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Um método baseado em fluorescência para visualizar a dinâmica de gotículas lipídicas e organelos durante a mitose em células hepatomáticas

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DOI:

10.3791/71222

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15 de maio de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo permite a visualização reprodutível de gotículas lipídicas e a dinâmica dos organelos durante a mitose usando células hepatomáticas sincronizadas.

Resumo

Gotículas lipídicas intracelulares (LDs) são onipresentes em vários tipos celulares. Os LDs armazenam lipídios neutros como triacilglicerol e éster de colesterol e desempenham papéis importantes no metabolismo energético, sinalização e respostas ao estresse. Embora os LDs sejam reconhecidos como organelos intracelulares, seu comportamento durante a progressão do ciclo celular permanece incerto. Durante a mitose, vários organelos, incluindo mitocôndrias e o aparelho de Golgi, passam por extensas remodelações e subsequentes remontagens, levantando a questão se os LDs também passam por alterações dependentes do ciclo celular. Como os LDs podem servir como fontes de energia e centros de sinalização, esclarecer sua dinâmica durante a mitose é de particular importância. Para resolver isso, apresentamos um protocolo que combina a sincronização do ciclo celular com coloração fluorescente de LD em células hepatomas. As células são sincronizadas na fronteira G2/M usando uma abordagem baseada em inibidor da quinase 1 dependente de ciclina, liberadas no ciclo celular e coletadas em pontos de tempo específicos. Os LDs são então marcados com um corante lipídico neutro e visualizados por microscopia de fluorescência. Esse método oferece uma abordagem reprodutível para examinar a redistribuição da LD durante a mitose e pode ser aplicado amplamente a estudos de biologia dos organelos, regulação metabólica e fisiologia das células cancerígenas.

Introdução

O ciclo celular é um evento altamente orquestrado que garante a duplicação e segregação precisas do DNA cromossômico 1,2, durante o qual organelos intracelulares são reorganizadosdinamicamente 3. Consiste em quatro fases principais: G1, S, G2 e M 1,2. Durante a mitose, cromossomos duplicados se alinham no plano equatorial do fuso bipolar e são posteriormente transferidos para duascélulas-filhas 4. Organelas como as mitocôndrias e o aparelho de Golgi passam por extensas remodelações durante amitose 5,6,7,8. Esses organelos fragmentaram-se em pequenas vesículas antes de serem distribuídos para as duas células-filhas, onde se reagrupam durante a progressão pelo ciclo celularsubsequente 3.

Gotículas lipídicas (LDs) são organelas contendo lipídios neutros compostas por um núcleo de lipídios neutros cercado por uma monocamada de fosfolipídios. Elas estão associadas a um conjunto diversificado de proteínas e são amplamente encontradas em muitos tipos de células, incluindo célulasproliferantes 9,10. A composição de proteínas e lipídios dos LDs varia dependendo do tipo celular etecido 11. Entre essas proteínas, a família da perilipina (PLIN) tem sido amplamente estudada, e o PLIN2 estabiliza as LDs emhepatócitos 12,13. Além da estabilização estrutural, as proteínas da família PLIN têm sido implicadas na regulação da dinâmica da LD e nas interações com outros componentescelulares 14. Os LDs funcionam não apenas como depósitos de armazenamento para triacilglicerol e éster de colesteril, mas também como centros para o metabolismo energético15, vias desinalização 16 e adaptação aoestresse 17. Em condições patológicas, como a esteatoheite associada à disfunção metabólica (MASH, anteriormente chamada de NASH), o acúmulo de LD é significativamente aumentado em comparação com o controlesaudável 18,19, destacando sua importância na biologia da doença. No entanto, apenas observações limitadas da localização espacial dos LDs em células em divisão estavam disponíveis, apesar de extensas pesquisas sobre a dinâmica das mitocôndrias, do retículo endoplasmático e do aparelho de Golgi durante a mitose. Analisamos a localização da LD durante a mitose, utilizando o método apresentado aqui. Já relatamos anteriormente que as LDs apresentavam padrões de distribuição espacial distintos dos de outros organelosintracelulares 20.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para investigar a distribuição de LDs e outros organelos intracelulares durante a mitose em células hepatomas. O método inclui sincronização do ciclo celular e coloração fluorescente, permitindo visualização reprodutível da dinâmica do LD durante a mitose. Resultados representativos demonstram que as LDs apresentam mudanças dependentes do ciclo celular na distribuição espacial entre a interfase e a mitose, facilitando uma análise comparativa da localização da LD durante a divisão celular. Essa abordagem pode ser amplamente aplicada para estudar a localização, dinâmica e regulação metabólica de organelos tanto em contextos fisiológicos quanto patológicos.

