Imunolocalização Tridimensional em Meiocitos de Milho

Resumo

Esse protocolo de imunolocalização nos meiócitos machos do milho mantém a integridade tridimensional das células durante a meiose. Ele permite o rastreamento dinâmico da localização intracelular de até três anticorpos independentes em material preservado fixado com paraformaldeído, além do DAPI, que tinge o DNA.

Resumo

Durante a prófase meiótica I, a configuração física dos cromossomos varia amplamente entre os estágios do desenvolvimento; felizmente, essas configurações específicas de cada estágio permitem a identificação adequada de cada um desses estágios meóticos clássicos, que são conhecidos respectivamente como leptoteno (por exemplo, os 'fios finos'), zigoteno (por exemplo, os 'fios acoplados'), paquiteno (por exemplo, os 'fios grossos'), diploteno (por exemplo, os 'fios duplos') e diacinese (por exemplo, o 'movimento de repulsão'). A análise visual de vários fenômenos citogenéticos que ocorrem durante a prófase I, como recombinação, pareamento e sinapse, requer técnicas altamente confiáveis de imunolocalização. Em contraste com as técnicas tradicionais de espalhamento e esmagamento que suprimem toda a informação subcelular e subnuclear, o procedimento de conservação 3D descrito aqui permite a preservação de proteínas meióticas-chave em seus locais nativos de localização subcelular (citoplasmático, nuclear e subnuclear: eucromatina, heterocromatina e nucleolar). Assim, este protocolo descreve como fixar eficientemente anteras meióticas, dissecar e liberar meiócitos de anteras e realizar a imunolocalização simultânea de três proteínas-chave em meiócitos machos de milho.

Introdução

A meiose é um processo fundamental que regula a transmissão de características em plantas e culturas modelo; assim, métodos simples de microscopia que permitem visualização consistente e fiel da localização de proteínas facilitam a compreensão de como essas características poderiam ser transmitidas de forma mais eficiente. Infelizmente, a visualização da localização das proteínas dentro dos meiócitos variou muito dependendo da técnica^{usada 1,2}. Assim, o objetivo do protocolo é fornecer um método direto e reproduzível que elimine artefatos durante a observação de meiócitos. Por exemplo, há muito tempo se reconhece que a observação dos cromossomos meióticos é um processo delicado facilitado pela esmagagem das células, seja por simples esmagamento ou por técnicas de espalhamento ainda mais ^{disruptivas 3,4,5}. Em Arabidopsis thaliana, pesquisadores comumente empregam métodos de espalhamento que utilizam o fixador de Carnoy (uma mistura 3:1 de etanol e ácido acético) junto com vários detergentes como Lipsol, Tween-20 e TritonX-100, além de misturas enzimáticas contendo celulase, pectinase e citohelicas, para quebrar células e permitir uma imunolocalização eficaz em seus pequenos^{cromossomos 1,2}. Essas técnicas transformam uma conformação cromossômica 3D em 2D, permitindo a observação rápida de todos os cromossomos artificialmente dispersos em uma única imagem. Certas características dos cromossomos que suportam esses tratamentos severos podem ser evidentes; No entanto, frequentemente não representam o comportamento típico das células e cromossomos in vivo⁶. A detecção rápida e muito ampla de até dois anticorpos é possível com técnicas de espalhamento 2D em várias espécies de plantas, incluindo^milho 7,8,9,10,11.

No entanto, apesar da conveniência das técnicas 2D legadas, agora se reconhece que certos fenômenos são sensíveis a métodos disruptivos e não podem ser observados se a célula, núcleo ou cromossomos forem danificados durante a expansão ou esmagamento. Por exemplo, o movimento da proteína RAD50 do citoplasma para o núcleo durante o estágio leptoteno, ou durante o acoplamento do centrômero (leptonema/zigonema), foi detectado apenas em meiócitos 3D^{intactos 12}. Aqui, os leitores recebem um protocolo 3D detalhado de 4 dias que utiliza anteras fixadas em 4% de paraformaldeído para imunolocalizar três proteínas chave nos meiócitos machos do milho, preservando assim sua integridade estrutural. Comparado a uma metodologia semelhante de imunolocalização 3D^{de milho, 8}, adicionamos notas práticas e dicas de solução de problemas para pesquisadores. Esse protocolo beneficiará o trabalho de biólogos de plantas e melhoristas de plantas interessados em estudar vários processos meióticos, como o controle da recombinação meiótica pelo complexo sinaptonêmico.

