Ensaio de Imagem Baseado em Placas para Quantificar Respostas Fotoperiódicas em Neurospora crassa Usando Desenvolvimento de Protoperitecias

Resumo

O Ensaio de Protoperitecias quantifica respostas fotoperiódicas em Neurospora crassa medindo a formação de protoperitécios sob ciclos claro-escuro definidos. Esse método baseado em placas oferece uma abordagem simples e escalável para comparar respostas de desenvolvimento dependentes do fotoperíodo entre condições experimentais.

Resumo

Neurospora crassa é um organismo-modelo bem estabelecido para estudar o tempo biológico e o desenvolvimento regulado pela luz. O Ensaio de Protoperitecos (PPA) é um método de imagem baseado em placas para quantificar respostas fotoperiódicas medindo a formação de protoperitecios como resultado do desenvolvimento. O objetivo desse protocolo é fornecer um fluxo de trabalho reprodutível e escalável para avaliar como ciclos claro-escuro definidos influenciam o desenvolvimento sexual fúngico. Neste ensaio, culturas fúngicas são cultivadas em meio sintético de cruzamento sob condições controladas de fotoperíodo, seguidas pela remoção padronizada de conídios superficiais para melhorar a visualização. Os protoperitécios são quantificados por contagem manual baseada em imagens, e contagens médias por placa são usadas para comparações estatísticas entre condições de fotoperíodo. Diferentemente de abordagens anteriores, a PPA integra condições padronizadas de cultura, exposição controlada ao fotoperíodo e imagens baseadas em quadrantes para permitir comparações quantitativas reprodutíveis entre cepas. Esse fluxo de trabalho vai além de um protocolo básico ao estabelecer uma estrutura consistente e escalável para medir a produção de desenvolvimento dependente do fotoperíodo sob condições experimentais definidas. O método leva aproximadamente uma semana desde a inoculação até a análise e pode ser aplicado em múltiplas cepas sob condições ambientais definidas. O PPA oferece uma plataforma simples e acessível para análise comparativa do desenvolvimento dependente do fotoperíodo em fungos sob condições laboratoriais controladas.

Introdução

O ensaio de protoperitecos (PPA) quantifica as respostas fotoperiódicas no fungo Neurospora crassa. Muitos organismos medem o comprimento do dia e da noite para coordenar processos biológicos em um fenômeno conhecido como^{fotoperiodismo} 1,2,3,4,5,6,7,8. Neste ensaio, o desenvolvimento da estrutura sexual feminina, o protoperitécio, serve como um proxy mensurável e dependente da luz para a resposta fotoperiódica. Embora o fotoperiodismo seja bem caracterizado em plantas por meio de experimentos de amanhecer^{da noite 3}, existem menos abordagens padronizadas para quantificar respostas fotoperiódicas em eucariotos não fotossintéticos, como fungos. N. crassa fornece um sistema modelo manejável para esse propósito devido à sua genética bem definida e às vias de desenvolvimento responsivas à luz. A regulação dependente do fotoperíodo do tempo reprodutivo foi observada em organismos 1,2,3,4,5,6,7,8, apoiando a relevância das respostas fisiológicas impulsionadas pela luz; no entanto, estudos mecanicistas em fungos continuam limitados pela falta de ensaios reprodutíveis.

Protoperitecios são estruturas sexuais prematuras femininas em N. crassa. Eles se originam da ascogônia, que desenvolve tricóginos enrolados que se fundem com hifas ou conídios do tipo^{oposto de acasalamento 9}. Após a fusão, núcleos do parceiro "masculino" entram no protoperitécio. O número de protoperitecos produzidos é regulado sazonalmente e fortemente induzido pela^{luz 10}. A regulação fotoperiódica é central para a ecologia, cronobiologia e fisiologia fúngica porque muitos processos controlados por relógios dependem da luz. A luz influencia diversas vias genéticas, incluindo fotorreceptores, quinases e mecanismos de transdução da luz ligados ao desenvolvimento^{sexual 11}. Os protoperitecos são bem adequados para medir a saída fotoperiódica porque são facilmente visualizados ao microscópio e respondem de forma sensível à luz.

Apesar da importância do fotoperiodismo em fungos, poucos ensaios padronizados e reprodutíveis estão disponíveis para quantificar a produção de protoperitécios sob ciclos de luz controlados. Um ensaio de média capacidade e baseado em placas é valioso porque os fungos são organismos modelo baratos e facilmente mantidos, permitindo uma análise sistemática do desenvolvimento sexual induzido pela luz e da função gênica. A maior parte das pesquisas em fotoperiodismo tem se concentrado em plantas, enquanto estruturas quantitativas equivalentes para sistemas fúngicos permanecem limitadas. Em outros organismos, incluindo insetos, fenômenos dependentes da luz como a diapausa são bem^{caracterizados,} mas faltam abordagens comparáveis em fungos. Essa lacuna restringe a comparação reprodutível de respostas fotoperiódicas entre cepas e condições experimentais.

A PPA se baseia em um estudo de 2004 que mediu a produção de protoperitécios ao longo do aumento do tempo de dia, desde escuridão constante até luz constante, na mutante banda (bd) (ras-1^bd), que tem sido usada em estudos^{circadianos 4,12}. Mudanças dependentes do fotoperíodo na produção de protoperitécios foram observadas nesse contexto. O fluxo de trabalho atual adapta e estende essa abordagem usando a cepa de referência FGSC 2489, que está associada ao sequenciamento do genoma inteiro e aos recursos^{knockout 13,14}. O ensaio quantifica o número médio de protoperitecos produzidos sob fotoperíodos definidos ao longo de uma semana como um indicador da resposta fotoperiódica. Essa abordagem padroniza condições de cultura, imagem e quantificação, permitindo comparações reprodutíveis entre condições experimentais e cepas. Avanços metodológicos chave incluem condições padronizadas de cultura baseadas em placas, parâmetros definidos de exposição ao fotoperíodo, imagens baseadas em quadrantes e um fluxo de trabalho de quantificação reproduzível.

Este protocolo quantifica as respostas fotoperiódicas em N. crassa medindo a formação de protoperitecios após exposição a ciclos definidos de luz-escuro. Para cada condição fotoperiódica, são usados quatro réplicas biológicas, cada uma consistindo em uma placa sintética de cruzamento (SC) inoculada independentemente. Quatro imagens são coletadas por placa e calculadas em média para gerar um único valor por réplica biológica para análise estatística. As placas são incubadas por sete dias sob fotoperíodos calibrados (por exemplo, ciclos de luz e escuridão de 12 h:12 h ou 8 h:16 h).

Um registrador de dados é colocado dentro da câmara de crescimento para registrar continuamente a intensidade da luz, temperatura e umidade, verificando assim condições ambientais estáveis. A intensidade da luz é mantida acima de 1.000 lux, à medida que níveis mais baixos reduzem a produção de protoperitecios. A iluminação excessiva é evitada para evitar aumentos na temperatura da câmara e efeitos térmicos de confusão. Após a incubação, os macroconídios são removidos suavemente com um papel toalha umedecido e saturado com 70% de etanol. Quatro quadrantes espaçados uniformemente no perímetro de cada placa são fotografados com ampliação de 40× usando um microscópio estereoscópico sob iluminação em campo claro. Protoperitecos são contados manualmente usando um pacote de processamento de imagens, e contagens médias por placa são usadas para comparações estatísticas entre fotoperíodos.

Protocolo

Os reagentes, softwares e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia e materiais

(Tempo estimado: 1–1,5 h de tempo ativo; resfriamento noturno opcional)