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Protocolo

1. Soluções padrão necessárias para este protocolo

  1. Prepare solução de albumina sérica bovina (BSA) livre de ácidos graxos 24% (v) dissolvida em 150 mM de NaCl.
  2. Prepare 10 mM de RO-3306 (um inibidor seletivo da quinase dependente de ciclina 1 (CDK1)) dissolvida em DMSO sob condições estéreis.
    NOTA: Outras soluções comumente usadas, como NaOH, NaCl e soro tampado com fosfato (PBS), foram preparadas conforme a prática padrão do laboratório. O PBS foi preparado dissolvendo 2,6 g de NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g de Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g de NaCl e 2,0 g de KCl em água destilada e ajustando o volume final para 1 L.

2. Preparação de ácido oleico conjugado com BSA

  1. Coloque 90 mg de ácido oleico em um béquer de 50 mL e adicione 2 mL de etanol (99,5%) para dissolver.
  2. Adicione 100 μL de 5 N NaOH à solução e mexa até que estejam totalmente misturados.
  3. Evapore etanol sob um fluxo de gás nitrogênio.
  4. Adicione 10 mL de 150 mM de NaCl e incube a mistura a 60 °C por 5 minutos.
  5. Adicione 12,5 mL de solução de estoque BSA gelada a 24% (p/v) lentamente, de forma gota, à solução de ácido oleico (2,4) e mexa suavemente a mistura continuamente por 10 minutos para permitir uma mistura gradual e homogênea em temperatura ambiente.
  6. Ajuste o pH para 7,4 e leve o volume final para 25 mL com 150 mM de NaCl. A concentração final de ácido oleico será de 12,8 mM.
  7. Filtre a solução por um filtro de 0,22 μm em condições estéreis e armazene as alíquotas a 4 °C por até 2 semanas ou a -20 °C para armazenamento mais longo.

3. Sincronização de fronteiras G2/M das células

  1. Prepare os controles necessários.
    1. Prepare células assíncronas não tratadas sem tratamento com RO-3306 como controle de base.
    2. Para condições tratadas com ácido oleico, prepare células tratadas apenas com ácido oleico, sem sincronização como controle de base.
    3. Para coloração por fluorescência, realize controles de coloração única para cada fluoróforo para verificar a especificidade do sinal e excluir sobreposição espectral entre canais (Figura Suplementar 1).
    4. Adquira imagens usando configurações sequenciais de aquisição ou configurações de filtro apropriadas para minimizar a sobreposição espectral e a diafonia do canal.
      NOTA: Esses controles são essenciais para distinguir mudanças dependentes do ciclo celular da distribuição basal dos organelos e para validar a especificidade de fluorescência.
  2. Mantenha células HuH7 no meio modificado de Eagle de Dulbecco, suplementado com soro fetal bovino a 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
  3. Coloque as coberturas de vidro em um prato de cultura de 35 mm. Semente 2 × 10células 5 por recipiente de 35 mm no meio descrito acima e incube as células durante a noite a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂.
  4. Lave as células duas vezes com PBS e depois incube com meio fresco contendo 9 μM RO-3306 e 0,5 mM ácido oleico.
  5. Incube as células por 20 horas sob condições padrão de cultura.

4. Remoção do reagente RO-3306 das células sincronizadas para entrar na fase mitótica

  1. Lave as células (passo 3.4) de três a cinco vezes com PBS.
  2. Lave as células uma vez com meio de cultivo fresco.
  3. Incubar células em meio fresco por 1 hora a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% para permitir a entrada na mitose.
    NOTA: A remoção do RO-3306 permite que células sincronizadas entrem na fase mitótica a partir da fronteira G2/M. Após a lavagem do reagente, uma proporção substancial de células entra na fase mitótica em aproximadamente 1 hora, durante a qual as células mitóticas podem ser identificadas por arredondamento celular e condensação cromossômica. O momento ideal para observar uma fase específica da mitose pode variar dependendo do tipo celular e das condições da cultura.

