Um método semi-automatizado para detectar diferenças de grupo nos números de neurônios dopaminérgicos do cluster medial anterior protocerebral no cérebro de Drosophila

Resumo

Este protocolo apresenta um método semi-automatizado para quantificar o número de neurônios dopaminérgicos no grande aglomerado medial anterior anterior da Drosophila . Projetada especificamente para detectar e comparar diferenças entre grupos experimentais e controle, essa abordagem reduz a dependência da contagem manual e oferece uma ferramenta prática para análises em nível de grupo.

Resumo

Drosophila melanogaster serve como um organismo-modelo poderoso para o estudo de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), principalmente por meio da análise da degeneração dos neurônios dopaminérgicos (DA) e déficits associados à locomoção. Historicamente, a quantificação da perda de neurônios DA no cérebro das moscas tem sido confinada a agrupamentos menores e facilmente enumeráveis, incluindo agrupamentos protocerebrais posteriores mediais (PPM) e grupos protocerebrais posteriores laterais (PPL). Em contraste, o agrupamento protocerebral antero-medial (PAM) substancialmente maior, composto por mais de 100 neurônios, apresenta um desafio significativo para a contagem manual, levando à sua sub-representação em estudos quantitativos. Até o momento, as investigações relatadas ainda dependem de contagens manuais intensivas por meio de empilhamentos confocais Z, que são demorados e propensos à variabilidade. Para suprir essa lacuna metodológica, desenvolvemos um pipeline semi-automatizado de análise de imagens usando a ferramenta de código aberto Labkit. Esse protocolo permite a quantificação eficiente relativa ao grupo de neurônios positivos para hidroxilase de tirosina (TH) no cluster PAM dentro do mesmo lote experimental. O método começa com a coloração padrão por imunofluorescência e a imagem confocal, seguidas por um guia detalhado passo a passo para segmentação e análise. Essa abordagem aborda o gargalo da quantificação de clusters PAM e oferece um fluxo de trabalho prático para detectar diferenças intergrupos na vulnerabilidade dos neurônios DA em modelos de neurodegeneração. A relativa escassez de estudos sobre DP no cluster PAM reflete uma barreira técnica histórica, e não uma falta de relevância biológica. Ao superar essa barreira, nosso método abre a porta para uma investigação sistemática da vulnerabilidade dos neurônios PAM na DP e sua possível ligação com sintomas não motores.

Introdução

A mosca-vinagre, Drosophila melanogaster, é um organismo-modelo popular para investigar as bases genéticas e moleculares de doenças neurodegenerativas, especialmente a doença de Parkinson (DP)¹. Suas vias de sinalização neuronal conservadas, kit sofisticado de ferramentas genéticas e curta vida útil o tornam excepcionalmente adequado para estudar a vulnerabilidade neuronal dependente da idade e para conduzir triagens genéticas e farmacológicas de alto^{rendimento 2,3}. Central nessas investigações está a análise de neurônios dopaminérgicos (DA), cuja degeneração seletiva é uma característica patológica da^{PD 4}. No cérebro de Drosophila, os neurônios DA são organizados em agrupamentos discretos e geneticamente^{identificáveis 5,6}. A perda progressiva de neurônios DA dentro de clusters específicos, visualizada pela imunocoloração TH e quantificada por microscopia, serve como um principal indicador funcional para avaliar a progressão da doença e intervenções neuroprotetoras em modelos^{experimentais 7,8}. Assim, a quantificação confiável da perda de neurônios DA é essencial para traduzir o poder da genética de Drosophila em resultados significativos de pesquisa sobre DP.

Convencionalmente, a análise quantitativa da perda de neurônios DA tem se concentrado na imunocoloração por tirosina hidroxilase (TH) de pequenos clusters, incluindo clusters protocerebrais posterior medial (PPM) e clusters protocerebral posterior lateral (PPL), com cada cluster contendo menos de 10 células facilmente contáveis pelo^{olho 7}. A enumeração manual por meio de Z-stacks confocais, embora trabalhosa, tem sido o método estabelecido para esses aglomerados em muitos estudos de DP usando Drosophila ^9,10,11. Em contraste, a contagem manual do agrupamento protocerebral anterior medial (PAM), o maior grupo de neurônios DA no cérebro da mosca, composta por mais de 100 células, apresenta um gargalo metodológico de longa data e impede sua inclusão na maioria dos estudos sobre DP ^9,10,11. Apesar do papel crítico dos neurônios PAM em circuitos de aprendizagem, memória e motivação, essa limitação resultou em sua relativa sub-representação em análises quantitativas da neurodegeneração 12,13,14,15. Notavelmente, até mesmo investigações recentes continuam a depender dessa abordagem ineficiente de contagem manual, ressaltando uma necessidade persistente e não atendida de uma solução padronizada e automatizada dentro da área¹³.

Para suprir essa lacuna crítica, desenvolvemos um pipeline de análise de imagem semi-automatizado que permite a quantificação eficiente relativa ao grupo de neurônios TH-positivos (TH⁺) no cluster PAM dentro de um experimento. Esse protocolo utiliza o plugin de código aberto baseado em aprendizado de máquina Labkit na plataforma Fiji/ImageJ e o software de processamento de imagens^{3D 16,17}. O fluxo de trabalho central exige que o usuário anote um subconjunto representativo de imagens para treinar um modelo de classificação de pixels, que é então aplicado a conjuntos de dados experimentais de coloração TH em processamento em lote, seguido pela criação e classificação de núcleos em relação à região TH⁺. Essa abordagem equilibra automação com supervisão de especialistas: reduz a carga e a variabilidade das contagens totalmente manuais, mantendo a contribuição dos pesquisadores para orientar o algoritmo e revisar resultados.

O objetivo deste artigo é fornecer aos pesquisadores um protocolo passo a passo para a quantificação eficiente da relação relativa dos neurônios DA do cluster PAM para comparações relativas a grupos dentro de um experimento. Demonstramos o fluxo de trabalho completo, desde a dissecação cerebral, coloração por imunofluorescência e imagem confocal até a pipeline detalhada de análise de imagens usando o método semi-automatizado. Ao padronizar essa etapa quantitativa chave, este protocolo visa capacitar a comunidade de pesquisa a incorporar consistentemente o grande cluster PAM em suas análises. Esse método semi-automatizado foi projetado especificamente para o cluster PAM e não é aplicável a outros clusters dopaminérgicos ou a neurônios TH-positivos nos lobos ópticos. Esse método pode facilitar estudos em nível de lote sobre a vulnerabilidade dos neurônios DA do cluster PAM e investigações adicionais sobre plasticidade sináptica, neurodegeneração e triagem terapêutica usando o modelo Drosophila .

Protocolo

1. Preparação de amostras e imagem confocal

1. Criação e coleta de moscas
   1. Moscas progenitoras cruzadas dos genótipos desejados para gerar prole experimental. Ao eclodir, colete 20–30 moscas por frasco de alimento fresco. Manter as moscas de acordo com o desenho experimental do usuário até que a idade experimental desejada seja atingida.
2. Preparação para dissecação
   1. Prepare um recipiente de dissecação preenchendo a tampa de uma placa de Petri de 30 mm até a metade da altura com elastomero de silicone Sylgard. Encha o recipiente com 1x Soro Tamponado com Fosfato (PBS). Aliquota 450 μL de fixador contendo 1x PBS e 4% de paraformaldeído (PFA) em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL, depois coloque o tubo sobre gelo.
   2. Anestesiar 10–20 moscas com um pulso de CO₂ de 5–10 s, e então transferi-las imediatamente para uma placa de Petri de 60 mm colocada no gelo para manter a imobilidade.
      ATENÇÃO: O PFA é tóxico e suspeito de ser carcinógeno. Manuse-se em uma exaustão com luvas, jaleco e óculos de proteção. Descarte resíduos conforme as diretrizes institucionais de materiais perigosos.
3. Dissecação e fixação do cérebro de mosca
   1. Segure uma mosca pela raiz da asa usando pinças e mergulhe o lado ventral para cima na placa de dissecação preenchida com PBS. Perfure o tórax com um fino pino de dissecação para ancorar a mosca na almofada de Sylgard.
   2. Oriente o corpo horizontalmente (por exemplo, cabeça para a esquerda, abdômen para a direita). Segure a base da probóscide com uma pinça enquanto usa a outra para remover toda a probóscide, criando uma abertura entre os olhos compostos.
   3. Segure as bordas expostas dos olhos com duas pinças e puxe-as muito lentamente para fora simetricamente, expondo o cérebro enquanto preserva sua conexão com o cordão nervoso ventral.
   4. Remova os sacos traqueais e o corpo de gordura ao redor do cérebro. Corte o cordão nervoso ventral para libertar o cérebro e permita que ele se assente no prato com o lado anterior voltado para cima.
      NOTA: Se o cérebro estabilizado mostrar a metade ventral posicionada mais alta que a metade dorsal (Figura 1B,C), use uma pinça para pressionar suavemente a parte elevada.
   5. Pré-umedeça uma ponta de pipeta P10 com 0,1% de Triton X-100 para evitar que o cérebro dissecado adera à parede interna da ponta. Usando essa ponta pré-umida, transfira cada cérebro dissecado para o tubo contendo o fixador, depois prossiga para a próxima dissecação. Depois que todos os cérebros forem transferidos, inverta o tubo 5 vezes e coloque-o horizontalmente sobre gelo por 30 minutos. Incube o tubo em temperatura ambiente (RT) por 1 hora com agitação.
   6. Deixe o cérebro se acalmar no fundo por 1 minuto. Lave o cérebro por 3 x 10 minutos com solução de lavagem contendo 1x PBS e 0,1% Triton X-100 (PBST) com agitação. Armazene o cérebro em PBS contendo 0,1% azida de sódio a 4 °C ou proceda à imunocoloração.
4. Imunocoloração
   1. Tinga cérebros em 300 μL de solução primária de coloração de anticorpos contendo 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Soro normal de cabra, 0,1% azida de sódio e anticorpo anti-TH de coelho (diluição 1:500) por 2 dias a 4 °C com agitação. Lave o cérebro por 3 x 10 minutos com PBST.
   2. Tinga o cérebro com solução secundária de anticorpos contendo 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Soro Normal de Cabra, 0,1% Azida de Sódio e Alexa Fluor 635 anti-coelho por 2 dias a 4 °C. Lave o cérebro uma vez com PBST.
   3. Incubar cérebros em PBST suplementado com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluição 1:1.000) por 2 horas em RT, depois lavar os cérebros em PBST por 2 horas. Armazene cérebros a 4 °C durante a noite ou continue montando.
5. Montagem
   1. Coloque 0,5 mL de suporte em uma seringa de 1 mL equipada com agulha de calibre fino. Crie uma câmara de montagem fixando duas tiras paralelas de fita adesiva transparente em uma lâmina de vidro, deixando um espaço de 3 mm (Figura 1A,D).
      ATENÇÃO: Agulhas afiadas representam risco de perfuração. Manuseie sempre com cuidado, refaça a recapitulação usando uma técnica de colher com uma mão só se necessário e descarte as agulhas usadas imediatamente em um recipiente aprovado para objetos cortantes.
   2. Transfira cérebros para uma placa de Petri limpa usando uma ponta de P200 truncada. Remova o excesso de líquido ao redor do cérebro e administre 10 μL de montant sobre o cérebro. Misture delicadamente o cérebro com a montadora.
   3. Distribua três gotas de montador ao longo da fresta do ferrolho e espalhe uniformemente pela abertura. Transfira e posicione o cérebro ao longo da linha central da folga com uma pipeta P10 (Figura 1A).
   4. Posicione os cérebros uniformemente ao longo da linha central do espaço, com o lado anterior voltado para cima. Cubra lentamente a abertura com uma capa de cobertura. Pressione perto das bordas da lâmina com os polegares por 3 segundos para garantir um contato firme.
   5. Coloque a lâmina horizontalmente em uma pasta para curar durante a noite no RT no escuro, depois a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
6. Imagem confocal
   1. Ligue o sistema de microscópio confocal e espere 15 minutos para estabilização a laser. Localize os cérebros em campo claro com uma lente objetiva 10x, depois mude para uma lente objetiva de imersão em óleo 100x e navegue até o cluster PAM em visualização ao vivo.
   2. Ajuste o estágio XY para localizar um cluster PAM no centro de imagem. Visualize até Z para confirmar os limites e a orientação. Ajuste o zoom digital e a orientação até que o painel PAM se ajuste ao quadro de imagem na diagonal.
   3. Defina a posição superior e inferior da pilha. Defina o tamanho do passo Z para 0,34 μm e a resolução da imagem para 512 x 512. Coloque o furo do pino no modo automático. Defina a tabela de consulta de exibição (LUT) para indicador de saturação.
   4. Ajuste a potência do laser e o ganho do detector no canal TH até que uma quantidade mínima de pontos dispersos e discretos dentro dos neurônios PAM esteja saturada. Ajuste as configurações do canal DAPI para obter um sinal nuclear brilhante e claro, sem saturação.
      NOTA: O fator de zoom ótimo varia. Diferenças na redução do tecido podem ocorrer entre lotes experimentais e entre cérebros individuais dentro do mesmo lote.
   5. Adquira e salve imagens em formato raw com 12 ou 16 bits na pasta de entrada (por exemplo, D:\Confocal\images). Volte para a visualização ao vivo, reinicie o zoom e navegue ao longo da abertura para encontrar o próximo cérebro sem mudar para a ampliação menor.
      NOTA: Não salve, exporte ou converta os arquivos de dados primários para um formato .tif processado neste momento. Preservar os metadados brutos originais é essencial para o processamento subsequente de imagens.

2. Processamento de imagem e quantificação

1. Conversão de arquivo de imagem e divisão do canal TH
   1. Converta imagens brutas localizadas na pasta de entrada para um formato compatível com o software de análise de imagens 3D usando o conversor de arquivos associado (Tabela de Materiais). Coloque os arquivos convertidos na pasta convertida (por exemplo, D:\Confocal\converted)
   2. Abra Fiji e navegue até Arquivo | Novo | Roteiro. No editor de script, clique em Arquivo | Aberto para carregar o arquivo macro ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Arquivo Suplementar 1). Clique em Executar perto do final da janela do editor (se o botão estiver oculto, clique no pequeno ícone triangular para mostrar).
   3. No diálogo de configuração, clique em Navegar e selecione a pasta convertida. Em Convenção de Nomes, selecione a opção 3. Em Canal para exportar, selecione o índice do canal correspondente ao TH. Clique em OK para dividir em lote o canal TH; as pilhas TH exportadas serão salvas automaticamente em uma pasta que termina com ChannelSplitOut.
2. Treinamento do classificador Labkit
   1. Preparação do conjunto de dados de treinamento
      1. Selecione 20 pilhas representativas que capturem uma faixa de intensidades de sinal e variações de fundo das amostras da pasta da pilha TH. Copie os arquivos selecionados para a pasta de seleção (por exemplo, D:\Confocal\selection).
      2. Execute a macro Fiji ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Arquivo Suplementar 2). Quando solicitado, selecione a pasta que contém as imagens de treinamento. A macro reduz cada pilha para o mesmo número de Z-slices e concatena as pilhas em um arquivo TIFF de time-lapse para treinamento.
   2. Treinamento interativo de classificador de pixels
      1. Iniciar o Labkit via Fiji Plugins | Labkit | Imagem aberta com o Labkit (Tabela de Materiais). Na barra de ferramentas, clique no botão 3D Box para alternar para o modo Slice View para navegar pelos Z-slices (controle deslizante do lado direito) e por samples (controle deslizante na parte inferior).
      2. Pressione S para abrir o painel de Brilho e Contraste e ajuste o controle controle Max para visualizar de forma ótima os neurônios TH⁺ . Defina um tamanho de pincel apropriado (por exemplo, 5 pixels). Clique em Configurações para expandir o painel de ferramentas. Mantenha os modos de exibição padrão (fusível, fonte, mais próximo).
      3. Clique em Desenhar. No painel de Rotulagem, destaque Fundo e selecione algumas regiões não celulares; destaque o Primeiro Plano e utilize o interior de alguns neurônios ^TH+.
      4. Dê zoom no campo com Ctrl + Shift + Scroll. Navegue para outras fatias Z usando o controle deslizante vertical e para outras amostras de treinamento usando o controle deslizante inferior. Desenhe várias vezes para garantir um treinamento robusto do classificador.
      5. Clique na classificação de pixels. Clique no triângulo Iniciar Treinamento para iniciar o treinamento e a previsão preguiçosa, que depois fornece feedback de segmentação em tempo real enquanto navega entre amostras, fatias ou posições (clique direito e arrasto) a qualquer momento.
      6. Clique em Desenhar para adicionar anotações corretivas onde a previsão estiver imprecisa, com opção de alternar a visibilidade da previsão e do rótulo no painel de Fontes e retreinar. Itere até que o classificador distinga de forma confiável os neurônios ^TH+ do fundo, então salve o classificador via Segmentação | Salve o classificador antes de fechar o Labkit.
3. Segmentação em lote do Labkit
   1. Abra uma imagem aleatória da pasta TH stack em Fiji. Inicie o Labkit e clique em Remover Tudo, depois carregue o classificador pré-treinado via Segmentação | Abra o Classificador para segmentar a imagem. Inspecione visualmente a qualidade para validar a generalização do classificador e feche a janela.
   2. Repita a 2.3.1 em várias outras imagens aleatórias. Feche a janela após cada inspeção, exceto a última.
   3. Crie uma pasta de saída Labkit (por exemplo, D:\Confocal\LabkitOut). Comece o processamento em lote via Outros > Imagens de Segmentos em Batch. Defina o Diretor de Entraday para a pasta da pilha TH e defina o Diretório de Saída para a pasta de saída do Labkit, e então clique em OK para iniciar o processamento em lote.
   4. Para experimentos futuros usando o mesmo anticorpo TH e configurações confocais comparáveis, pule a 2.2 e reutilize o classificador anterior.
      NOTA: Também fornecemos um classificador pré-treinado para fins de teste (Arquivo Suplementar 3).
4. Criação de spots DAPI e TH⁺ Quantificação de neurônios
   1. Coloque XT_Jove_Labkit_TH.m (Arquivo Suplementar 4) em uma pasta de script (por exemplo, D:\scripts). Abra o software 3D e navegue até Arquivo | Preferências, então selecione Ferramentas Personalizadas. No painel da pasta XTension , clique em Adicionar... para selecionar a pasta de script e clicar em OK.
   2. Para cada arquivo convertido, o script executará automaticamente as seguintes operações sequenciais.
      NOTA: Esta seção explicativa não contém ações para o usuário, mas é essencial para avançar para os próximos passos.
      1. O canal DAPI é processado por Subtração de Fundo e Filtro Gaussiano para facilitar a identificação otimizada de pontos DAPI.
      2. A máscara de segmentação Labkit é refinada por meio de redução de ruído e preenchimento de buracos, e anexada como um canal de máscara ao conjunto de dados. Um objeto superficial refinado de TH é construído a partir do canal da máscara. O objeto de superfície TH gera ainda uma máscara refinada para sobrescrever o canal da máscara.
      3. Um canal de transformação de distância é criado a partir da superfície TH, onde os voxels dentro da superfície são definidos para 0 e os voxels fora da superfície recebem valores de ponto flutuante representando sua distância euclidiana à superfície TH mais próxima.
      4. Use o perfil de intensidade de cada ponto DAPI no canal de transformada de distância como métrica para identificação do neurônio TH⁺ . Pontos DAPI localizados dentro ou próximos às regiões TH⁺ apresentam valores baixos de distância. Esse critério ajuda a resgatar falsos negativos, como núcleos reais de neurônios DA localizados logo fora, mas imediatamente adjacentes a uma região imperfeita prevista pelo Labkit.
   3. Otimização manual da Qualidade para criação de spots DAPI
      1. Abra uma amostra aleatória da pasta convertida em um software 3D. Navegar para Editar | Propriedades da imagem e verifique se o Voxel Tamanho Z no painel de Coordenadas é 0,340 μm. Se não, altere manualmente para 0,340 μm.
      2. Aplique subtração de fundo ao canal DAPI clicando em Processamento de Imagem | Limiar | Subtração de Antecedentes. No diálogo, marque apenas o canal DAPI, defina a Largura do Filtro para 3 e clique em OK. Repita essa etapa mais uma vez e depois execute uma terceira repetição com largura de filtro 1.
      3. Aplique suavização Gaussiana clicando em Processamento de Imagem | Suavização | Filtro Gaussano. Marque apenas o canal DAPI, defina a Largura do Filtro para 0,2 e clique em OK.
      4. Na Cena de Sobrepassar, clique em Adicionar Novos Pontos para iniciar o assistente de criação de Manchas. Selecione o canal DAPI e insira um Diâmetro Estimado XY de 1,2 μm. Seguindo o assistente, adicione um filtro "Qualidade acima" e ajuste o limite até que ele forneça robustamente um ponto único preciso para cada núcleo.
      5. Repita os passos 2.4.3.1–2.4.3.3.4 em várias amostras selecionadas aleatoriamente e finalize valor(es) limiar(es) que funcionem de forma confiável entre as amostras.
   4. Abra o script XT_Jove_Labkit_TH.m (Arquivo Suplementar 4) no editor de texto para modificar os seguintes parâmetros definidos pelo usuário.
      1. Defina ims_Folder para o caminho da pasta convertida; defina LabkitOut_Folder para o caminho da pasta de saída do Labkit. Defina Ch_DAPI para o índice do canal DAPI para todos os arquivos na pasta convertida (por exemplo, 1 se DAPI for o primeiro canal, 2 se DAPI for o segundo canal).
      2. Defina reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Se os tamanhos dos voxels estiverem corretos nas Propriedades da Imagem (veja o passo 2.4.3.1), deixe as respostas entre parênteses vazios []. Caso contrário, insira manualmente valores adequados (por exemplo, 0,130, 0,130, 0,340, respectivamente) que serão aplicados a todos os arquivos na pasta convertida.
   5. Finalize os parâmetros de criação do spot.
      1. Personalize múltiplas versões dos parâmetros no array de células SpotsParameterAss , onde cada linha especifica uma versão. Isso inclui definir o diâmetro XY estimado (μm) para detecção pontual DAPI na parte esquerda de cada linha, e definir a String de Filtro composta por(es) filtro(s) critério(s) na parte direita de cada linha, contendo o (s) limiar(es) de Qualidade do passo 2.4.3.4 e/ou limiar de Intensidade no canal de máscara refinado do passo 2.4.2.2 ou canal transformado por distância do passo 2.4.2.3.
      2. Defina "Centro de Intensidade Ch=aSizeC+1" acima de 0,5 para manter apenas os pontos cujo centro geométrico está dentro do canal refinado da máscara TH a partir de 2.4.2.2 (valor voxel > 0,5). Esse é o critério mais direto e rigoroso para a filtragem pontual TH⁺ DAPI.
      3. Defina "Intensidade Média Ch=aTamanhoC+2" abaixo de [limite] para manter pontos cuja intensidade média no canal de transformação de distância a partir do passo 2.4.2.3 caia abaixo de um limite especificado. Thresholds mais baixos selecionam pontos posicionados dentro ou extremamente próximos à superfície TH; Limiares mais altos incluem pontos progressivamente mais distantes. Isso permite a calibração empírica da proximidade aceitável para a atribuição de TH⁺ .
      4. Exemplo pré-configurado:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Centro de Intensidade Ch=aSizeC+1" acima de 0,5'];
         1.2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Média de Intensidade Ch=aSizeC+2" abaixo de 0.0001'];
         1.2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Média de Intensidade Ch=aSizeC+2" abaixo de 0.001'];
         1,2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Média de Intensidade Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,01'];
         ... Mais combinações de filtro são fornecidas no script.
         };
      5. Para experimentos futuros usando os mesmos ajustes de anticorpo TH e confocais, reutilize as combinações de parâmetros anteriores. Exclua aquelas combinações ruins que geram contagens pontuais que se desviam substancialmente dos números reais, reduzindo assim a carga computacional desnecessária.
   6. Criação de lotes
      1. Salve todas as modificações acima no script XT_Jove_Labkit_TH manhã. Abra uma nova janela de software 3D. Clique no menu Processamento de Imagem | PAM_TH_processing executar o script em lote.
      2. Inicialmente, observe por alguns minutos que, para cada combinação de filtros, o script cria um objeto Spots nomeado para refletir seus parâmetros, e que os arquivos da pasta convertida são processados e salvos como cópias em uma nova pasta de saída com o sufixo "processed". Então deixe o computador sem vigilância.
      3. Ao concluir, uma planilha será gerada. Observe a primeira coluna contendo nomes de arquivos, e as colunas subsequentes contendo contagens de pontos DAPI correspondentes a cada combinação de filtros, com cabeçalhos indicando o diâmetro XY estimado e a String de filtro usada.
   7. Validação de pós-processamento
      1. Após a conclusão da etapa 2.4.6, abra manualmente alguns arquivos aleatórios da pasta "processed" e examine os diferentes objetos Spots sobrepostos ao canal original do TH. Com base na inspeção visual, selecione um ou dois filtros ótimos que forneçam a representação mais fiel das contagens verdadeiras de neurônios TH⁺ . Exporte as colunas correspondentes da planilha para análise estatística posterior e preparação de figuras.
      2. Para corrigir erros de contagem de pontos na(s) combinação(ões) de filtros preferidas, selecione o(s) objeto(s) Spots correspondente(s) na cena Surpass e clique na aba Editar . Remova manualmente manchas erradas ou adicione as manchas esquecidas conforme necessário, pressionando Shift e clicando na tela. Salve as atualizações usando Store as/Exportar como/Salvar para sobrescrever o arquivo correspondente na pasta "processed" com o mesmo nome de arquivo.
         NOTA: Não delete, adicione, renomeie ou arraste/reposicione quaisquer objetos Spots — apenas edite os spots preferidos. Não são necessárias modificações no roteiro; basta reexecutar o script para gerar instantaneamente uma planilha atualizada refletindo refinamentos manuais. Para consistência, deixe nenhum editado ou edite o(s) objeto(s) Spots preferido(s) para todas as amostras em um experimento.

Resultados

Os dados brutos coletados pelo software foram depositados em um repositório público e estão acessíveis no seguinte DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Para demonstrar o uso desse pipeline de quantificação semi-automatizado, o aplicamos a um modelo Drosophila bem estabelecido de DP, usando expressão pan-neuronal da α-sinucleína humana (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). As moscas de controle abrigavam apenas o driver nSyb-QF2 . Ambos os genótipos foram envelhecidos a 29 °C por 3 semanas, após as quais cérebros foram dissecados, imunocolorados para TH e imagados para o cluster PAM. Como mostrado na Figura 3E, o pipeline semi-automatizado detectou uma redução significativa na contagem de neurônios TH⁺ de PAM em moscas expressas de α-sinucleína em comparação com controles (teste t de Student, p < 0,0001), demonstrando que o método pode capturar diferenças dependentes do genótipo dentro do mesmo lote experimental. As seções a seguir descrevem a configuração de montagem (Figura 1), a interface de treinamento do Labkit (Figura 2) e os passos de processamento de imagem (Figura 3) que possibilitam essa quantificação.

A Figura 1 ilustra a configuração de montagem dos cérebros dissecados de Drosophila e seu impacto na imagem de cluster de PAM. Após a dissecação, o cérebro ocasionalmente apresenta dobração ou inclinação do tecido adjacente à medula nervosa ventral seccionada. Esse levantamento na parte ventral do cérebro altera a perspectiva sob o estereoscópio, levando a uma projeção alterada do sulco estereotípico no contorno dorsal e a uma diferença na perspectiva relativa dos pontos de referência ventrais. (Figuras 1B,C). Essa deformação geralmente ocorre no momento em que o cérebro é desconectado do corpo. Tal deformação afeta a orientação do cluster PAM durante a montagem, influenciando consequentemente a profundidade necessária do Z-stack (Figura 1C,D). Em condições ideais de montagem, o espaçador de fita Scotch de camada única cria uma compressão adequada na região central do cérebro, fazendo com que o cluster de PAM localizado dorsalmente assuma uma orientação horizontal imediatamente adjacente ao revestimento. Essa configuração gera Z empilhados de 15–25 fatias em intervalos de 0,34 μm (Figura 1D). Na outra condição, o cluster PAM mantém uma posição inclinada, exigindo pilhas Z mais profundas (Figura 1D). De forma semelhante, o uso de um espaçador de fita de dupla camada falha em fornecer compressão adequada, deixando o cluster PAM em sua conformação nativa inclinada e, da mesma forma, aumentando a profundidade da pilha Z (Figura 1D). A Figura 1E mostra vistas representativas de projeção lateral de Z-stacks tingidos com TH sob condições de posicionamento ótimo e inclinação.

A Figura 2 apresenta a interface do usuário do Labkit e um fluxo de trabalho representativo de treinamento. Com apenas algumas anotações esparsas de rabiscos em uma única amostra (Figura 2A), o classificador inicial de pixels já produz uma segmentação notavelmente razoável (Figura 2B). No entanto, é fundamental enfatizar que essa anotação mínima é insuficiente para um desempenho robusto e generalizável em todo um conjunto de dados. É necessário um rotulagem muito mais iterativa — abrangendo múltiplas fatias Z, amostras e variações de coloração — para gerar um classificador que segmente de forma confiável os neurônios ^TH+ em todo o conjunto de dados. Notavelmente, as múltiplas imagens de treinamento são concatenadas ao longo da dimensão temporal (frame) em vez de empilhadas ao longo do eixo Z. Esse design preserva a integridade espacial de cada volume cerebral individual, garantindo que os grãos do filtro 3D operem exclusivamente dentro — e não atravessando — amostras biológicas. Se as amostras fossem, em vez disso, empilhadas verticalmente em um único e grosso Z-stack, as fatias Z nos limites entre amostras adjacentes se tornariam espacialmente contíguas, fazendo com que voxels de diferentes cérebros fossem tratados como estruturas vizinhas, o que aumentaria o risco de correções manuais desnecessárias (Figura 2C). A concatenação ao longo do eixo de tempo evita essa contaminação cruzada de amostras, ao mesmo tempo em que possibilita um treinamento eficiente e multi-amostra em uma única sessão de Labkit.

A Figura 3 ilustra o pipeline de pós-processamento e a quantificação final. Máscaras de segmentação de Raw Labkit (Figura 3A) contêm numerosos pequenos pontos falsos positivos e buracos internos. Após aplicar operações de derução morfológica e preenchimento de buracos (Figura 3B), uma superfície TH suavizada é construída e usada para gerar uma máscara binária refinada (Figura 3C). A melhoria alcançada por esse refinamento é visualizada como uma sobreposição comparando as máscaras inicial e final (Figura 3D, superior). Notavelmente, algumas regiões neuríticas ricas em TH são ocasionalmente retidas na máscara final; no entanto, essas áreas quase invariavelmente carecem de núcleos coloridos com DAPI e, portanto, contribuem de forma negligenciável para a contagem final de neurônios. Usuários avançados podem ajustar ainda mais os parâmetros morfológicos no script de processamento em lote fornecido para ajustar a eliminação desses artefatos residuais. A Figura 3D (abaixo) mostra os pontos finais DAPI (magenta) sobrepostos ao canal TH (verde) a partir de uma projeção de intensidade máxima. A Figura 3D também revela um raro tipo de falso positivo ocasionalmente observado em nosso pipeline: um núcleo colorido com DAPI localizado em uma região de neuritas rica em TH pode ser classificado incorretamente como um ponto TH⁺ quando o sinal de neurita se sobrepõe fortemente ao núcleo. No entanto, como mostrado na Figura 3C, núcleos DAPI-positivos na proximidade dos neuritos são geralmente escassos. Além disso, os poucos sinais DAPI presentes próximos a essas regiões neuríticas frequentemente permanecem corretamente classificados como verdadeiros negativos (ou seja, não contados como TH⁺), pois não são identificados incorretamente pelo pipeline. A Figura 3E demonstra a utilidade prática do método: moscas nSyb-QF2>SNCA com 3 semanas apresentam uma redução significativa na contagem de neurônios TH⁺ do PAM em comparação com controles nSyb-QF2 em múltiplos filtros (teste t de Student, p < 0,0001). Embora as contagens absolutas de pontos possam variar entre diferentes combinações de filtros e o método não alcance precisão perfeita de um único ponto, a diferença relativa entre os grupos experimental e controle permanece robusta. Para múltiplos filtros testados, o resultado estatístico da comparação de grupos é amplamente preservado entre filtros dentro do mesmo lote experimental. Assim, a saída deve ser interpretada como uma leitura comparativa dentro do lote, em vez de uma contagem absoluta sem erros dos neurônios PAM.

Figura 1. Dissecação cerebral e configuração de montagem do cérebro por Drosophila. (A) Diagrama esquemático do conjunto de montagem do cérebro. Barras amarelas representam espaçadores de fita adesiva. Um esquema cerebral ampliado indica a localização aproximada do agrupamento PAM (roxo). (B) Esquemas da seção transversal lateral correspondentes ao plano tracejado em A representando duas morfologias cerebrais comuns após a dissecação: posicionada de forma ótima (superior) e inclinada (inferior). (C) Dois cérebros de mosca dissecados vistos sob estereoscópio: posicionados de forma ótima (esquerda) versus inclinados (direito). Setas amarelas indicam o sulco estereotipado ao longo do contorno dorsal. Linhas azuis tracejadas conectam dois pontos correspondentes nos lados esquerdo e direito da metade ventral. Setas azuis destacam a mudança resultante na perspectiva relativa desses marcos ventrais. Barra de escala = 500 μm. (D) Ilustração esquemática mostrando como a morfologia cerebral e a espessura do espaçador da fita (camada simples vs. dupla) influenciam o posicionamento vertical do cluster PAM e, consequentemente, a profundidade necessária da pilha Z. (E) Vistas laterais representativas (projeção em Y) de acúmulos confocais em Z tingidos com TH a partir de condições de montagem posicionadas de forma ótima (superior) e deformadas (inferiores). Barra de escala = 5 μm. Abreviação: PAM = protocerebral antero-medial. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Treinamento em kits de laboratório e segmentação interativa. (A) Interface gráfica do Labkit. As anotações (rabiscos) são mostradas em duas classes: primeiro plano (vermelho) e fundo (azul). (B) Resultado de segmentação gerado imediatamente após o treinamento nos rabiscos mostrados em A. Vermelho indica cor em primeiro plano; azul indica cor de fundo. Barra de escala = 5 μm. (C) Diafonia entre fatias Z adjacentes. Imagens de corte único de mitocôndrias marcadas com proteínas fluorescentes de diferentes cérebros de moscas foram concatenadas ao longo do eixo Z. As fatias 1 e 3 são cópias idênticas da mesma imagem, enquanto as fatias 2 e 4 têm origem em cérebros diferentes. Setas amarelas, previsão que passa do slice 2 para o slice 1. Setas verdes, previsão que atravessa do slice 4 para o slice 3. Barra de escala = 3 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Pós-processamento de máscaras de segmentação Labkit e quantificação de neurônios TH⁺. (A) Máscara binária Raw Labkit (ciano, superior) e sobreposição com o canal TH original (inferior). Note abundância de pequenos pontos e preenchimento incompleto dos corpos celulares neuronais. (B) Máscara após desruido morfológico e preenchimento de buracos (magenta, superior); sobreposição com o canal TH (inferior). (C) Máscara binária refinada (vermelha, superior) a partir de uma superfície TH suavizada para B e re-mascaramento; sobreposição com o canal TH (inferior). (D) Superior: Sobreposição de máscaras brutas (ciano) e refinadas (vermelhas), destacando regiões corrigidas por pós-processamento. Inferior: Projeção de intensidade máxima mostrando os pontos finais DAPI (magenta) sobrepostos ao canal TH (verde). Note que as duas manchas no canto superior direito se originam do agrupamento contralateral de PAM. O filtro 4 era usado para ilustração. (E) Validação quantitativa em um modelo de doença de Parkinson usando múltiplas combinações de filtros. Moscas nSyb-QF2>SNCA (modelo PD) com três semanas de idade apresentam uma redução significativa na contagem de neurônios TH⁺ do PAM em comparação com controles nSyb-QF2 em múltiplos filtros (acima). Os dados brutos são fornecidos em uma planilha (parte inferior). filtro 1: 1,2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,0001']; filtro 2: 1,2, ['"Qualidade" acima de 94,5, "Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,001']; filtro 3: 1,2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,01']; filtro 4: 1,2, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,05']; filtro 5: 0,6, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,001']; filtro 6: 0,6, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,01']; filtro 7: 0,9, ['"Qualidade" acima de 94,5,"Intensidade Média Ch=aSizeC+2" abaixo de 0,01']; n = 57 cérebros (controle), n = 65 cérebros (PD); Teste t do aluno, p < 0,0001 (****). Moscas foram cultivadas a 29 °C. Barras de escala = 5 μm (A–D). Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1. Fiji macro para dividir o canal TH a partir de arquivos de imagem convertidos e salvar as pilhas de saída.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2. Fiji macro para recortar pilhas Z de treinamento para uma profundidade comum de Z-slice e concatená-las em um arquivo TIFF de time-lapse para treinamento com classificadores Labkit.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3. Classificador Labkit pré-treinado usado para testar o fluxo de trabalho de segmentação PAM TH.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4. Script MATLAB para processamento em lote de máscaras Labkit, geração de spots DAPI, aplicação de combinações de filtros e exportação de contagens de neurônios TH⁺ .Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A quantificação dos neurônios DA no cluster PAM de Drosophila tem sido historicamente um desafio formidável. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho semi-automatizado que integra classificação de pixels baseada em aprendizado de máquina com software de análise de imagens para resolver esse problema antigo. Esse método permite a detecção em nível de lote de variações nos neurônios ^TH+ no aglomerado PAM entre grupos dentro do mesmo experimento, apoiando estudos comparativos em modelos da doença^{de Parkinson 18}.

Ao selecionar o filtro ideal para um determinado experimento, os usuários podem escolher o filtro que melhor corresponde à inspeção visual das imagens brutas, ou consultar a faixa e/ou média relatada dos números de neurônios PAM do tipo selvagem na^{literatura 12,13}. No entanto, é necessário cautela: apenas dois estudos relataram contagens de agrupamentos de PAM, nenhum deles relacionado à DP, e os valores relatados mostram considerável inconsistência. Além disso, o desvio padrão pode aumentar com a idade, complicando ainda mais as comparações entre estudos. Portanto, a referência baseada em literatura deve ser usada apenas como um guia aproximado, não como um padrão absoluto. Reconhecemos que esse pipeline não gera contagens absolutas sem erros (Figura 3D). No entanto, desde que as comparações sejam limitadas a grupos dentro do mesmo lote experimental (ou seja, não agrupando dados entre diferentes lotes em um único plot), o método pode ser usado para detectar diferenças relativas entre genótipos ou condições de tratamento dentro de um lote.

Em nossa experiência, anticorpos secundários conjugados com AF488 devem ser evitados devido ao alto nível de fundo, e AF546 deve ser evitado devido à maior atenuação do sinal ao longo do eixo Z. Também descobrimos que a incubação e lavagem completa do DAPI são críticas para alcançar alta relação sinal-ruído e sinais nucleares claros, o que impacta diretamente o desempenho da segmentação automatizada. O DAPI é preferível ao Hoechst para essa aplicação, pois sua coloração preferencial de heterocromatina gera manchas nucleares mais brilhantes e definidas, facilitando uma detecção mais precisa.

Discussão sobre solução de problemas para modos de falha comuns

Falhas relacionadas a manchas. A habilidade de dissecação é um dos principais fatores determinantes da qualidade dos dados. O agrupamento de PAM está localizado superficialmente e é facilmente danificado ao remover os dois sacos traqueais e o corpo gordo dorsal a essa região. As pinças devem ser manuseadas com cuidado para evitar furar ou comprimir a área do PAM. A deformação ventral frequentemente ocorre no momento em que a medula nervosa ventral é cortada, fazendo com que o cérebro se incline ou enrole quando colocado sobre uma lâmina de vidro; essa deformação pode se fixar permanentemente após a incubação com PFA. Os usuários devem experimentar ângulos de pinça durante o corte para encontrar uma técnica ideal. Se a inclinação for observada após a dissecação, uma pressão suave na região elevada pode reverter a deformação (aceitável se a área comprimida não for a região de interesse).

Falhas de segmentação. Segmentação ruim geralmente ocorre devido a dados de treinamento insuficientemente diversos. O classificador Labkit deve ser treinado com um conjunto representativo de imagens que abrange toda a gama de qualidade de coloração dentro do lote, incluindo a melhor, média e pior. Durante a correção iterativa, priorize anotar falsos positivos e falsos negativos sobre os quais você tenha confiança. Evite corrigir regiões ambíguas ou incertas, pois isso pode enganar o classificador e degradar o desempenho.

Falhas na detecção pontual. A otimização de parâmetros requer uma exploração sistemática em um pequeno subconjunto de amostras representativas. Teste diferentes diâmetros estimados de pontos e limite de filtro de qualidade, ou até mesmo tipos de filtro além do filtro "Qualidade acima" usado neste protocolo. O assistente de criação de spots oferece várias opções de filtragem (por exemplo, intensidade). Os usuários são incentivados a adaptar limiares e tipos de filtro ao seu conjunto de dados específicos, e a realizar ajustes empíricos antes do processamento em lote.

Por que a contagem manual dos neurônios do cluster PAM continua sendo excepcionalmente difícil? O agrupamento PAM apresenta características anatômicas e de coloração únicas que tornam os métodos tradicionais de contagem manual inadequados. Primeiro, a imunofluorescência TH no citosol dos neurônios dopaminérgicos de Drosophila marca predominantemente um anel citoplasmático fino que envolve um grande vazio nuclear não corado. Consequentemente, o núcleo colorido com DAPI e o compartimento citoplasmático ^TH+ apresentam sobreposição espacial mínima. Essa falta fundamental de colocalização impede a estratégia direta de classificação "DAPI na máscara TH". Segundo, o cluster PAM é composto por mais de 100 neurônios densamente compactados organizados em uma arquitetura tridimensional, semelhante a uma uva. À medida que se navega por acúmulos confocais Z, os neurônios aparecem e desaparecem gradualmente — alguns entrando no plano, outros saindo — criando uma alta carga cognitiva e uma variabilidade substancial entre observadores. O estudo mais recente que quantificou neurônios PAM DA baseou-se na contagem manual usando o plugin de contador celular do ImageJ. Embora totalmente apropriada para agrupamentos menores como PPM1/2 ou PPL1, essa abordagem se torna proibitivamente intensiva em trabalho quando aplicada ao cluster PAM, especialmente em estudos que exigem dezenas ou centenas de amostras.

Por que a arquitetura de floresta aleatória do Labkit é particularmente adequada para segmentação de neurônios TH? O Labkit implementa um classificador de pixels baseado em floresta aleatória que é excepcionalmente bem adaptado aos desafios específicos das imagens de cluster PAM com coragem TH. O algoritmo calcula um vetor de características abrangente para cada pixel aplicando uma cascata de filtros de transformação, incluindo desfoque gaussiano, diferença de gaussianos, magnitude do gradiente gaussiano, laplaciano de Gaussiano e autovalores hessianos — cada um avaliado em múltiplas escalas sigma (1, 2, 4, 8). Essa extração de características multiescala captura efetivamente as características texturais e de borda que distinguem o interior nuclear do fundo extracelular. Importante destacar que, como as florestas aleatórias exigem ordens de magnitude menos dados de treinamento do que abordagens de aprendizado profundo, os usuários podem refinar iterativamente o classificador com anotações esparsas de rabiscos em apenas 20–40 imagens representativas. Cada iteração adiciona novas árvores de decisão ao conjunto, que coletivamente votam para classificar cada pixel. Esse processo acomoda inerentemente a variabilidade de lote para lote nas condições de coloração e imagem — uma vantagem crítica dada a variabilidade biológica inerente aos cruzamentos genéticos e estudos de envelhecimento com Drosophila . Usando essa abordagem, a perda de neurônios ^TH+ em modelos de Parkinson que expressam α-sinucleína pode ser detectada, e os efeitos de potenciadores e supressores genéticos na contagem de neurônios do cluster PAM podem ser comparados em um lote experimental.

Importante, para fins de treinamento, as pilhas recortadas são concatenadas ao longo da dimensão temporal, em vez de empilhadas ao longo do eixo Z. Essa escolha de design é fundamental para o treinamento ideal de classificadores. A classificação de pixels 3D do Labkit considera informações voxel entre fatias Z consecutivas, o que é essencial para resolver com precisão o fino anel citoplasmático TH que define a morfologia dos neurônios PAM. Se as amostras individuais fossem, em vez disso, empilhadas verticalmente em uma única pilha Z ultraespessa, as fatias Z nas fronteiras entre amostras adjacentes se tornariam espacialmente contíguas na pilha. Consequentemente, voxels pertencentes a diferentes amostras biológicas seriam tratados como estruturas vizinhas dentro do mesmo volume tridimensional. Durante o treinamento interativo, um rabisco desenhado próximo a tal limite pode, inadvertidamente, capturar características de duas amostras diferentes simultaneamente, confundindo o classificador (Figura 2B, setas). Além disso, sinais falsos positivos originados de uma amostra podem ser projetados no volume da amostra adjacente, resultando em rabiscos corretivos errôneos que se propagam por iterações de treinamento subsequentes, gerando árvores de decisão que codificam regras biologicamente sem sentido. Concatenar amostras ao longo do eixo temporal preserva a integridade espacial de cada volume individual, permitindo que os núcleos do filtro 3D operem exclusivamente dentro — e não atravessando — amostras biológicas, enquanto ainda possibilita um treinamento eficiente e multiamostra em uma única sessão Labkit.

Considerações metodológicas e limitações

Várias ressalvas importantes merecem discussão. Primeiro, esse protocolo é otimizado especificamente para o cluster PAM e pode não se generalizar para outros clusters DA (por exemplo, PPM1/2/3, PPL1) ou para neurônios ^TH+ nos lobos ópticos. A região PAM se beneficia de uma densidade relativamente esparsa de DAPI, com núcleos bem separados em espaço tridimensional, permitindo uma detecção robusta e inequívoca de pontos DAPI. Em contraste, esse fluxo de trabalho não é facilmente transferível para outros clusters de DA, como PPL1 ou PPM1/2. Nessas regiões, os neuritos têm maior probabilidade de serem justapostos ou sobreporem núcleos coloridos com DAPI de células não DA. Dado o número muito baixo de neurônios DA na linha de base nesses pequenos aglomerados (frequentemente menos de 10 células por cluster), até mesmo algumas classificações incorretas podem levar a erros proporcionalmente grandes, tornando o método menos confiável para essas aplicações. Segundo, a imunocoloração TH também rotua neuritos e projeções axonais dentro do neuropil. Apesar das anotações corretivas durante o treinamento, esses trechos fibrados ocasionalmente produzem sinais fortes de TH e podem ser classificados erroneamente como em primeiro plano pelo classificador. No entanto, essas regiões no aglomerado PAM são quase invariavelmente desprovidas de núcleos coloridos com DAPI; assim, vóxeles falsos positivos na região rica em neuritos do cluster PAM contribuem minimamente para a contagem final de neurônios. Terceiro, a classificação de pixels do Labkit opera com características locais de textura dentro de uma vizinhança finita (kernels de filtro padrão respondem a aproximadamente 16 × 16 janelas de pixel). Esse design garante eficiência computacional e possibilita segmentação interativa em tempo real, mas também significa que o classificador não pode aproveitar o contexto anatômico global. Consequentemente, artefatos raros ou irregularidades de coloração que se desviam substancialmente do conjunto de treinamento podem exigir curadoria caso a caso. Por fim, o pipeline de processamento em lote descrito aqui — integrando segmentação Labkit com detecção pontual DAPI e transformação de distância — gera múltiplos canais de saída e combinações de filtros. Os usuários devem validar sistematicamente os parâmetros ótimos do filtro para suas condições experimentais específicas, em vez de adotar acriticamente os limiares padrão apresentados neste protocolo.

Aplicações futuras

Além do modelo de DP demonstrado aqui, esse pipeline semi-automatizado pode ser aplicado diretamente a qualquer modelo de Drosophila envolvendo quantificação de neurônios DA em cluster PAM, incluindo estudos de aprendizagem e memória, motivação, regulação do sono e neurodegeneração relacionada à idade. Especificamente, a capacidade de processamento em lote desse método pode torná-lo adequado para: (1) Testes de medicamentos de médio a alto rendimento: Testar múltiplos compostos neuroprotetores em diferentes doses torna-se mais viável sem um aumento proporcional no esforço manual de contagem. (2) Rastreamentos modificadores genéticos: Quantificar a contagem de neurônios PAM em centenas de cruzamentos genéticos (por exemplo, linhas de RNAi, linhas de superexpressão) para identificar potenciadores ou supressores da toxicidade por α-sinucleína. (3) Estudos de envelhecimento longitudinal: Acompanhamento da perda de neurônios PAM em múltiplos pontos temporais com redução da carga manual de contagem. Além disso, o fluxo de trabalho de segmentação baseado em Labkit não se limita à coloração TH; com o retreinamento adequado, pode ser adaptado para quantificar outras populações neuronais no cérebro de Drosophila , desde que compartilhem duas características principais com o cluster PAM: uma densidade relativamente baixa de núcleos coloridos com DAPI e interferência mínima da coloração de neuritas. Além do Labkit e do software 3D usado aqui, a lógica geral desse pipeline — classificação de pixels baseada em aprendizado de máquina seguida por detecção pontual e transformação de distância — pode ser implementada em outras plataformas suportadas de análise de imagens 3D, aumentando assim sua acessibilidade e flexibilidade para a comunidade de pesquisa mais ampla.

Em resumo, apresentamos um fluxo de trabalho semi-automatizado para detectar diferenças de grupos nos números de neurônios TH⁺ do cluster PAM. Ao combinar classificação de pixels baseada em Labkit com detecção pontual e transformação de distância, esse método permite a comparação do número de neurônios TH⁺ entre grupos experimental e controle dentro do mesmo lote, ao mesmo tempo em que reduz a carga da contagem manual à medida que o tamanho da amostra aumenta. Escalar de dezenas para centenas de amostras aumenta proporcionalmente o tempo de computação, mas o esforço manual adicional é principalmente limitado à organização de arquivos e verificação pontual de qualidade. Embora o cluster PAM tenha recebido pouca atenção nas pesquisas sobre DP até o momento, isso se deve em grande parte a limitações técnicas e não à irrelevância biológica. Ao fornecer uma ferramenta prática de quantificação, nosso protocolo facilitará, no futuro, a investigação de se e como os neurônios da PAM degeneram em modelos de DP e explorará sua possível contribuição para sintomas não motores, como déficits olfativos e declínio motivacional. Prevemos que este protocolo facilitará estudos comparativos em nível de lote sobre neurodegeneração dopaminérgica, plasticidade sináptica e triagem de fármacos neuroprotetores no sistema modelo Drosophila .

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software de processamento de imagem 3D - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Software de análise de imagens 3D utilizado neste estudo
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Centro de Estoques Drosophila de Bloomington	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Centro de Estoques Drosophila de Bloomington	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Pinça Dumont Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Ciências da Microscopia Eletrônica	72680-D (0203-3C-PO)
FV3000 confocal	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) adsorvido cruzadamente de cabra, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Pinos Minutien, aço inoxidável, 0,15 mm de diâmetro	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Soro normal de cabra, liofilizado sólido	Sigma-Aldrich	566380
Software de computação numérica - Python	Python	3.8+
Software de computação numérica - Matlab	Trabalho em matemática	R2016a+	Software de computação numérica utilizado neste estudo
Octilfenol Etoxilato (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Solução de paraformaldeído 4% em PBS	Santa Cruz Biotecnologia	SC-281692
Prato de Cultura Celular de Poliestireno	Nest Scientific	706001
Montagem ProLong Gold Antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934
Anti-Tirosina Hidroxilase do Coelho (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S2002
Estereoscópio	Olympus	SZ51
Einmalkan estericano; len 27 G grau 0,40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Seringa, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Fita adesiva transparente	3M Scotch 600, limpo	600