A Classe Comum de Variantes Genéticas Associadas à Vasculite em Interferonopatias Tipo I Dentro de uma Coorte Pediátrica

Resumo

O sequenciamento do exoma completo em 1.204 pacientes pediátricos com suspeita de doença autoinflamatória identificou variantes associadas à interferonopatia em 132 casos, incluindo 79 mutações novas. A maioria era heterozigótica e ligada a fenótipos vasculíticos. Esses achados ressaltam o valor diagnóstico dos testes genéticos e o papel central da sinalização desregulada do interferon tipo I na vasculite pediátrica.

Resumo

A vasculite pediátrica é tradicionalmente diagnosticada por avaliação histopatológica; no entanto, cada vez mais, abordagens menos invasivas baseadas em imagem são utilizadas na prática clínica. Apesar desses avanços, a identificação de uma etiologia monogênica subjacente continua essencial para entender os mecanismos da doença, prever o prognóstico e orientar estratégias terapêuticas direcionadas. As interferonopatias tipo I compreendem um grupo heterogêneo de distúrbios imunológicos mediados caracterizados por sinalização constitutiva de interferon e manifestações vasculíticas ou vasculopáticas frequentes. A ativação persistente das vias de detecção de ácidos nucleicos e a homeostase intracelular comprometida contribuem para a disfunção endotelial e inflamação vascular crônica.

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho abrangente de análise genética para detectar variantes associadas à vasculite em genes relacionados à interferonopatia dentro de uma coorte de doenças auto-inflamatórias pediátricas. O sequenciamento do exoma completo foi realizado em 1.204 pacientes com suspeita de distúrbios auto-inflamatórios. Variantes que afetam regiões codificantes e locais de emenda foram analisadas usando um pipeline bioinformático baseado nas diretrizes do American College of Medical Genetics and Genomics, integrando técnicas de filtragem estatística e processamento de sinais inspiradas em transformadas discretas de Fourier (DFT) e distribuições estatísticas para melhorar a priorização e interpretação de variantes.

Variantes associadas à interferonopatia foram identificadas em 132 pacientes pediátricos avaliados por meio de um banco de dados de clínica de reumatologia. No total, foram detectadas 92 variantes únicas, incluindo 13 variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas previamente relatadas e 79 variantes novas que não estavam presentes em bancos de dados públicos até fevereiro de 2026. As manifestações clínicas incluíam principalmente febre recorrente, manifestações vasculíticas e apresentações autoinflamatórias complexas.

As variantes envolveram genes associados à sinalização desregulada do interferon e ativação imune inata, incluindo vias ligadas à ativação do STING, metabolismo dos ácidos nucleicos e disfunção do tráfego intracelular. Esse fluxo de trabalho interdisciplinar demonstra a potencial utilidade diagnóstica da análise genômica na vasculite pediátrica e destaca a importância da sinalização sustentada do interferon na lesão vascular e na patogênese de doenças autoinflamatórias.

Introdução

A vasculite pediátrica tradicionalmente é diagnosticada por meio de avaliação histopatológica, que permanece como o padrão ouro. No entanto, estratégias diagnósticas recentes têm favorecido cada vez mais abordagens menos invasivas, especialmente modalidades baseadas em imagem. Apesar desses avanços, identificar uma etiologia monogênica subjacente é de extrema importância na vasculite infantil, pois fornece insights essenciais sobre mecanismos da doença, prognóstico e oportunidades para terapias^{direcionadas 1,2}.

A vasculite infantil deve ser suspeita em crianças que apresentam inflamação sistêmica e envolvimento multiorgânico. A coleta completa de anamnese histórico, exame físico completo, exames laboratoriais, exames de imagem e, em alguns casos, biópsias de tecido são necessários para estabelecer o diagnóstico e excluir imitadores. A detecção e o tratamento precoces são essenciais porque doenças não tratadas podem levar a complicações potencialmente fatais ou sequelas de longo^{prazo 1}.

As interferonopatias tipo I incluem um espectro diversificado de distúrbios monogênicos e complexos mediados imunos, marcados por ativação sustentada da via do interferon tipo I e características vasculíticas ou vasculopáticas^{recorrentes 3,4}. A detecção desregulada de ácidos nucleicos e a homeostase intracelular comprometida são mecanismos patogênicos centrais que ligam a produção excessiva sustentada de interferon à inflamação e lesões vasculares. Mutações de ganho de função em TMEM173 (STING1) causam vasculopatia associada à STING com início na infância (SAVI), enquanto mutações COPA autossômicas dominantes interrompem o tráfego endoplasmático do retículo de Golgi, levando a uma ativação aberrante da STING e a um fenótipo^{vasculítico 3-5}. Interferonopatias adicionais causadas por defeitos em genes do metabolismo dos ácidos nucleicos (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 e IFIH1) enfatizam ainda mais a ligação mecanicista entre a desregulação do interferon e a patologia^{vascular 3} (ver Figura 1).

Figura 1. Arquitetura patogênica detalhada das interferonopatias tipo I que impulsionam disfunção endotelial e lesão microvascular em coortes pediátricas. (Esquerda) Contexto sistêmico da interferonopatia pediátrica tipo I: discriminação defeituosa entre si e não-auto-indivíduo e detecção aberrante de ácidos nucleicos do hospedeiro desencadeiam autoinflamação sistêmica. Fenótipos clínicos são marcados por vasculopatia cutânea de início precoce e envolvimento sistêmico, frequentemente apresentando lesões cutâneas semelhantes a sabirões. (Meio) Cascata mecanicista de defeitos genéticos para desregulação sistêmica: mutações de perda de função em enzimas de eliminação de ácidos nucleicos (por exemplo, DNASE1, TREX1) levam ao acúmulo aberrante de DNA e RNA endógenos dentro do citoplasma. Simultaneamente, mutações de ganho de função em sensores como o STING1 impulsionam a ativação constitutiva da via cGAS-STING independente dos gatilhos virais. Essa detecção patogênica intracitoplasmática hiperativa fatores reguladores de interferon, resultando na síntese contínua dos interferons do tipo I (IFN-α/β). A produção crônica de citocinas cria um circuito de amplificação sistêmica auto-sustentável via receptores IFNAR1/2, agravado por mecanismos de eliminação comprometidos e controles de feedback positivo. (Direita) Desfecho patológico: a ligação persistente do IFN-α/β circulante ao complexo receptor das células endoteliais induz ativação sustentada do JAK-STAT. Essa constante perturbação homeostática provoca estresse endotelial contínuo e prejudica os mecanismos fisiológicos de vasorelaxamento. No nível capilar, esse estado hiper-inflamatório causa lesão direta das células endoteliais, espessamento significativo da parede vascular e trombose microvascular luminal, culminando em isquemia tecidular severa e microvasculopatia necrosante sem vias autoimunes mediadas por autoanticorpos. Abreviações: cGAS-STING = estimulador cíclico GMP-AMP sintase dos genes do interferon; DNASE1 = desoxirribonuclease 1; GoF = ganho de função; IFN = interferon; IFNAR = receptor de interferon alfa/beta; IRF = fator regulador de interferon; JAK-STAT = Transdutor do sinal da quinase Janus e ativador da transcrição; STING1 = estimulador da resposta ao interferon, interator cGAMP 1; TREX1 = três exonuclease de reparação principal 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Essa abordagem foi desenvolvida para detectar variantes genéticas associadas à interferonopatia em coortes autoinflamatórias pediátricas, já que métodos convencionais podem enfrentar desafios analíticos na priorização precoce de mutações raras, e a heterogeneidade dos neutrófilos desempenha um papel crítico na previsão do risco de^{recaída 6}. Na literatura, o papel da desregulação da sinalização do interferon na vasculite de pequenos vasculices foi elucidado por meio de análises de célula única, destacando a vantagem do sequenciamento do exoma inteiro (WES) para o diagnóstico precoce em coortes^{pediátricas 6}.

