Fenotipagem Comportamental Multimodal de Estados Semelhantes à Depressão Induzidos pelo Estresse em Drosophila melanogaster

Resumo

Esse protocolo fornece uma estrutura para avaliar mudanças comportamentais induzidas pelo estresse em Drosophila melanogaster. Combinar ensaios complementares permite quantificar atividade, exploração e tomada de decisão para moscas individuais. A abordagem é flexível e pode ser adaptada a uma ampla gama de estudos que investigam biologia do estresse, metabolismo e função neurocomportamental.

Resumo

Transtornos metabólicos, neurodegenerativos e relacionados ao estresse frequentemente são acompanhados por alteração da locomoção, tomada de decisão prejudicada e redução da flexibilidade comportamental. No entanto, estruturas comportamentais multimodais acessíveis para quantificar esses fenótipos em Drosophila melanogaster continuam limitadas. Aqui, é apresentado um protocolo que integra exposição forçada à natação, comportamento e mobilidade manual do labirinto em Y, fototaxia e avaliação de atividade no sistema FlyVac, exploração em campo aberto e monitoramento locomotor de longo prazo usando o Monitor de Atividade Drosophila . Esses ensaios complementares capturam múltiplas dimensões do comportamento, incluindo saída motora, motivação, estrutura de decisão e variabilidade comportamental, como leituras funcionais de estados neurais e metabólicos. O pipeline é escalável, reproduzível e adaptável a manipulações farmacológicas, genéticas e ambientais, fornecendo uma estrutura versátil para detectar fenótipos comportamentais relacionados ao estresse, metabólicos e neurodegeneração em Drosophila.

Introdução

Alterações comportamentais, como mudanças na locomoção, tomada de decisão e atividade exploratória, são amplamente utilizadas como indicadores em nível de organismo do estado neural e fisiológico. Em todos os táxons, a disfunção neural frequentemente se manifesta como alteração da estrutura do movimento, redução da motivação exploratória, comprometimento do comportamento de decisão guiado sensorialmente e mudanças na previsibilidade comportamental. Como essas saídas em nível de organismo integram estados neurais, metabólicos e fisiológicos, fornecem leituras escaláveis para detectar fenótipos relevantes para a doença. No entanto, apesar do uso extensivo de Drosophila melanogaster em genética molecular e neurociência, estruturas comportamentais multimodais padronizadas que capturam simultaneamente o desempenho locomotor, a estrutura de decisão e a variabilidade comportamental permanecem limitadas.

Organismos modelo são essenciais para estudar mecanismos subjacentes aos fenótipos relacionados ao estresse e neuropsiquiátricos, pois a manipulação experimental controlada é frequentemente impossível em humanos. Síndromes comportamentais relacionadas ao estresse ocorrem em muitos táxons, incluindo insetos, e envolvem sistemas neuromoduladores conservados, como serotonina e dopamina, além de vias metabólicas de sinalização metabólica. A mosca-das-frutas, portanto, surgiu como um sistema poderoso para ligar disfunção molecular a resultados comportamentais em nível de organismo devido ao seu curto tempo de geração, tratabilidade genética e conservação de vias relevantes para^{doenças 1,2}.

Ao mesmo tempo, muitos ensaios comportamentais em Drosophila são tipicamente aplicados isoladamente, dificultando a distinção entre efeitos gerais da doença, comprometimento motor, mudanças motivacionais e alterações comportamentais em nível de decisão. Além disso, apenas medidas comportamentais médias podem obscurecer fenótipos biologicamente significativos, já que perturbações neuromodulatórias e do desenvolvimento frequentemente alteram a variabilidade comportamental em vez da produção comportamental média. Uma abordagem comportamental multimodal que combine ensaios locomotores, exploratórios, sensoriais e de tomada de decisão é, portanto, necessária para gerar assinaturas fenotípicas robustas em nível^{de organismo 3}.

Aqui, é apresentado um pipeline comportamental multimodal integrando exposição forçada à^{natação 4,5}, comportamento e manobrabilidade do labirinto^{em Y} 6,7,8,9, fototaxia e avaliação de atividade usando o sistema FlyVac ^10,11, exploração em campo^{aberto 12} e monitoramento locomotor de longo prazo usando o Drosophila Activity^{Monitor 5,13} (Figura 1). Cada ensaio nesse contexto captura uma dimensão comportamental distinta relevante para fenótipos relacionados ao estresse. O teste de natação forçada mede comportamentos passivos de enfrentamento, onde uma transição precoce para a imobilidade reflete uma motivação reduzida para sustentar respostas de fuga. Os ensaios de campo aberto e DAM quantificam a atividade locomotora geral e a estrutura circadiana, fornecendo medidas de base da saída motora e da excitação. O ensaio Y-maze captura a estrutura de tomada de decisão por meio de sequências de escolhas esquerda–direita, permitindo estimar tanto o viés de virada (lateralização) quanto a variabilidade comportamental como medida de previsibilidade. Por fim, o ensaio FlyVac avalia a tomada de decisão guiada sensorialmente e o comportamento de aproximação–evitação por meio de escolhas fototáticas repetidas. Juntos, esses ensaios fornecem leituras complementares que distinguem mudanças em atividade, motivação e comportamento em nível de decisão.

Este protocolo captura aspectos complementares de saída motora, motivação, estrutura de decisão e variabilidade comportamental, fornecendo uma estrutura escalável para detectar fenótipos comportamentais relacionados ao estresse, metabólico e neurodegeneração em D. melanogaster¹⁴. O objetivo principal deste estudo é estabelecer uma estrutura multimodal de fenotipagem comportamental que integre ensaios complementares para capturar múltiplas dimensões da mudança comportamental induzida pelo estresse. O paradigma de tensão é usado aqui como uma perturbação padronizada para demonstrar a sensibilidade e aplicabilidade do framework.

Protocolo

O ensaio de natação forçada foi realizado de acordo com os princípios dos 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento). A substituição foi alcançada usando Drosophila melanogaster como modelo de invertebrados, evitando assim paradigmas de natação forçada em vertebrados, que estão cada vez mais restringidos por razões éticas. A redução foi apoiada pela natureza de alto rendimento do ensaio, que permite uma inferência comportamental robusta a partir de coortes relativamente pequenas, minimizando o uso animal. O refinamento foi abordado limitando a exposição à natação a 2 minutos, duração que previne exaustão ou afogamento e permite a recuperação total do comportamento locomotor normal imediatamente após o teste. Juntas, essas considerações garantem que o ensaio forneça dados comportamentais significativos, minimizando o potencial sofrimento e maximizando a aceitação ética, inclusive em ambientes educacionais.

1. Indução de um estado semelhante a depressão em Drosophila (protocolo de estresse vibracional)

1. Colete o macho D. melanogaster dentro de 24 horas após a eclosão sob anestesia leve de CO₂. Todos os detalhes estão mencionados na Tabela de Materiais.
2. Coloque as moscas em grupos de 10 em frascos de polipropileno ou acrílico (95 mm de comprimento × 25 mm de diâmetro interno) selados com tampões de algodão.
3. Expõe as moscas à vibração mecânica (300 Hz) usando uma plataforma vibratória.
4. Aplique ciclos repetidos que consistem em 45 minutos de vibração seguida de 15 minutos de recuperação em frascos contendo alimentos padrão.
5. Continue os ciclos de vibração por um total de 6 horas por dia.
6. Repita o protocolo de estresse por 3 dias consecutivos.
7. Manter as moscas de controle sob condições idênticas de alojamento, sem exposição a vibrações.
   NOTA: No protocolo atual, apenas moscas machos foram usadas para reduzir a variabilidade associada a diferenças fisiológicas e comportamentais específicas do sexo, incluindo estado reprodutivo e influências hormonais. Essa padronização facilita a detecção de efeitos comportamentais induzidos pelo estresse em um ambiente controlado. No entanto, o protocolo é totalmente aplicável às fêmeas, e as respostas específicas por sexo representam uma área importante para futuras investigações. Considerando que a sensibilidade a fenótipos relacionados ao estresse e semelhantes à depressão pode variar conforme o sexo e a idade entre táxons, incluindo Drosophila, estender essa estrutura para diferentes grupos demográficos pode fornecer insights biológicos adicionais. Esse paradigma é adaptado a partir de modelos estabelecidos de estresse vibracional incontrolável que induzem alterações motivacionais e de atividade em moscas.

2. Teste de natação forçada em Drosophila melanogaster

ATENÇÃO: O dodecilsulfato de sódio (SDS) é um irritante. Use equipamentos de proteção individual apropriados (por exemplo, luvas e proteção ocular) ao preparar e manusear soluções SDS. Evite contato visual com pele. Descarte resíduos contendo SDS de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.

1. Recolha as moscas adultas dentro de 24 horas após a eclosão e mantenha-as sob luz constante e condições ambientais controladas.
2. Prepare lâminas de câmara multipoço e encha cada poço com ~2 mL de solução SDS 0,08% em temperatura ambiente.
3. Transfira uma única mosca para cada poço imediatamente antes de gravar. Não é necessário anestesia.
4. Grave o comportamento usando uma câmera aérea por 2 minutos para quantificar a latência até a primeira imobilidade.
5. Quantifique a latência até a primeira imobilidade.
6. Remova as moscas após a gravação e coloque-as sobre papel absorvente para confirmar a recuperação da locomoção normal.
   NOTA: Imobilidade é definida como a cessação de movimentos ativos de fuga mantendo a posição na superfície. Para registrar parâmetros adicionais, como duração total de imobilidade e número de períodos de imobilidade, são necessários durações de gravação mais longas (por exemplo, 3 minutos). Este ensaio reflete um comportamento passivo de enfrentamento; A redução da latência à imobilidade é interpretada como diminuição da motivação para sustentar respostas de fuga. Variabilidade da latência até a imobilidade / imobilidade total entre moscas. Este ensaio pode induzir estresse transitório ou fadiga. Quando usado em projetos longitudinais, realize-o antes de outros ensaios e permita uma recuperação suficiente (por exemplo, ≥24 horas) antes dos testes subsequentes.

3. Monitoramento de atividade locomotora de longo prazo usando o Monitor de Atividade Drosophila (DAM)

1. Anestesiar as moscas-das-frutas brevemente (5 s) usando CO₂ para a seleção.
2. Coloque moscas individuais em tubos de vidro DAM contendo comida e tampões^{de algodão 17}.
3. Insira tubos no sistema Drosophila Activity Monitor.
4. Registrar atividade locomotora continuamente (48 h) sob temperatura controlada e condições de luz-escuro.
5. Armazene contagens de quebra de feixe usando software de aquisição.
6. Agrupe os dados de atividade em intervalos de tempo definidos (por exemplo, 1–10 min).
7. Exclua moscas que morrem ou não demonstram atividade após a aclimatação.
   NOTA: O monitoramento contínuo da locomotora durante um período de 48 horas é suficiente para capturar padrões de atividade circadiana. DAM: variabilidade na distância total, velocidade e estrutura de aproximação entre indivíduos.

4. Ensaio locomotor em campo aberto

1. Anestesiar brevemente (5 s) moscas-das-frutas usando CO₂.
2. Transfira moscas individuais para arenas retangulares de 25 x 75 mm (uma mosca por arena).
3. Permita que as moscas se aclimatem (20 min) ao ambiente da arena antes de registrarem sob luz branca difusa e de baixa intensidade constante.
4. Registre o comportamento sob iluminação constante usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo.
5. Analise trajetórias usando software de rastreamento para extrair:
   Distância total percorrida
   Velocidade média da locomotora
   Métricas de aceleração e curvas
   NOTA: Este ensaio fornece uma base para interpretar mudanças comportamentais relacionadas ao estresse. O período de aclimatação minimiza o estresse induzido pelo manuseio e permite que as moscas se habituem à arena, garantindo que a atividade locomotora registrada reflita o comportamento básico. A iluminação constante foi usada para reduzir a variabilidade associada às flutuações circadianas e garantir condições comportamentais consistentes entre os ensaios. Trajetórias podem ser extraídas usando softwares automatizados de rastreamento como EthoVision XT (Noldus Information Technology), ou alternativas de código aberto como Ctrax, idTracker e TrackMate (ImageJ/Fiji), dependendo da disponibilidade e preferência do usuário. Ensaio em campo aberto: variabilidade na distância total, velocidade e estrutura de bordes entre indivíduos. Para reduzir os efeitos de ordem, padronize as condições de aclimatação e iluminação ao longo das sessões. Quando múltiplos testes são realizados nos mesmos indivíduos, mantenha a duração da exposição da arena consistente.

5. Comportamento de viragem em Y e ensaio de variabilidade comportamental

1. Anestesie brevemente (5 s) as moscas-das-frutas usando CO₂.
2. Coloque moscas individuais nas câmaras do labirinto^{em Y 8,9}. Labirintos foram cortados em acrílico preto de 1,6 mm de espessura usando um gravador a laser. Colocamos moscas em uma matriz de 95 labirintos individuais, cada um consistindo em três braços simétricos (12 mm de comprimento e 3,3 mm de largura).
3. Permita que as moscas explorem livremente por períodos prolongados de gravação (20 min).
4. Registre decisões de virada (esquerda ou direita) durante a locomoção exploratória (1 h).
5. Calcule o viés individual de viragem como a proporção de curvas à direita. Calcule métricas relevantes como velocidade, aceleração, movimento sem movimento, variações de atividade baseadas no^{tempo 12,15}.
6. Quantifique a variabilidade comportamental entre moscas usando o desvio absoluto mediano (MAD) do viés de viragem.
   NOTA: Este ensaio mede a mão locomotriça e a previsibilidade comportamental independentemente dos níveis gerais de atividade. Sequências de curvas capturam a estrutura de decisão; O viés de virada reflete lateralização, enquanto a variabilidade entre indivíduos reflete previsibilidade comportamental. Viés = proporção de curvas à direita (por mosca); variabilidade = dispersão (MADn) do viés entre moscas. Para testes repetidos, considere contrabalançar a ordem dos ensaios entre indivíduos ou coortes para controlar os efeitos da sequência.

6. Escolhas fototáticas: monitoramento de atividade no aparelho FlyVac

1. Coloque moscas individuais nas câmaras^{FlyVac 6,11} sem usar anestesia de_CO-2.
2. Permita a aclimatação (10 minutos) antes de iniciar os testes.
3. Apresente repetidas escolhas binárias luz–escuro para cada mosca.
4. Registre escolhas em 40 ensaios usando detecção automatizada.
5. Calcule a probabilidade de escolha da luz por mosca e o tempo médio entre as escolhas da luz como medida da atividade.
6. Quantifique a variabilidade comportamental entre indivíduos que utilizam DMA.
   NOTA: O sistema FlyVac permite a avaliação simultânea do viés médio de decisão e da variabilidade entre indivíduos. Os ensaios comportamentais descritos neste protocolo são modulares e podem ser realizados em diferentes sequências dependendo do desenho experimental. No entanto, para minimizar possíveis efeitos de retenção, recomenda-se realizar o teste de natação forçada antes de outros ensaios. Para reduzir os efeitos de ordem, padronize as condições de aclimatação e iluminação ao longo das sessões.

7. Análise de dados

NOTA: Análises comportamentais foram realizadas usando moscas individuais como unidade de inferência, salvo indicação em contrário.

1. Teste de natação forçada: Analise as gravações manualmente ou usando um software de pontuação comportamental.
   NOTA: Imobilidade foi definida como a ausência de movimentos ativos de fuga enquanto a mosca permanecia à tona. Os seguintes parâmetros foram extraídos por mosca: latência até a primeira imobilidade ( s).Comparações em grupos foram realizadas usando testes estatísticos não paramétricos devido à distribuição não normal das medidas comportamentais.
2. Atividade locomotora de longo prazo (DAM): Recorde de contagens de quebra de feixe pelo Drosophila Activity Monitor. Exporte e faça o bin em intervalos de 10 minutos.
   NOTA: Para cada mosca, foram calculados os contagens totais de atividade e os padrões circadianos de atividade. Esses padrões podem ser calculados em R, Python ou Excel — o que estiver disponível. Moscas que apresentavam inatividade devido à mortalidade ou artefatos técnicos foram excluídas antes da análise. O ensaio durou 48 horas.
3. Ensaio de locomotores em campo aberto: Processe os dados de rastreamento de vídeo usando software automatizado de rastreamento. Importe os arquivos de vídeo para o EthoVision XT. Realize o rastreamento usando detecção automatizada com limiar baseado em contraste.
   NOTA: As trajetórias foram suavizadas usando o algoritmo de filtragem padrão. Parâmetros locomotores por mosca (distância, velocidade, aceleração) eram exportados como arquivos CSV para análise a jusante. Os parâmetros do locomotor por mosca incluíam: distância total percorrida (mm), acelerações (mm/^{s 2}). Estatísticas resumidas foram calculadas em nível individual antes da comparação de grupos. A duração desse teste foi de 1 hora para cada grupo.
4. Comportamento de giro em Y-labirinto: extrair as decisões de giro das trajetórias registradas, classificar como esquerda ou direita e exportar como sequências binárias (esquerda/direita) para cada indivíduo.
   NOTA: Para cada mosca, o viés de virada foi calculado como a proporção de curvas à direita em todas as decisões registradas. A variabilidade comportamental entre as moscas foi quantificada usando o desvio absoluto da mediana escalada (MAD_n = 1,4826 × MAD) do viés de viragem. A duração desse teste foi de 1 hora para cada grupo.
5. Escolhas fototáticas do FlyVac: Registre automaticamente as escolhas binárias de luz–escuro. Para cada mosca, calcule a probabilidade de escolha da luz (LCP) como a proporção de testes em que o braço leve foi selecionado. Expresse o viés fototático como a média dos resultados binários dos ensaios (luz = +1, escura = −1).
   NOTA: A variabilidade entre moscas foi quantificada usando MAD_n dos índices individuais de fototaxia.
6. Análise estatística: Avalie as diferenças entre grupos em medidas comportamentais usando testes baseados em permutação com 10.000 randomizações de rótulos.
   NOTA: Para comparar a variabilidade, testes de permutação foram realizados nas diferenças absolutas na_{DMAD n} entre os grupos. Intervalos de confiança para estimativas de_{MAD n} foram obtidos usando reamostragem bootstrap. Um teste t sem pares de duas caudas foi usado para comparar a distância percorrida pelas moscas (mm) e a aceleração máxima (mm/^{s 2}). Para visualização de dados, foram usados gráficos de violino (principalmente para mostrar densidade, concentração e assimetria), plots de caixa e gráficos de colunas. A significância estatística foi avaliada em α = 0,05.

Resultados

A aplicação do protocolo de estresse vibracional produziu alterações comportamentais mensuráveis em múltiplos ensaios (Figura 1) projetadas para capturar atividade, comportamento de enfrentamento e tomada de decisão em D. melanogaster.

Indução semelhante à depressão

Moscas expostas a vibrações mecânicas repetidas (Figura 1A) apresentaram atividade exploratória reduzida e respostas ...

Discussão

O protocolo atual demonstra uma abordagem multimodal para induzir e quantificar estados comportamentais semelhantes à depressão em D. melanogaster. Utilizando um paradigma de estresse baseado em vibração combinado com ensaios comportamentais complementares, este estudo mostra que indução semelhante à depressão pode ser detectada em medidas de comportamento de enfrentamento, atividade locomotora, dinâmica exploratória, tomada de decisão e variabilidade^{comportame...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento de anestesia: por exemplo, Benchtop Flowbuddy, Sistema Completo com Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, EUA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Letônia	BS-010210-TAH	Com todas as plataformas
Fechamento de algodão para frascos estreitos	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 EUA	Número de catálogo: 51-101
Monitor de Atividade de Drosophila (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, EUA	DAM2; RRID: não disponível	32 tubos
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, EUA;	Nome do catálogo: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Versão 11.0.1
Webcam Logitech C920 HD Pro, lente HD 1080pNúmero de catálogo: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Suíça	RRID: não disponível	A câmera de gravação superior usada para FST
Frasco de mosca estreito, polipropileno	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 EUA	Número de catálogo: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, Países Baixos	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Sulfato de dodecil de sódio (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Alemanha	Nome do catálogo: Sulfato de dodecil de sódio (reagente ACS, ≥99% de pureza); RRID: não disponível
ZEISS Stemi 508 Estereomicroscópio	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Alemanha	15634448