão pelo ciclo celular^{subsequente 3}.

Gotículas lipídicas (LDs) são organelas contendo lipídios neutros compostas por um núcleo de lipídios neutros cercado por uma monocamada de fosfolipídios. Elas estão associadas a um conjunto diversificado de proteínas e são amplamente encontradas em muitos tipos de células, incluindo células^{proliferantes 9,10}. A composição de proteínas e lipídios dos LDs varia dependendo do tipo celular e^{tecido 11}. Entre essas proteínas, a família da perilipina (PLIN) tem sido amplamente estudada, e o PLIN2 estabiliza as LDs em^{hepatócitos 12,13}. Além da estabilização estrutural, as proteínas da família PLIN têm sido implicadas na regulação da dinâmica da LD e nas interações com outros componentes^{celulares 14}. Os LDs funcionam não apenas como depósitos de armazenamento para triacilglicerol e éster de colesteril, mas também como centros para o metabolismo energético¹⁵, vias de^{sinalização 16} e adaptação ao^{estresse 17}. Em condições patológicas, como a esteatoheite associada à disfunção metabólica (MASH, anteriormente chamada de NASH), o acúmulo de LD é significativamente aumentado em comparação com o controle^{saudável 18,19}, destacando sua importância na biologia da doença. No entanto, apenas observações limitadas da localização espacial dos LDs em células em divisão estavam disponíveis, apesar de extensas pesquisas sobre a dinâmica das mitocôndrias, do retículo endoplasmático e do aparelho de Golgi durante a mitose. Analisamos a localização da LD durante a mitose, utilizando o método apresentado aqui. Já relatamos anteriormente que as LDs apresentavam padrões de distribuição espacial distintos dos de outros organelos^{intracelulares 20}.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para investigar a distribuição de LDs e outros organelos intracelulares durante a mitose em células hepatomas. O método inclui sincronização do ciclo celular e coloração fluorescente, permitindo visualização reprodutível da dinâmica do LD durante a mitose. Resultados representativos demonstram que as LDs apresentam mudanças dependentes do ciclo celular na distribuição espacial entre a interfase e a mitose, facilitando uma análise comparativa da localização da LD durante a divisão celular. Essa abordagem pode ser amplamente aplicada para estudar a localização, dinâmica e regulação metabólica de organelos tanto em contextos fisiológicos quanto patológicos.

Protocolo

1. Soluções padrão necessárias para este protocolo

1. Prepare solução de albumina sérica bovina (BSA) livre de ácidos graxos 24% (v) dissolvida em 150 mM de NaCl.
2. Prepare 10 mM de RO-3306 (um inibidor seletivo da quinase dependente de ciclina 1 (CDK1)) dissolvida em DMSO sob condições estéreis.
   NOTA: Outras soluções comumente usadas, como NaOH, NaCl e soro tampado com fosfato (PBS), foram preparadas conforme a prática padrão do laboratório. O PBS foi preparado dissolvendo 2,6 g de NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g de Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g de NaCl e 2,0 g de KCl em água destilada e ajustando o volume final para 1 L.

2. Preparação de ácido oleico conjugado com BSA

1. Coloque 90 mg de ácido oleico em um béquer de 50 mL e adicione 2 mL de etanol (99,5%) para dissolver.
2. Adicione 100 μL de 5 N NaOH à solução e mexa até que estejam totalmente misturados.
3. Evapore etanol sob um fluxo de gás nitrogênio.
4. Adicione 10 mL de 150 mM de NaCl e incube a mistura a 60 °C por 5 minutos.
5. Adicione 12,5 mL de solução de estoque BSA gelada a 24% (p/v) lentamente, de forma gota, à solução de ácido oleico (2,4) e mexa suavemente a mistura continuamente por 10 minutos para permitir uma mistura gradual e homogênea em temperatura ambiente.
6. Ajuste o pH para 7,4 e leve o volume final para 25 mL com 150 mM de NaCl. A concentração final de ácido oleico será de 12,8 mM.
7. Filtre a solução por um filtro de 0,22 μm em condições estéreis e armazene as alíquotas a 4 °C por até 2 semanas ou a -20 °C para armazenamento mais longo.

3. Sincronização de fronteiras G2/M das células

1. Prepare os controles necessários.
   1. Prepare células assíncronas não tratadas sem tratamento com RO-3306 como controle de base.
   2. Para condições tratadas com ácido oleico, prepare células tratadas apenas com ácido oleico, sem sincronização como controle de base.
   3. Para coloração por fluorescência, realize controles de coloração única para cada fluoróforo para verificar a especificidade do sinal e excluir sobreposição espectral entre canais (Figura Suplementar 1).
   4. Adquira imagens usando configurações sequenciais de aquisição ou configurações de filtro apropriadas para minimizar a sobreposição espectral e a diafonia do canal.
      NOTA: Esses controles são essenciais para distinguir mudanças dependentes do ciclo celular da distribuição basal dos organelos e para validar a especificidade de fluorescência.
2. Mantenha células HuH7 no meio modificado de Eagle de Dulbecco, suplementado com soro fetal bovino a 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
3. Coloque as coberturas de vidro em um prato de cultura de 35 mm. Semente 2 × 10^{células 5} por recipiente de 35 mm no meio descrito acima e incube as células durante a noite a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂.
4. Lave as células duas vezes com PBS e depois incube com meio fresco contendo 9 μM RO-3306 e 0,5 mM ácido oleico.
5. Incube as células por 20 horas sob condições padrão de cultura.

4. Remoção do reagente RO-3306 das células sincronizadas para entrar na fase mitótica

1. Lave as células (passo 3.4) de três a cinco vezes com PBS.
2. Lave as células uma vez com meio de cultivo fresco.
3. Incubar células em meio fresco por 1 hora a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% para permitir a entrada na mitose.
   NOTA: A remoção do RO-3306 permite que células sincronizadas entrem na fase mitótica a partir da fronteira G2/M. Após a lavagem do reagente, uma proporção substancial de células entra na fase mitótica em aproximadamente 1 hora, durante a qual as células mitóticas podem ser identificadas por arredondamento celular e condensação cromossômica. O momento ideal para observar uma fase específica da mitose pode variar dependendo do tipo celular e das condições da cultura.

5. Preparação de amostras de células mitóticas

1. Fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: As células mitóticas tendem a se desprender do prato; Evite lavar antes de fixar.
   NOTA: Para a coloração com PLIN3, as células foram fixadas com uma combinação de 2% de paraformaldeído e 2% de glutaraldeído.
2. Permeabilize células fixas com 0,1% (p/v) Triton X-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
3. Bloqueie células com 1% (v/v) de BSA em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.

6. Coloração de LDs e outros organelos celulares

1. Remova cuidadosamente as coberturas de vidro do recipiente de cultura usando pinças finas e coloque-as com o lado da célula para cima em uma câmara umidificada para evitar que ressecem.
   NOTA: Realize todas as etapas subsequentes de coloração em um ambiente umidificado e protegido contra luz para preservar os sinais de fluorescência.
2. Lave as células duas vezes com PBS e incube com anticorpos primários diluídos em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.
3. Lave as células duas vezes com PBS e incube com anticorpos secundários diluídos em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.
4. Lave as células duas vezes com PBS e tinga com um corante fluorescente lipídico neutro por 10 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: Corantes com propriedades espectrais distintas foram selecionados para permitir imagens multicoloridas flexíveis e minimizar a sobreposição espectral com outros marcadores de organelos.
5. Lave as células duas vezes com PBS e colora os núcleos com um corante fluorescente que liga o DNA (DAPI: excitação, 350–410 nm; emissão, 420–450 nm) diluído 1:1.000 em PBS por 5 min.
6. Lave as células duas vezes com PBS e depois monte as coberturas em lâminas de vidro usando um meio antidescolorante para preservar a fluorescência durante a imagem.
7. Sele as bordas das capas com esmalte transparente para evitar o ressecamento e o movimento durante a imagem.
   NOTA: Como os sinais fluorescentes vão diminuindo gradualmente, adquira imagens dentro de 1 semana após a coloração.

7. Observação de organelas intracelulares e sua localização subcelular

1. Adquira imagens de fluorescência usando microscopia de fluorescência de campo amplo para triagem rápida de múltiplas células e selecionar células representativas de interfase e mitóticas, utilizando baixa intensidade de excitação e configurações de aquisição rápida para minimizar o fotobranqueamento.
2. Adquira imagens das células selecionadas com ampliação apropriada para análise de coloração por fluorescência.
   NOTA: As células de interfase tipicamente exibem um núcleo único intacto posicionado centralmente no citoplasma. Em contraste, as células mitóticas exibem cromossomos condensados alinhados no plano equatorial do fuso bipolar. Essas características morfológicas podem servir como critério visual para distinguir células interfásicas e mitóticas.
3. Visualize LDs e morfologia nuclear usando conjuntos de filtros apropriados para corantes fluorescentes lipídicos neutros e um corante fluorescente que liga o DNA pela microscopia de fluorescência de campo amplo.
   NOTA: Selecione os conjuntos de filtros de acordo com as especificações do sistema de microscópio utilizado.
4. Para validação de maior resolução, adquira imagens de fluorescência usando microscopia confocal equipada com uma lente objetiva de alta abertura numérica (por exemplo, 60×, NA ≥1,2). Detectar sinais de fluorescência para corantes fluorescentes lipídicos neutros e um corante fluorescente que liga o DNA usando lasers de excitação apropriados e configurações de filtro de emissão. Processar imagens usando softwares comuns de aquisição e análise de imagens.
   NOTA: Dependendo do sistema de microscópio, podem ser usadas lentes objetivas de imersão em água ou em óleo. A escolha do meio de imersão deve seguir as recomendações do fabricante e o propósito experimental. A microscopia de fluorescência de campo amplo é adequada para observação rotineira e comparação da distribuição da LD entre células interfásicas e mitóticas, enquanto a microscopia confocal é recomendada quando é necessária uma resolução espacial maior.

8. Quantificação do número e tamanho dos LDs

1. Adquira imagens de fluorescência das células sob configurações idênticas para todas as condições.
2. Abra as imagens adquiridas usando um software de análise de imagens.
3. Estabeleça limiares apropriados para identificar LDs e realize análise de partículas para quantificar o número e a área de gotículas lipídicas.
   NOTA: Os parâmetros de imagem devem ser mantidos constantes em todas as condições para garantir uma comparação precisa do número e área do LD.

Resultados

Sincronização das células hepatomáticas na fronteira G2/M usando RO-3306

Para investigar a dinâmica dos organelos intracelulares durante a mitose, RO-3306, um inibidor seletivo de CDK1, foi usado para sincronizar as células na fronteira G2/^{M 20,21}. Quando as células foram tratadas com o inibidor CDK1 por 20 horas, seguidas por mais 1 hora em meio fresco, mais de 50% das células estavam sincronizadas na fronteira G2/M (...

Discussão

A redistribuição observada dos LDs durante a mitose sugere que seu posicionamento não é aleatório, mas está em coordenação com a reorganização do citoesqueleto e progressão do ciclo celular. Em particular, a exclusão de LDs da região do fuso pode refletir restrições espaciais impostas pela montagem do fuso mitótico ou por mecanismos de transporte ativo que mantêm a segregação dos organelos durante a divisão celular. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e reprodutível para pre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.25% Trypsin/EDTA	Wako	201-16945	Dissociation de células
10 cm dish	Corning	430167	Cultivo celular
35 mm tissue culture dish	IWAKI	3000-035	Cultivo celular
6 cm tissue culture dish	IWAKI	3010-060	Cultivo celular
Anti-PLIN2 (ADRP) antibody	Proteintech	15294-1-AP	Marcador de gotículas de lipídio
Anti-PLIN3 (TIP47) antibody	Proteintech	10694-1-AP	Marcador de gotículas de lipídio
Anti-α-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T6199	Marcador do fuso mitótico
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Coloração de lipídios neutros
Bottle-top filter (0.22 μm)	NEST	WNB343001	Filtração estéril da solução de OA–BSA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Reagente de bloqueio
Clear nail polish	Comercialmente disponível	Não aplicável	Selagem de lâminas de vidro
Confocal microscope	Olympus	FV1200	Imageamento de alta resolução
DAPI	Dojindo	340-07971	Coloração nuclear
D-PBS (–)	Wako	049-29793	Cultivo celular
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Wako	041-30081	Meio de cultivo celular
Ethanol (99.5%)	Wako	057-00456	Solvente para ácido oleico
Fatty acid–free BSA	Sigma-Aldrich	A7030	Proteína transportadora para ácido oleico
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106	Suplemento de meio
Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated)	Comercialmente disponível	Não aplicável	Anticorpos secundários específicos para imunofluorescência
FV10-ASW software	Olympus	Não aplicável	Aquisição e processamento de imagem
Glass coverslips (φ15 mm)	Matsunami	2-176-03	Semeadura de células para microscopia
Glass microscope slides	Matsunami	SFF-001	Lâminas de vidro para montagem de lâminas de vidro
Glutaraldehyde (25% solution)	Wako	073-00536	Fixação alternativa para PLIN3
HuH7 cells	JCRB Cell Bank	JCRB0403	Linha celular de hepatoma humano
LipidTOX Red Neutral Lipid Stain	Invitrogen	H34476	Coloração alternativa de gotículas de lipídio
Nitrogen gas (N2)	Comercialmente disponível	Não aplicável	Evaporação do etanol
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1383	Para preparação de conjugados de ácido oleico–BSA
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Nacalai Tesque	09154-85	Fixação
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140-122	Antibióticos
Phosphate-buffered saline (×10)	Não aplicável	Não aplicável	Pode ser substituído por qualquer fornecedor
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	Inibidor de CDK1 para sincronização G2/M
SlowFade Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	S36963	Meio de montagem
Sodium chloride (NaCl)	Wako	191-01665	Preparação de NaCl 150 mM
Sodium hydroxide (NaOH)	Wako	080-01061	Usado para saponificação de ácido oleico
Tali Cellular Analysis Slides	Thermo	T10794	Usado para análise do ciclo celular
Tali Image-based Cytometer	Thermo	Não aplicável	Usado para análise do ciclo celular
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilização celular
Widefield fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-9000	Triagem rápida de células mitóticas