Avaliação em tempo real e não invasiva da função mitocondrial usando espectroscopia Raman por ressonância

Resumo

Apresentamos um método não invasivo e em tempo real para monitorar a saúde mitocondrial usando Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS). Usamos RRS para quantificar os estados redox mitocondriais e desenvolvemos uma métrica para a saúde mitocondrial, a razão mitocondrial reduzida de Ressonância Raman (3RMR), que mostra uma resposta mais rápida às mudanças na oxigenação do que os analitos tradicionais de gases sanguíneos.

Resumo

Embora as mitocôndrias sejam centrais para a patogênese e progressão da doença, o conhecimento mecanicista sobre a dinâmica da saúde mitocondrial continua sendo custoso e inacessível. Para suprir essa lacuna, este estudo utiliza a Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS) para avaliar a função mitocondrial, utilizando um sistema portátil que fornece medições em tempo real, não invasivas e quantitativas dos estados redox do citocromo mitocondrial em fígados de ratos. Neste protocolo, demonstramos o uso dessa tecnologia, incluindo configuração, aquisição de dados e processamento de dados. Este estudo apresenta um experimento de prova de conceito que destaca a capacidade do RRS de medir mudanças em tempo real no estado redox mitocondrial – e, por extensão, na função mitocondrial. Por um breve período, o dispositivo RRS era conectado a uma bomba a laser, bem como a um computador de aquisição de dados, e posicionado a 1 cm do fígado do rato.  Os parâmetros de aquisição foram selecionados de acordo com o protocolo do fígado de rato; Os estados redox foram medidos em condições oxigenadas e isquêmicas utilizando um teste de estresse de oxigênio. Mudanças nos estados redox mitocondrial foram acompanhadas durante todo o teste de estresse de oxigênio.

Introdução

Mitocôndrias desempenham um papel crucial na função celular e na homeostase. Mitocôndrias são os principais motores do metabolismo celular, regulando a geração de ATP por meio da fosforilação oxidativa. Eles também servem como organelos sinalizadores que ditam o destino celular ao regular vias apoptóticas, assim como ROS e sinalização Ca^{+2 1}. Assim, a disfunção mitocondrial pode levar a várias doenças neurodegenerativas, musculares e^{cardiovasculares 2,3}. Apesar do papel crucial que as mitocôndrias desempenham na progressão da doença, avaliar a função mitocondrial pode ser invasiva, custosa e limitada.

Indicadores-chave da função mitocondrial, como taxa de consumo de oxigênio, fosforilação oxidativa e a atividade de vários complexos dentro da cadeia de transporte de elétrons (ETC), são medidos por meio da respirometria. O ETC é composto por quatro complexos (I–IV) embutidos na membrana mitocondrial interna (IMM). Esses complexos, com a ajuda de outras coenzimas, transferem elétrons de substratos reduzidos, como NADH e FADH2, para o aceitador final de elétrons,_O2, que então é reduzido a água. A maioria dos ensaios contemporâneos de respirometria, como o Seahorse e o O2k de Orobros, requer processamento de tecidos, restringindo assim sua aplicação para pesquisas translacionais ^4,5. Medir o potencial da membrana mitocondrial (MMP) é outro método para avaliar a disfunção mitocondrial, que utiliza fluoróforos lipofílicos catiônicos, como o JC-1, juntamente com imagem microscópica, onde mitocôndrias acopladas (saudáveis) e não acopladas (danificadas) fluorescem com diferentes comprimentos^{de onda 6}. No entanto, esses ensaios podem ter baixa^{sensibilidade 5}. O próprio corante também pode apresentar alta citotoxicidade em altas^{concentrações 5}. Por fim, de forma semelhante às medições de respirometria, essa técnica também requer processamento de tecidos. Técnicas baseadas em espectroscopia têm sido recentemente utilizadas como métodos não invasivos para avaliar a saúde mitocondrial. Por exemplo, a Espectroscopia de Ressonância Magnética de Fósforo (P-MRS), um método que avalia o metabolismo celular medindo as concentrações de metabólitos contendo fósforo, tem sido usada para caracterizar tecido adipogênico engenheirado passando por^{diferenciação 7}. No entanto, essa técnica também requer equipamentos e treinamento especializados.

