Artigo de investigação

Análise de Randomização Mendeliana de Traços Inflamatórios Associados a NETs e Diabetes Tipo 2 e suas Complicações

DOI:

10.3791/71230

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21 de agosto de 2026

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1Department of Laboratory Medicine, Zhongshan People's Hospital, 2Department of Advanced Diagnostic and Clinical Medicine, Zhongshan People's Hospital

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo de MR com duas amostras identificou associações potenciais entre traços inflamatórios associados a NETs preditos geneticamente e complicações do DM2. A IL-6 predita geneticamente apresentou associação inversa com DAC diabética, enquanto as NETs estiveram associadas a complicações renais e circulatórias periféricas no DM2. As análises de sensibilidade geralmente apoiaram a estabilidade dessas associações significativas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As características inflamatórias associadas às armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) desempenham um papel significativo no diabetes melito tipo 2 (DM2) e suas complicações. Notavelmente, a IL-6, uma citocina inflamatória chave, está intricadamente ligada à formação das NETs e à patogênese do DM2 e suas complicações. Este estudo teve como objetivo explorar a associação causal entre características inflamatórias associadas às NETs e o DM2, bem como suas complicações, utilizando uma abordagem de Randonização Mendeliana (MR). Este estudo utilizou um delineamento de MR de duas amostras com dados de estudos de associação em todo o genoma (GWAS), compreendendo uma grande meta-análise baseada em população europeia para DM2 e suas complicações. O método principal de análise foi a abordagem ponderada pela variância inversa (IVW), complementada pela regressão MR-Egger, métodos da mediana ponderada e da moda ponderada. As análises de sensibilidade incluíram MR-Egger, MR-PRESSO, Q de Cochran e métodos leave-one-out para avaliar a robustez dos achados. O estudo indicou que os níveis de interleucina-6 (IL-6) preditos geneticamente foram inversamente associados à doença arterial coronariana diabética (CAD) (OR = 0,8997, IC 95%: 0,8257–0,9803, P = 0,0158). Além disso, as NETs mostraram associações significativas com DM2 com complicações renais (OR = 0,97, IC 95% 0,9428–0,998, P = 0,0358) e DM2 com complicações circulatórias periféricas (OR = 1,0342, IC 95% 1,002–1,0673, P = 0,037). As associações significativas pelo IVW não apresentaram evidência de heterogeneidade ou pleiotropia horizontal. Este estudo sugere que características inflamatórias associadas às NETs preditas geneticamente estão relacionadas a complicações específicas do DM2. A IL-6 predita geneticamente foi inversamente associada à CAD diabética, enquanto as NETs estiveram associadas a complicações renais e circulatórias periféricas no DM2.

Introdução

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O diabetes melito tipo 2 (DM2), caracterizado pela resistência à insulina e frequentemente acompanhado por disfunção progressiva das células beta, atingiu proporções epidêmicas em todo o mundo1,2. Entre as complicações do DM2 estão doenças cardiovasculares, insuficiência renal, neuropatia e retinopatia, que impõem um peso substancial não apenas sobre os indivíduos em termos de saúde e qualidade de vida, mas também sobre os sistemas de saúde em todo o mundo, sobrecarregando recursos, aumentando custos e afetando as economias3,4. Considerando a natureza multifatorial do DM2, é necessário um estudo detalhado de seus fatores etiológicos. Evidências crescentes têm implicado as armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) na fisiopatologia de diversas doenças metabólicas, especialmente associadas ao DM2.

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (AEN) são redes extracelulares de DNA descondensado e proteínas de grânulos que possuem fortes propriedades microbicidas5,6. Marcadores como DNA livre de células e histona H3 citrulinada servem como indicadores-chave da NETose, refletindo a atividade inflamatória em diversas doenças7,8. Evidências crescentes sugerem que o diabetes promove a formação de AEN, propagando assim a inflamação e lesão tecidual9,10. Clinicamente, níveis elevados de marcadores de AEN correlacionam-se com hiperglicemia e desfechos adversos em múltiplas complicações diabéticas. Por exemplo, níveis aumentados de dsDNA estão associados à desregulação da glicose em pacientes com IAMCEST11, enquanto componentes das AEN estão ligados à progressão da retinopatia diabética12 e predizem o risco de amputação em úlceras do pé diabético13. Apesar dessas associações, a relação causal precisa entre as AEN e o desenvolvimento do DM2 e suas complicações ainda precisa ser totalmente esclarecida. Evidências acumuladas destacam uma interação bidirecional entre IL-6 e AEN na inflamação metabólica. A hiperglicemia prepara os neutrófilos para a NETose, sendo a IL-6 um potente indutor desse processo dependente de energia14. Clinicamente, a IL-6 prediz independentemente níveis elevados de marcadores de AEN (por exemplo, H3Cit e DNA livre de células) no diabetes tipo 2, os quais se correlacionam fortemente com estados protrombóticos e complicações microvasculares como a retinopatia diabética15,16. Além disso, a NETose induzida por infecção pode potencializar o trans-sinal da IL-6, estabelecendo um circuito regulatório recíproco17. Em conjunto, essas descobertas enfatizam a fisiopatologia estreitamente acoplada da IL-6 e das AEN, particularmente no ambiente diabético.

A Randomização Mendeliana (MR) é um método estatístico poderoso que utiliza variantes genéticas naturalmente ocorrentes como variáveis instrumentais para estimar os efeitos causais de exposições modificáveis sobre desfechos de saúde, oferecendo insights sobre vias de doenças complexas18. Essa abordagem, baseada nas leis de Mendel da hereditariedade, permite aos pesquisadores inferir causalidade em estudos observacionais explorando a distribuição aleatória de alelos durante a meiose, contornando assim algumas das limitações dos métodos epidemiológicos tradicionais no estabelecimento de relações de causa e efeito19.

Até o momento, houve relatos limitados sobre estudos de RM investigando a relação causal entre traços inflamatórios associados a NETs preditos geneticamente e o DM2 e suas complicações. Portanto, o presente estudo tem como objetivo explorar as possíveis associações causais entre traços inflamatórios associados a NETs e o DM2, bem como suas complicações, utilizando um método de análise de RM com duas amostras.

Protocolo

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Desenho do Estudo

Esta pesquisa utilizou uma abordagem de MR de duas amostras para explorar a relação causal entre traços inflamatórios associados a NETs e DM2 e suas complicações. A estrutura do MR baseia-se em três pressupostos principais20: 1) a variante genética deve estar robustamente associada à exposição, 2) a variante genética deve influenciar o desfecho apenas por meio da exposição (exclusão de pleiotropia) e 3) a variante genética não deve estar associada a quaisquer fatores de confundimento. Para uma visão geral detalhada do processo deste estudo, consulte Figura 1. O manuscrito segue as diretrizes MR-STROBE para relato de estudos de MR, assegurando padrões rigorosos de transparência e reprodutibilidade21.

Fontes de Dados

Os dados de Estudos de Associação Genômica Ampla (GWAS) utilizados nesta análise de MR foram obtidos a partir de bancos de dados públicos de GWAS. Em relação aos GWAS de nível resumido sobre DM2, incluíram-se a maior meta-análise de uma população europeia, composta por 74.124 casos e 824.006 controles, juntamente com um estudo prospectivo aninhado tipo caso-coorte conduzido na Europa, com 9.978 casos e 12.348 controles22. Para complicações diabéticas, incluindo DM2 com complicações renais e DM2 com complicações circulatórias periféricas, este estudo recuperou estatísticas resumidas de GWAS de estudos nos quais os casos eram pacientes com DM2 que apresentavam a complicação específica e os controles eram indivíduos sem DM2. Informações detalhadas sobre as fontes dos dados podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1.

Dados de GWAS para traços inflamatórios associados a NETs foram obtidos do catálogo de GWAS (consulte Tabela Suplementar 2). Para abordar a heterogeneidade na especificidade biológica, este estudo categorizou as exposições incluídas em dois grupos distintos com base em seus papéis funcionais na biologia dos neutrófilos: (1) Fatores Relacionados à NETose Principal: Esta categoria inclui marcadores diretamente envolvidos na formação estrutural de NETs ou no processo enzimático de descondensação da cromatina. Especificamente, este estudo incluiu as próprias NETs, Mieloperoxidase (MPO), Elastase de Neutrófilos (NE) e o complexo MPO-DNA. A MPO e a NE são enzimas essenciais para a degradação de histonas e descondensação da cromatina, enquanto o complexo MPO-DNA é um marcador substituto específico para NETs23. (2) Mediadores Inflamatórios Associados a NETs: Esta categoria compreende citocinas e mediadores que atuam como reguladores upstream ou efeitos downstream estreitamente ligados à NETose, mas que também estão envolvidos em vias inflamatórias mais amplas. Este grupo inclui Interleucina-6 (IL-6)24, Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α)25, níveis de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL)26 e Fator de Rede de Comunicação Celular 1 (CCN1)27.

Os dados utilizados neste estudo foram obtidos de bancos de dados de acesso aberto ou de estudos de associação do genoma inteiro (GWAS) publicados em pesquisas anteriores; portanto, a aprovação ética não foi necessária para esta pesquisa.

Seleção de Instrumentos Genéticos Relacionados aos NETs

Dado que a formação de NETs representa um processo biológico dinâmico não mensurado diretamente em estudos de associação genômica ampla convencionais, este estudo empregou uma abordagem baseada em genes para identificar instrumentos genéticos para traços inflamatórios associados às NETs. Um conjunto abrangente de 257 genes sabidamente envolvidos de forma crítica na formação e regulação das NETs, como o MPO, juntamente com genes que codificam histonas e proteínas de grânulos de neutrófilos, foi compilado a partir de estudos mecanicistas estabelecidos e da literatura publicada28.

Seleção da Variável Instrumental

Para identificar instrumentos genéticos robustos para traços inflamatórios associados às NETs, este estudo implementou um fluxo de trabalho sequencial de filtragem utilizando estatísticas sumárias de GWAS. Os passos operacionais específicos foram os seguintes:

Triagem Inicial: Variantes genéticos significativamente associados às características de exposição foram extraídos29 com base em um limiar de significância de P < 5 × 10⁻6.

Filtragem por frequência do alelo minoritário (MAF): para garantir poder estatístico, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) com MAF ≤ 0,01 foram excluídos30.

Agrupamento por Desiquilíbrio de Ligação (LD): Para mitigar a confusão causada pelo desiquilíbrio de ligação (LD), foram selecionados SNPs independentes utilizando a função de agrupamento com parâmetros definidos como r2 < 0,001 dentro de uma janela de 10.000 kb31.

Avaliação da Força do Instrumento: A força de cada IV remanescente foi quantificada utilizando a estatística F, calculada como F = R2 × (N-2) / (1-R2). Apenas SNPs com estatística F > 10 foram mantidos para minimizar o viés de instrumento fraco32.

Identificação de SNP Proxy e Harmonização de Dados

Para abordar SNPs ausentes no conjunto de dados do resultado, este estudo realizou uma busca por substitutos e um processo de harmonização de dados:

Substituição por Proxy: Quando um SNP alvo da GWAS de exposição não estava disponível na GWAS de desfecho, este estudo utilizou a função LDproxy() com base no painel de referência europeu do Projeto 1,000 Genomas. Um SNP proxy candidato foi selecionado somente se apresentasse alta LD com o SNP original (r2> 0,8). Caso nenhum proxy qualificado fosse encontrado, o SNP era excluído.

Harmonização: os conjuntos de dados de exposição e desfecho foram alinhados utilizando a função harmonise_data() do pacote TwoSampleMR (R versão 4.0.5). Este estudo definiu o parâmetro action = 2 para alinhar automaticamente todos os SNPs à fita direta e remover SNPs palindrômicos com orientação de fita ambígua.

Verificação: após a harmonização, este estudo inspecionou manualmente o conjunto de dados harmonizados para confirmar que as frequências do alelo de efeito eram consistentes entre os dados de exposição e desfecho.

Análise de RM e Testes de Sensibilidade

A inferência causal foi conduzida utilizando o pacote TwoSampleMR (R versão 4.0.5).

Análises Primária e Secundária: Este estudo aplicou o método ponderado pela variância inversa (IVW, na sigla em inglês) como abordagem primária33. Foram realizadas análises complementares utilizando os métodos MR-Egger34, mediana ponderada e moda ponderada para garantir a robustez dos resultados35.

Avaliações de Sensibilidade: A heterogeneidade entre as IVs foi avaliada utilizando o teste Q de Cochran36 por meio da função mr_heterogeneity(). A pleiotropia horizontal foi avaliada utilizando o teste de intercepto MR-Egger34 (mr_pleiotropy_test()).

Detecção de Valores Atípicos: Este estudo utilizou o pacote MR-PRESSO para detectar possíveis valores atípicos37. A função mr_presso() foi executada com 1.000 simulações. Os SNPs atípicos identificados (P < 0,05) foram removidos, e as estimativas causais foram recalculadas para verificar a estabilidade dos resultados. Além disso, foi realizada uma análise leave-one-out para garantir que a associação causal não fosse influenciada por um único SNP38.

Correção Estatística

Para levar em consideração testes múltiplos, os valores-P obtidos a partir das análises de MR foram corrigidos utilizando o método da Taxa de Descoberta Falsa (FDR). Isso foi implementado usando a função P.adjust() no R com o parâmetro method = "fdr". Associações com valor-P corrigido (PFDR) < 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.

Resultados

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Variáveis Instrumentais Selecionadas

Este estudo realizou análise MR utilizando traços inflamatórios associados a NETs como exposição. Um total de 106 IVs foi identificado para esse propósito, com detalhes fornecidos na Tabela Suplementar 3. As estatísticas F desses IVs apresentaram um valor médio de 26,46, variando de um mínimo de 20,6 a um máximo de 250,4.

Ao adotar o DM2 e suas várias complicações (cetoacidose diabética, complicações renais, complicações oftálmicas, complicações neurológicas e complicações circulatórias periféricas) como desfechos, as informações de três SNPs não puderam ser correspondidas nos dados resumidos. SNPs substitutos foram utilizados neste estudo (Tabela Suplementar 4).

Associação causal de traços inflamatórios associados a NETs na DM2 e suas complicações

Os principais resultados obtidos pelo método IVW são apresentados em Tabela 1, enquanto Tabela Suplementar 5 detalha as estimativas complementares de MR derivadas pelos métodos MR-Egger, mediana ponderada e moda ponderada. Notavelmente, os resultados do IVW revelaram associações estatisticamente significativas entre os níveis de interleucina-6 (IL-6) e DAC diabética (OR = 0,8997, IC 95% 0,8257–0,9803, P = 0,0158), consistente com o resultado do método da mediana ponderada. Essas descobertas sugeriram que a IL-6 estava geneticamente associada às complicações cardiovasculares do diabetes. Além disso, os resultados da análise IVW indicaram que as NETs estavam significativamente associadas ao DM2 com complicações renais (OR = 0,97, IC 95% 0,9428–0,998, P=0.0358) e DMT2 com complicações circulatórias periféricas (OR = 1,0342, IC 95% 1,002–1,0673, P = 0,037). Os gráficos de dispersão e de floresta para os resultados positivos mencionados acima são apresentados em Figura 2.

Os resultados da regressão MR Egger indicaram ausência de evidência de pleiotropia horizontal na análise, conforme detalhado na Tabela 2. A partir dos resultados de heterogeneidade apresentados no teste Q de Cochran (Tabela 2) e nos gráficos em funnel (Figura 3A–C), observa-se que nenhum dos valores de P para a estatística Q está abaixo do limiar convencional de 0,05, indicando ausência de heterogeneidade significativa entre as IVs para os principais desfechos de interesse neste estudo.

Além disso, a análise MR-PRESSO (Tabela 3) identificou um valor aberrante (rs139237904) quando CCN1 foi considerado como exposição e DMT2 como desfecho; os resultados permaneceram não significativos após sua exclusão. De forma semelhante, quando MPO foi a exposição e DMT2 o desfecho, dois valores aberrantes (rs10916508 e rs6544660) foram detectados, e os resultados não significativos persistiram após sua remoção. Para NGAL como exposição e DMT2 como desfecho, um valor aberrante (rs10497219) foi encontrado, e os resultados negativos foram mantidos após sua exclusão. No caso de TNF-α como exposição e DMT2 com cetoacidose como desfecho, um único valor aberrante (rs10103048) estava presente, e a exclusão não alterou o desfecho não significativo. No entanto, quando NGAL foi associado a DMT2 com complicações neurológicas, dois valores aberrantes (rs10497219 e rs1287048) foram identificados, e após sua remoção, os resultados tornaram-se positivos, indicando uma associação significativa. A análise 'leave-one-out' (Figura 3D–F) fornece evidências adicionais da robustez dos achados. Em resumo, esta análise MR sugere um possível papel da IL-6 e das NETs na etiologia das complicações diabéticas, exigindo investigações adicionais.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo e na Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2, Tabela Suplementar 3, Tabela Suplementar 4 e Tabela Suplementar 5.

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Figura 1: Desenho do estudo neste estudo de randomização mendeliana. (A) As análises de randomização mendeliana dependem de três pressupostos fundamentais. (B) Esquema do desenho do estudo. TRN: armadilhas extracelulares de neutrófilos; DM2: diabetes melito tipo 2; SNP: polimorfismo de nucleotídeo único; RM: randomização mendeliana; IVW: ponderação por variância inversa; MR-PRESSO: Soma Residual de Pleiotropia e Detecção de Outliers em Randomização Mendeliana Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Associação causal de características inflamatórias associadas a NETs sobre o diabetes tipo 2 e suas complicações. (A) Gráfico de dispersão mostrando a associação entre os níveis de IL-6 e DAC diabética. (B) Gráfico de dispersão mostrando a associação entre NETs e diabetes tipo 2 com complicações renais. (C) Gráfico de dispersão mostrando a associação entre NETs e diabetes tipo 2 com complicações circulatórias periféricas. (D) Gráfico em floresta dos níveis de IL-6 na DAC diabética. (E) Gráfico em floresta de NETs no diabetes tipo 2 com complicações renais. F: Gráfico em floresta de NETs no diabetes tipo 2 com complicações circulatórias periféricas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Resultados da análise de sensibilidade. (A) Gráfico em funil dos níveis de IL-6 na DAC diabética. (B) Gráfico em funil de NETs em DMT2 com complicações renais. (C) Gráfico em funil de NETs em DMT2 com complicações circulatórias periféricas. (D) Análise de sensibilidade leave-one-out dos níveis de IL-6 na DAC diabética. (E) Análise de sensibilidade leave-one-out de NETs em DMT2 com complicações renais. (F) Análise de sensibilidade leave-one-out de NETs em DMT2 com complicações circulatórias periféricas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Associação causal primária de características inflamatórias associadas a NETs na DM2 e suas complicações Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Resultados da heterogeneidade e pleiotropia das variáveis instrumentais Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Resultados do MR-PRESSO Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 1: Fonte dos dados sobre DM2 e suas complicações Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Fonte de dados das características inflamatórias associadas às ETNs Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Seleção de variáveis instrumentais (IVs) Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Lista de SNPs proxy utilizados na análise de MR Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Estimativas complementares de RM para as associações causais entre traços inflamatórios associados a NETs e complicações do DM2 Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo utiliza uma abordagem de MR de duas amostras para investigar as associações entre características inflamatórias relacionadas às NETs e o diabetes tipo 2 (T2DM), bem como suas complicações. Os principais achados indicam uma associação inversa estatisticamente significativa entre os níveis de IL-6 preditos geneticamente e a DAC diabética. Esse achado pode refletir a arquitetura genética complexa das vias de sinalização da IL-6, em vez de um efeito protetor direto da IL-6 circulante sobre as complicações cardiovasculares do diabetes. Além disso, este estudo revela associações entre as NETs e várias complicações diabéticas, incluindo complicações renais e do sistema circulatório periférico em pacientes com T2DM. Essas associações destacam a importância das NETs na patogênese das complicações relacionadas ao diabetes e podem orientar futuras estratégias terapêuticas direcionadas a essas vias inflamatórias.

A associação entre IL-6 e DAC diabética tem sido objeto de considerável debate, com estudos apresentando perspectivas variadas sobre o papel da IL-6. Este estudo sugere que a IL-6 pode ter uma associação complexa e negativa com complicações cardiovasculares relacionadas ao diabetes. Cupido et al.39 corroboram esses achados, associando a perturbação da sinalização da IL-6 à redução do risco de doenças cardiometabólicas. Por outro lado, Indumathi et al.40 observaram hipometilação e superexpressão da IL-6 em indivíduos diabéticos, sugerindo um papel patogênico na DAC. Isso está de acordo com Shrivastav et al.41 e Chittaragi et al.42, que identificaram níveis elevados de IL-6 como fatores pró-inflamatórios e marcadores prognósticos na DAC diabética. No entanto, Liu et al.43 destacam a natureza dual das adipocinas, como a IL-6, na aterosclerose; essa dualidade dependente do contexto provavelmente explica as evidências conflitantes entre os estudos. A discordância nos achados pode ser atribuída a diversos fatores. Primeiro, a heterogeneidade nos delineamentos dos estudos, nas populações de pacientes e nos métodos utilizados para medir os níveis de IL-6 pode levar a conclusões variadas44. Segundo, a relação temporal entre IL-6 e o desenvolvimento de DAC é complexa e pode envolver componentes causais e reativos, os quais podem não ser plenamente capturados em estudos transversais ou mesmo em alguns estudos longitudinais45.

Embora o presente estudo e vários outros sugiram uma associação significativa entre IL-6 e DAC diabética, a natureza exata dessa relação permanece complexa e pode ser influenciada por diversos fatores biológicos e metodológicos. Vale ressaltar que esta análise de MR indica uma associação negativa estatisticamente significativa entre níveis genéticamente preditos de IL-6 e DAC relacionada ao diabetes (OR=0,8997), o que contrasta com a visão convencional de que a IL-6 promove a patologia cardiovascular. Essa discrepância pode ser atribuída ao papel dual e complexo da IL-6 na inflamação e na reparação tecidual46, ou à possibilidade de que os instrumentos genéticos utilizados na análise de MR reflitam uma via biológica específica do sinal de IL-6 distinta de seu efeito sistêmico geral. A associação negativa observada neste estudo não deve ser simplesmente interpretada como indicativa de que a IL-6 exerce um efeito cardioprotetor; ao contrário, provavelmente reflete os mecanismos genéticos complexos subjacentes à sinalização do receptor de IL-6. Alternativamente, a associação negativa observada pode ser influenciada por mecanismos compensatórios ou por circuitos de retroalimentação negativa dentro da rede inflamatória que não são plenamente capturados em estudos observacionais convencionais. Pesquisas futuras devem buscar esclarecer essas complexidades por meio de estudos longitudinais bem delineados e considerando a natureza multifatorial da patogênese da DAC.

O papel das NETs nas complicações diabéticas, particularmente no contexto da doença renal, tem sido cada vez mais reconhecido como um mediador significativo da inflamação e do dano tecidual. Magaña-Guerrero et al.12 associam as NETs à hiperglicemia e à insuficiência renal na retinopatia diabética, posicionando-as como marcadores da progressão da doença. No contexto da doença renal diabética (DKD), Liu et al.47 demonstram que a superexpressão da midcina promove lesão renal ao aumentar a formação de NETs, enquanto Zheng et al.48 mostram que as NETs induzem disfunção endotelial glomerular e piróptose, efeitos atenuados pelo tratamento com DNase I. Além desses achados experimentais, análises recentes de MR e transcriptômicas identificaram genes específicos relacionados às NETs (por exemplo, CLIC3, GBP2) como fatores de risco causais para retinopatia diabética proliferativa28. Curiosamente, essa evidência genética contrasta fortemente com os achados de associação negativa com complicações renais, destacando os mecanismos específicos de tecido das NETs. Em conjunto, o estudo complementa esse panorama ao demonstrar uma associação causal significativa entre as NETs e complicações circulatórias periféricas no DM2. Pesquisas adicionais são essenciais para desvendar a complexa interação de fatores que podem influenciar o papel das NETs na nefropatia diabética.

Embora este estudo tenha identificado uma associação potencial entre a IL-6 e a DAC diabética, bem como uma correlação significativa entre as NETs e outras complicações diabéticas, a interação entre esses dois mediadores inflamatórios exige investigação adicional. Embora este estudo não tenha realizado uma análise MR dedicada para testar a via causal da IL-6 para as NETs, um corpo substancial de evidências experimentais sugere que a IL-6 pode atuar como um fator regulador ascendente de características inflamatórias associadas às NETs.

Biologicamente, a IL-6 é uma citocina fundamental na resposta de fase aguda49 e demonstrou-se capaz de preparar neutrófilos para a formação de ETNs50. Níveis elevados de IL-6, frequentemente observados no microambiente hiperglicêmico do diabetes51, podem ativar a via de sinalização JAK/STAT3 dentro dos neutrófilos52. Essa ativação é uma etapa crítica na regulação transcricional da peptidilarginina desiminase 4 (PAD4)53, enzima responsável pela citrulinização da histona e descondensação da cromatina54, características marcantes da NETose54. Assim, é biologicamente plausível hipotetizar um eixo patológico sequencial: a regulação sistêmica da IL-6 promove a formação excessiva de ETNs, o que por sua vez agrava os danos endoteliais e a trombose, levando a diversas complicações diabéticas, incluindo DAC diabética e lesões renais. Estudos futuros utilizando MR multivariável ou análise de mediação são necessários para quantificar formalmente a extensão em que os efeitos deletérios da IL-6 são mediados por meio das ETNs.

A estrutura analítica apresentada aqui possui grande potencial para aplicações futuras. Do ponto de vista metodológico, este fluxo de trabalho pode ser estendido para a MR multivariável (MVMR) a fim de dissecar os efeitos causais independentes de exposições correlacionadas, abordando assim vias biológicas complexas de maneira mais abrangente. Além disso, a integração de análises de colocalização em futuras iterações ajudaria a verificar se a exposição e o desfecho compartilham a mesma variante causal, reduzindo ainda mais o risco de viés de desequilíbrio de ligação. Do ponto de vista clínico, esta abordagem fornece uma base sólida para a validação de alvos terapêuticos. Ao filtrar sistematicamente a pleiotropia horizontal e garantir a validade dos instrumentos, esta estrutura pode priorizar alvos terapêuticos com maior probabilidade de sucesso clínico. Em última instância, a tradução desses achados genéticos em modelos de predição de risco poderia facilitar estratégias de medicina de precisão, identificando subgrupos de alto risco que se beneficiariam mais com intervenções precoces.

Este estudo utiliza uma abordagem de MR com duas amostras, que aproveita variantes genéticas como IVs para estabelecer causalidade, fornecendo assim uma estrutura robusta para explorar a relação entre traços inflamatórios associados a NETs e o DM2 e suas complicações. Essa abordagem melhora os estudos observacionais ao usar MR para mitigar fatores de confusão e causalidade reversa. Diferentemente das implementações padrão de MR que dependem exclusivamente das estimativas IVW, este estudo integrou análises de sensibilidade robustas (mediana ponderada, MR-Egger) e verificações de pleiotropia. Essa estrutura multímétodo garante que as estimativas causais não sejam influenciadas por instrumentos inválidos, oferecendo maior validade do que análises de método único. Além disso, a reprodutibilidade dessa abordagem é assegurada por meio de um protocolo padronizado e transparente para harmonização de dados e controle de qualidade, abordando a "crise de replicação" frequentemente observada em análises genéticas complexas. Em termos de eficiência e aplicabilidade, este fluxo de trabalho otimizado reduz a carga computacional associada à curadoria manual de dados, permitindo a triagem rápida de múltiplos fenótipos. Essa escalabilidade torna a estrutura amplamente aplicável a análises, bem como a varreduras fenômicas em larga escala, oferecendo uma ferramenta mais versátil para explorar redes biológicas complexas do que abordagens observacionais rígidas e de etapa única.

No entanto, o estudo não está isento de limitações. O uso de instrumentos genéticos baseia-se na premissa de que as variantes selecionadas estão associadas à exposição de interesse e ao desfecho por meio de uma única via, o que pode não capturar plenamente a complexidade dos sistemas biológicos. Em segundo lugar, como este estudo se baseou principalmente em dados de populações europeias para sua análise de MR, a generalização dos achados para outras populações étnicas ou geográficas pode ser limitada. Em terceiro lugar, embora este estudo tenha identificado associações potenciais entre traços inflamatórios associados às NETs e DM2 e suas complicações, as redes regulatórias moleculares específicas e os mecanismos biológicos subjacentes exigem maior esclarecimento por meio de estudos experimentais subsequentes. É importante observar que as associações causais significativas foram limitadas a complicações específicas, como DAC diabética, complicações renais e circulatórias periféricas, e não foram observadas de forma uniforme em todos os desfechos diabéticos testados. Além disso, embora a MR possa reduzir a confusão, ela não consegue levar em conta todas as possíveis fontes de viés, como fatores ambientais não medidos ou estratificação populacional.

Além disso, a generalização dos achados pode ser limitada pelas populações específicas das quais os dados genéticos são derivados, sendo necessária a replicação em populações diversas para confirmar esses resultados. Embora este estudo utilize estatísticas sumárias de GWAS em larga escala, a ausência de dados complementares de sequenciamento multi-ômico provenientes de coortes clínicos ou modelos experimentais limita a capacidade de validar os mecanismos moleculares e as alterações transcricionais subjacentes às associações causais observadas. Este fluxo de trabalho de MR exigiu ajustes específicos para lidar com desafios analíticos, particularmente no que se refere à harmonização de alelos e pleiotropia. Para mitigar a ambiguidade de fita com SNPs palindrômicos, este estudo modificou o pipeline para excluir rigorosamente variantes com frequências alélicas intermediárias (>0,42). Além disso, para solucionar potencial pleiotropia horizontal, este estudo integrou o teste de outlier MR-PRESSO neste fluxo de trabalho. Isso permitiu a remoção iterativa de variáveis instrumentais inválidas, assegurando que as estimativas causais finais fossem robustas e não influenciadas por outliers pleiotrópicos.

A validade dos achados de MR depende fortemente de várias etapas analíticas críticas. Primeiramente, a seleção rigorosa de IVs é fundamental. Ao aderir a limiares estritos de significância em todo o genoma (P<5×10-6) e ao agrupamento por desequilíbrio de ligação (r2<0,001), este estudo minimizou o risco de viés de instrumento fraco, garantindo que os SNPs selecionados estejam fortemente associados à exposição. Em segundo lugar, a robustez das estimativas causais depende do tratamento da pleiotropia horizontal. Este estudo utilizou múltiplos métodos complementares, especificamente MR-Egger, mediana ponderada e MR-PRESSO, que forneceram uma proteção necessária; a consistência entre esses métodos, juntamente com interceptos MR-Egger não significativos, apoia a suposição de que os IVs influenciam o desfecho exclusivamente por meio da exposição. Embora as variações genéticas possam servir como proxies para traços inflamatórios associados a NETs, elas podem não refletir plenamente as flutuações dinâmicas e em tempo real da NETose in vivo, uma vez que as vias regulatórias do genótipo germinativo até a ativação transcricional e liberação proteica envolvem processos biológicos complexos que não são estritamente lineares. Em relação à reprodutibilidade, o uso de estatísticas sumárias de GWAS em larga escala e de acesso público garante que esta análise possa ser verificada independentemente. A transparência do fluxo analítico, incluindo os parâmetros específicos para harmonização e remoção de outliers, permite a réplica exata desses resultados. Essas etapas, coletivamente, fortalecem a validade interna deste estudo e fornecem um arcabouço reprodutível para investigações futuras.

Em conclusão, este estudo utiliza uma abordagem de MR de duas amostras para explorar a associação entre traços inflamatórios associados a NETs e DM2 e suas complicações. Os resultados sugerem uma associação significativa entre os níveis de IL-6 e DAC diabética, destacando um possível papel da IL-6 nas complicações cardiovasculares do diabetes. Além disso, este estudo revela associações entre NETs e várias complicações diabéticas, incluindo complicações renais e circulatórias periféricas, enfatizando a importância dos traços inflamatórios associados a NETs na patogênese de condições relacionadas ao diabetes. Esses achados contribuem para a compreensão da complexa interação entre inflamação, metabolismo da glicose e saúde vascular no DM2. Embora o estudo forneça evidências valiosas sobre o papel das NETs nas complicações diabéticas, também reconhece a complexidade dos mecanismos biológicos envolvidos e a necessidade de pesquisas adicionais para elucidar as vias precisas e potenciais alvos terapêuticos.

Divulgações

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Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.

Agradecimentos

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O estudo foi apoiado pelo Projeto Social e Tecnológico de Pesquisa de Zhongshan (número do convênio: 2021B3013) e pelo Projeto Social e Tecnológico de Pesquisa de Zhongshan (número do convênio: 2022B1080). Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CCN1Catálogo GWASGCST90277805http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90277001-GCST90278000/GCST90277805/harmonised/GCST90277805.h.tsv.gz
CAD diabéticoCatálogo GWASGCST006405http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST006001-GCST007000/GCST006405/Fall_gwas_results_any_chd_tab.txt.gz
IL-6Catálogo GWASGCST90010146http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90010001-GCST90011000/GCST90010146/harmonised/33303764-GCST90010146-EFO_0007937.h.tsv.gz
MPOCatálogo GWASGCST90087967http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90087001-GCST90088000/GCST90087967/harmonised/35078996-GCST90087967-EFO_0011039.h.tsv.gz
MPO-DNACatálogo GWASGCST90013658http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90013001-GCST90014000/GCST90013658/harmonised/33717105-GCST90013658-EFO_0005243.h.tsv.gz
Pacote MR-PRESSOGitHub (rondolab)Versão 1.0Pacote R utilizado para detectar e corrigir estimativas causais por pleiotropia.
NECatálogo GWASGCST90162366http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90162001-GCST90163000/GCST90162366/harmonised/GCST90162366.h.tsv.gz
NETsCatálogo GWASGCST90137414http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90137001-GCST90138000/GCST90137414/harmonised/GCST90137414.h.tsv.gz
NGALCatálogo GWASGCST90161504http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST90161001-GCST90162000/GCST90161504/harmonised/GCST90161504.h.tsv.gz
Software RFoundation R para Computação EstatísticaVersão 4.0.5Ambiente principal de computação estatística utilizado em todas as análises.
T2DFINN R9T2Dhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_T2D.gz
T2D com cetoacidoseFINN R9E4_DM2KETOhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2KETO.gz
T2D com complicações neurológicasFINN R9E4_DM2NEUhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2NEU.gz
T2D com complicação oftálmicaFINN R9E4_DM2OPTHhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2OPTH.gz
T2D com circulação periféricaFINN R9E4_DM2PERIPHhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2PERIPH.gz
T2D com complicações renaisFINN R9E4_DM2RENhttps://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_E4_DM2REN.gz
TNF-aCatálogo GWASGCST004426http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gwas/summary_statistics/GCST004001-GCST005000/GCST004426/harmonised/27989323-GCST004426-EFO_0004684.h.tsv.gz
Pacote TwoSampleMRGitHub (MRCIEU)Versão 0.6.22Pacote R utilizado para realizar a análise de Randomização Mendeliana.

Referências

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