5. Preparação de amostras de células mitóticas

  1. Fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
    ATENÇÃO: As células mitóticas tendem a se desprender do prato; Evite lavar antes de fixar.
    NOTA: Para a coloração com PLIN3, as células foram fixadas com uma combinação de 2% de paraformaldeído e 2% de glutaraldeído.
  2. Permeabilize células fixas com 0,1% (p/v) Triton X-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
  3. Bloqueie células com 1% (v/v) de BSA em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.

6. Coloração de LDs e outros organelos celulares

  1. Remova cuidadosamente as coberturas de vidro do recipiente de cultura usando pinças finas e coloque-as com o lado da célula para cima em uma câmara umidificada para evitar que ressecem.
    NOTA: Realize todas as etapas subsequentes de coloração em um ambiente umidificado e protegido contra luz para preservar os sinais de fluorescência.
  2. Lave as células duas vezes com PBS e incube com anticorpos primários diluídos em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.
  3. Lave as células duas vezes com PBS e incube com anticorpos secundários diluídos em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.
  4. Lave as células duas vezes com PBS e tinga com um corante fluorescente lipídico neutro por 10 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: Corantes com propriedades espectrais distintas foram selecionados para permitir imagens multicoloridas flexíveis e minimizar a sobreposição espectral com outros marcadores de organelos.
  5. Lave as células duas vezes com PBS e colora os núcleos com um corante fluorescente que liga o DNA (DAPI: excitação, 350–410 nm; emissão, 420–450 nm) diluído 1:1.000 em PBS por 5 min.
  6. Lave as células duas vezes com PBS e depois monte as coberturas em lâminas de vidro usando um meio antidescolorante para preservar a fluorescência durante a imagem.
  7. Sele as bordas das capas com esmalte transparente para evitar o ressecamento e o movimento durante a imagem.
    NOTA: Como os sinais fluorescentes vão diminuindo gradualmente, adquira imagens dentro de 1 semana após a coloração.

7. Observação de organelas intracelulares e sua localização subcelular

  1. Adquira imagens de fluorescência usando microscopia de fluorescência de campo amplo para triagem rápida de múltiplas células e selecionar células representativas de interfase e mitóticas, utilizando baixa intensidade de excitação e configurações de aquisição rápida para minimizar o fotobranqueamento.
  2. Adquira imagens das células selecionadas com ampliação apropriada para análise de coloração por fluorescência.
    NOTA: As células de interfase tipicamente exibem um núcleo único intacto posicionado centralmente no citoplasma. Em contraste, as células mitóticas exibem cromossomos condensados alinhados no plano equatorial do fuso bipolar. Essas características morfológicas podem servir como critério visual para distinguir células interfásicas e mitóticas.
  3. Visualize LDs e morfologia nuclear usando conjuntos de filtros apropriados para corantes fluorescentes lipídicos neutros e um corante fluorescente que liga o DNA pela microscopia de fluorescência de campo amplo.
    NOTA: Selecione os conjuntos de filtros de acordo com as especificações do sistema de microscópio utilizado.
  4. Para validação de maior resolução, adquira imagens de fluorescência usando microscopia confocal equipada com uma lente objetiva de alta abertura numérica (por exemplo, 60×, NA ≥1,2). Detectar sinais de fluorescência para corantes fluorescentes lipídicos neutros e um corante fluorescente que liga o DNA usando lasers de excitação apropriados e configurações de filtro de emissão. Processar imagens usando softwares comuns de aquisição e análise de imagens.
    NOTA: Dependendo do sistema de microscópio, podem ser usadas lentes objetivas de imersão em água ou em óleo. A escolha do meio de imersão deve seguir as recomendações do fabricante e o propósito experimental. A microscopia de fluorescência de campo amplo é adequada para observação rotineira e comparação da distribuição da LD entre células interfásicas e mitóticas, enquanto a microscopia confocal é recomendada quando é necessária uma resolução espacial maior.

8. Quantificação do número e tamanho dos LDs

  1. Adquira imagens de fluorescência das células sob configurações idênticas para todas as condições.
  2. Abra as imagens adquiridas usando um software de análise de imagens.
  3. Estabeleça limiares apropriados para identificar LDs e realize análise de partículas para quantificar o número e a área de gotículas lipídicas.
    NOTA: Os parâmetros de imagem devem ser mantidos constantes em todas as condições para garantir uma comparação precisa do número e área do LD.