Nosso grupo demonstrou recentemente uma técnica em tempo real, não invasiva e altamente específica para medir o estado redox mitocondrial como marcador de viabilidade do órgão usando Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS). O RRS utiliza espalhamento inelástico de fótons para quantificar os estados redox dos citocromos mitocondriais. Anéis porfirinos em grupos hemo de moléculas como citocromos mitocondriais, hemoglobina e mioglobina produzem um espectro Raman característico dependendo de seu estado de oxidação quando excitados com um laser^{de comprimento de onda 8} de 441 nm. Embora o sistema RRS utilize um comprimento de onda de 441 nm, lasers com comprimentos de onda de 420 nm e 405 nm também podem ser usados, cada um dos quais potencializa preferencialmente um complexo de citocromo diferente. O espectro obtido de uma amostra desconhecida de interesse é cruzado com bibliotecas pré-gravadas de mitocôndrias intactas totalmente oxidadas ou reduzidas, resultando na razão entre mitocôndrias reduzidas e totais ou o estado redox médio dos citocromos ETC in situ . Essa razão é definida como a Razão Mitocondrial Reduzida por Ressonância Raman (3RMR).

Existem 3 cálculos/tipos distintos de 3RMR: 3RMR mitocondrial (mito-3RMR), 3RMR III complexo (cIII-3RMR) e 3RMR complexo IV (cIV-3RMR). Cada um desses índices é calculado através da fração de reduzida ao número total de um dado componente. Por exemplo, o 3RMR de cIII seria a razão entre o cIII reduzido e o número total de cIII no tecido (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). O mesmo padrão se aplica ao cIV. Assim, 3RMR-cIII referir-se-ia à razão entre cIII reduzido e a quantidade total de cIII, e 3RMR-cIV referir-se-ia à razão entre cIV reduzido e a quantidade total de cIV. Por meio da análise de regressão, ou estados redox mitocondriais (mito-3RMR) são calculados utilizando bibliotecas espectrais de mitocôndrias intactas, ou estados redox complexos individuais (cIII-3RMR e cIV-3RMR) são calculados utilizando bibliotecas espectrais cIII e cIV. Uma publicação^{recente 9} demonstrou que a mito-3RMR representa a média ponderada dos estados redox de cIII e cIV (ou cIII-3RMR e cIV-3RMR). É importante notar que cI e cII não são ativos em Raman nem são ressonantemente aprimorados através do comprimento de onda de 441 nm. Consequentemente, eles não são calculados ao calcular o mito-3RMR.

Aproveitando esses tipos de 3RMR, temos definido a faixa ótima de 3RMR. Em órgãos "saudáveis", as mitocôndrias permanecem intactas e possuem suprimento suficiente de oxigênio. Em contraste, órgãos danificados podem ter entrega ou utilização insuficiente de oxigênio, fazendo com que os complexos ETC acumulem elétrons. O acúmulo de elétrons causa "estresse redutivo", deslocando as mitocôndrias do estado oxidado para o estado reduzido e aumentando os valores de 3RMR. Vários estudos ^8,9,10,11,12, abrangendo corações e fígados em modelos de roedores e suínos, começaram a esclarecer a faixa ideal de "saúde" para a 3RMR, que se propõe estar entre 10 e 30. Por exemplo, Perry et al. submeteram corações de mamíferos à hipóxia, onde um 3RMR de 30% demonstrou fornecer o equilíbrio ideal para sensibilidade e especificidade para detectar^{tecido hipóxico 8}. Essa tendência foi ainda confirmada em estudos adicionais com tecido^{cardíaco 11,12} e enxertos de^{fígado 10}. Além disso, Nyugen et ^al.9 demonstraram que os valores de 3RMR caem para valores muito baixos (oxidados) em tecidos em que o metabolismo parou, com níveis de 3RMR (7,667 ±± 4,926) de fígados quente-isquêmicos não transplantáveis após 3 horas de perfusão normotérmica por máquinas, em comparação com valores de 3RMR acima de 10 (~12–15) para fígados quentes-isquêmicos frescos e^{transplantáveis 9}.