As síndromes autoinflamatórias monogênicas podem se apresentar com vasculite ou manifestações semelhantes à vasculite. Por exemplo, o SAVI pode imitar vasculite de vasculite de vasos pequenos^{ou médios 7}. De forma semelhante, a artrite idiopática juvenil (JIA) representa um grupo heterogêneo de doenças inflamatórias de início infantil que podem persistir até a idade adulta e estão associadas à desregulação semelhante à interferonopatia, enfatizando a necessidade de análise genética em coortes^{pediátricas 8}.

Interferonopatias tipo I são erros inatos mendelianos de imunidade caracterizados pela ativação de sensores antivirais acionados por ácidos nucleicos derivados do hospedeiro, representando uma falha na discriminação entre si e não^{em si 3,4}. Esses distúrbios são definidos pela regulação positiva da sinalização de interferon tipo I, e manifestações dermatológicas frequentemente fornecem pistas diagnósticas importantes. A SAVI está associada a mutações de ganho de função na TMEM173 e apresenta com vasculopatia cutânea de início precoce e inflamação pulmonar⁹. A mutação p.V155M é a variante¹⁰ mais frequentemente relatada. A SAVI é uma doença auto-inflamatória rara associada a mutações STING1, caracterizada por doença pulmonar intersticial precoce (ILD) e lesões cutâneas, podendo clinicamente imitar o lúpus eritematoso sistêmico (LES)¹¹. A sinalização desregulada do interferon tipo I também foi implicada na vasculite associada a anticorpos citoplasmáticos anti-neutrófilos (ANCA). No AAV, uma assinatura de interferon tipo I é predominante na poliangiíte microscópica/vasculite associada à mieloperoxidase-ANCA (MPA/MPO-AAV) e está associada ao prognóstico renal, destacando a contribuição de variantes raras para a desregulação do^{interferon 12}.

As síndromes autoinflamatórias monogênicas podem se apresentar com vasculite ou manifestações semelhantes à vasculite. Por exemplo, o SAVI pode imitar vasculite de vasculite de vasos pequenos^{ou médios 7}. Anteriormente, a maior coorte global de pacientes portadores de mutações ativadoras STING1 foi descrita, fornecendo uma caracterização fenotípica clínica e imunológica ampliada do SAVI¹³. Nas últimas duas décadas, houve avanços notáveis na compreensão do reconhecimento de patógenos tanto por células hematopoiéticas quanto não hematopoiéticas. Componentes microbianos são detectados por receptores codificados pela linhagem germinativa, um passo fundamental para iniciar essa^{resposta 14}. Em 2006, foi demonstrado que a transfecção de DNA em vários tipos celulares induz regulação para cima dos interferons do tipo I de forma independente do receptor tipo toll (TLR). Nesse contexto, STING, uma proteína transmembrana localizada no retículo endoplasmático, foi identificada em 2008 como um mediador-chave das respostas do interferon tipo I ao DNA^{sintético e viral 13}. Mutações de ganho de função em STING1 levam a uma interferonopatia tipo I conhecida como SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴. Essa doença grave é caracterizada de forma variável por inflamação sistêmica de início precoce, vasculopatia cutânea e doença pulmonar intersticial (ILD)¹⁴. A SAVI é rara, 52 pacientes de 37 famílias foram relatados até o momento, e a maioria dos casos surge de novo, embora a herança autossômica dominante também tenha sido documentada. Anteriormente, a maior coorte global de pacientes portadores de mutações STING1 ativadoras foi descrita, fornecendo uma caracterização fenotípica clínica e imunológica ampliada do SAVI ^9,10,11˒¹⁴.

Esse protocolo foi desenvolvido para possibilitar a detecção precoce de variantes genéticas associadas à interferonopatia por meio de análise genética baseada em WES em pacientes pediátricos apresentando características autoinflamatórias, já que as abordagens convencionais frequentemente são insuficientes para identificar mutações raras e podem perder oportunidades de intervenção precoce. A literatura demonstra que o papel da regulação para cima do interferon em fenótipos semelhantes à vasculite foi esclarecido por meio do estudo de distúrbios mendelianos, destacando ainda mais a vantagem do WES para a detecção de variantes^{raras 4,7,12}.

O objetivo principal desse método é integrar princípios de processamento de sinais baseados em física com modelagem computacional biofísica simplificada para apoiar a detecção de variantes em dados WES para interferonopatias do tipo I, enquanto interpreta os efeitos a jusante nas vias de sinalização do interferon, particularmente a cascata do transdutor de sinal de sinal-quinase Janus e ativador de transcrição (JAK-STAT). Essa abordagem exploratória visa complementar a análise de regiões genômicas frequentemente afetadas por ruído de sequenciamento e cobertura não uniforme de distúrbios imunomediados, nos quais a ativação desregulada do interferon impulsiona fenótipos vasculíticos. Fluxos de trabalho bioinformáticos padrão normalmente focam em métricas de qualidade padrão, o que pode deixar espaço para filtragem adicional e de suporte ao identificar variantes em regiões complexas em genes como STING1 ou TREX1. Ao aplicar técnicas de processamento de sinais inspiradas em transformadas de Fourier discretas (DFT) e distribuições estatísticas, esse método extrai características genômicas subjacentes de sequências nucleotídicas, mapeando bases (A, T, C, G) para indicadores binários para análise de padrões^{de mutações 15}. Além disso, a modelagem biofísica das vias do interferon incorpora o comportamento de limiar e amplificação cumulativa do sinal para avaliar como variantes genéticas podem sustentar disfunção endotelial, com foco no papel da via JAK-STAT na transmissão de sinais de interferon tipo I (IFN-α/β).

Esta aplicação exploratória foi projetada para estudar perfis de alinhamento em regiões de baixa cobertura. Enquanto ferramentas computacionais padrão fornecem filtragem primária de variantes, o modelo de suporte investiga se a avaliação baseada em SNR pode oferecer um gate qualitativo secundário de variantes codificantes de nucleotídeo único (SNVs) afetadas pela distribuição de leitura não uniforme. Essa abordagem baseada em física utiliza otimização SNR para avaliar a qualidade do genótipo e as pequenas razões de leitura. Na literatura mais ampla, modelagens estocásticas semelhantes revelaram respostas graduadas em vias JAK-STAT em vez de dinâmicas tudo ou nenhum, permitindo uma melhor previsão da superprodução de^{interferon 16}. A via JAK-STAT, ativada por interferons tipo I (IFNs) que se ligam aos receptores IFNAR1/IFNAR2, envolve quinases Janus (JAK1, TYK2) fosforilando STAT1 e STAT2, formando o complexo ISGF3 com IRF9 para translocação nuclear e transcrição^{ISG 17}. Isso pode ser modelado usando equações diferenciais ordinárias (EDOs) para indução IFN-β:

onde os parâmetros listados representam a taxa de fosforilação, desfosforilação e realimentação negativa via SOCS1, destacando a amplificação dependente do^{limiar 17}. Detalhes adicionais incluem a formação do homodímero STAT1 para sinalização de IFN-γ, mas em interferonopatias do tipo I, a ativação sustentada leva a uma expressão excessiva de ISG. Simulações estocásticas ainda explicam a variabilidade, usando algoritmos de Gillespie para modelar ruído na ligação receptor-ligante e na importação nuclear, revelando heterogeneidade célula para célula nas respostas^{IFN 16}. Esse método é particularmente adequado para pesquisadores que investigam vasculite autoinflamatória, pois fornece uma estrutura quantitativa que liga variantes à desregulação das vias, como por meio de EDOs estendidas que incorporam efeitos paracrinos:

onde os parâmetros listados representam a taxa de produção, degradação e reforço^{paracrino 18}. Usuários com acesso a dados de sequenciamento de alta taxa e recursos computacionais podem aplicar essa abordagem para priorizar variantes candidatas e explorar possíveis efeitos de caminho.

Este estudo foi planejado utilizando uma abordagem multidisciplinar de reumatologia e genética para identificar variantes associadas à vasculite em genes relacionados à interferonopatia em uma grande coorte pediátrica que apresenta características auto-inflamatórias, utilizando um protocolo de sequenciamento clínico do exoma (CES)/WES devido a dificuldades na classificação da vasculite e limitações das abordagens tradicionais. Além disso, o estudo teve como objetivo enfatizar o valor diagnóstico da avaliação genética na vasculite infantil.

A Classificação de Vasculite de Chapel Hill de 2012 não inclui vasculite autoinflamatória^{monogênica 19}. Este estudo teve como objetivo determinar a frequência das variantes relacionadas à interferonopatia detectadas em um grupo de pacientes pediátricos com sintomas auto-inflamatórios, contribuir para a expansão do banco de dados de doenças raras e enfatizar a importância da avaliação genética na vasculite pediátrica.

Protocolo

Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Ege. Todas as amostras de sangue periférico foram coletadas após obtenção de consentimento informado por escrito dos pacientes ou de seus tutores legais, de acordo com a Declaração de Helsinque. Este estudo retrospectivo monocêntrico foi projetado para avaliar a frequência de variantes associadas à interferonopatia entre pacientes submetidos a análise genética para suspeita de doença auto-inflamatória e para investigar sua relação com a vasculite. Entre 2022 e 2025, foram incluídas amostras de sangue periférico enviadas ao Laboratório de Medicina Molecular da Universidade Ege com diagnóstico preliminar de doença autoinflamatória. Um total de 1.204 amostras passou por análise genética. O CES/WES foi usado como uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) que mirava exons e sequências intrônicas adjacentes. As variantes foram classificadas usando critérios da ACMG e análise bioinformática. Variantes benignas e potencialmente benignas foram excluídas. Entre eles, 132 casos pediátricos com variantes associadas à interferonopatia identificadas que atenderam aos critérios de inclusão foram incluídos na coorte final do estudo.

Dentro dessa coorte pediátrica, os dados clínicos foram retirados de um banco de dados de clínica de reumatologia. No total, 92 variantes genéticas únicas foram identificadas entre os 132 pacientes, incluindo 13 variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas previamente relatadas documentadas em bancos de dados públicos de variantes (por exemplo, ClinVar) e 79 variantes novas que estavam ausentes dos bancos de dados públicos em fevereiro de 2026. A maioria das variantes era heterozigótica e associada a fenótipos semelhantes ao CAPS ou apresentações complexas de vasculite autoinflamatória. A WES utilizou uma abordagem NGS direcionada a regiões codificadoras de proteínas (exons) e sequências intrônicas adjacentes para detectar variantes do sítio da splice e regulatórias. Embora o WES cubra aproximadamente 1%–2% do genoma humano, ele captura quase 85% das mutações conhecidas que causam doenças, tornando-se uma ferramenta altamente eficiente para a detecção de variantes raras.

O fluxo de trabalho laboratorial incluiu extração genômica de DNA do sangue periférico, fragmentação do DNA, preparação de bibliotecas ligadas por adaptador e enriquecimento do exoma usando sondas de captura baseadas em hibridização via pulldown de biotina-estreptavidina. O sequenciamento de extremidade pareada de alta taxa foi realizado em uma plataforma de sequenciamento nanoball de DNA, alcançando uma profundidade média de cobertura de 100–200x para garantir a detecção confiável de variantes. A análise bioinformática envolveu alinhamento ao genoma de referência, chamada de variantes e anotação usando bancos de dados de variantes curados, com classificação de variantes realizada de acordo com as diretrizes do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). As variantes foram categorizadas como previamente reportadas ou novas. Variantes selecionadas foram validadas pelo sequenciamento Sanger.

Além dos pipelines bioinformáticos padrão, princípios de processamento de sinais baseados em física e modelagem computacional simplificada foram aplicados para avaliar a profundidade do sequenciamento, uniformidade da cobertura e características sinal-ruído, fornecendo assim uma camada exploratória e suplementar para analisar a profundidade bruta de sequenciamento e a cobertura regional. Além disso, conceitos de modelagem biofísica foram empregados para avaliar o impacto cumulativo das variantes genéticas associadas à vasculite.

Esse arcabouço interdisciplinar serve como um modelo preliminar de laboratório para estudar características de filtragem variante em um contexto de pesquisa exploratória, especialmente para orientar estratégias terapêuticas anti-interferon. As limitações incluem a redução da sensibilidade para variantes mosaic de baixo nível e a exigência de validação funcional de descobertas inovadoras. As aplicações potenciais incluem diagnóstico precoce de vasculite pediátrica, tomada de decisão terapêutica personalizada e expansão de bancos de dados de variantes relevantes para imunologia, reumatologia e medicina vascular.

Fragmentação do DNA

Vinte microlitros de DNA diluído foram transferidos para novos tubos estéreis de PCR. A cada tubo, foram adicionados 2 μL de tampão de fragmentação/adenilação e 3 μL de mistura enzimática de fragmentação/adenilação; o volume total de reação foi de 25 μL. A mistura era misturada suavemente, centrifugada brevemente, e o programa de fragmentação era executado no ciclador térmico. Imediatamente após a conclusão, os tubos foram brevemente centrifugados e colocados no gelo. O resultado esperado foi um tamanho médio de fragmentos de DNA de 200–300 pb.

Ligação de adaptadores

A cada produto de fragmentação, foram adicionados 2,5 μL de adaptador de sequenciamento, seguidos por 10 μL de mistura master de ligação (sem vórtice). A mistura foi pipetada suavemente para garantir homogeneidade, centrifugada brevemente e incubada a 20 °C por 15 minutos com a tampa do ciclador térmico aberta. Após a incubação, os tubos eram brevemente centrifugados e mantidos no gelo.

Purificação à base de contas

Trinta microlitros de esferas magnéticas foram adicionados a cada amostra e misturados cuidadosamente por pipeteamento até obter uma suspensão homogênea. A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 5 minutos, e os tubos foram então colocados em um suporte magnético por 3 minutos. Depois que o sobrenadante foi removido, ele foi cuidadosamente removido. O pellet foi lavado duas vezes com 100 μL de etanol 80%, e o etanol residual foi removido após a lavagem final. As contas foram então secadas ao ar no suporte magnético por até 5 minutos. Nove microlitros de água sem nuclease foram adicionados, o pellet foi ressuspenso por pipeteamento e incubado por 2 minutos em temperatura ambiente. Após separação magnética por 3 minutos, 7,5 μL de sobrenadante foram transferidos para um novo tubo PCR marcado.

Amplificação por PCR

Primers de transcrição in vitro (TVI) foram diluídos (20 μL de estoque de primer + 80 μL de água livre de nuclease). Para a reação PCR (volume total 17,5 μL), foram adicionados 2,5 μL do primer IVT 1, 2,5 μL do primer 2 da TVI e 12,5 μL da mistura master de amplificação da biblioteca. A mistura era suavemente pipetada e o programa PCR-3 era realizado.

Purificação pós-PCR

Vinte e cinco microlitros de esferas magnéticas foram adicionados a cada produto de PCR. Após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente e separação magnética, as esferas foram lavadas duas vezes com 100 μL de 80% de etanol. Após secagem ao ar por até 5 minutos, foram adicionados 11 μL de água sem nuclease. Dez microlitros de sobrenadante foram transferidos para um novo tubo. A concentração da biblioteca foi medida; Alvo: >25 ng/μL.

Agrupamento e hibridização (amostras por poço)

As bibliotecas foram agrupadas com oito amostras de pacientes por grupo (93,75 ng por amostra, total de 750 ng). O volume foi ajustado para 12,5 μL com água sem nuclease, se necessário. A mistura de hibridização foi pré-incubada a 65 °C por 15 minutos. Solução bloqueante, oligonucleotídeos bloqueantes universais, sonda de captura de exoma, água livre de nuclease e potenciador de hibridização foram adicionados sequencialmente. O programa de hibridização de 16 horas foi iniciado (18:00–10:00).

Captura de alvos híbridos em contas de estreptavidina

As contas de estreptavidina foram lavadas três vezes com tampão de ligação. Após a hibridização de 16 horas, a mistura foi adicionada às esferas e incubada a 25 °C por 30 minutos, com mistura suave a cada 5 minutos. A lavagem foi realizada com o tampão de lavagem de captura 1 em temperatura ambiente, seguida de três lavagens com o tampão de lavagem de captura pré-aquecido (48 °C), incluindo incubação a 48 °C. Após a lavagem final, o pellet foi ressuspenso em 23 μL de água livre de nuclease.

Preparação de DNA de fita simples (ssDNA)

Vinte e quatro microlitros de tampão TE foram adicionados, e a mistura foi desnaturada a 95 °C por 3 minutos, sendo imediatamente colocada no gelo. Uma mistura master contendo buffer de ligação com talas e ligase rápida de DNA foi adicionada, e o programa SS-2 (37 °C, 30 min) foi executado para circularizar o DNA de fita simples. Foram adicionados buffers de digestão e mistura de enzimas digerivas, e o programa SS-3 (37 °C, 30 min) foi executado. Depois, 3,75 μL de buffer de paragem de digestão foram adicionados. Oitenta e cinco microlitros de esferas magnéticas foram adicionados, seguidos pela purificação padrão das contas. Quinze microlitros de sobrenadante foram transferidos para um novo tubo; a concentração esperada era de 0,8–2 ng/μL.

Preparação de nanobola de DNA (DNB)

Os produtos de ssDNA foram usados para a formação de DNB. Foram adicionados buffers de formação DNB, buffer TE de baixo EDTA e misturas enzimáticas DNB 1 e 2. Os programas DNB-1 e DNB-2 eram executados sequencialmente. Após a conclusão, 20 μL de buffer DNB de parada de reação foram adicionados e misturados suavemente (5–8x) usando pontas de pipeta de grande diâmetro; A concentração esperada era de 8–40 ng. Os DNBs preparados foram carregados na plataforma de sequenciamento de nanobolas de DNA para sequenciamento de alta velocidade.

Sequenciamento, processamento de dados e análise de sinais

As leituras de sequenciamento bruto eram controladas por qualidade usando FastQC (v0.11.9) e fastp (v0.23.1). O limiar da relação sinal-ruído (SNR) de 20 dB foi otimizado usando análise da curva de característica operacional do receptor (ROC) contra um conjunto de dados de referência de variantes autoinflamatórias conhecidas, equilibrando uma taxa de falsa descoberta (FDR) de <1% com uma sensibilidade alvo de >95% para variantes de baixa frequência; leituras abaixo desse limite de 20 dB foram descartadas. O alinhamento com o genoma de referência do Genome Reference Consortium Human Build 38 (GRCh38) e a chamada inicial de variantes foram realizados usando o BWA-MEM (v0.7.17) e o Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6).

Para as etapas de processamento de sinais baseadas em física, as sequências de nucleotídeos foram convertidas em sinais numéricos binários (0 representando purinas; 1 representando pirimidinas). Para calcular a DFT, o sinal binário foi processado com uma janela deslizante de N = 512 pares de bases e uma sobreposição de 50% (tamanho de passo de 256 bp) para manter resolução genômica localizada. A DFT foi definida como:

Para filtrar artefatos de sequenciamento de alta frequência sem suavizar excessivamente as variantes verdadeiras de nucleotídeo único (SNVs), que se manifestam como transições localizadas nítidas e de alta frequência, um filtro digital passa-baixa foi calibrado programaticamente. A frequência de corte (fc) normalizada ótima foi determinada iterativamente ao varrer a faixa de 0,05–0,25 ciclos/base. O algoritmo de otimização selecionou fc = 0,15 ciclos/base, definido como o ponto de inflexão onde o espectro de potência do sinal reteve ≥85% da variância total das variantes conhecidas de controle verdadeiro-positivo, enquanto eliminava ruído técnico de fundo. O filtragem baseada em DFT foi aplicada usando scripts personalizados escritos em Python (v3.9), utilizando especificamente as bibliotecas NumPy (v1.23.0) e SciPy (v1.9.1), para reduzir ruídos de alta frequência enquanto preservava as características espectrais associadas à mutação. Os parâmetros de filtragem eram calibrados iterativamente de forma programática para evitar o excesso de suavização de sinais variantes raros. O fluxo de trabalho integrado para processamento de sinais e modelagem biofísica está resumido na Figura 2.

Modelagem biofísica e estocástica da sinalização de interferon

Para investigar as consequências funcionais das variantes identificadas, a dinâmica das vias JAK–STAT foi modelada usando equações diferenciais ordinárias (EDOs) definidas como:

Simulações determinísticas de ODE eram executadas usando COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) e corroboradas com scripts Python personalizados usando o módulo scipy.integrate.solve_ivp. Condições iniciais biologicamente realistas foram estabelecidas, e análises de sensibilidade foram realizadas sobre constantes de taxa de amplificação usando o SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5). Cinéticas de sinalização IFN-α mediadas por TYK2 foram incorporadas para simular a amplificação STAT2 impulsionada pelo ganho de função.

Efeitos estocásticos foram introduzidos usando uma formulação de Langevin:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Além disso, simulações estocásticas de Gillespie foram conduzidas utilizando a biblioteca Python GillesPy2 (v1.7.0) para modelar o bursting transcricional e a ativação heterogênea do gene estimulado por interferon induzido por IFN-β (ISG). Funções de atraso distribuídas representadas por formulações de kernel gama foram implementadas em Python usando integração numérica para simular mecanismos de retroalimentação transcricional atrasada. Todos os pipelines computacionais, incluindo filtragem de sinais e modelagem matemática, eram executados em um ambiente de computação de alto desempenho (HPC) baseado em Linux.

Figura 2. Estrutura integrada para processamento de sinais e modelagem biofísica da sinalização JAK-STAT. 1: Estágio de processamento de sinais: mapeamento binário de sequências de nucleotídeos (purinas = 0, pirimidinas = 1) seguido por filtragem baseada em DFT. Note o limiar crítico de SNR em 20 dB para chamadas variantes precisas. 2: Modelagem biofísica: Simulação baseada em EDO de taxas de amplificação onde pequenas perturbações em condições iniciais levam a mudanças de limiar na sinalização sustentada. 3: Fenótipo biológico: modelagem das variantes de ganho de função do TYK2 na via IFN-α, levando à ativação amplificada do STAT2 e aos fenótipos resultantes de interferonopatia. Abreviações: DFT = transformada discreta de Fourier; IFN-α = interferon alfa; JAK-STAT = Transdutor do sinal da quinase Janus e ativador da transcrição; ODE = equação diferencial ordinária; SNR = relação sinal-ruído; STAT2 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 2; TYK2 = tirosina quinase 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A Figura 2 resume a integração do processamento de sinais baseado em DFT com componentes de modelagem de EDO e estocástica usados no fluxo de trabalho computacional exploratório. Este protocolo abrangente integra genética molecular avançada, tecnologias de sequenciamento de alta produtividade, algoritmos de processamento de sinais e modelagem biofísica para apoiar a detecção e interpretação funcional de variantes associadas à interferonopatia na vasculite autoinflamatória pediátrica.

Estrutura estatística e distribuição de probabilidade de mapeamento de sinais

Para formalizar o mapeamento digital das sequências genômicas antes do filtragem de sinais, foi estabelecido um arcabouço de conversão binária baseado na bioquímica dos nucleotídeos. Para qualquer janela genômica estrutural de comprimento N, as purinas {A, G} são mapeadas para um valor digital de 0, e as pirimidinas {C, T} são mapeadas para 1. Sob a hipótese nula (H0) de uma distribuição genômica de fundo uniforme e imparcial, essa conversão binária segue um ensaio de Bernoulli. A função de massa de probabilidade (PMF) do sinal mapeado X é definida da seguinte forma

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x para x ∈ {0,1}

onde p = 0,5 representa a probabilidade de encontrar um resíduo de pirimidina em uma trilha de fundo não selecionada. Ao escalar essa conversão entre bases sequenciais para o cálculo da densidade espectral de potência (PSD) via DFT, a distribuição cumulativa de ruído de fundo se comporta como uma caminhada aleatória, convergindo para uma distribuição de ruído branco Gaussiana pelo Teorema Central do Limite. Consequentemente, o espectro de potência normalizado dessa distribuição nula segue uma distribuição qui-quadrado (χ²) com 2 graus de liberdade. Para manter um limiar de significância estatística estrita (α = 0,05), o limiar de intensidade de potência crítica para definir um pico genuíno de sinal de variante patogênica foi calculado analiticamente usando a seguinte integração de densidade de probabilidade:

Limiar = - Em(a) x a²

onde σ² representa a variância operacional do piso local de ruído genômico de fundo. Qualquer pico espectral que ultrapassasse esse limite (p < 0,05, equivalente a um SNR > 20 dB) foi priorizado para portões de filtragem in silico a jusante, garantindo que a chamada variante seja orientada por dados e menos afetada pelo ruído estocástico de sequenciamento.

Eficiência operacional e análise de custos (Figura 3)

Do ponto de vista translacional e de implementação clínica, a eficiência operacional, o tempo de resposta clínica (TAT) e a viabilidade econômica desse protocolo integrado foram comparados com vias diagnósticas tradicionais, como sequenciamento sequencial de Sanger ou painéis genéticos direcionados restritos. Enquanto as odisseias diagnósticas convencionais para vasculite pediátrica ou suspeita de interferonopatias tipo I frequentemente duram de 8 a 12 semanas devido a testes iterativos de gene único, o fluxo de trabalho simplificado — abrangendo WES de alto rendimento, hibridização otimizada de 16 horas e filtragem paralelizada de sinais DFT em um cluster de computação de alto desempenho (HPC) — alcança um TAT clínico total relatado de 10 a 14 dias desde o recebimento inicial da amostra até o relatório molecular final. Além disso, devido à multiplexação eficiente de amostras (agrupamento de oito amostras de pacientes por bloco de hibridização), o custo principal do reagente e sequenciamento é reportado em aproximadamente $250–$300 por paciente, em comparação com os painéis tradicionais abrangentes que frequentemente ultrapassam $1.200–$1.800. Essa compressão tanto dos quadros de linha do tempo diagnóstica quanto dos custos sugere que o fluxo de trabalho de bioinformática inspirado na física proposto pode ser viável e escalável para laboratórios clínicos rotineiros de genética.

Resultados

Nessa coorte de 132 pacientes com variantes associadas à interferonopatia identificadas, foi identificado um amplo espectro de variantes genéticas (Tabela 1). Dos pacientes, 53 (40,2%) eram do sexo feminino e 79 (59,8%) do sexo masculino. A idade média era de 10,2 anos (variedade: 0–18 anos). Os dados em nível de paciente correspondentes à coorte final são fornecidos na Tabela Suplementar S1.

Tabela 1: Distribuição e classificação das variantes genéticas associadas à interferonopatia tipo I identificadas dentro da coorte autoinflamatória pediátrica (n = 132). Por favor, clique aqui para baixar esta tabela

Os genes mais frequentemente afetados foram ADAR (25 pacientes, 18,94%) e DNASE1 (24 pacientes, 18,18%). As variantes do DNASE1 eram exclusivamente da classe 3 (100% dentro do gene; 18,18% da coorte total). Da mesma forma, a maioria das variantes de ADAR era classe 3 (24 pacientes, 96,00%; 18,18% da coorte), com apenas uma variante classe 2 (4,00% dentro do gene; 0,76% da coorte) (Tabela 2).

Tabela 2: Variantes identificadas no painel de NGS de doenças raras. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela

Variantes em STING1 (20 pacientes, 15,15%) e RNASEH2B (14 pacientes, 10,61%) também foram comuns. Todas as variantes STING1 eram classe 3 (100%). Para RNASEH2B, 10 pacientes (71,43%) tinham variantes classe 3 (7,58% da coorte), enquanto 4 pacientes (28,57%) tinham variantes classe 2 (3,03% da coorte).

RNASEH2A mutações foram identificadas em 13 pacientes (9,85%), todos portadores de variantes classe 3 (100%). Mutações no TREX1 estavam presentes em 10 pacientes (7,58%), incluindo 8 variantes classe 3 (80,00%; 6,06% da coorte) e 2 variantes classe 2 (20,00%; 1,52% da coorte).

Variantes SAMHD1 foram detectadas em 9 pacientes (6,82%), com 7 pacientes portadores de variantes classe 3 (77,78%; 5,30% da coorte), 1 paciente portador de variante classe 1 (11,11%; 0,76%) e 1 paciente portador de variante classe 2 (11,11%; 0,76%).

RNASEH2C mutações foram encontradas em 8 pacientes (6,06%), todos de classe 3. DNASE1L3 mutações foram identificadas em 6 pacientes (4,55%), incluindo 5 variantes classe 3 (83,33%; 3,79% da coorte) e 1 variante classe 2 (16,67%; 0,76%). Mutações em PSMB8 e COPA foram detectadas em 5 pacientes (3,79%), com todas as variantes sendo classe 3 (100%). Mutações DNASE2 e STAT4 estavam presentes em 3 pacientes (2,27%), com todas as variantes classificadas como classe 3.

No geral, as variantes da classe 3 constituíram a classe predominante em quase todos os genes da coorte. Os sítios variantes específicos, incluindo substituições detalhadas de nucleotídeos e alterações correspondentes de aminoácidos entre os genes-alvo, estão catalogados na Tabela 3.

Análise exploratória do desempenho do processamento de sinais

Para explorar a robustez e sensibilidade do pipeline de processamento de sinal baseado em DFT, foi realizado um benchmark comparativo com o fluxo de trabalho padrão de chamada variante apenas para GATK, focando especificamente em regiões genômicas de baixa cobertura (profundidade < 30x). No benchmarking preliminar, o layout integrado de filtragem DFT mostrou uma tendência potencial para uma melhor priorização em regiões selecionadas de baixa cobertura, sugerindo uma estimativa exploratória de recuperação de até 96,8% nessas condições específicas de controle laboratorial. Importante destacar que esses parâmetros e métricas numéricas de eficiência representam achados preliminares e exploratórios, calibrados dentro do contexto institucional específico da coorte, e não um pipeline clínico universalmente validado. O gasoduto também recuperou variantes true-positive anteriormente descartadas em regiões de alto ruído. Além disso, o FDR foi reduzido de 6,4% para 1,2%, destacando a potencial robustez do filtro passa-baixa na eliminação de artefatos de sequenciamento de alta frequência. Entre as variantes novas identificadas na coorte, 14 variantes (representando 17,7% dos achados novos), predominantemente localizadas em regiões de cobertura não uniforme em STING1 e TREX1, foram inicialmente classificadas como artefatos de baixa qualidade por limiares algorítmicos padrão, mas foram recuperadas e validadas com sucesso pelo sequenciamento Sanger seguindo o protocolo de aprimoramento sinal-ruído. Essa observação analítica sugere que avaliar características físicas do sinal pode ser uma ferramenta útil em fluxos de trabalho de pesquisa exploratória.

Benchmarking comparativo com fluxos de trabalho padrão

Para avaliar o desempenho comparativo dessa estrutura integrada, foi realizada uma análise de benchmarking lado a lado contra dois pipelines padrão de chamadas de variantes: o fluxo de trabalho de Melhores Práticas GATK (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) e DeepVariant (v1.5). As métricas de desempenho foram calculadas usando um subconjunto de validação de alta confiança da coorte, avaliado em regiões genômicas de baixa cobertura (profundidade < 30x) e de alto ruído. A arquitetura comparativa é resumida na Tabela 4.

Parametrização quantitativa e validação de modelos computacionais

Para fundamentar os marcos biofísicos e estocásticos em termos quantitativos, as EDO e as simulações de Gillespie foram parametrizadas usando valores cinéticos empíricos calibrados contra condições experimentais de controle. Simulações contínuas de ODE acompanham a concentração absoluta de STAT2 fosforilado ([STAT2p]) ao longo de um período de 720 minutos após exposição simulada ao interferon tipo I. No modelo computacional wild-type (WT), a cascata de sinalização demonstrou atenuação homeostática rápida, caracterizada por um pico de ativação em t = 45 min seguido por uma rápida limpeza impulsionada por feedback negativo programado (k3 = 0,45 min-1) via expressão simulada de SOCS1. Em contraste, a modelagem das variações de ganho de função (GoF) nas vias STING1 e TYK2 revelou mudanças severas no limiar, resultando em um estado hiper-inflamatório persistente e não atenuante. As mudanças na meia-vida do sinal (t1/2) e na dobra em regime estacionário são resumidas na Tabela 5.

Declaração de Disponibilidade de Dados

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level dados clínicos correspondentes à coorte final são fornecidos na Tabela Suplementar S1. Os limiares discretos de processamento digital de sinais, formulações matemáticas, configurações de ambientes de software e parâmetros computacionais necessários para replicar o filtragem DFT e as simulações de vias biofísicas (EDOs e modelagem estocástica) foram disponibilizados publicamente. Para garantir acesso permanente e sem restrições para os leitores, esse framework de replicação foi depositado no GitHub e arquivado permanentemente no Zenodo via DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Bibliotecas de software open-source padrão e plataformas de computação numérica usadas nesse fluxo de trabalho, como NumPy, SciPy e COPASI, são de acesso público.

Figura 3. Storyboard operacional e arquitetura de pipeline orientada por dados para identificação e modelagem biofísica de variantes associadas à interferonopatia tipo I. O esquema delineia um fluxo de trabalho experimental e computacional cronológico de quatro níveis, integrando análise clínica de coortes com processamento biológico de sinais. (A) Estratificação de coortes e pipeline NGS: fluxo de trabalho para a coorte autoinflamatória pediátrica (n = 132) que está passando por WES. O inserto exibe faixas brutas de controle de qualidade FastQ com pontuação Phred, transitando para chamadas variantes GATK/DeepVariant e geração final de matriz VCF. (B) Processamento de sinais baseado em DFT: tradução algorítmica de texto genômico em sinais genômicos numéricos para redução de ruído. O gráfico incorporado e orientado por dados traça uma distribuição do espectro de potência, identificando frequências variantes patogênicas (picos de sinal) contra ruído genômico de fundo com um limiar de SNR de >20 dB. (C) Porta de curadoria in silico : funil de priorização em múltiplas camadas integrando diretrizes de patogenicidade ACMG de 5 níveis, HGMD e verificações cruzadas de Infevers para priorizar as 79 variantes novas e 13 relatadas. (D) Validação de modelagem biofísica funcional: camada de validação biológica. A estrutura determinística de ODE e as curvas de simulação estocásticas de Gillespie são integradas como componentes gráficos, plotando a recuperação de curso de 720 minutos e a sinalização sustentada da cinética celular do tipo selvagem versus a cinética mutante simulada. Abreviações: ACMG = American College of Medical Genetics and Genomics; DFT = transformada discreta de Fourier; GATK = Kit de Ferramentas de Análise Genomática; HGMD = Banco de Dados de Mutações Genéticas Humanas; NGS = sequenciamento de próxima geração; ODE = equação diferencial ordinária; SNR = relação sinal-ruído; VCF = formato variante de chamada; WES = sequenciamento de exoma inteiro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 3: Controle abrangente de anotação e banco de dados de locus das variantes genéticas associadas à interferonopatia tipo I identificadas dentro da coorte pediátrica (n = 132). Critérios do ACMG (segundo as diretrizes ACMG/AMP de 2015): Os códigos de evidência do ACMG/AMP foram agrupados por força de evidência. Evidências muito fortes incluíram PVS1, que se refere a variantes previstas de perda de função em genes onde a perda de função é um mecanismo estabelecido da doença. Evidências fortes incluíram PS1–PS4, abrangendo alterações de aminoácidos previamente estabelecidas, ocorrência confirmada de novo, evidências funcionais de suporte e aumento da frequência de variantes em indivíduos afetados. Evidências moderadas incluíram PM1–PM6, incluindo localização em domínio crítico ou ponto de concentração mutacional, ausência ou frequência muito baixa em bancos de dados populacionais, ocorrência trans em distúrbios recessivos, alterações no comprimento das proteínas, novas alterações missense em resíduos com variação patogênica conhecida e ocorrência de novo assumida. As evidências de apoio incluíram PP1–PP5, incluindo co-segregação, restrição de erro específica do gene, evidências in silico , especificidade do fenótipo e relatos anteriores confiáveis de patogenicidade quando evidências independentes não estavam disponíveis. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela

Tabela 4: Comparação de desempenho lado a lado de pipelines de chamada variant em regiões genômicas de alto ruído. A avaliação de benchmarking foi realizada em áreas de baixa cobertura (<30x) para avaliar o desempenho do filtro passa-baixa DFT baseado em física na eliminação de ruído de sequenciamento e na proteção de sinais verdadeiros-positivos em comparação com configurações algorítmicas padrão. Abreviações: DFT = transformada discreta de Fourier. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela

Tabela 5: Parâmetros cinéticos quantitativos e variações em regime estacionário da sinalização JAK-STAT a jusante. Resumo dos limites de simulação de Gillespie de EDO e estocástica ao longo de um período de 720 minutos, destacando a falha da atenuação homeostática celular em modelos que possuem variações patogênicas de STING1 e TYK2. Abreviações: JAK-STAT = transdutor do sinal da quinase Janus e ativador da transcrição; ODE = equação diferencial ordinária; STING1 = estimulador da resposta ao interferon, interator cGAMP 1; TYK2 = tirosina quinase 2. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela

Tabela Suplementar S1. Conjunto de dados em nível de paciente para a coorte pediátrica com variantes associadas à interferonopatia. A tabela fornece os dados em nível de paciente correspondentes à coorte final de 132 pacientes analisada no manuscrito. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Etapas críticas do protocolo incluem fragmentação de DNA, ligação de adaptadores, amplificação por PCR e circularização de DNA de fita simples (ssDNA). Durante essas etapas, a execução meticulosa é essencial para minimizar o risco de contaminação. Lavagens precisas com etanol e tempos adequados de incubação do suporte magnético durante a purificação à base de esferas são obrigatórias, pois desvios podem resultar em redução do rendimento do produto ou na detecção de variantes perdidas. Durante a preparação da biblioteca em pool, é necessário cálculo preciso de 93,75 ng por paciente e ajuste cuidadoso do volume.

Para otimização e resolução de problemas de protocolos, medições de quantificação fluorométrica baixa, particularmente concentrações de ssDNA abaixo do limite de 0,8–2 ng/μL, podem exigir aumento da profundidade de sequenciamento ou encurtamento dos tempos de secagem das esferas para melhorar a sensibilidade à chamada de variantes. Em casos de variantes suspeitas de mosaico, a integração de tecnologias de sequenciamento de leitura longa pode aumentar a precisão da detecção. Além disso, a transferência rápida das amostras para o gelo após a digestão enzimática é fundamental para manter a estabilidade do^{produto 12,13}. Durante a preparação do DNB, a pipetagem lenta e suave, juntamente com a adição cuidadosa do buffer de parada, preserva a integridade das nanobolas. Isso é especialmente importante para estabelecer correlações genótipo-fenótipo em interferonopatias de início precoce, como^{SAVI 6,11}.

Essa análise genética baseada em WES fornece uma estrutura para avaliar variantes associadas à interferonopatia em pacientes pediátricos com características autoinflamatórias e vasculite. Ao identificar variantes em genes-chave como DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 e COPA, o estudo destaca a heterogeneidade genética subjacente aos fenótipos vasculíticos impulsionados pelo interferon. A frequência de variantes no metabolismo dos ácidos nucleicos e nos genes sensoriais, particularmente DNASE1 e ADAR, nesta coorte é consistente com o papel central da sinalização desregulada do interferon tipo I na patogênese da vasculite pediátrica e doenças auto-inflamatórias. Esses achados são consistentes com relatos anteriores que ligam esses genes a interferonopatias e manifestações vasculíticas ^4,5,7.

Ao elucidar apresentações semelhantes à vasculite de síndromes auto-inflamatórias monogênicas, como o envolvimento pulmonar cutâneo e intersticial observado na SAVI, essa abordagem pode facilitar o diagnóstico precoce e ajudar a orientar terapias anti-interferon ^4,5,7. Interferonopatias monogênicas podem clinicamente imitar vasculite associada à ANCA e outros vasculítides infantis, ressaltando a importância dos testes genéticos em casos atípicos ou resistentes^{ao tratamento 9,10,11}. O diagnóstico genético precoce também pode permitir o início oportuno de tratamentos direcionados, como os inibidores de JAK, que demonstraram benefício clínico em pacientes com STING1 e outras mutações relacionadas ao^{interferon 7,13,14}.

Este estudo também reforça que uma proporção significativa de pacientes pediátricos apresentados com vasculite autoinflamatória complexa possui variantes raras ou novas em genes relacionados à interferonopatia. A identificação de 79 novas variantes nessa grande coorte amplia o espectro genético conhecido e pode contribuir para melhores correlações genótipo-fenótipo na vasculite infantil.

Uma consideração operacional nesse fluxo de trabalho exploratório envolve avaliar limites de limiar, pois desvios nos parâmetros exploratórios do SNR podem alterar a saída do filtro. Por exemplo, a filtragem baseada em DFT das distribuições de nucleotídeos ajuda na redução de ruído, mas requer calibração para evitar suavizar excessivamente os sinais de mutação; A solução de problemas inclui ajuste iterativo dos parâmetros binários de mapeamento (0 para purinas, 1 para pirimidinas) para otimizar a extração de características¹⁵. Em modelagem biofísica, definir condições iniciais para EDOs é essencial, pois pequenas perturbações nas taxas de amplificação podem alterar comportamentos de limiar, potencialmente subestimando a sinalização sustentada do interferon. Detalhes aprimorados do JAK-STAT incluem a modelagem do papel do TYK2 na sinalização IFN-α, onde variantes de ganho de função amplificam a ativação do STAT2, levando ao fenótipo de^{interferonopatia 20}.

Modificações ao método podem incluir a integração de elementos estocásticos para ambientes celulares ruidosos, como a adição de termos de ruído de Langevin aos EDOs:

dX = f(X)dt + g(X)dW

onde dW, o termo listado, representa o ruído do processo de Wiener, aumentando o realismo na simulação da variabilidade^{JAK-STAT 21}. Simulações estocásticas de vias de interferon, usando algoritmos de Gillespie, capturam a heterogeneidade na expressão do IFN-β devido a loops de retroalimentação negativa, onde diferenças de célula a célula nos níveis de fatores de transcrição resultam em distribuições bimodais de ativação do^{ISG 22,23}. A resolução de problemas em modelos de vias envolve validação contra dados experimentais de IFN-β; Se a amplificação divergir, controles negativos, como taxas de ativação da fosfatase, podem ser recalibrados, ou atrasos distribuídos podem ser incorporados para transcrição:

com kernel gama para processos atrasados.

Comparado ao sequenciamento do genoma inteiro (WGS), essa abordagem focada no WES pode ser custo-efetiva, mas é menos abrangente para regiões não^{exônicas 24,25}. O escopo deste quadro preliminar é limitado a fornecer um modelo de simulação bioquímica de suporte para avaliar como variações matemáticas se correlacionam com o comportamento estimado de sinalização do interferon, como visto em modelos de limiar onde os efeitos cumulativos excedem valores críticos levando a lesão vascular. As limitações do método incluem o potencial de negligenciar variantes mosaic de baixo nível e a necessidade de validação funcional de descobertas^{novas 6}.

Essa técnica tem aplicações potenciais em imunologia e medicina vascular, incluindo a orientação de terapias anti-interferon simulando impactos variantes em vias e enriquecendo bancos de dados para diagnósticos de doenças^{raras 19}. Extensões estocásticas podem ainda permitir a previsão de respostas heterogêneas em interferonopatias, auxiliando na medicina personalizada.

Neste estudo, a avaliação genética na vasculite pediátrica é enfatizada juntamente com ferramentas diagnósticas convencionais, como histopatologia e modalidades de imagem. No geral, este estudo destaca a importância da avaliação genética na vasculite pediátrica, ao mesmo tempo em que enfatiza a frequência das variantes associadas à interferonopatia identificadas entre pacientes submetidos à análise genética para suspeitas de doenças autoinflamatórias. Ao avaliar o impacto dessas variantes nas vias de sinalização do interferon e ressaltar a importância do diagnóstico precoce na vasculite pediátrica, este trabalho contribui para o enriquecimento de bancos de dados de doenças raras relacionadas a distúrbios vasculíticos e auto-inflamatórios e fornece insights para estudos futuros que investiguem patogenicidade variante e polimorfismos específicos da população.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetas ajustáveis (P2, P10, P20, P200, P1000)	Qualquer fornecedor		Para manipulação precisa de líquidos
Centrífuga de bancada	Qualquer fornecedor		Para centrifugação breve de tubos PCR
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (ou equivalente)	Master mix de amplificação de PCR
Etanol (grau de biologia molecular)	Qualquer fornecedor		Usado para preparar solução de lavagem de etanol 80%
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Incluído no kit ou separado	Primers de amplificação de biblioteca
Tubos PCR de baixo vínculo (0,2 mL)	Qualquer fornecedor		Tubos PCR estéreis
Suporte magnético / Rack magnético	Qualquer fornecedor		Para separação de contas magnéticas
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Secuenciador de bancada de próxima geração usando tecnologia DNBSEQ (DNA Nanoball Sequencing); suporta vários comprimentos de leitura (por exemplo, SE50 para PE300); saída de alto rendimento de até 1440 Gb por execução; ideal para aplicações de WES, WGS e sequenciamento direcionado.
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) ou 1000005260 (V2.0)	Kit de circularização para geração de DNA circular de fita simples (ssCirDNA); versão com código de barras duplo reduz o salto de índice; etapa pós-preparo de biblioteca essencial para a formação de DNB no fluxo de trabalho de sequenciamento MGI.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Contas magnéticas para purificação de DNA
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (integrado com Circularização de código de barras duplo) ou DNB Make relacionado (por exemplo, 940-000036-00 Onestep DNB)	Módulo de preparação de DNA Nanoball (DNB); inclui circularização e geração de nanoball para carga de célula de fluxo; etapa final no processamento de biblioteca para sequenciadores DNBSEQ (frequentemente combinado com o Kit de Circularização).
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (ou equivalente)	Contém solução bloqueadora, bloqueadores universais MGI, potencializador, tampão de ligação, tampão de lavagem 1 & 2 e contas de estreptavidina
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (ou Twist CES Probes, compatível com MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (para MGIEasy) ou Twist Bioscience (para Twist)	1000007745 (Conjunto de sondas V4, 16 RXN) ou 1000007740 (Sondas); Twist: Personalizado / específico para painel (baseado em pedido, sem número padrão)	Sondas de captura de exoma inteiro baseadas em hibridização; tem como alvo ~ 59 Mb de regiões codificantes (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); projetado para enriquecimento de alta eficiência em fluxos de trabalho WES em plataformas DNBSEQ; usado com o kit de acessórios MGIEasy para hibridização (pré-incubação a 65°C, 16 horas durante a noite a 65°C), adição de bloqueador, captura de contas de estreptavidina (tampão de ligação, tampão de lavagem 1/2 a 48°C), eluição e amplificação de PCR pós-captura (compatível com mix Equinox).
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Reagentes de hibridização e lavagem
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (conjunto de 16 RXN) ou 1000005256 (kit central de 96 RXN)	Kit de preparação de biblioteca de DNA baseado em fragmentação rápida; fragmentação enzimática com entrada de gDNA de 5–400 ng; compatível com plataformas DNBSEQ para construção eficiente de biblioteca WGS / WES.
Água livre de nuclease	Qualquer fornecedor		Grau de biologia molecular
Kit Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Para quantificação de biblioteca
Kit Qubit ssDNA Assay (opcional)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Para quantificação de ssDNA após circularização
Contas de estreptavidina magnéticas	MGI Tech	Incluído no kit de acessórios	Para captura híbrida
Buffer TE (pH 8,0)	Qualquer fornecedor		Para etapa de desnaturação
Termociclador	Vários (Bio-Rad, Thermo, etc.)		Usado para fragmentação, ligação, PCR e programas DNB
Misturador Vortex	Qualquer fornecedor		Para mistura de amostras
Dicas de pipeta de orifício largo	Qualquer fornecedor		Requerido para preparação de DNB