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Resultados

Sincronização das células hepatomáticas na fronteira G2/M usando RO-3306

Para investigar a dinâmica dos organelos intracelulares durante a mitose, RO-3306, um inibidor seletivo de CDK1, foi usado para sincronizar as células na fronteira G2/M 20,21. Quando as células foram tratadas com o inibidor CDK1 por 20 horas, seguidas por mais 1 hora em meio fresco, mais de 50% das células estavam sincronizadas na fronteira G2/M (...

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Discussão

A redistribuição observada dos LDs durante a mitose sugere que seu posicionamento não é aleatório, mas está em coordenação com a reorganização do citoesqueleto e progressão do ciclo celular. Em particular, a exclusão de LDs da região do fuso pode refletir restrições espaciais impostas pela montagem do fuso mitótico ou por mecanismos de transporte ativo que mantêm a segregação dos organelos durante a divisão celular. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e reprodutível para pre...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse em relação ao conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Bolsa da Universidade Showa para Jovens Pesquisadores e pela Bolsa JSPS KAKENHI Número 24K10084.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.25% Trypsin/EDTAWako201-16945Dissociation de células
10 cm dishCorning430167Cultivo celular
35 mm tissue culture dishIWAKI3000-035Cultivo celular
6 cm tissue culture dishIWAKI3010-060Cultivo celular
Anti-PLIN2 (ADRP) antibodyProteintech15294-1-APMarcador de gotículas de lipídio
Anti-PLIN3 (TIP47) antibodyProteintech10694-1-APMarcador de gotículas de lipídio
Anti-α-tubulin antibodySigma-AldrichT6199Marcador do fuso mitótico
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Coloração de lipídios neutros
Bottle-top filter (0.22 μm)NESTWNB343001Filtração estéril da solução de OA–BSA
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA8022Reagente de bloqueio
Clear nail polishComercialmente disponívelNão aplicávelSelagem de lâminas de vidro
Confocal microscopeOlympusFV1200Imageamento de alta resolução
DAPIDojindo340-07971Coloração nuclear
D-PBS (–)Wako049-29793Cultivo celular
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Wako041-30081Meio de cultivo celular
Ethanol (99.5%)Wako057-00456Solvente para ácido oleico
Fatty acid–free BSASigma-AldrichA7030Proteína transportadora para ácido oleico
Fetal Bovine SerumGibco10270-106Suplemento de meio
Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated)Comercialmente disponívelNão aplicávelAnticorpos secundários específicos para imunofluorescência
FV10-ASW softwareOlympusNão aplicávelAquisição e processamento de imagem
Glass coverslips (φ15 mm)Matsunami2-176-03Semeadura de células para microscopia
Glass microscope slidesMatsunamiSFF-001Lâminas de vidro para montagem de lâminas de vidro
Glutaraldehyde (25% solution)Wako073-00536Fixação alternativa para PLIN3
HuH7 cellsJCRB Cell BankJCRB0403Linha celular de hepatoma humano
LipidTOX Red Neutral Lipid StainInvitrogenH34476Coloração alternativa de gotículas de lipídio
Nitrogen gas (N2)Comercialmente disponívelNão aplicávelEvaporação do etanol
Oleic acidSigma-AldrichO1383Para preparação de conjugados de ácido oleico–BSA
Paraformaldehyde, 4% in PBSNacalai Tesque09154-85Fixação
Penicillin–StreptomycinGibco15140-122Antibióticos
Phosphate-buffered saline (×10)Não aplicávelNão aplicávelPode ser substituído por qualquer fornecedor
RO-3306Sigma-AldrichSML0569Inibidor de CDK1 para sincronização G2/M
SlowFade Diamond Antifade MountantInvitrogenS36963Meio de montagem
Sodium chloride (NaCl)Wako191-01665Preparação de NaCl 150 mM
Sodium hydroxide (NaOH)Wako080-01061Usado para saponificação de ácido oleico
Tali Cellular Analysis SlidesThermoT10794Usado para análise do ciclo celular
Tali Image-based CytometerThermoNão aplicávelUsado para análise do ciclo celular
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilização celular
Widefield fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000Triagem rápida de células mitóticas

Referências

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