1. Prepare mídia de cruzamento sintético (SC)
   1. Prepare o meio SC: 0,2% de sacarose, 5 μg/L de biotina, 1,5% de agar e sais de Westergaard (pH 6,5 com 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoclave o meio. Deixe esfriar até 50–55 °C até atingir um estado de despejamento.
      ATENÇÃO: Use luvas resistentes ao calor ao remover frascos do autoclave.
2. Servir pratos
   1. Pipete 10 mL de meio fundido em placas de Petri de 60 mm usando uma pipeta descartável.
   2. Deixe as placas solidificarem em temperatura ambiente por 30–45 minutos.
   3. Guarde os pratos de cabeça para baixo a 4 °C por até 4 semanas.
      NOTA: Mantenha a hidratação dos pratos. Não armazene pratos por mais de 4 semanas a 4 °C.
3. Prepare cepas fúngicas
   1. Cultive cada cepa em pequenos tubos de ensaio de vidro contendo meio completo ou mínimo preparado conforme as instruções do manual^{do laboratório 15}.
   2. Incube os tubos em escuridão constante (DD) a 30 °C até que uma cobertura micelial visível se forme ao longo da superfície do tubo (tipicamente por 2–3 dias).
      ATENÇÃO: Manusear culturas fúngicas usando práticas microbiológicas padrão e trabalhar em um gabinete de biossegurança para minimizar a contaminação.

2. Inoculação das placas

(Tempo estimado: 15–30 min por conjunto de pratos)

1. Conídios fúngicos de transferência
   1. Inocule cada placa SC usando técnica estéril e um laço de inoculação.
   2. Coloque conídios no centro da placa para garantir um crescimento uniforme (Figura 1A). Os conídios aparecem como esporos claros e em pó cobrindo a superfície da colônia.
   3. Aplique aproximadamente 1–2 μL de suspensão conídica concentrada (ou um loop equivalente) para padronizar a inoculação entre placas.
2. Prepare as placas para incubação
   1. Feche as placas com segurança para evitar contaminação enquanto permite a troca de gás.
   2. Rotule cada placa com nome da cepa, data e condição do fotoperíodo.

3. Configuração de tratamento por fotoperíodo

(Tempo estimado: 10 minutos de montagem + incubação de 7 dias)

1. Calibre a câmara de crescimento
   1. Ajuste a temperatura da câmara para 25 °C.
   2. Ajuste a umidade para 50% (faixa aceitável: 40%–60%) para evitar a secagem da placa.
   3. Ciclos de fotoperíodo do programa: EQ (equinócio): 12 h luz / 12 h escuro e SDP (curto dia): 8 h claro / 16 h escuro
   4. Ajuste a intensidade da luz para >1.000 lux no nível da placa usando um fotômetro calibrado. Evite intensidades que aumentem a temperatura da câmara acima de 25 °C.
      NOTA: Certifique-se de que as luzes da câmara não superaqueçam o interior.
      ATENÇÃO: Não use parafilm ou sacos plásticos para manter a umidade, pois eles restringem a troca de gases e prejudicam o crescimento fúngico. Se o controle de umidade não estiver disponível, coloque um reservatório de água dentro da câmara.
2. Coloque as placas na câmara
   1. Organize os pratos uniformemente nas prateleiras para garantir uma exposição uniforme à luz.
   2. Coloque um registrador de dados dentro da câmara para monitorar continuamente temperatura e umidade e verificar condições ambientais estáveis.
3. Comece o ensaio
   1. Incube as placas sob o fotoperíodo programado por 7 dias sem perturbação.

4. Monitoramento e preparação de placas para imagem

(Tempo estimado: 15–20 min por placa)

1. Remova as placas da câmara
   1. Remova as placas após 7 dias de incubação.
   2. Inspecionar placas para crescimento de conídios e formação de protoperitécios.
2. Limpe as placas para maior visibilidade
   1. Remova conídios superficiais da tampa da placa e da superfície do ágar usando papel toalha rasgado (Figura 1B).
   2. Umedecida uma toalha de papel com 1–2 mL de etanol 70%. Dê suavemente uma tamponada na superfície da placa de 3 a 5 vezes para remover os conídios. Deixe as placas secarem ao ar por 1 a 3 minutos antes da imagem (Figura 1C).
      ATENÇÃO: O etanol é inflamável; Fique longe de fontes de calor.
      NOTA: Evite aplicar pressão excessiva. Não arraste a toalha pela superfície do ágar, pois isso pode danificar o meio ou perturbar o protoperitécio.

