Análise Metabolômica por Ressonância Magnética Nuclear em Meios de Cultura de Embriões Humanos Gastos: Validação de Métodos e Considerações Técnicas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para coleta, preparação e análise de meio de cultivo de embriões humanos usados usando espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN), permitindo a detecção reprodutível de metabólitos de baixo peso molecular a partir de amostras em escala de microlitros sob condições de cultura clínica rotineira.

Resumo

Os meios de cultura embrionária humana usados contêm metabólitos de baixo peso molecular que podem fornecer uma leitura não invasiva da fisiologia embrionária pré-implantacional. No entanto, a análise metabolômica baseada em ressonância magnética nuclear (RMN) dessas amostras é tecnicamente desafiadora porque condições rotineiras de cultivo embrionário envolvem volumes de microlitros, suplementação proteica e sobreposições de óleo de parafina que geram sinais de fundo e comprometem a qualidade espectral. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado de metabolômica de RMN para meios de cultivo embrionário usados, incorporando coleta controlada de gotículas para minimizar a contaminação por óleo, revestimentos de tubos de etileno propileno fluorado (FEP) para isolar quimicamente a amostra da referência externa (TMSP) enquanto acomodam volumes de microlitros, e aquisição usando uma sequência de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill para suprimir sinais de fundo macromolecular. O protocolo permite a detecção e quantificação consistentes de metabólitos de baixo peso molecular a partir de embriões humanos cultivados individualmente e suporta análises reprodutíveis sob condições laboratoriais rotineiras. Devido a inúmeros desafios técnicos, o método deve ser devidamente validado antes de poder ser usado para pesquisa ou fins clínicos.

Introdução

Durante o desenvolvimento pré-implantacional in vitro., embriões consomem continuamente e liberam metabólitos de baixo peso molecular no meio ao redor. A composição do meio de cultura embrionária (SECM) usado, portanto, reflete a atividade metabólica embrionária e fornece uma leitura funcional não invasiva da fisiologia embrionária e da competência do^{desenvolvimento 1,2}. A análise dessa pegada metabólica pode complementar os métodos convencionais de avaliação e melhorar as estratégias de seleção de embriões na tecnologia de reprodução^{assistida 3,4}. Em particular, alterações na renovação de aminoácidos e carboidratos foram associadas ao potencial e viabilidade do desenvolvimento ^{embrionário 5,6,7}.

A espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN) é amplamente utilizada para o perfilamento de metabólitos não direcionados de diversas amostras biológicas, incluindo meios de cultivo embrionário ^8,9,10. No entanto, a análise dessas amostras continua sendo um desafio^{analítico 11}. Na prática clínica rotineira, embriões são cultivados em microambientes definidos projetados para imitar condições fisiológicas. Os meios de cultivo são suplementados com proteínas, tipicamente albumina, para estabilizar a pressão osmótica, ligar compostos tóxicos e fornecer moléculas transportadoras para lipídios e fatores de crescimento que sustentam o desenvolvimento normal¹². Para evitar a evaporação e manter concentrações constantes de soluto, as gotículas de cultura são sobrepostas com óleo estéril de^{parafina 13}.

Lipídios originados de componentes sobrepostos de óleo e proteína geram amplos sinais de fundo que obscurecem ressonâncias estreitas de metabólitos de baixo peso molecular, como glicose, piruvato e aminoácidos. Além disso, analisar volumes de amostras de microlitros em tubos padrão de RMN de 5 mm requer diluição significativa para alcançar o volume ativo da bobina de RF. Essa redução na concentração do analito diminui severamente a relação sinal-ruído (S/N), mascarando metabólitos de baixa abundância e dificultando a quantificação reprodutível. Embora inúmeros estudos tenham aplicado metabolômicas baseadas em RMN a meios de cultura embrionária humana usados, a ausência de protocolos padronizados e reprodutíveis de coleta e preparação limitou a reprodutibilidade e a comparabilidade entre estudos ^8,9,11.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho metabolômico baseado em RMN (Figura 1), projetado para superar desafios técnicos associados à amostragem e análise de meios de cultura embrionária humana. A abordagem combina coleta controlada de gotículas para reduzir o transporte de óleo, aquisição em microlitros de volume usando revestimentos de etileno propileno fluorado (FEP) para evitar artefatos de diluição, e atenuação de sinais macromoleculares usando uma sequência de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).

Protocolo

Este estudo foi realizado entre janeiro e abril de 2023 no Departamento de Medicina Reprodutiva e Endocrinologia Ginaecológica do Centro Médico Universitário de Maribor, Eslovênia. A análise de RMN foi realizada no Instituto Nacional de Química em Ljubljana, Eslovênia. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes. Recebeu aprovação tanto do Comitê de Ética Institucional (nº: UKC-MB-KME-21/1) quanto do Comitê Nacional de Ética Médica (nº: 0120-37/2021/15).

1. Desenho do estudo

NOTA: O estudo analisou meios de cultivo embrionário humano usando metabolômica baseada em RMN.

1. Colete amostras após a cultura embrionária prolongada após a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Colete um número igual de amostras controle incubadas não gastas.

2. Coleta de amostras

1. Colete amostras de meios de cultivo embrionário (SECM) usados após a incubação do embrião, conforme ilustrado na Figura 2.
2. Após a remoção do embrião da gota de cultura, aspire cuidadosamente o excesso de óleo de camada da superfície do recipiente de cultura sem perturbar o meio (Figura 2, passo 1).
3. Usando uma pipeta estéril, aspire aproximadamente 35 μL de meio de cultura a partir da gota original, deixando aproximadamente 5 μL para evitar que o óleo residual seja absorvido na superfície. Transfira esse volume para uma placa de Petri estéril para formar uma nova gota (Figura 2, passo 2).
4. Sob um estereoscópio, inspecione visualmente a gotícula recém-formada. Aspire cuidadosamente aproximadamente 30 μL dessa gotícula, deixando novamente aproximadamente 5 μL para minimizar a recarga de óleo. Transfira esse volume para um segundo local estéril para formar uma gota mais limpa (Figura 2, passo 3).
5. Inspecione visualmente a segunda gota sob ampliação. Identifique regiões onde as gotículas de óleo são menos pronunciadas. Insira a ponta da pipeta nessa região e aspire aproximadamente 25 μL de meio, novamente deixando aproximadamente 5 μL para minimizar o retransporte de óleo (Figura 2, passo 4).
6. Transfira imediatamente os 25 μL coletados para um tubo de microcentrífuga estéril e livre de RNase. Evite tocar nas paredes internas do tubo durante a dispensação da amostra para evitar contaminação e perda de amostra. Congele imediatamente todas as amostras coletadas em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até a análise de RMN (Figura 2, passo 5).
7. Colete gotículas controle incubadas não gastas (meio incubado sem embriões) preparadas, incubadas e processadas sob condições idênticas de cultura, utilizando os mesmos recipientes de cultura, óleo sobreposto, duração da incubação, ambiente da incubadora e procedimento de manuseio descrito acima, para minimizar a variabilidade ambiental e o potencial viés sistemático.
   NOTA: A adesão rigorosa à transferência sequencial de gotículas e à inspeção visual reduz significativamente a contaminação por óleo. Nesta fase, o experimento pode ser pausado e retomado antes do processamento adicional da amostra para aquisição de RMN.

3. Preparação de amostras para análise de RMN

1. Descongelar amostras em temperatura ambiente por ~10 min.
2. Prepare a mistura de RMN:
   1. Transfira 25 μL de SECM para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 200 μL de D₂O. Faça um vórtice por 10 s e depois centrifuge a 1000 × g por 10 s em temperatura ambiente.
3. Inserir a carga: Transfira 225 μL da mistura para um revestimento FEP.
4. Prepare o tubo de referência externo.
   1. Encha um tubo de RMN de 5 mm com 150 μL de D₂O contendo 1 mM de sal de sódio ácido 3-(trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3-d4 ácido (TMSP-d4).
5. Monte a amostra: Insira o inserto FEP no tubo de RMN e sele com parafilme.

4. Aquisição de RMN e processamento espectral

1. Adquirir ¹aquisição de H-CPMG usando a sequência de pulsos Bruker cpmgpr1d com: 64 varreduras; 65.536 pontos de dados; Atraso de relaxamento: 8 s; Largura espectral: 11,9 kHz; Tempo de eco: 400 μs × 80 loops (filtro T₂ efetivo 32 ms); Tempo total de aquisição: ~15 min.
   NOTA: A duração efetiva do filtro CPMG T₂ de 64 ms foi selecionada com base nos protocolos de metabolômica estabelecidos para amostras biológicas contendo proteínas, onde esse valor proporciona supressão eficiente de sinais macromoleculares enquanto preserva ressonâncias metabólicas de baixo peso^{molecular 14}.
2. Realize processamento espectral:
   1. Obtenha espectros de transformada de Fourier.
   2. Aplique alargamento exponencial de linha a 0,3 Hz.
   3. Realize correção de fase e de base.
   4. Consulte espectros para TMSP-d4 a 0 ppm.
   5. Referência aos deslocamentos químicos (δ) para o sinal externo TMSP-d₄ a 0 ppm.
      NOTA: Como a mistura da amostra dentro do revestimento FEP (225 μL) e a solução de referência_{TMSP-d 4} externa no espaço coaxial externo (150 μL) ocupam geometrias físicas e volumes distintos dentro da janela ativa de detecção da bobina de RMN, suas intensidades absolutas de sinal não escalam 1:1. A quantificação absoluta direta usando a referência externa requer uma curva de calibração geométrica específica do sistema. Portanto, dado o volume estritamente constante das amostras e a precisão de pipetagem altamente reprodutível desse protocolo, integrais de balde brutos foram utilizados diretamente para rastrear variações metabólicas relativas entre amostras, omitindo a necessidade de referência externa ou normalização da intensidade da soma total.
3. Realize binning espectral:
   1. Exclua a região de ressonância da água (por exemplo, 4,65–5,00 ppm) e a região de referência TMSP-d4 (por exemplo, -0,05–+0,05 ppm) antes do binning.
   2. Divida os espectros em baldes de largura variável para evitar a divisão dos picos.
   3. Use integrais de balde brutas para análise estatística, em vez de normalizar para o sinal externo TMSP-d4, pois a referência está fisicamente isolada no volume externo do tubo. Essa abordagem evita erros de quantificação decorrentes dos diferentes volumes ativos do insert em comparação com o tubo externo.
   4. Exporte integrais de balde como uma matriz numérica de dados para análise estatística.
      NOTA: Cada "balde" (ou bin) representa a integral numérica somada de todos os sinais de RMN dentro de uma faixa definida de ppm. Embora esses integrais reflitam a concentração relativa dos grupos químicos presentes nessa faixa, um único balde pode conter sinais de múltiplos metabólitos sobrepostos ou apenas uma parte do sinal total de um metabólito específico.

5. Análise estatística

1. Importação processada ^{por 1}espectro H-CPMG em Python (v3.12) usando nmrglue¹⁵.
2. Remova a água e as regiões espectrais TMSP-d4.
3. Exporte integrais de balde para análise.
4. Realize testes estatísticos usando o SciPy (v1.14.1):
   1. Avalie a normalidade de cada balde espectral usando o teste de Shapiro–Wilk.
   2. Aplique ANOVA unidirecional (para dados normalmente distribuídos) ou Kruskal-Wallis (para dados não paramétricos) para identificar baldes com diferenças estatisticamente significativas entre controle incubado não gasto e meios usados.
   3. Para baldes que apresentam diferenças significativas, realize a atribuição estrutural usando uma combinação de experimentos de RMN 1D e 2D: ^{1 H-13}C HSQC, ^{1 H-13}C HMBC e ^{1 H-1}H COSY.
   4. Compare as correlações 2D observadas com bancos de dados padrão (por exemplo, HMDB) para verificar a identidade dos metabólitos que contribuem para os baldes discriminatórios.

Resultados

O fluxo de trabalho analítico para o perfil metabolômico de RMN não direcionado de meio de cultura embrionária gasto é resumido na Figura 1.

Remoção da contaminação por óleo durante a amostragem
A Figura 2 ilustra o procedimento sequencial de transferência de gotículas usado para reduzir a sobreposição de retenção de óleo. Amostras coletadas sem pipeteamento cuidadoso apresentaram amplas ressonâncias hidrocarbo...

Discussão

Neste estudo, abordamos desafios analíticos importantes associados à identificação e quantificação de metabólitos de baixo peso molecular em meios de cultura embrionária usados, utilizando metabolômica de RMN não direcionada. Nossos resultados mostram que o fluxo de trabalho otimizado permite a aquisição de espectros de alta qualidade e ricos em informação, adequados para a detecção confiável de metabólitos de baixo peso molecular.

A cuidadosa transferência se...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5 mm FEP tube liner	SP Wilmad-LabGlass	4682701	Inserção interna para NMR coaxial
5 mm NMR tube	SP Wilmad-LabGlass	535-PP-7-SB	Tubo externo
6-well culture plate	Oosafe	OOPW-SW02	Prato de cultura de embriões
Cryogenic liquid nitrogen	Messer	Contact manufacturer	Congelamento instantâneo de amostra
Deuterium oxide (D2O)	Eurisotop	D214L	Solvente NMR
Micropipette (10–100 µL)	Eppendorf	4924000053	Pipeta de volume ajustável
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL, RNase-free	Eppendorf	N216966N	Coleta e armazenamento de amostras
Mineral oil	Vitrolife	VTL-10029	Recobrimento de gota de cultura
NMR spectrometer, 600 MHz	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	Aquisição espectral
Pasteur pipette	Falcon	FAL-357575	Transferência de gota
Pipette, single-channel mechanical	Sartorius	728060	Manuseio de amostras
Pipette tips, sterile	Eppendorf	22491148	Compatível com micropipeta
Pipette tips, sterile filter	Sartorius	790201F	Barreira contra aerossóis
Sequential G-series culture media	Vitrolife	VTL-10143	Meio de cultura de embriões
TMSP-d4 (sodium 3-trimethylsilylpropionate-d4)	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-48-1	Referência de deslocamento químico
Tubes, Safe-Lock	Eppendorf	0030121589	Tubos de armazenamento