Manuseio em túneis e enriquecimento ambiental para pletismografia repetida de corpo inteiro em camundongos

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos de manuseio em túneis e enriquecimento ambiental para pletismografia corporal repetida para reduzir a variabilidade respiratória associada ao estresse durante estudos longitudinais em camundongos.

Resumo

A pletismografia repetida de corpo inteiro (WBP) é amplamente utilizada para avaliação longitudinal da função respiratória em camundongos. No entanto, o estresse induzido pelo manuseio pode introduzir variabilidade fisiológica que confunde os efeitos do tratamento e reduz a reprodutibilidade experimental. Métodos tradicionais de manuseio da cauda podem produzir respostas de estresse sustentadas e baixa habituação em sessões repetidas, potencialmente afetando os resultados experimentais. Este protocolo descreve métodos refinados de manuseio e alojamento que integram o manuseio de túneis e o enriquecimento ambiental para sessões repetidas de WBP. Seis camundongos selvagens do tipo 129S1/SvImJ (3 machos, 3 fêmeas) receberam manuseio em túneis e enriquecimento ambiental contínuo ao longo de um estudo de 10 semanas. Os animais passaram por sessões repetidas de WBP, e períodos de aclimatação foram analisados nos pontos iniciais, iniciais, intermediários e finais do estudo. A frequência respiratória durante a colocação inicial da câmara (inicial f, 0–2 min) e a linha base estável (basal f, 8–10 min) foram quantificadas para avaliar padrões longitudinais de aclimatação. Mudanças progressivas foram observadas ao longo do cronograma do estudo sob as condições implementadas. A frequência respiratória inicial média diminuiu de 345 ± 111 respirações por minuto no início para 267 ± 43 respirações por minuto durante sessões tardias do estudo, acompanhada de redução do coeficiente de variação (32% a 16%). As medições respiratórias de base também diminuíram de 255 ± 67 para 193 ± 43 respirações/minuto (p = 0,033), consistente com melhora na estabilidade da medição em sessões posteriores. Observações comportamentais mostraram aclimatação calma com mínima defecação, micção ou agitação. Esse protocolo oferece uma abordagem prática para laboratórios que realizam avaliações respiratórias repetidas em camundongos. O manejo em túneis e o enriquecimento ambiental estiveram associados à aclimatação progressiva e à redução da variabilidade respiratória durante estudos longitudinais de WBP.

Introdução

A pletismografia de corpo inteiro (PBB) permite a avaliação não invasiva da função respiratória em roedores conscientes e sem restrições, tornando-se uma ferramenta indispensável para estudos longitudinais em fisiologia respiratória, toxicologia por inalação e modelagem^{de doenças 1,2}. As principais vantagens da técnica, incluindo sua natureza não invasiva e adequação para medições repetidas, a tornam particularmente valiosa para acompanhar alterações respiratórias durante a progressão da doença, intervenções terapêuticas ou períodos de exposição. Glaab e Braun² destacaram que a pletismografia não invasiva cabeça-fora do corpo é um método confiável para medições repetidas da função pulmonar em camundongos conscientes, fornecendo ferramentas essenciais para pesquisas translacionalistas em doenças das vias aéreas, incluindo infecções respiratórias emergentes. No entanto, a qualidade e reprodutibilidade das medições de WBP dependem criticamente de alcançar estados de baixa frequência respiratória consistentes com a quiescência comportamental, que pode ser comprometida pelo estresse induzido pelo manuseio. O manejo do estresse representa uma fonte bem reconhecida, mas frequentemente subestimada, de variabilidade experimental que pode confundir medições fisiológicas e comprometer a qualidade dos dados. A prática padrão de laboratório normalmente envolve o manuseio da cauda, na qual camundongos são agarrados pela cauda para transporte e^{manipulação 3,4}.