5. Imagem de protoperitecios

(Tempo estimado: 5 min por prato)

1. Prepare-se para a imagem
   1. Monte um microscópio com iluminação e ampliação consistentes (normalmente 40×).
   2. Certifique-se de que a superfície da placa esteja seca e livre de detritos.
2. Capturar imagens
   1. Imagine quatro quadrantes espaçados uniformemente no perímetro da placa usando ampliação consistente.
   2. Rotule cada imagem com deformação, condição do fotoperíodo, número da placa e posição do quadrante.
   3. Salve as imagens em um formato consistente (por exemplo, TIFF) para análise.

6. Quantificação e análise de dados

(Tempo estimado: 10–20 min por placa para contagem; 15–25 min para análise)

1. Conde protoperitecos
   1. Abra cada imagem em um pacote de processamento de imagem.
   2. Use o plugin Cell Counter para contar protoperitecias manualmente. Exclua bolhas, artefatos de borda e estruturas ambíguas. Conte os protoperitécios agrupados como unidades individuais e distinguíveis.
   3. Registre as contagens para cada quadrante e calcule a média por placa.
2. Analisar dados
   1. Importar dados quantificados para um software de análise estatística.
   2. Realize análise estatística usando o teste t de Welch para comparações mostradas na Figura 2.
   3. Gerar gráficos comparando tratamentos de fotoperíodo, cepas ou replicações.

Resultados

Após a inoculação com a cepa selvagem, os conídios cobriram a superfície do SC em 36–48 horas. Após 7 dias de exposição ao fotoperíodo, uma camada densa de conídeos se formou e foi removida com um papel toalha umedecido saturado com 70% de etanol (Figura 1). Esse passo expôs os protoperitécios subjacentes sem perturbar sua estrutura. Na microscopia, os protoperitecios apareciam como estruturas circulares escuras distribuídas pela superfície da placa. Essas estruturas apresentavam uma morfolo...

Discussão

O objetivo da PPA é usar o desenvolvimento sexual em fungos como um indicador para determinar se um organismo percebe um fotoperíodo específico. Ao quantificar o número médio de protoperitecos produzidos sob diferentes ciclos de luz, respostas fotoperiódicas podem ser avaliadas e comparadas entre condições. Consistente com observações^{anteriores 4,16}, N. crassa apresenta maior produção de protoperitécios sob fotoperíodos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	BD	90000-786	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Alcohol burner flame	Wards	470346-104	Para esterilização de alça de inoculação
Ammonium iron sulfate hexahydrate	Supelco	FX0245-1	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Ammonium nitrate (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Para Meio Mínimo
Autoclave	VWR International	76683-456	Para esterilização de vidraria e meio
Biological Safety Cabinet	ThermoFischer Scientific	1323TS	Para reduzir a contaminação das placas e do laboratório.
Biotin	VWR	97061-444	Para Meio de Cruzamento Sintético
Boric acid (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Calcium chloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Para Meio de Cruzamento Sintético
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Para Meio Mínimo
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Usado para remover conídios da superfície da placa e esterilizar alça de inoculação
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Para análise de imagens/contagem
Gloves	SW Safety Solutions	76382-944	Para segurança
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Para realizar testes estatísticos e criar figuras
Growth Chamber	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Programável para ciclos de fotoperíodo
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Para registro de intensidade de luz e temperatura
Inoculation loop	VWR International	10806-354	Para transferência de material fúngico para placas de petri
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Para imagens
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Cepa fúngica
Paper Towels	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	Para derramar meio
Permanent Marker	Sharpie	30072	Para rotulagem de placas
Petri Dishes	VWR International	25384-164	Para placas de Meio de Cruzamento Sintético
Pipettes	VWR International	75816-090	Para derramar meio
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Potassium nitrate (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Para Meio de Cruzamento Sintético
Small Disposable Glass Test Tubes	VWR International	470211-698	Para crescimento inicial de cepas fúngicas
Sodium chloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Para Meio de Cruzamento Sintético
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Para Meio Mínimo
Sodium hydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Para Meio de Cruzamento Sintético
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo