O Ensaio de Protoperitecias quantifica respostas fotoperiódicas em Neurospora crassa medindo a formação de protoperitécios sob ciclos claro-escuro definidos. Esse método baseado em placas oferece uma abordagem simples e escalável para comparar respostas de desenvolvimento dependentes do fotoperíodo entre condições experimentais.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ensaio de Imagem Baseado em Placas para Quantificar Respostas Fotoperiódicas em Neurospora crassa Usando Desenvolvimento de Protoperitecias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurospora crassa é um organismo-modelo bem estabelecido para estudar o tempo biológico e o desenvolvimento regulado pela luz. O Ensaio de Protoperitecos (PPA) é um método de imagem baseado em placas para quantificar respostas fotoperiódicas medindo a formação de protoperitecios como resultado do desenvolvimento. O objetivo desse protocolo é fornecer um fluxo de trabalho reprodutível e escalável para avaliar como ciclos claro-escuro definidos influenciam o desenvolvimento sexual fúngico. Neste ensaio, culturas fúngicas são cultivadas em meio sintético de cruzamento sob condições controladas de fotoperíodo, seguidas pela remoção padronizada de conídios superficiais para melhorar a visualização. Os protoperitécios são quantificados por contagem manual baseada em imagens, e contagens médias por placa são usadas para comparações estatísticas entre condições de fotoperíodo. Diferentemente de abordagens anteriores, a PPA integra condições padronizadas de cultura, exposição controlada ao fotoperíodo e imagens baseadas em quadrantes para permitir comparações quantitativas reprodutíveis entre cepas. Esse fluxo de trabalho vai além de um protocolo básico ao estabelecer uma estrutura consistente e escalável para medir a produção de desenvolvimento dependente do fotoperíodo sob condições experimentais definidas. O método leva aproximadamente uma semana desde a inoculação até a análise e pode ser aplicado em múltiplas cepas sob condições ambientais definidas. O PPA oferece uma plataforma simples e acessível para análise comparativa do desenvolvimento dependente do fotoperíodo em fungos sob condições laboratoriais controladas.
Introdução
O ensaio de protoperitecos (PPA) quantifica as respostas fotoperiódicas no fungo Neurospora crassa. Muitos organismos medem o comprimento do dia e da noite para coordenar processos biológicos em um fenômeno conhecido comofotoperiodismo 1,2,3,4,5,6,7,8. Neste ensaio, o desenvolvimento da estrutura sexual feminina, o protoperitécio, serve como um proxy mensurável ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os reagentes, softwares e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de mídia e materiais
(Tempo estimado: 1–1,5 h de tempo ativo; resfriamento noturno opcional)
- Prepare mídia de cruzamento sintético (SC)
- Prepare o meio SC: 0,2% de sacarose, 5 μg/L de biotina, 1,5% de agar e sais de Westergaard (pH 6,5 com 1 N NaOH)15.
- Autoclave o meio. Deixe esfriar até 50–55 °C até atingir um estado de despejamento.
ATENÇÃO: Use luvas resistentes ao ca....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Após a inoculação com a cepa selvagem, os conídios cobriram a superfície do SC em 36–48 horas. Após 7 dias de exposição ao fotoperíodo, uma camada densa de conídeos se formou e foi removida com um papel toalha umedecido saturado com 70% de etanol (Figura 1). Esse passo expôs os protoperitécios subjacentes sem perturbar sua estrutura. Na microscopia, os protoperitecios apareciam como estruturas circulares escuras distribuídas pela superfície da placa. Essas estruturas apresentavam uma morfolo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O objetivo da PPA é usar o desenvolvimento sexual em fungos como um indicador para determinar se um organismo percebe um fotoperíodo específico. Ao quantificar o número médio de protoperitecos produzidos sob diferentes ciclos de luz, respostas fotoperiódicas podem ser avaliadas e comparadas entre condições. Consistente com observaçõesanteriores 4,16, N. crassa apresenta maior produção de protoperitécios sob fotoperíodos .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung e Morgan Bartleson pelo apoio, assistência e contribuições para este projeto. Os autores também reconhecem o Departamento de Biologia da Rutgers University–Camden e o Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) por fornecerem apoio institucional, instalações de pesquisa e recursos.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | Para esterilização de alça de inoculação |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Para Meio Mínimo |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | Para esterilização de vidraria e meio |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Para reduzir a contaminação das placas e do laboratório. |
| Biotin | VWR | 97061-444 | Para Meio de Cruzamento Sintético |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Para Meio de Cruzamento Sintético |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Para Meio Mínimo |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Usado para remover conídios da superfície da placa e esterilizar alça de inoculação |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Para análise de imagens/contagem |
| Gloves | SW Safety Solutions | 76382-944 | Para segurança |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | Para realizar testes estatísticos e criar figuras |
| Growth Chamber | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Programável para ciclos de fotoperíodo |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Para registro de intensidade de luz e temperatura |
| Inoculation loop | VWR International | 10806-354 | Para transferência de material fúngico para placas de petri |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Para imagens |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Cepa fúngica |
| Paper Towels | Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex | 6666114 | Para derramar meio |
| Permanent Marker | Sharpie | 30072 | Para rotulagem de placas |
| Petri Dishes | VWR International | 25384-164 | Para placas de Meio de Cruzamento Sintético |
| Pipettes | VWR International | 75816-090 | Para derramar meio |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Potassium nitrate (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Para Meio de Cruzamento Sintético |
| Small Disposable Glass Test Tubes | VWR International | 470211-698 | Para crescimento inicial de cepas fúngicas |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Para Meio de Cruzamento Sintético |
| Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Para Meio Mínimo |
| Sodium hydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Para Meio de Cruzamento Sintético |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Para Meio de Cruzamento Sintético/Meio Mínimo |
Referências
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