A prática padrão de laboratório normalmente envolve o manuseio da cauda, na qual camundongos são agarrados pela cauda para transporte e manipulação. Gouveia e^{Hurst 3} demonstraram que o manuseio da cauda induz ansiedade em camundongos, com animais manejados apresentando comportamento mais elevado semelhante à ansiedade no labirinto elevado mais em comparação com controles com cabo em túnel. Essa resposta de ansiedade está associada a parâmetros fisiológicos alterados. Rasid et ^al.4 usaram WBP para quantificar os efeitos respiratórios de procedimentos laboratoriais rotineiros, descobrindo que a contenção e o manuseio alteraram significativamente o volume minúsculo de forma dependente do sexo, com efeitos persistindo por até 24 horas após o procedimento. A magnitude e a duração desses efeitos induzidos pelo manuseio ressaltam que medições respiratórias obtidas logo após o manuseio da cauda podem refletir a fisiologia do estresse agudo, em vez da função basal estável.

A literatura mais ampla sobre contenção e manejo do estresse revela impactos que vão além das respostas comportamentais imediatas. Buynitsky e^{Mostofsky 5} revisaram os extensos efeitos do estresse de contenção nos processos fisiológicos, imunológicos, endócrinos e do desenvolvimento, enfatizando que confusões relacionadas ao estresse frequentemente são insuficientemente documentadas em artigos de pesquisa. Para estudos respiratórios especificamente, o problema é agravado pela necessidade de medições repetidas. Cada evento de manuseio pode reiniciar a resposta ao estresse, limitando a habituação progressiva e produzindo medições de linha de base inconsistentes entre os pontos de tempo longitudinais. DeLorme e^{Moss 1} compararam abordagens de pletismografia restrita versus não restringida em camundongos com diferenças fisiológicas conhecidas entre deformações, descobrindo que, embora sistemas de câmara única sem restrições tenham proporcionado uma análise aprimorada da reatividade das vias aéreas, o desafio de obter medições de referência reprodutíveis permanecia.

O manuseio em túneis, no qual camundongos entram voluntariamente em um túnel para transporte, surgiu como uma alternativa baseada em evidências que reduz substancialmente a ansiedade induzida pelo manuseio. A eficácia do método foi demonstrada em múltiplas cepas e contextos experimentais. Gouveia e^{Hurst 3} mostraram que camundongos com cabo de túnel apresentaram maior disposição para interagir com os condutores e menor comportamento semelhante à ansiedade em testes elevados plus labirinto em comparação com ratos com cabo de cauda, com benefícios observados mesmo quando os túneis eram desconhecidos. Importante destacar que esses benefícios vão além do período imediato após o manuseio. Sensini et ^al.6 examinaram os efeitos da técnica de manuseio e da frequência do manuseio entre sexos, descobrindo que o manuseio frequente da cauda reduzia comportamentos associados ao bem-estar, como escavação, e aumentava o comportamento semelhante ao desespero nos machos, enquanto o manuseio em túneis era preferido por ambos os sexos e associado a comportamentos de abordagem mais positivos e menos respostas defensivas. Além disso, Davies et ^al.7 demonstraram que os benefícios do manuseio sem cauda persistem durante procedimentos complexos. Ratos expostos ao manuseio da cauda durante toda a experiência em laboratório, inclusive durante procedimentos de contenção, mostraram maior capacidade de resposta a estímulos ambientais e redução da facilidade de manuseio em comparação com camundongos manuseados exclusivamente por métodos de copa ou túnel.

Além do manejo da seleção do método, a habituação sistemática aos procedimentos experimentais pode reduzir ainda mais a variabilidade induzida pelo estresse. Sorli et ^al.8 investigaram o treinamento de camundongos para pletismografia head-out, um sistema baseado em contenção, e descobriram que cinco dias consecutivos de treinamento melhoraram a tolerância, com os camundongos demonstrando maior estabilidade comportamental até o segundo dia, embora os parâmetros respiratórios tenham estabilizado em até 5 minutos durante todas as sessões. De forma semelhante, Ueno et ^al.9 demonstraram que o manuseio repetitivo e suave de camundongos machos C57BL/6 antes dos testes comportamentais reduziu o comportamento semelhante à ansiedade nos testes elevados mais em labirinto e melhorou a cognição espacial, indicando que o contato repetido com os manipuladores pode produzir efeitos mensuráveis de habituação. Esses achados sugerem que combinar métodos de manuseio não aversivos com protocolos sistemáticos de habituação pode proporcionar benefícios cumulativos para reduzir a variabilidade fisiológica durante medições repetidas.

O enriquecimento ambiental representa um fator adicional que pode influenciar a resposta ao estresse e a fisiologia de base, embora seus efeitos sejam complexos e dependentes do contexto. Embora o enriquecimento geralmente promova o bem-estar positivo, o enriquecimento excessivo ou imprevisível pode, paradoxalmente, aumentar a variabilidade fisiológica e os comportamentos associados ao estresse em alguns contextos^{experimentais 10,11}. Uma abordagem equilibrada que mantenha elementos centrais estáveis, como material de nidificação, enquanto oferece novidade gerenciável por meio da rotação periódica dos itens de enriquecimento, pode otimizar o bem-estar sem introduzir variação^{confusa 12}. A interação entre enriquecimento, método de manuseio e protocolos de habituação permanece pouco estudada no contexto de medições respiratórias repetidas, destacando a necessidade de protocolos integrados que abordem os três fatores simultaneamente.

Apesar do crescente reconhecimento dos efeitos do manuseio nas medições fisiológicas, protocolos padronizados especificamente projetados para minimizar o estresse durante sessões repetidas de WBP continuam limitados. Os protocolos WBP existentes normalmente dependem de períodos estendidos de aclimatação (10–30 minutos por sessão) para permitir que a taquipneia induzida pelo estresse diminua, mas raramente abordam o método de manuseio subjacente ou avaliam sistematicamente se ocorre uma habituação progressiva entre as sessões. Além disso, a maioria dos estudos não avalia se os animais alcançam estados fisiológicos consistentes com a quiescência comportamental, como frequências respiratórias próximas a intervalos relatados na literatura como associados a estados de repaciência ou relacionados ao sono, ou então fazem a transição de estresse agudo para excitação crônica de baixo nível. Aqui, apresentamos um protocolo que integra o manejo de túneis, o enriquecimento ambiental equilibrado e sessões repetidas do WBP ao longo de um estudo longitudinal de 10 semanas. Descrevemos uma abordagem associada a mudanças progressivas na frequência respiratória consistentes com a habituação, incluindo a diminuição das frequências respiratórias iniciais ao longo das sessões e medições iniciais próximas a intervalos relatados na literatura como associados a estados de repacio ou relacionados ao sono. Importante destacar que esse protocolo é apresentado não apenas como um aprimoramento do bem-estar animal, mas também como uma consideração experimental no desenho que pode ajudar a reduzir a variabilidade e melhorar a consistência durante medições respiratórias longitudinais.

Protocolo

Realize todos os procedimentos de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (Protocolo IACUC #23-103) da Universidade de Miami. Camundongos domésticos em uma instalação de vivário credenciada pela AAALAC, com condições ambientais mantidas de acordo com padrões institucionais.

1. Seleção de Animais e Condições de Habitação

1. Selecionar e preparar os animais para o estudo
   1. Selecione animais de uma colônia de reprodução já estabelecida ou adquira-os de um fornecedor comercial. Para este estudo, utilize seis camundongos selvagens do tipo 129S1/SvImJ (3 machos, 3 fêmeas).
   2. Manter os animais sob condições de FPS (livres de patógenos específicos) em uma instalação credenciada pela AAALAC, com monitoramento de saúde rotineiro realizado de acordo com padrões institucionais.
   3. Confirme que os animais têm aproximadamente 6 meses de idade (jovens adultos) no início do estudo.
      NOTA: Os camundongos neste estudo já tinham exposição prévia ao manuseio de túneis como parte da manutenção rotineira. Para camundongos ingênuos, implemente um período de condicionamento antes de iniciar as sessões de WBP (veja Passo 3.2).
2. Inicie os procedimentos experimentais quando os camundongos atingirem a idade adequada aos objetivos do estudo. Neste estudo, os camundongos tinham aproximadamente 6 meses de idade (jovens adultos) no início das sessões de PBA. Para reprodutibilidade, utilize camundongos dentro de uma faixa etária definida (por exemplo, ±1 mês) e informe as idades específicas utilizadas, pois a idade pode influenciar parâmetros respiratórios de base e a cinética da habituação.

2. Protocolo de Enriquecimento Ambiental

1. Forneça material de aninhamento constante
   1. Coloque um quadrado de algodão comprimido (aproximadamente 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) em cada gaiola a cada troca de gaiola.
   2. Transfira a maior parte da estrutura do ninho existente intacta para a nova gaiola durante as trocas usando as duas mãos.
   3. Se o material acumulado de nidificação exceder aproximadamente 10 g (aproximadamente o dobro da massa original), remover as partes mais antigas e compactadas do fundo preservando a estrutura externa da cúpula.
   4. Adicione um quadrado de algodão fresco (5 cm × 5 cm) à gaiola limpa para apoiar a construção e manutenção contínua do ninho.
   5. Substitua o material de nidificação apenas se estiver visivelmente úmido (contaminação por urina cobrindo >25% da superfície) ou se o ninho tiver sido destruído e não reconstruído em até 48 horas (Figuras 1A e 1C).
      NOTA: Preserve a estrutura do ninho para minimizar o estresse associado às mudanças na gaiola e mantenha sinais olfativos e táteis consistentes ao longo do estudo. A qualidade dos ninhos serve como indicador do bem-estar animal e do estado de saúde¹³.
2. Avalie a construção do ninho semanalmente usando o seguinte procedimento padronizado
   1. A cada troca de gaiola, transfira cuidadosamente o ninho intacto para uma superfície limpa usando ambas as mãos, sem perturbar a estrutura.
   2. Fotografe o ninho diretamente de cima com a câmera posicionada 30–40 cm perpendicular à superfície para visualizar a estrutura geral e a formação da cratera.
   3. Fotografe o ninho de lado, na altura do ninho, para documentar a integridade da parede e as características da cúpula.
   4. Pontue o ninho usando a escala padronizada de 5 pontos Deacon¹³, onde 1 = material de nidificação praticamente intocado e 5 = ninho em forma de cúpula com cratera clara. Consulte a Figura 1A–1C para exemplos de ninhos com pontuação 5.
   5. Devolva o ninho cuidadosamente para a gaiola limpa.
      NOTA: Fotografias semanais de ninhos fornecem documentação objetiva da qualidade do ninho ao longo do estudo. A deterioração na construção do ninho pode indicar doença, estresse ou outras preocupações de bem-estar que exigem atendimento veterinário.
3. Fornecer enriquecimento rotativo alterado semanalmente
   1. Selecione um item de enriquecimento e coloque-o na gaiola. Use papel triturado (papel branco simples, porção de um punhado), papel toalha (2–3 folhas, sem perfume, branco, dobrado ou amassado) ou abrigos de papel (tubos de papelão ou pequenas caixas).
   2. Alternar os itens de enriquecimento semanalmente de acordo com um cronograma pré-determinado (por exemplo, Semana 1: papel triturado; Semana 2: papel toalha; Semana 3: tubo de papelão; Semana 4: repetir) para manter a novidade administrável.
      NOTA: A rotação semanal traz novidade sem sobrecarregar os ratos. Evite itens plásticos para enriquecimento, como cabanas plásticas, bolas ou estruturas rígidas, que podem aumentar a variabilidade fisiológica¹¹. Substitua todos os itens de enriquecimento a cada troca de gaiola.

Figura 1. Implementação de protocolos e indicadores de bem-estar durante estudos longitudinais de pletismografia corporal inteira (WBP). (A) Ninho representativo de alta qualidade (pontuação Deacon 5) de uma gaiola feminina mostrando uma estrutura de cúpula bem formada com cratera definida. (B) Túnel transparente de manuseio de policarbonato (aproximadamente 10 cm de comprimento × 5 cm de diâmetro interno) integrado com material de nidificação na gaiola doméstica. Os túneis permaneceram permanentemente em gaiolas como dispositivos de enriquecimento e manuseio durante todo o estudo. (C) Qualidade representativa do ninho em estudos tardios (Semana 10) mostrando construção sustentada de ninhos com pontuação 5 tanto em gaiolas masculinas quanto femininas. (D) Pontuações de qualidade Nest durante o período de estudo de 10 semanas. Cada ponto de dados representa a pontuação semanal de ninho de uma gaiola usando a escala padronizada de 5 pontos^{Deacon 13}, onde 1 = material de nidificação intocado e 5 = ninho completo em forma de cúpula com cratera. Ambas as gaiolas mantiveram a qualidade do ninho com pontuação 5 em todas as fases do estudo. A região verde sombreada indica as pontuações associadas a condições ideais de bem-estar (escores 4–5). As fases do estudo são indicadas por regiões coloridas de fundo correspondentes à Linha de Base (Semana 0), Início do estudo (Semanas 2–3), Meio do estudo (Semanas 5–7) e Estudo Tardio (Semanas 8–10). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Implementação de Manuseio de Túneis

1. Preparar túneis de manuseio
   1. Use túneis de policarbonato transparente (100 mm ou 130 mm de comprimento × 50 mm de diâmetro interno) com bordas lisas e arredondadas (Figura 1B).
   2. Coloque um túnel permanentemente em cada gaiola residencial como parte do enriquecimento da gaiola.
   3. Não remova túneis entre os eventos de manuseio.
      NOTA: Manter o túnel dentro da gaiola permite que ele adquira odores familiares da gaiola e se associe ao ambiente doméstico, em vez de procedimentos de manuseio. Os ratos frequentemente usam túneis como refúgios ou locais de ninho.
   4. A cada troca de gaiola, limpe o interior do túnel com uma pequena quantidade de cama usada da gaiola anterior antes de colocá-la na gaiola limpa.
   5. Túneis de autoclave ou lavá-los com o mesmo agente desinfetante usado para a higiene da gaiola, caso seja necessário desinfecção entre os usos. Enxágue bem e deixe os túneis secarem ao ar antes de devolvê-los à gaiola.
      NOTA: Manter a continuidade olfativa ajuda a minimizar o estresse associado a cheiros desconhecidos. Túneis são autoclaváveis e reutilizáveis.
2. Condicionar os camundongos para manuseio em túneis
   1. Para camundongos adultos ingênuos, implemente um período de condicionamento de pelo menos 1–2 semanas antes de iniciar as sessões de^{WBP 14,15}.
   2. Coloque túneis transparentes de policarbonato (veja Passo 3.1) permanentemente na gaiola da casa e permita de 3 a 7 dias para a familiarização passiva.
   3. Após a exposição passiva, realize sessões diárias de manuseio suave. Incentive os camundongos a entrarem voluntariamente no túnel, depois levante o túnel horizontalmente por 30–60 segundos antes de devolver o rato à gaiola.
   4. Avalie a habituação bem-sucedida usando os seguintes critérios: entrada voluntária no túnel em 10–30 segundos, comportamento calmo dentro do túnel sem tentativas de fuga ou vocalização, e uso espontâneo do túnel para descanso ou exploração durante observações rotineiras da^{gaiola 14,15}.
   5. Comece as sessões de WBP assim que todos os critérios de habituação forem atendidos.
      NOTA: Os camundongos neste estudo já tinham exposição prévia ao manuseio de túneis como parte da manutenção rotineira antes do início das sessões de BPA.
3. Executar manuseio não aversivo
   1. Use luvas de nitrilo sem pó em todos os procedimentos de manuseio.
   2. Use o manuseio de túneis como método principal de manuseio. Se o rato estiver dentro do túnel, levante o túnel horizontalmente com uma mão apoiando a base.
   3. Se o rato estiver fora do túnel, posicione a abertura do túnel a até 5–10 cm do rato e permita 10–30 s para entrada voluntária sem perseguir ou forçar.
   4. Se o mouse não entrar dentro de 30 s, incentive o movimento em direção ao túnel usando uma mão em concha posicionada atrás do mouse sem fazer contato.
   5. Se o mouse não entrar após duas tentativas (máximo total de 60 s), use o método de ventosa. Coloque uma mão achatada perto do rato, permita a aproximação voluntária por 10–20 segundos, depois aperte o mouse suavemente com as duas mãos, evitando o manuseio da cauda.
   6. Use o método de manuseio que resulte em comportamento calmo, definido como ausência de vocalização, tentativas de fuga ou defecação associada ao estresse.
4. Transferir camundongos para a câmara de pletismografia
   1. Transfira o rato do túnel para as mãos em concha antes de colocá-lo na câmara.
   2. Mantenha o túnel na horizontal e incline a traseira (lado da cauda) para cima aproximadamente 10–20°.
   3. Deixe o rato sair do túnel com as patas traseiras primeiro, apoiando as mãos em concha.
   4. Abaixe ambas as mãos na câmara e permita que o rato pise voluntariamente no chão da câmara dentro de 5 a 10 segundos.
      NOTA: Este método de transferência de túnel para mãos para a câmara oferece controle aprimorado durante a colocação da câmara.
   5. Alternativamente, transfira o mouse diretamente do túnel para a câmara, inclinando o túnel sobre a abertura da câmara.
      NOTA: A transferência direta de túnel para câmara oferece menos controle durante a colocação e foi usada com menos frequência neste estudo.
   6. Nunca inverta o túnel verticalmente nem o sacuda.
   7. Sele a tampa da câmara imediatamente após a colocação do rato e devolva o túnel para a gaiola da casa.
      PASSO CRÍTICO: Nunca segure ratos pela cauda em nenhum momento durante o estudo. Se um camundongo não entrar no túnel em até 30 segundos ou se aproximar de uma mão em concha, incentive o movimento suave com cama macia, sem perseguir ou forçar a interação. Permita que o mouse escolha a abordagem por túnel ou mão com base na preferência individual. A paciência durante as sessões iniciais ajuda a estabelecer associações positivas com manuseio não aversivo ^3,7.

4. Protocolo de Sessão WBP

1. Prepare o sistema de pletismografia
   1. Calibre o pletismógrafo de corpo inteiro uma vez ao dia antes da aquisição dos dados.
   2. Com as câmaras vazias e seladas, inicie a sequência automatizada de calibração através do software de análise respiratória FinePointe (alvo: 18–22 cm H₂O). Confirme a calibração bem-sucedida quando a faixa efetiva do fluxo da caixa exceder ±40 mL/s por local.
   3. Ajuste o fluxo de polarização para 1,0 L/min por câmara.
   4. Monitore continuamente a temperatura da câmara (22°C–24°C) e a umidade usando sensores digitais.
   5. Coloque as câmaras em um local silencioso, com iluminação constante e vibração mínima.
      NOTA: Mantenha condições constantes da câmara em todas as sessões. Flutuações de temperatura alteram os padrões respiratórios e confundem as comparações^{longitudinais 1}.
2. Conduza sessões de PBA durante uma fase circadiana consistente
   1. Realize todas as medições durante a mesma janela de tempo do ciclo de luz.
   2. Realize sessões entre 08:00 e 10:00 (luzes acesas às 06:00) e evite as primeiras 2 horas após acender as luzes, quando os ritmos circadianos estão em transição.
3. Transporte camundongos para a sala experimental
   1. Transporte as gaiolas para casa para a sala experimental em um carrinho aproximadamente 15 minutos antes do início da sessão.
   2. Permita que os camundongos se acostumem ao ambiente experimental da sala enquanto permanecem em sua gaiola familiar.
   3. Coloque gaiolas de casa próximas às câmaras de pletismografia.
   4. Use o manuseio em túnel (veja os Passos 3.3–3.4) para transferir cada camundongo da gaiola para as mãos em concha e depois para dentro da câmara.
   5. Manuseie os camundongos com calma e minimize movimentos bruscos durante a transferência.
      NOTA: A transferência individual do mouse requer apenas alguns segundos.
4. Coloque o rato na câmara
   1. Transfira o rato suavemente das mãos em concha para a câmara (veja Passo 3.4).
   2. Sele a tampa da câmara dentro de 5 segundos após a colocação do mouse.
5. Início da aclimatação e gravação
   1. Comece a registrar sinais respiratórios usando o software de análise respiratória.
   2. Permita 10 minutos para a aclimatação sem perturbação ou intervenção.
6. Monitore a estabilidade comportamental durante a aclimatação
   1. Observe o rato continuamente durante todo o período de adaptação.
   2. Registre movimentos excessivos, imobilidade sustentada acompanhada de sinais de estresse (por exemplo, postura rígida) ou tentativas repetidas de fuga sem períodos de comportamento calmo no registro da sessão.
   3. Reconhecer que tais sessões ainda podem fornecer dados iniciais válidos; No entanto, as medições de linha de base da Fpodem ser pouco confiáveis.
   4. Sessões de sinalização sem períodos de calma observáveis durante a janela de aclimatação para possível exclusão das análises de linha inicial de acordo com critérios específicos do estudo.
   5. Mantenha todas as sessões deste estudo, pois nenhuma atendeu aos critérios de exclusão baseados no comportamento de aclimatação.
      PASSO CRÍTICO: O período de aclimatação de 10 minutos é essencial para avaliar a habituação. Embora alguns protocolos utilizem períodos de aclimatação de 20–30 minutos, camundongos bem habituados neste estudo alcançaram padrões respiratórios estáveis em 8–10 minutos, tornando a aclimatação prolongada desnecessária e potencialmente contraproducente devido ao aumento do movimento.
7. Observe o comportamento do camundongo durante a aclimatação
   1. Observe os camundongos continuamente durante o período de aclimatação de 10 minutos por meio do monitoramento visual das câmaras.
   2. Note indicadores de estresse evidentes, incluindo defecação, micção, tentativas prolongadas de fuga ou imobilidade prolongada.
   3. Registre a presença e a quantidade aproximada de pellets fecais e urina na câmara após cada sessão.
      NOTA: Essas observações fornecem uma avaliação qualitativa dos níveis de estresse e do progresso da habituação, mas não foram formalmente avaliadas por meio de um etograma padronizado neste estudo.
8. Analisar métricas respiratórias da fase de aclimatação
   1. Use o software de análise respiratória para calcular automaticamente a frequência respiratória a partir de sinais de pressão, usando o algoritmo padrão de detecção de sopro e as configurações padrão de limiar neste software.
   2. Adquira sinais respiratórios sob condições estáveis de fluxo de ar (veja Passo 4.1) usando parâmetros padrão de aquisição.
   3. Calcule a frequência respiratória média para dois períodos: finicial (0–2 min), representando a resposta inicial ao estresse e a fisiologia imediata após o manuseio, e fbasal (8–10 min), representando a frequência respiratória de base estabilizada.
   4. Exclua períodos com artefatos de movimento visíveis, definidos como deflexões de pressão não respiratórias ou formas de onda irregulares associadas ao movimento de animais ou distúrbios na câmara.
      NOTA: Inspecione visualmente um subconjunto de gravações (aproximadamente 10%) para confirmar a detecção precisa da respiração pelo algoritmo automatizado. A validação manual confirmou concordância entre a detecção automatizada e os padrões respiratórios observados.
9. Prossiga com o protocolo experimental, se aplicável
   1. Continue com intervenções experimentais após o período de aclimatação de 10 minutos conforme o desenho do estudo (por exemplo, administração de medicamentos em aerossol, desafio hipóxico, teste de exercício).
      NOTA: Nenhuma intervenção experimental foi realizada durante as sessões de avaliação de habituação neste estudo. As métricas respiratórias relatadas (inicial fe linha basal f) foram obtidas durante sessões apenas de aclimatação, sem procedimentos adicionais.
10. Devolva o rato para a gaiola de casa
    1. Use manuseio de túnel ou mãos em concha para transferir o rato da câmara de volta para a gaiola da casa.
    2. Observe o rato por 5 minutos após a sessão para confirmar o comportamento normal, incluindo movimentos espontâneos, tosa, interação com companheiros de gaiola e investigação de comida e água.
    3. Alongue a observação e consulte a equipe veterinária se o comportamento anormal persistir além de 15 minutos, incluindo imobilidade prolongada (>5 minutos), respiração difícil, postura curvada ou incapacidade de interagir com os companheiros de gaiola.
       NOTA: Nenhum comportamento anormais pós-sessão foi observado neste estudo.
11. Mantenha a frequência consistente das sessões
    1. Realize sessões de PBA regularmente durante o período longitudinal do estudo (10 semanas neste protocolo).
    2. Realize sessões em intervalos semanais para acompanhar a progressão da habituação.
    3. Agende sessões em horários consistentes do dia (veja Passo 4.2) para manter a consistência circadiana e procedimental.

Resultados

A aplicação desse protocolo de manuseio de túneis e enriquecimento ambiental a seis camundongos selvagens tipo 129S1/SvImJ (3 machos, 3 fêmeas) em um estudo longitudinal de 10 semanas com WBP produziu evidências de habituação progressiva e melhora da estabilidade fisiológica. Medições de frequência respiratória foram obtidas durante sessões repetidas de WBP realizadas em intervalos longitudinais regulares, com dados analisados de quatro fases do estudo: Linha inicial (Semana 0), Início d...

Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem integrada que combina o manejo de túneis, enriquecimento ambiental e exposição repetida no contexto da WBP longitudinal. Nessas condições, as medições de frequência respiratória mostraram estabilização progressiva ao longo de sessões repetidas, consistente com redução da excitação e habituação progressiva. Vários fatores de implementação parecem importantes para o desempenho bem-sucedido do protocolo. Primeiro, o manuseio de túneis deve ser introduzi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aspen Chip Bedding	Suprimentos de Laboratório	Aspen 323	Cama de lascas de madeira de Aspen. Autoclavada antes do uso; colocada a aproximadamente 1 cm de profundidade no piso da gaiola.
Água Autoclavada	Fornecida pela Instalação	Não aplicável	Água municipal autoclavada fornecida ad libitum através de garrafas de água padrão.
Tubo de Papelão	Gerado pela Instalação	Não aplicável	Rolo de papel higiênico de papelão liso. Usado como item de enriquecimento e abrigo rotacionado.
Crink-I-Nest (Irradiado)	The Andersons / Suprimentos de Laboratório	CNKR	Material de enriquecimento de papel triturado. Gama-irradiado. Fornecido como enriquecimento rotacionado em uma base de semana alternada.
Software FinePointe	Data Sciences International	Sem número de catálogo	Software de aquisição e análise de dados respiratórios, versão 3.0. Usado para coleta de dados WBP e cálculo de parâmetros.
Gaiola Ventilada Individual (IVC) Rack	Allentown	EP5000E	Rack IVC com pak de exaustão, capacidade para 140 gaiolas. Sistema de alta densidade de dupla face com conexões de ventilação automática.
Ração Irradiada para Roedores	Envigo	T.2918.15	Dieta irradiada padrão para roedores. Fornecida ad libitum via funil de barras de arame.
Túnel de Transferência de Camundongos	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Túnel de policarbonato transparente, 100 mm de comprimento × 50 mm de diâmetro interno. Autoclavável e reutilizável. Usado para procedimentos de transferência de animais com baixo estresse.
Nestlets (Irradiados)	Suprimentos de Laboratório	IRR	Quadrados de nidificação de algodão compactado (~5 cm × 5 cm, ~2,5 g cada). Gama-irradiados. Fornecidos como enriquecimento constante; um por gaiola.
Luvas de Nitrila, Sem Pó	Kimberly-Clark	KC500	Luvas de exame de nitrila sem pó, roxas. Usadas durante todos os procedimentos de contato com animais.
Esponja de Gaze Não Tecida	Pivetal	21295040	Esponja de gaze não tecida não estéril, 4 camadas, 4 pol × 4 pol (10,16 cm × 10,16 cm). Usada como material de enriquecimento.
Toalha de Papel	Tork (Essity)	MB 540A	Toalha de mão multidobra branca. Usada como material de enriquecimento rotacionado.
Câmera de Smartphone	Apple	Sem número de catálogo	Câmera de smartphone iPhone. Usada para documentação semanal de pontuação de ninhos.
Sistema de Pletismogrfia de Corpo Inteiro	Data Sciences International	10222C (2 locais); 770621 (4 locais)	Sistema de pletismogrfia de corpo inteiro FinePointe FP Series sem restrições para camundongos. Disponível em configurações de 2 e 4 locais.