Protocolo

ATENÇÃO: Manusear formaldeído e acrilamida usando equipamentos de proteção individual adequados e um capuz químico; Ambos são tóxicos (a acrilamida também é neurotóxica antes da polimerização). Todos os materiais utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fixação de anteras de milho para preservar a estrutura intacta dos meiócitos

1. Use plantas de milho no estágio V13, com inflorescências ainda crescendo dentro do caule. Durante a semana de fixação de outra meótica, use luvas e pressione suavemente o caule aumentado na protuberância para determinar se ele está macio o suficiente para cortar.
   NOTA: Este protocolo para fixação e imunolocalização pode ser usado tanto para milho quanto para botões florais meióticos de Arabidopsis thaliana (menos de 400 μm). Mas, no caso do milho, dependendo da variedade usada e da época do ano (o crescimento é mais rápido na primavera), leva cerca de 8 semanas desde o plantio, para referência, a linhagem endogámica B73, mas apenas 6 semanas para a linhagem endogâmica de floração precoce A344.
2. Preparação de tampões.
   NOTA: No dia anterior à fixação química, prepare as seguintes soluções de trabalho, faça isso com cuidado e rotule todas as garrafas corretamente.
   1. Prepare 100 mL de 10x sais Buffer A (BA), adicionando 4,53 g de PIPES (Pirazina-N, N′-bis (2-ácido etanossulfônico) em concentração final de 150 mM), 5,96 g de KCl (concentração final 800 mM), 1,17 g de NaCl (concentração final 200 mM), 0,74 g de EDTA (concentração final 20 mM), 0,19 g de EGTA (concentração final 5 mM) e 90 mL_H2O, primeiro ajuste o pH para 6,8–7 com KOH, depois ajuste o volume para 100 mL.
   2. Por fim, esterilize com filtro usando uma unidade de filtro estéril descartável Rapid-Flow com PES de 0,45 μm de poros (mantenha a 4 °C, mas não congele; você pode armazená-la por vários meses).
   3. Prepare-se:
      -50 mM PIPES (pH ajustado para 7 com KOH).
      - estoques de espermina em concentração de 0,4 M (previamente dissolvidos em 50 mM TUBOS, ajuste do pH para 7 com KOH, mantendo alíquotas de 50 μL em -20 °C).
      - estoques de espermidina em concentração de 0,4 M (dissolvido em 50 mM PIPES, com pH ajustado para 7 com KOH, manter alíquotas congeladas de 125 μL em -20°C).
      - estoques de Ditiotreitol (DTT) 1 M (dissolvido em acetato de sódio 0,01 M, até pH 5,2, manter alíquotas congeladas de 100 μL a -20 °C).
      - sorbitol 2 M, mantido a 4 °C.
3. Prepare 50 mL de 2x Buffer A (BA), em gelo, usando 10 mL de 10x sais Buffer A (mantidos a 4 °C), 50 μL de espertina (0,4 M em PIPES 50 mM, com pH ajustado para 7 com KOH), 125 μL de espermidina (0,4 M em PIPES 50 mM, com pH ajustado para 7 com KOH), 100 μL de DTT (1 M em 0,01 M acetato de sódio, pH 5,2) se dissolvem vigorosamente; E não aqueça.
   1. Depois, adicione 16 mL de 2 M sorbitol. Ajuste o volume final para 50 mL com água estéril. Esterilize com filtro usando um filtro descartável Rapid-Flow estéril e armazene a 4 °C.
4. Prepare uma câmara úmida feita de 5 a 10 toalhas de papel umidificadas colocadas em uma caixa plástica. Verifique se a tampa veda bem. Elimine qualquer excesso de água.
5. Depois, coloque em uma bandeja os seguintes itens: a câmara úmida, uma lâmina de barbear, pinças finas (previamente esterilizadas com 70% de etanol), um pequeno frasco de água estéril e fita adesiva. Leve a bandeja e seu conteúdo para as plantas de milho verificadas na etapa 1.1.
6. Use uma lâmina de barbear para cortar o caule irregular no nível da inflorescência. Os principais ramos das franjas, assim como os ramos laterais da inflorescência, podem ser usados para a colheita de floretes meióticas.
   NOTA: Esses galhos de borla contêm os floretes de interesse para coletar anteras meióticas. Cada florete contém seis anteras, e as três superiores maiores são tipicamente usadas para análise. O tamanho aproximado e a cor das anteras correlacionam com cada estágio meiótico. Anteras quase transparentes de cerca de 1 mm de comprimento estão no estágio leptoteno, anteras translúcidas com 1,5 mm de comprimento estão no estágio zigoteno, anteras esbranquiçadas com 2 mm de comprimento estão no estágio paquiteno, e anteras amareladas com > 2 mm de comprimento podem conter meiócitos no diploteno, tétradas e grãos de pólen que terminam a gametogênese. Note que outra correlação entre o estágio de comprimento pode variar entre os antecedentes genéticos do milho, e que fatores ambientais (por exemplo, alta temperatura) podem acelerar a progressão meiótica e alterar essa relação. Recomenda-se que os pesquisadores validem correlações entre tamanho e estágio de outra para cada genótipo específico de milho e condições de crescimento (via esmagamento por acetocarmina, cf. 1.6).
7. Use pinças finas para dissecar e coletar cuidadosamente os ramos laterais das inflorescências e envolvê-los dentro do papel toalha da câmara úmida.
   NOTA: Com alguma prática, apenas uma incisão linear curta de 3–4 cm no caule é necessária para extrair os ramos da borla meiótica. Você pode fechar essa incisão envolvendo-a três a quatro vezes com fita adesiva padrão, o que permite colher a mesma planta posteriormente usando a inflorescência restante não dissecada. O tecido continuará crescendo e, posteriormente, pode ser usado para polinização.
8. Mantenha a câmara em temperatura ambiente. Use apenas aqueles ramos da inflorescência que contenham floretes que carregam anteras no estágio meiótico. Certifique-se de cobrir os galhos com metade das toalhas úmidas, mas não os mergulhe na água.
9. Umidifice novamente se as toalhas secarem. Feche a caixa até a dissecação das anteras, de preferência até 30 minutos antes do início da coleta de outra área.
10. Usando um estereomicroscópio binocular com balança calibrada, colete anteras frescas dos flós em 2 mL de 1x BA em uma placa de Petri de 35 mm, garantindo a identificação precisa dos estágios meióticos usando o proxy do tamanho e cor de outra área.
    NOTA: Para determinar com precisão o estágio de meiócitos em anteras amostradas, uma das três anteras sincronizadas por floreta é rapidamente analisada usando fixação de ácido etanol-acético 3:1, coloração com acetocarmina e microscopia tradicional de^{abóbora 13}.
11. Prepare o fixador de formaldeído a 4% em 1x BA e 0,0025% Tween-20
    NOTA: Para 3 mL, adicione 750 μL de formaldeído 16%, 750 μL de_{H 2}O, 1,5 mL 2x BA e 7,5 μL Tween-20 a 1%.
12. Remova o buffer inicial de BA e adicione os 3 mL dessa solução fixadora fresca às anteras faseadas, fixando-as por 45 minutos dentro de uma nova placa de Petri de 35 mm, selada por parafilme para evitar a evaporação do formaldeído, depois coloque sobre uma placa de Petri maior colocada em um agitador rotativo (ajustada em 40–60 rpm, ou 0,2 x g). Faça isso em temperatura ambiente. As anteras devem girar levemente para uma boa fixação. Elas geralmente flutuam na superfície.
13. Enxágue com 3 mL de 1x BA, depois transfira a amostra para uma pequena placa de Petri e coloque-a em um agitador rotativo (40–60 rpm) em temperatura ambiente por 45 minutos.
14. Usando pinças limpas, transfira as anteras para uma pequena placa de Petri de 35 mm contendo 3 mL frescos de 1X BA. Sele bem a placa de Petri com parafilme. Depois, guarde a pequena placa de Petri dentro de uma placa de Petri, cobrindo-a com papel alumínio para mantê-la no escuro, e coloque a 4 °C até o uso. Você pode armazená-la por vários meses, se necessário.

2. Incorporação de meiócitos de milho em bases sanduíche de poliacrilamida

DIA 1: Preparação de slides 3D

1. Prepare 2 mL de solução de acrilamida misturando volumes iguais (1:1) de acrilamida e 2x BA. Antes de adicionar sulfito de sódio (NaS) e persulfato de amônio (APS), desgaseifice a solução de acrilamida a vácuo por 5–10 minutos.
2. Aliquota, a acrilamida e a proporção 1:1 de 2x BA se misturam pipetando 100 μL em tubos de 1,5 mL.
   O número de tubos que você prepara depende do número de lâminas que você vai preparar.
3. Faça 1 mL 1x BA.
4. Coloque pedaços de parafilme de 2 cm x 2 cm sobre uma placa de Petri e depois coloque-os sob um microscópio dissecador. Pipete 50 μL de solução BA com anteras sobre parafilme. Corte a ponta da pipeta com tesoura para facilitar a entrega de outras partes.
   1. Pipete 25 μL de solução BA em parafilme em outro lugar.
5. Usando pinças para segurar as anteras, corte a ponta das anteras com um bisturi e esprema suavemente os meiócitos para fora. Com uma pipeta, transfira os meiocitos suavemente para a gota de 25 μL de BA e misture delicadamente.
6. Pipete 10 μL da mistura de meiocitos em uma capa de cobertura separada.
7. Rapidamente, pipeteie 5 μL de 20% (0,2g/1mL) NaS e 5 μL de 20% (0,2g/1mL) APS em um tubo de 1,5 mL com Acrilamida/2x Buffer A.
8. Rapidamente, pipetei 5 μL do que foi mencionado acima misturando sobre um coverslip e misture com meiocitos. Coloque uma capa coberta com poli-L-lisina por cima, mas gire 45 graus. Usar apenas um revestimento de poli-L-lisina (seja comercialmente obtido ou feito imergindo os cachetas em uma solução de poli-L-lisina em uma placa de Petri por alguns minutos e deixando-as secar, na borda de uma nova placa de Petri limpa) ajuda na liberação de uma almofada completa após a polimerização. A capa de cobertura é rapidamente retirada da solução e seca antes do uso. Para microscopia de super-resolução, coverslips de alta performance com espessura padronizada (≤170 nm) devem ser usados¹⁴.
9. Por favor, não toque nas coberturas por 30–50 minutos para permitir a polimerização completa da amostra em temperatura ambiente (um processo de polimerização mais rápido reduz o período de secagem da pastilha e a qualidade resultante é inferior ao ideal).
10. Repita os passos '2.6–2.9' para cada slide que você deseja preparar.
11. Separe todas as coberturas cuidadosamente com uma lâmina de barbear. Coloque todas as coberturas, lado da almofada para cima, sobre uma almofada de poliacrilamida (ou a maior parte da almofada), em uma placa de 6 poços.
12. Lave cada cobertor com uma almofada com 2 mL de soro salino fosfatado (PBS) 1x tamponado com fosfato por 10 minutos. Repita essa lavagem uma vez, para um tempo total de lavagem de 20 minutos em temperatura ambiente.
13. Prepare 50 mL misturando 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M e 500 μL Triton.
14. Enxágue cada capa com uma almofada em 1 mL desse PBS 1x suplementado com 1 mM de EDTA e 1% de Triton por 2 horas em temperatura ambiente.
15. Prepare um novo lote de tampão bloqueante contendo 1x PBS, 1 mM de EDTA, 0,1% Tween-20 e 3% de BSA (1 mL por lâmina). Para 50 mL de tampão bloqueante, misture 44 mL de PBS 1x, 100 μL de EDTA 0,5 M, 5 mL de solução Tween-20 a 1% e 1,5 g de BSA. A BSA é preferida ao soro de burro como agente bloqueante porque ajuda a minimizar sinais inespecíficos ao usar múltiplos anticorpos primários e secundários.

3. Imunolocalizações

1. Prepare anticorpos primários (ou anticorpos) na diluição desejada usando um tampão bloqueante. Combine anticorpos primários com base na capacidade deles de produzir sinais distintos quando usados juntos. Eles devem vir de diferentes organismos, como coelho, rato, porquinho-da-índia ou galinha, que podem ser reconhecidos por anticorpos secundários específicos marcados fluorescente. O uso de anticorpos contra burro ou cabra é evitado porque eles são destinados ao uso como anticorpos secundários. Recomendamos o uso de uma única espécie de anticorpo secundário (por exemplo, cabra no experimento mostrado na Figura 1).
2. Adicione 50 μL desse anticorpo primário diluído no centro de cada capa com uma almofada.
   Adicione água entre os poços para desacelerar a evaporação. Coloque a placa em uma câmara úmida (uma caixa plástica com tampa). Vá embora durante a noite.

DIA 2: Lavando

3. Prepare 500 mL de tampão de lavagem (1x PBS + 0,1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Remova a solução noturna dos poços por aspiração com sua pipeta.
5. Lave rapidamente cada cobertor com uma almofada duas vezes com 1 mL de buffer de lavagem e depois remova dos poços.
6. Pipete mais 1 mL/capa com absorvente e deixe descansar por 1 hora em temperatura ambiente.
   Repita mais 7 vezes. (8 h no total)
7. Após a lavagem final, adicione água entre os poços, cubra a placa e deixe a água durante a noite em uma câmara úmida.

DIA 3: Anticorpos secundários, lavagens e lâminas de montagem

8. Prepare os anticorpos secundários diluindo cada um na proporção de 1:50 no tampão bloqueador.
   Aspire a solução de lavagem. Dispense 50 μL do anticorpo secundário diluído no centro de cada absorção usando uma pipeta.
   NOTA: Todo anticorpo secundário deve ser usado em associação com corantes fluorescentes distintos com comprimentos de onda de emissão não sobrepostos. Por exemplo, um anticorpo secundário deve ser marcado com AlexaFluor488 (verde), o próximo com AlexaFluor555 (laranja) e o terceiro com AlexaFluor647 (vermelho distante), que pode ser combinado com DAPI (excitação a 461 nM, azul). Outros corantes fluorescentes, como o DyLight (da Dyomics GmbH), também são utilizáveis. Além disso, todos esses anticorpos secundários não devem reagir cruzadamente com outras espécies usadas na mistura de anticorpos primários. Por exemplo, o anticorpo secundário anti-coelho deve ser cross-adaptado para ser seletivo para anticorpos de coelho e não reconhecer anticorpos de rato ou porquinho-da-índia. O mesmo vale para todos os anticorpos secundários. Um experimento bem projetado deve ser usado para validar todos esses requisitos simultaneamente ao realizar co-imunolocalizações.
9. Adicione água entre os poços, coloque uma placa na câmara úmida e deixe por 2 horas em temperatura ambiente.
10. Aspire a solução dos poços.
11. Realize quatro lavagens usando 1 mL por poço, 1 h em cada um em temperatura ambiente (4 h no total).
12. Lave cada poço com 1 mL de 1x PBS por 10 minutos em temperatura ambiente e repita esse processo mais duas vezes. (30 min no total)
13. Dilua DAPI em 1x PBS.
14. Tinga com uma concentração final de 1 μg/mL de dapi (pó de dapi dissolvido em água) por 30 minutos em temperatura ambiente, e coloque 500 μL/poço.
15. Remova o ProLong™ Gold antifade do freezer de 4 °C para permitir que descongele e atinja a temperatura ambiente.
16. Lave as lâminas em 1x PBS por 30 minutos em temperatura ambiente, com 1 mL/poço. Faça isso duas vezes de novo. (1 h 30 no total)
17. Remova a última lavagem.
18. Depois, adicione duas gotas de antifade ProLong™ Gold no meio de cada almofada.
19. Encaixe as tampas em cada slide, etiquete cada slide, levante as tampas do poço usando pinças finas e coloque-as lentamente no slide. Usando pinças finas, abaixe lentamente uma segunda capa sobre a primeira. Usando um vácuo, remova o excesso de glicerol das bordas dos abrigos de cobertura. Vede as bordas dos slips com duas demãos de esmalte.
20. Se as lâminas não forem imediatamente examinadas sob um microscópio fluorescente. Guarde-os em um freezer de -20 °C, protegidos da luz, até serem observados. Depois, deixe os slides em temperatura ambiente por 1 hora em uma caixa de slides, horizontalmente e no escuro, para evitar condensação.

DIA 4: Observações microscópicas

21. Observa o deslizamento sob os comprimentos de onda e filtros de excitação corretos. Microscopia confocal padrão é suficiente, mas é recomendável usar um microscópio com alvo 60x para permitir imagens tridimensionais de toda a célula usando uma pilha z a cada 0,2 μm, com aquisições sequenciais de imagem e processamento de deconvolução usando o software Applied Precision SoftWoRx^® .

Resultados

Usando esse protocolo, podemos observar simultaneamente os padrões de localização das três principais proteínas meióticas no milho (Figura 1). A proteína meiótica AUSÊNCIA DA PRIMEIRA DIVISÃO 1 (AFD1) é um homólogo da subunidade alfa-Kleisin REC8 do complexo meiótico coesin. O ASINÁPTICO 1 (ASY1) é um elemento axial crucial, enquanto o ZYPPER1 (ZYP1) é o elemento transversal do complexo^{sinaptonemal 15}. A coloração DAPI mostra um núcle...

Discussão

Esse protocolo oferece uma vantagem fundamental sobre outros ao preservar dados tridimensionais essenciais sobre a carga de proteínas cromossômicas meióticas. Essas características não podem ser preservadas usando técnicas regulares de^{espalhamento 1,2}. No entanto, esse protocolo tem duas limitações: é lento e tecnicamente exigente em comparação com as técnicas regulares de propagação realizadas em um dia. Em contraste, nosso prot...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum