Oxidação de Fenton Assistida por Vitamina C Melhora a Eliminação Oxidativa de Helicobacter pylori In Vitro

Resumo

Este estudo examina como a vitamina C modula o comportamento cinético de uma reação de Fenton sob condições in vitro . Sondas com corantes químicos e ensaios bacterianos mostram que a dosagem controlada de vitamina C altera o comportamento oxidativo da reação e está associada a um aumento da atividade antibacteriana contra Helicobacter pylori em um sistema modelo simplificado.

Resumo

A infecção por Helicobacter pylori continua sendo um grande fardo global para a saúde, e a crescente prevalência da resistência aos antibióticos ressalta a necessidade de estratégias antibacterianas alternativas. Este estudo examinou se a dosagem de vitamina C poderia modular a oxidação do Fenton e aumentar a atividade antioxidante antibacteriana contra H. pylori sob condições ácidas in vitro definidas. A atividade oxidativa foi avaliada usando descoloração por Acid Orange 7 como leitura química indireta e um ensaio de fluorescência de ácido tereftálico como indicador relativo da formação de produto associado a radicais hidroxila em reações de peróxido de ferro suplementadas com vitamina C. A eficácia antibacteriana foi avaliada expondo o H. pylori padronizado suspensões em soro fisiológico contendo ureia no pH 3 até peróxido de hidrogênio e ferro ferroso, com ou sem suplementação gradual de vitamina C, seguidas pela enumeração de unidades formadoras de colônias. A suplementação com vitamina C alterou as leituras oxidativas e esteve associada a maiores reduções nas bactérias viáveis em comparação com a química convencional de Fenton. Experimentos de resgate usando deferoxamina e tioureia atenuaram a atividade antibacteriana, apoiando a hipótese de que a atividade antibacteriana está associada a processos oxidativos mediados pelo ferro e relacionados a radicais. Coloração por fluorescência viva/morta e microscopia eletrônica de varredura forneceram observações visuais qualitativas consistentes com os resultados da enumeração da unidade formadora de colônias (CFU). Coletivamente, esses achados indicam que a dosagem controlada de vitamina C pode modular reações oxidativas baseadas em Fenton e aumentar a atividade antibacteriana contra H. pylori em um modelo in vitro ácido simplificado.

Introdução

H. pylori, uma bactéria Gram-negativa com formato espiral que pertence ao gênero Helicobacter, foi demonstrada por estudos de saúde populacional apresentar alta prevalência de infecção em áreas geográficas, sexo e idade, com uma taxa global de prevalência de aproximadamente 50^%. A Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer (IARC) classificou o H. pylori como carcinógeno do Grupo 1, destacando sua forte conexão com o câncer gástrico e o linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT). Atualmente, o manejo clínico da infecção por H. pylori depende principalmente de regimes farmacológicos. Os agentes mais estudados incluem inibidores da bomba de prótons (IBPs), que suprimem a secreção de ácido gástrico; compostos de bismuto, que aumentam a eficácia dos antibióticos; e antibióticos como amoxicilina, claritromicina e metronidazol. No entanto, a monoterapia demonstrou ser insuficiente para a erradicação completa, levando ao uso generalizado de regimes combinados, comumente chamados de terapia tripla. Essa abordagem normalmente consiste em um IBP, claritromicina e amoxicilina ou metronidazol, administrados por aproximadamente duas^semanas. Com o aumento da prevalência de cepas resistentes a antibióticos de H. pylori, a eficácia da terapia tripla diminuiu significativamente, levando à adoção da terapia quádrupla combinando um IBP, bismuto e dois^{antibióticos 3}. No entanto, esses regimes ainda dependem fundamentalmente de antibióticos, e a resistência aos antibióticos continua sendo um grande desafio no manejo^{clínico 4,5}. Consequentemente, a exploração de estratégias antibacterianas alternativas independentes de antibióticos tem despertado um interesse crescente.

Além de seus efeitos patológicos diretos, a infecção por H. pylori também tem sido associada a alterações na homeostase dos micronutrientes gástricos. Estudos clínicos e epidemiológicos relataram concentrações reduzidas de vitamina C no suco gástrico e no soro de indivíduos^{infectados 6}, o que pode estar relacionado à inflamação mucosa, secreção comprometida ou aumento do consumo^{oxidativo 7,8,9}. Paralelamente, a infecção por H. pylori tem sido associada à deficiência de ferro por meio de múltiplos mecanismos, incluindo redução da acidez gástrica, comprometida absorção de ferro na dieta e competição bacteriana pelo ferro^{disponível 10}. Essas observações destacam o ambiente bioquímico complexo que acompanha a infecção por H. pylori e ressaltam a relevância dos processos relacionados ao redox e ao ferro em condições gástricas ácidas.

Espécies reativas de oxigênio (ROS) têm ganhado considerável interesse em pesquisas antimicrobianas devido às propriedades oxidativas dessas espécies. ROS refere-se a uma classe de moléculas quimicamente reativas formadas durante a redução parcial do oxigênio, como ânion superóxido (O₂•⁻), peróxido de hidrogênio (H₂O₂), oxigênio singlete (¹O₂) e radicais hidroxila (•OH), entre outros. Em sistemas biológicos, os ROS estão amplamente envolvidos no metabolismo fisiológico normal e são essenciais para diversas atividades regulatórias^{celulares 11}. Notavelmente, inúmeros estudos demonstraram que ROS excessivo pode perturbar as membranas celulares bacterianas por meio da peroxidação lipídica, levando a alterações na estrutura e função das membranas, resultando, em última análise, na inativação^{bacteriana 12}. Assim, abordagens antimicrobianas baseadas em ROS têm despertado interesse como uma via potencial para investigar os efeitos antibacterianos não antibióticos contra H. pylori 13,14,15,16. Entre os vários métodos de geração de ROS, a reação de Fenton recebeu atenção significativa por sua produção altamente eficiente de radicais. A reação de Fenton é um processo avançado de^{oxidação 17} no qual íons ferrosos (Fe²⁺) reagem com H₂O₂ sob condições ácidas para produzir radicais hidroxila (•OH), que possuem forte potencial oxidativo e podem oxidar biomoléculas intracelulares.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+^OH-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Especificamente, com pH de aproximadamente 2,8–4,5, H₂O₂ sofre decomposição catalítica por Fe²⁺, gerando •OH enquanto Fe²⁺ é oxidado em Fe³⁺. O Fe³⁺ então reage com o H₂O₂ para regenerar o Fe²⁺, estabelecendo um ciclo redox de Fe²⁺/Fe³⁺ que sustenta a produção contínua de^{ROS 18}. No entanto, a redução de Fe³⁺ para Fe²⁺ é relativamente lenta, constituindo o passo limitante de taxa e, consequentemente, reduzindo a eficiência geral da reação de Fenton. Estudos indicam que a introdução de um agente redutor adequado no sistema de reação de Fenton pode acelerar a redução de Fe²⁺ para Fe²⁺, aumentando assim a geração de ROS. A vitamina C tem um papel redox dependente do contexto. Em sistemas contendo ferro, ele pode promover a redução de Fe²⁺ para Fe²⁺ e, assim, apoiar o ciclo de Fenton, enquanto em concentrações mais altas ou sob diferentes condições de reação, também pode funcionar como um antioxidante ou catador de^{radicais 19}.

Com base nesse contexto, o presente estudo investiga um sistema de reação de Fenton assistido por vitamina C como uma abordagem quimicamente ajustável para modular a atividade oxidativa sob condições ácidas in vitro ^{definidas 20,21}. A vitamina C foi usada como agente redutor para facilitar a regeneração de Fe²⁺ e, assim, alterar o comportamento oxidativo eficaz da reação de Fenton. O sistema experimental utilizado aqui foi um modelo simplificado de soro salino-ureia ácida e não foi projetado para reproduzir completamente o microambiente gástrico fisiológico, que contém muco, componentes tamponadores, células hospedeiras, fatores imunes e diversos substratos orgânicos. Dentro desse modelo controlado, a atividade oxidativa foi caracterizada usando leituras químicas e avaliada em paralelo com respostas fenotípicas bacterianas, fornecendo uma base experimental para investigar os efeitos antibacterianos associados à ROS contra H. pylori in vitro.

Protocolo

Declaração de ética
Este estudo foi um estudo bacteriano in vitro e não envolveu participantes humanos, animais ou materiais derivados de pacientes. Portanto, não era necessária aprovação do conselho de revisão institucional nem da ética animal.

Avaliação da degradação do AO7 no sistema Fenton assistido por vitamina C
Para avaliar o efeito da vitamina C no comportamento oxidativo observável da reação de Fenton, a degradação do Ácido Laranja 7 (AO7) foi usada como leitura química indireta da atividade oxidativa. Este ensaio não quantifica especificamente as espécies individuais reativas de oxigênio. Preparei 100 mL de solução de AO7 a 5 mg/L e ajustei a solução para pH 3. Adicionaram H₂O₂ e FeSO₄ às concentrações finais de 2,2 mM e 0,055 mM, respectivamente. Adicionou vitamina C seja como um bolo único no início da reação ou em um esquema de dosagem em três etapas. Para o experimento dose-resposta, foram usadas razões molares Vc: Fe²⁺ de 0, 0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 e 8, correspondendo às concentrações finais de vitamina C de 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 e 0,440 mM, respectivamente, quando FeSO₄ é usado a 0,055 mM. Para a condição de adição em três etapas, dividi a mesma quantidade total de vitamina C em três alíquotas iguais e adicionou uma aliquota aos 3, 5 e 7 minutos após o início da reação. Por exemplo, com uma razão^{Vc:Fe de 2}⁺ de 0,48, adicionou vitamina C a 0,0088 mM por alíquota, resultando em uma concentração total final de 0,0264 mM.

Mexi a solução de reação continuamente no escuro por 10 minutos, mantendo a temperatura abaixo de 30 °C. Coletei 2 mL de amostras antes e depois da reação. Medi a absorvância a 483 nm usando um espectrofotômetro UV-Vis e calculou a taxa de degradação do AO7 usando a Equação 1:

Taxa de degradação (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100% (1)

Aqui, A₀ representa a absorção da amostra antes da reação, enquanto A₁ representa a absorção da amostra após a reação.

Avaliação do sinal de fluorescência •OH associado usando uma sonda TA
Para avaliar sinais de fluorescência associados a radicais hidroxila sob as mesmas condições ácidas in vitro usadas nos experimentos antibacterianos, foi estabelecido um sistema químico livre de células usando tereftalato dissódico (TA, 1 mM) como sonda de fluorescência. Esse ensaio foi usado como indicador relativo da formação do produto associado à •OH e não foi interpretado como uma quantificação absoluta da geração de radicais hidroxila. Sete grupos foram incluídos: (1) blank (1 mM TA apenas no buffer de reação), (2) H₂O₂ sozinho, (3) Fe²⁺ sozinho, (4) Vc sozinho (adição em etapas), (5) Fenton convencional (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) Fenton assistido por vitamina C com adição de bolus Vc (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, bolus), e (7) Fenton assistido por Vc com adição de Vc em etapas (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, passo a passo). Na condição de adição por etapas, o Vc foi introduzido aos 3, 5 e 7 minutos após a iniciação da reação em alíquotas iguais, enquanto a condição do bolus recebeu a mesma quantidade total de Vc como uma única adição.

As aliquotas foram coletadas ao longo de um período de reação de 10 minutos, imediatamente alcalinizadas com NaOH para neutralizar novas reações radicais e estabilizar a fluorescência, e armazenadas a 4 °C antes da medição. A intensidade de fluorescência do produto derivado da TA foi medida usando um leitor de microplacas (Ex/Em: 315/425 nm). A geração de radicais foi expressa como intensidade de fluorescência após subtração de blank e usada como indicador relativo da geração de radicais. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados, e os dados foram apresentados como perfis de curso temporal e comparações de desfechos em 10 minutos.

Avaliação do desempenho antibacteriano por contagem de colônias
Cepas de H. pylori foram armazenadas a −80 °C em caldo de infusão cerebral cardíaca (BHI) contendo 25% de glicerol. A principal deformação usada para o ensaio principal de contagem de colônias, ensaio de resgate, ensaio de interferência matricial, coloração por fluorescência viva/morta e análise por microscopia eletrônica de varredura foi H. pylori G27. Antes de cada experimento, as bactérias eram riscadas nas placas de ágar sanguíneo da Columbia e incubadas por 3 dias a 37 °C sob condições microaerofílicas consistindo em 5% O₂, 10% CO₂ e 85% N^₂22.

Colônia contando ensaio na cepa primária
Utilizou a enumeração de unidades formadoras de colônias (CFU) para avaliar a atividade antibacteriana sob diferentes condições de tratamento. Incluíram os seguintes grupos: controle não tratado, H₂O₂ sozinho, vitamina C sozinha, reação convencional de Fenton e reação de Fenton assistida por vitamina C. Se um grupo Fe²⁺-sozinho não foi incluído no experimento original, evite interpretar o ensaio primário como separando totalmente os efeitos apenas de ferro dos efeitos oxidativos mediados pela reação de Fenton. Colheu H . pylori e cultivou e ressuspendeu as bactérias em soro fisiológico. Ajustou a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) para 0,5, e transferiu a suspensão para uma solução fisiológica fisiológica contendo 3 mM de ureia ajustada para pH 3. Adicionou H₂O₂, FeSO₄ e vitamina C de acordo com o grupo de tratamento designado. Foram usadas concentrações finais de 2,2 mM H₂O₂ e 0,055 mM de FeSO₄. Para o tratamento com Fenton assistido por vitamina C, adicionou-se vitamina C em três alíquotas iguais em 3, 5 e 7 minutos, com concentração total final de 0,0264 mM.

Após 10 minutos de tratamento, cada amostra foi imediatamente diluída 100 vezes em soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4) para neutralizar a suspensão ácida e reduzir o remanescente de oxidantes e ferro para a etapa de placagem. Placaram a suspensão bacteriana diluída em placas de ágar sanguíneo Columbia e incubaram a 37 °C por 3 dias sob condições microaerofílicas de 5% O₂, 10% CO₂ e 85% N₂. Contaram as CFUs e calcularam a atividade antibacteriana como redução log₁₀ da CFU em relação ao controle não tratado usando a Equação 2:

log₁₀ CFU redução = log₁₀ (_controle CFU) − log10 (_{CFU tratada}) (2)

Ensaio de resgate
Para examinar se a atividade antibacteriana do sistema Fenton assistido por vitamina C estava associada à disponibilidade de ferro e processos relacionados a radicais, experimentos de resgate foram realizados usando deferoxamina (DFO) como quelante de ferro e tioureia como catador de radicais hidroxila. DFO ou tioureia foi adicionada à suspensão bacteriana 5 minutos antes da adição de FeSO₄ e H₂O₂. DFO e tioureia foram usados em concentrações finais de 100 μM e 5 mM, respectivamente.

Seis grupos experimentais foram incluídos: controle não tratado, Fenton assistido por vitamina C, Fenton assistido por vitamina C com DFO, Fenton assistido por vitamina C com tioureia, DFO isolado e tioureia isolada. Todos os outros parâmetros experimentais, incluindo pH, fundo de soro fisiológico/ureia, concentração de H₂O₂, concentração de FeSO₄, esquema de dosagem de vitamina C, duração do tratamento, diluição/neutralização antes do placagem e condições de incubação, foram idênticos aos usados no ensaio primário de contagem de colônias. A atividade antibacteriana foi quantificada por enumeração de UFC e expressa como redução log₁₀ da UFC em relação ao controle não tratado.

Validação multideformação
Para fornecer suporte limitado de cepa cruzada para o efeito antibacteriano observado na cepa primária, o ensaio de contagem de colônias foi aplicado ainda a duas cepas adicionais de referência de H. pylori , ATCC 43504 e ATCC 26695. Para cada cepa, três grupos experimentais foram incluídos: controle não tratado, reação de Fenton convencional e reação de Fenton assistida por vitamina C com adição gradual de vitamina C. As condições e procedimentos experimentais eram idênticos aos usados no ensaio primário de contagem de colônias. A atividade antibacteriana foi expressa como redução logarítmica₁₀ da UFC em relação ao controle não tratado para cada cepa. Cada experimento foi realizado com n = 3 réplicas biológicas independentes, e os dados foram apresentados como pontos individuais com média ± desvio padrão.

Ensaio de interferência matricial
Para avaliar se componentes da matriz orgânica poderiam atenuar a atividade antibacteriana do sistema Fenton assistido por vitamina C, foi estabelecido um modelo de interferência proteica usando albumina sérica bovina (BSA). A BSA foi incluída em concentrações finais de 0, 1 e 3 g· L⁻¹. Em cada concentração de BSA, três grupos experimentais foram incluídos: (1) controle não tratado, (2) Fenton convencional (Fe²⁺ + H₂O₂) e (3) Fenton assistido por vitamina C com adição gradual de vitamina C. O ensaio foi realizado usando a cepa primária sob o mesmo protocolo descrito no ensaio primário de contagem da colônia, com condições idênticas de pH, fundo salino/ureia, concentrações de reagentes, duração do tratamento (10 min) e procedimentos de placagem. A atividade antibacteriana foi expressa como redução log₁₀ da CFU em relação ao controle não tratado em cada concentração de BSA. Cada experimento foi realizado pelo menos três vezes de forma independente. A comparação principal focou em saber se a condição de Fenton aprimorada permaneceu superior, ou pelo menos não mais fraca que, a condição de Fenton convencional sob condições contendo proteínas.

Coloração bacteriana viva/morta por fluorescência
Após o tratamento, a suspensão bacteriana foi diluída 100 vezes em PBS, conforme descrito acima, para reduzir o remanescente ácido e oxidativo residual. Centrifugou a suspensão a 1.800 × g por 10 minutos em temperatura ambiente e descartou o sobrenadante. Ressuspenso o pellet bacteriano em 200 μL de soro fisiológico. Adicionaram SYTO9 e iodeto de propidio (PI) a concentrações finais de 6 μM e 30 μM, respectivamente. Incubei a suspensão no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente. Coloquei 5–10 μL da suspensão bacteriana manchada sobre uma lâmina de vidro limpa e a cobriu com uma tampa de cobertura. Imagens de fluorescência adquiridas usando um microscópio de fluorescência com canais de fluorescência verde e vermelho sob configurações idênticas de exposição para todos os grupos de tratamento. Capturaram pelo menos três campos selecionados aleatoriamente para cada grupo. Usaram as imagens como evidência visual qualitativa de padrões de coloração viva/morta, em vez de uma medida quantitativa da viabilidade bacteriana.

Análise da morfologia bacteriana por microscopia eletrônica de varredura
Após o tratamento, as amostras bacterianas foram coletadas e fixadas em glutaraldeído a 2,5% preparadas em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) a 4 °C por 12 horas. Após a fixação, as amostras foram lavadas com tampão fosfato para remover o fixador residual. As amostras foram então desidratadas sequencialmente em soluções de etanol graduadas de 50%, 70%, 90% e 100%. Após a desidratação, foi realizada a secagem em ponto crítico. As amostras secas foram montadas em tocos de SEM e revestidas com uma fina camada de ouro de aproximadamente 10 nm. A morfologia bacteriana foi examinada usando microscopia eletrônica de varredura com uma tensão acelerada de 5 kV. Imagens representativas foram adquiridas com baixa e alta ampliação para cada grupo de tratamento. Imagens de MEV foram usadas como observações morfológicas qualitativas, em vez de evidências quantitativas de um mecanismo de dano definido.

Análise estatística
Análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism versão 10.0. Todos os experimentos quantitativos foram realizados com n = 3 réplicas biológicas independentes, e os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Para ensaios de fluorescência TA, comparações estatísticas entre múltiplos grupos de tratamento foram realizadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguidas pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Para ensaios de contagem de colônias na cepa primária envolvendo múltiplas condições de tratamento, comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Para ensaios de resgate, comparações entre grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste de múltiplas comparações de Dunnett, com o grupo de Fenton assistido por vitamina C como referência. Para experimentos limitados de validação cruzada, as reduções log₁₀ da CFU foram comparadas entre os grupos Fenton convencional e Fenton assistido por vitamina C dentro de cada cepa, utilizando um teste t bicaudal sem pareamento. Para ensaios de interferência matricial, foi realizada ANOVA bidirecional com tratamento e concentração de BSA como fatores, incluindo o termo de interação. Comparações par a par entre tratamentos em cada concentração de BSA foram realizadas usando o teste de múltiplas comparações de Šídák. A significância estatística foi definida como P < 0,05. Os níveis de significância são indicados como *p < 0,05, ** P < 0,01, ***P < 0,001 e ****p < 0,0001.

Resultados

Avaliação da degradação do AO7 no sistema Fenton assistido por vitamina C
A degradação do AO7 foi usada como uma sonda química para examinar como a vitamina C influencia o comportamento oxidativo observável da reação de Fenton sob condições ácidas. Na ausência de vitamina C, o sistema convencional Fenton resultou em degradação parcial do AO7 ao longo do período de reação de 10 minutos. Quando a vitamina C foi introduzida, a extensão da degradação do corante aumentou, ...

Discussão

O presente estudo examinou se a dosagem de vitamina C poderia modular o comportamento oxidativo e as leituras antibacterianas de um sistema baseado em Fenton sob condições definidas de ácido in vitro . Nos ensaios químicos e microbiológicos, a suplementação gradual de vitamina C alterou o comportamento observável da reação e esteve associada a maior atividade antibacteriana contra H. pylori do que a reação convencional de Fenton nas condições testadas. Importante, esse ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	Usado como um corante modelo para o ensaio de degradação AO7.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Usado para o ensaio de interferência da matriz.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Usado para cultura bacteriana e criossalvimento.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Usado para cultura bacteriana e enumeração de UFC.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Usado para preparação de amostra SEM após desidratação em etanol graduado.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Usado como quelante de ferro no ensaio de resgate.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	Usado como sonda de fluorescência TA para detecção de sinal associado a •OH.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	Usado para preparar a série de etanol graduado para desidratação de amostra SEM.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Usado para imagem de fluorescência vivo/morto.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	Usado para fixação de amostras bacterianas antes do SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Usado para criossalvimento bacteriano em caldo BHI.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	Usado para análise estatística e criação de gráficos.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Cepa de referência adicional usada para validação limitada entre cepas.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Cepa de referência adicional usada para validação limitada entre cepas.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Cepa primária usada para contagem de colônias, ensaio de resgate, ensaio de interferência da matriz, coloração vivo/morto e SEM.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	Usado como substrato de peróxido em ensaios de reação de Fenton.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Usado como fonte de íon ferroso na reação de Fenton.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	Usado para medir a fluorescência derivada de TA (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	Usado para diluição/neutralização pós-tratamento antes da colocação e lavagem da amostra.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	Usado para suspensão bacteriana e preparação do modelo de sal fisiológico-ureia ácido.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Usado para análise de morfologia bacteriana.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Usado para alcalinizar alíquotas do ensaio TA e estabilizar a fluorescência.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	Usado para aplicar o revestimento fino de ouro antes da imagem SEM.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Usado para coloração bacteriana vivo/morto baseada em fluorescência.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Usado como captador de radicais no ensaio de resgate.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Usado para preparar o modelo de sal fisiológico-ureia ácido.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	Usado para medir a absorção AO7 a 483 nm.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Usado como redutor no sistema Fenton assistido por vitamina C.