Além dessas demonstrações de como a 3RMR pode medir a viabilidade tecidual, a sensibilidade, especificidade e facilidade de uso do RRS o tornam altamente aplicável a muitos outros tipos de pesquisa onde o metabolismo celular e a função mitocondrial são afetados. Em estudos anteriores, o RRS foi utilizado para detectar degenerescência macular e glaucoma em camundongos por meio da avaliação da atividade metabólica dos axônios não mielinizados das células ganglionares da retina na cabeça do nervo^{óptico 13}. Além disso, foi usado para detectar coarctação da aorta (CoA) em um modelo de rato de doença cardíaca congênita, um diagnóstico frequentemente negligenciado em exames cardíacos^{de recém-nascidos.} Essa tecnologia foi utilizada para entender a função e a viabilidade dos órgãos sob várias condições experimentais relevantes no campo do transplante de órgãos, incluindo estudos que avaliam a viabilidade de órgãos em perfusão de máquina ex ^{vivo 10,11}, avaliam a reoxigenação pós-armazenamento estático^{a frio 14}, ou mitigam lesão por reperfusão de fígados quentes-isquêmicos⁹.

Este artigo busca estabelecer o RRS como uma ferramenta sensível e em tempo real para avaliar a saúde mitocondrial. Fígados inteiros de um modelo de rato foram submetidos a diferentes níveis de isquemia e reperfusão de oxigênio como teste de esforço para avaliar a resposta mitocondrial. Neste teste de estresse por oxigênio, fígados frescos são submetidos a 5 minutos de fluxo inicial de perfusão, 5 minutos de isquemia e 5 minutos de reperfusão. 3RMR, assim como medições de lactato, K+ e pressão parcial de oxigênio (pO2) foram feitas durante todo o teste de esforço. Uma resposta mais rápida às mudanças na oxigenação foi observada com 3RMR em comparação com analitos tradicionais de gases sanguíneos. Com esses experimentos, o uso do RRS é destacado não apenas para estudos mecanicistas, mas também como método diagnóstico e como banco de testes terapêutico. Assim, o protocolo compartilhado pode ser útil para diversos pesquisadores que trabalham com mitocôndrias. No geral, o RRS, com sua natureza não invasiva, em tempo real e altamente específica, pode ter um impacto substancial no metabolismo celular.

Protocolo

Todos os animais para os experimentos foram mantidos de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Pesquisa e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) no Massachusetts General Hospital (Boston, MA, EUA).

1. Configuração e utilização de RRS

1. Descrição do dispositivo:
   NOTA: O sistema RRS portátil (Pendar Technologies; o produto é apenas para fins de pesquisa) utiliza um laser de 441 nm devido a um aprimoramento ressonante do espectro Raman dos citocromos mitocondriais com esse comprimento de onda. O laser funciona entre 4 mW e 8 mW.
   1. Conecte uma fonte de excitação a laser a uma sonda personalizada via cabo de fibra óptica. A sonda projeta um ponto laser de 2 mm de diâmetro no tecido, além de coletar o espectro emitido. O espectro então passa por um filtro passa-banda e é coletado por um arranjo de dispositivo de carga acoplada (CCD). O espectro é coletado a cada segundo em um período de 180 graus e feito em média para criar um espectro bruto e reduzido pelo ruído para análise.
   2. O software compara esse espectro obtido com bibliotecas espectrais pré-medidas por meio de uma análise de regressão.
2. Procedimento para bibliotecas de pré-gravação
   NOTA: Para os experimentos apresentados neste artigo, formas reduzidas e oxidadas de bibliotecas de mitocôndrias, complexo III e complexo IV, hemoglobina e mioglobina foram criadas e utilizadas. Os sinais RRS de todas as bibliotecas eram captados em uma caixa preta à temperatura ambiente (21 °C). Esses arquivos da biblioteca são fornecidos separadamente com o software de análise. No entanto, dependendo do tecido de interesse e da presença de outras moléculas ativas em Raman, outras bibliotecas também poderiam ser criadas adaptando adequadamente o protocolo a seguir. Espectros RRS brutos das bibliotecas de hemoglobina, mioglobina e complexos III/IV oxidados/reduzidos são fornecidos em Figura suplementar 1.
   1. Bibliotecas de hemoglobina (Figura Suplementar 1C):
      1. Colete sangue fresco de roedor por exsanguinação animal. Oxigene o sangue coletado usando 100% de oxigênio, ou desoxigene usando 100% de nitrogênio, em uma cubeta de vidro, adicionando ditionato de sódio.
      2. Meça o RRS de cada estado através da parede da cuveta de vidro por 10 minutos, com a sonda RRS posicionada a 9 mm da cubeta de vidro.
      3. Use picos espectrais em 1356 ^cm-1 para verificar o estado desoxigenado, e use picos em 1376 ^cm-1 para confirmar o estado oxigenado.
   2. Bibliotecas mitocondriais reduzidas/oxidadas (Figura 1)
      1. Isole mitocôndrias de corações de roedores homogeneizados e purificados em uma cuveta de vidro. Coloque a sonda Raman a 9 mm de distância da cubeta de vidro e meça os espectros dessas mitocôndrias através da parede de vidro.
      2. Crie condições totalmente oxidadas fornecendo 100% de fluxo de oxigênio para as mitocôndrias. Verifique o estado oxidado na ausência do pico RR reduzido em 1357 ^cm-1.
      3. Crie condições totalmente reduzidas expondo as mitocôndrias a 100% de nitrogênio com pequenas quantidades de sulfeto de hidrogênio. Verifique as condições reduzidas na ausência do pico oxidado do marcador RR em 1371 ^cm-1.
   3. Complexo III/IV oxidado/reduzido (Figura Suplementar 1A,B):
      1. Isolar os Complexos III e IV conforme descrito em outros^{lugares 9,15,16,17}. Resumidamente, utilize uma amostra de estoque de mitocôndrias isoladas (correspondentes a 200 nanomoles de citocromo a) como material inicial.
      2. Dilua as mitocôndrias para 10 nmol de citocromo A/mL em tampão gelado C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Depois, adicione 10% de p/v de n-β-D-dodecil maltosido (DM) gota a gota até uma concentração final de 1%, enquanto mistura suavemente no gelo.
      3. Centrifuge o extrato a 40.000 × g por 40 min a 4 °C. Aplique o sobrenadante em uma coluna de vidro de 2,5 cm × 20 cm que tenha sido previamente preenchida com uma resina de troca equilibrada com 5 volumes de coluna de buffer C (contendo 0,02% w/v DM).
      4. Após lavagem com 2 volumes de coluna de tampão C, elude os complexos mitocondriais aplicando um gradiente linear de 0–400 mM de NaCl no mesmo tampão e coleta o eluto em frações de 4 mL.
      5. Frações verdes contendo Complexo IV eluíram próximas ao meio do gradiente (~180 mL NaCl), antes das frações avermelhadas contendo Complexo III. Concentre as frações agrupadas contendo cada complexo em 20–30 nmoles de citocromo a/mL.
      6. Uma vez isolados os complexos individuais, expõe-se cada um a condições oxidantes e redutoras. Reduza uma amostra de 11 mM do Complexo III no tampão Tris usando 2 mL de ascorbato (1 M) para reduzir o citocromo c1 e 2 mL de HS (hidrossulfito) para reduzir totalmente os citocromos b_L e_{b H}.
      7. Reduza uma amostra de 18,67 mM do Complexo IV no tampão Tris em múltiplas etapas, já que o Complexo IV passa por um processo de oxidação catalítica em múltiplas etapas. Para reduzir totalmente o Complexo IV, adicione dois comprimidos de 2 mL de_H2O₂ (10 mM), seguidos por 2 mL de HS.
      8. Colete espectros de biblioteca após cada adição para capturar cada etapa do ciclo. Adicione espectros totalmente oxidados e reduzidos à biblioteca de referência final para representar os estados estacionários do complexo IV.
      9. Prepare todas as amostras em um frasco de vidro de 1 mL e segure-as em posição fixa a 9 mm da lente da sonda, encerrando-as em uma caixa preta para evitar contaminação por luz. Colete espectros RRS por 600 s para cada estado complexo e de oxidação.
      10. Validar a pureza de cIII e cIV isolados conforme descrito^{anteriormente 17}, e validar a adequação das bibliotecas espectrais isoladas de cIII e cIV na explicação dos espectros mitocondriais completos, conforme descrito em um artigo^{recente 9}.
   4. Bibliotecas de mioglobina (Figura Suplementar 1D):
      1. Usando fluxos semelhantes de oxigênio e nitrogênio (com ditionito de sódio dissolvido), varia a saturação de oximioglobina do extrato de mioglobina miocárdica entre 0% e 100%. Verifique os espectros Raman por meio de picos marcadores em 1355 ^cm-1 e 1376 ^cm-1.

NOTA: A maioria dos componentes espectrais detalhados acima, como hemoglobina ou mitocôndrias oxidadas/reduzidas, são moléculas contendo hemes e são excitadas pelo mesmo comprimento de onda. Esse sistema RRS evita sobreposição de sinais ao criar uma biblioteca de regressão para cada molécula baseada em seu sinal espectral único. Os espectros espalhados obtidos são executados por um algoritmo de regressão contra as bibliotecas selecionadas. O algoritmo de regressão fornece um fator para cada espectro de biblioteca que representa a estimativa mais adequada de sua contribuição relativa no espectro registrado e, portanto, sua concentração relativa no tecido. Como o algoritmo utiliza o melhor ajuste em uma faixa de números de ondas, pequenas diferenças na posição ou intensidade dos picos espectrais dos diversos componentes da biblioteca permitem que a regressão discerna até mesmo cromóforos próximos de forma próxima. Por meio do algoritmo de regressão e das bibliotecas espectrais, o sistema RRS pode dividir o sinal total espalhado em vários componentes dependendo de seus picos espectrais únicos, evitando sobreposição de sinais de moléculas contendo hemes. Para mostrar a relação entre hemoglobina e mitocôndrias, está incluída a Figura Suplementar 2 , que fornece imagens de espectros retirados de uma perfusão hepática, fragmentados no sinal medido, na linha de melhor ajuste e no residual inexplicado que resulta das diferenças nos picos espectrais individuais. No painel A, são selecionadas as bibliotecas de regressão de hemoglobina reduzida e oxidada e de mitocôndrias reduzidas e oxidadas. A linha de melhor ajuste curada pelas bibliotecas e pela análise de regressão se sobrepõe perfeitamente ao sinal medido, e há pouco resíduo inexplicado. No painel B, apenas bibliotecas de mitocôndrias oxidadas e reduzidas são selecionadas. Como há uma grande estrutura residual inexplicada, o pico espectral mitocondrial é deslocado vários números de onda em relação ao da hemoglobina, que não foi incluída na análise de regressão. Além disso, nas figuras suplementares de Nguyen et ^al.9, os autores explicam a relação entre mitocôndrias e os complexos individuais (cIII e cIV), bem como a relação entre os complexos^{individuais 16}, onde o complexo III apresenta picos mais agudos e de frequência mais baixa, enquanto o complexo IV apresenta bandas mais amplas e deslocadas para cima. Além disso, os autores mostram que as bibliotecas reduzidas de Complexo III e Complexo IV explicam completamente o espectro medido de mitocôndrias inteiras reduzidas, resultando em resíduos inexplicáveis mínimos.

Figura 1: Bibliotecas espectrais de mitocôndrias totalmente oxidadas e reduzidas. Espectros da biblioteca RRS foram obtidos após mitocôndrias isoladas receberem (A) 100% de oxigênio, ou 100% de nitrogênio (B) para alcançar estados oxidado e reduzido, respectivamente. Esses estados foram confirmados com a presença de picos oxigenados e reduzidos do marcador (D) RR (C). O deslocamento desses picos corresponde a alterações nos modos vibracionais moleculares na presença de oxigênio. A intensidade de cada pico é normalizada para 1 unidade arbitrária de intensidade (UA), pois o aumento do estado reduzido é maior usando esse comprimento de onda de excitação de 441 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Coleta de dados usando RRS

1. Configuração do dispositivo:
   1. Conecte a unidade do espectrômetro (alojada dentro de uma caixa compacta) à fonte de corrente contínua (DC) e ao adaptador de energia usando os cabos fornecidos. A unidade do espectrômetro possui um plugue redondo com reentrâncias de alinhamento.
   2. Alinhe as marcas do plugue redondo com as do cabo que é conectado ao adaptador de energia. Não é necessária limpeza antes de conectar as portas (Figura 2).
   3. Conecte o computador que executa a análise ao mesmo adaptador de energia que conecta o espectrômetro e a fonte de alimentação usando os cabos fornecidos.
   4. Coloque a sonda a laser no suporte da sonda. Ajuste a posição dessa sonda no início do experimento.
   5. Abra o software de controle do espectrômetro (Software de Energia Celular).
2. Configuração de software:
   NOTA: Arquivos de configurações e bibliotecas de regressão para diferentes tipos de tecido são fornecidos com o sistema. Esses arquivos incluem informações sobre quais bibliotecas o sistema RRS deve incluir na regressão, quantos espectros estão incluídos na janela de regressão e outros parâmetros como potência do laser. Configurações padrão podem ser alteradas e um novo arquivo de configurações salvo para uso em experimentos futuros. Capturas de tela do software detalhadas abaixo são apresentadas na Figura Suplementar 3.
   1. Ao abrir o software de controle do espectrômetro, aparecerá um gráfico mostrando a porcentagem de 3RMR, Saturação de Oxigênio (_{StO 2}) e saturação de mioglobina. Essa tela é onde essas métricas serão exibidas, se selecionadas, em tempo real durante as medições. Clique na aba Configurações no canto inferior esquerdo da página.
   2. Na aba Informações , insira as informações da sessão em Nome da Sessão e quaisquer detalhes necessários na aba Descrição da Sessão .
   3. Existem dois modos de coleta de dados. Use o modo Verificação Pontual para acumular espectros até que as métricas de qualidade especificadas sejam atendidas (por exemplo, sigma alvo ou janela/número de espectros de regressão), então pare de gravar. Use o Modo Contínuo para registrar espectros até que o botão de parada seja pressionado. Em ambos os modos, todos os dados, tanto os resultados do 3RMR quanto os espectros individuais, são armazenados automaticamente. Este experimento utiliza o Modo Contínuo.
   4. Depois de inserir todas as informações da sessão, clique na aba Sistema .
   5. Em Arquivo de Configurações, selecione o protocolo apropriado para o projeto (para perfusões acelulares de fígado de rato, escolha o protocolo Acelular de Fígado de Rato ). Isso ajustará automaticamente o tipo de medição, o comprimento médio da medição (janela de regressão), bem como o sigma alvo.
      1. Para criar um novo arquivo de configurações, ajuste qualquer um dos componentes listados acima e clique no botão Salvar . Isso deve salvar esses parâmetros como um arquivo de configurações separado que pode ser importado para o sistema.
      2. Para importar um novo arquivo de configurações, clique no menu suspenso ao lado de Padrão (Mod) e selecione Importar Novo Arquivo de Configurações. Clique no novo arquivo de Configurações para ser importado.
   6. Em Bibliotecas de Regressão, selecione e confirme a combinação de bibliotecas a serem usadas para aquisição e análise de dados. As bibliotecas para mitocôndrias reduzidas e oxidadas [Apenas Mito] foram selecionadas para este experimento. Outros usuários podem optar por usar bibliotecas que também incluem hemoglobina, mioglobina ou outros complexos encontrados na Biblioteca Avançada.
   7. Selecione e confirme o Modo de Largura de Janela preferido.
      1. Modo de largura adaptativa: Use o modo de largura adaptativa para adicionar espectros individuais ao espectro médio até que o alvo máximo de sigma seja atingido. Se o alvo sigma não for alcançado, a gravação parará quando atingir o limite superior da janela de regressão definida (ou seja, o número máximo de espectros que foi instruído a registrar). Os resultados da medição serão exibidos na tela após o alvo mínimo de sigma ser atingido.
      2. Modo de largura fixa: Use o modo de largura fixa para adicionar espectros individuais ao espectro médio até que o número alvo de espectros seja incluído (definido abaixo do comprimento médio).
   8. Quando as configurações do sistema estiverem completas, clique na aba Plot .
   9. Em Série Principal, selecione os componentes a serem plotados e exibidos na tela durante as medições.
   10. Confirme que todos os componentes de medição selecionados estão em conformidade com o protocolo de interesse.
3. Aquisição de dados:
   NOTA: As medições Raman devem ser feitas em um espaço escuro. Antes de iniciar a aquisição de dados, certifique-se de que o espaço de trabalho esteja o mais protegido possível contra a luz. Se o cômodo não puder ser totalmente protegido da luz, o sistema RRS vem com uma tampa preta com uma abertura retangular no centro (mostrado em Figura 2), através do qual a sonda a laser pode ser posicionada. A caixa pode cobrir a amostra/a seção do órgão onde as medições do RRS são feitas por meio do Serviço Aéreo. Ao trabalhar com o laser RRS, evite exposição direta ou prolongada aos olhos. Não aponte um laser diretamente no olho ou em superfícies refletivas. Ative o laser apenas quando estiver posicionado diretamente no tecido de interesse. O laser RRS é um laser Classe 3R quando usado a 4 mW, e Classe 3B quando usado a 10 mW. O laser é seguro para contato com tecidos.
   1. Selecione as configurações pré-salvas, parâmetros de gravação e arquivos de biblioteca apropriados.
   2. Coloque a sonda laser diretamente acima do tecido/órgão de interesse. Posicione a sonda o mais perpendicular possível e a 1 cm de distância do tecido. Use uma régua para medir com precisão a 1 cm da superfície do órgão. Ajuste a sonda para posicionar-se mais próxima que 1 cm se o sinal não estiver claro. No entanto, certifique-se de que a sonda nunca toque o tecido.
      NOTA: A sonda pode ser portátil, mas recomenda-se usar um suporte/suporte para sonda que possa ser ajustado e permaneça estável. Posicione a sonda o mais perpendicular possível e a 1 cm de distância do tecido. Uma régua podia ser usada para medir com precisão 1 cm da superfície do órgão. A sonda pode ser ajustada para ser posicionada mais próxima que 1 cm se o sinal não estiver claro. No entanto, a sonda nunca deve tocar no tecido.
   3. Confirme que o ponto laser está no lobo lateral esquerdo, o mais próximo possível da veia porta.
   4. Confirme que todas as bibliotecas selecionadas, configurações de regressão, sigma alvo, janela de regressão e modos de aquisição estão corretos e conforme desejado.
      1. Certifique-se de que o cômodo fique o mais escuro possível. Verifique se a sonda não tem nenhuma contaminação, especialmente sangue, na janela. Em caso de contaminação, use um lenço sem fiapos e não abrasivo com álcool isopropílico 70% para limpar a janela de quartzo, seguido de uma secagem completa com um lenço seco antes de prosseguir.
      2. Em caso de contaminação grave, limpe a sonda o mais completamente possível, conforme descrito acima. Depois, calibre o dispositivo colocando o laser em um gabinete escuro forrado com fita preta e pressionando o botão Take Dark . A calibração leva cerca de 5 a 10 minutos. Independentemente da contaminação, calibre o dispositivo uma vez por mês e ele enviará mensagens automáticas de lembrete.
         NOTA: As explicações de cada métrica de controle de qualidade, exemplos dessas métricas de QC e o sinal espectral bruto obtido a partir de registros ótimos e subótimos (Arquivo Suplementar 1, Figura 3, Figura Suplementar 3). Esses critérios de controle de qualidade foram otimizados para fígados inteiros a partir do modelo de rato. Qualquer protocolo recém-desenvolvido usando um órgão/modelo animal diferente deve refinar e ajustar essas métricas de acordo.
   5. Na página principal, clique no botão Iniciar para começar a adquirir dados. Dependendo das configurações escolhidas, o software fará gravações até que o valor de erro alvo (sigma) ou 180 s seja atingido. A aquisição de dados já está concluída.
      1. Inferir a qualidade do sinal RRS a partir desses gráficos e valores para permitir o ajuste da posição da sonda ou das condições de medição (Figura 3). Se o sinal RRS obtido não atender a esses critérios de controle de qualidade, ajuste a sonda para ser o mais perpendicular possível e cerca de 9 mm da superfície até a janela da sonda.
   6. Uma vez concluído o protocolo de coleta de dados/experimento, descarte todo o fígado/tecido em uma caixa de risco biológico. Limpe qualquer sistema ou superfície que tenha estado em contato com o órgão/tecido com 70% de etanol.
      1. Se estiver trabalhando com um sistema de perfusão, administre água DI misturada com limpador enzimático (7,8 mL diluído em 1 L de água deionizada [DI]), seguida de água DI limpa.
         NOTA: Cada gravação será salva como um arquivo de análise separado em um novo arquivo de sessão. Os resultados para 3RMR e força do sinal mitocondrial (r3RMR) são apresentados na janela principal. O espectro bruto também pode ser exibido. Outras métricas de verificação de qualidade, como força residual do sinal e força total do sinal, serão exibidas na aba Espectro .
4. Análise de dados:
   1. Depois de concluir a aquisição dos dados, clique na pasta Review na parte inferior da tela para abrir o arquivo experimental e ver os resultados.
   2. Alternativamente, abra um arquivo de texto contendo os resultados. Selecione o arquivo de sessão de interesse. Um arquivo de análise contendo todas as medições obtidas será aberto. Cada parâmetro e seu valor sigma terão sua própria coluna. Por exemplo, valores de 3RMR obtidos a cada segundo serão listados na coluna "3RMR", e seu valor sigma será listado em "sigma_3RMR".
   3. A última linha de cada coluna conterá os valores finais para cada parâmetro daquele arquivo de sessão. Use esse valor para plotar.
   4. Repita os passos para cada arquivo de sessão/cada gravação. Plote os valores obtidos conforme desejado.

Figura 2: Configuração do dispositivo RRS. Um esquema da configuração do sistema RRS. A sonda é conectada por um cabo de fibra óptica ao sistema RRS, que contém a fonte de excitação a laser e o espectrômetro. Essa configuração então se conecta a qualquer laptop que contenha o aplicativo de controle do espectrômetro para coleta e análise de dados. Tanto o computador quanto a unidade do espectrômetro estão conectados a uma tomada de energia. As medições do RRS devem ser feitas no escuro. Se o cômodo não puder ser totalmente protegido da luz, o sistema RRS vem com uma tampa preta com uma abertura retangular no centro, onde a sonda laser pode ser colocada. A caixa cobre a amostra/a seção do órgão de onde as medições do RRS estão sendo feitas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Exemplos de trilhas e métricas de controle de qualidade de trilhas de qualidade subótima e ótima de qualidade. O sinal residual (ruído) é marcado com um suporte laranja, e o sinal mitocondrial com um suporte verde. (A) Exemplo de traço de um sinal Raman subótimo. O sinal residual é grande demais para ser diferenciado do sinal mitocondrial. Picos espectrais são indistinguíveis ao longo do sinal medido. (B) Exemplo de traço a partir do sinal Raman ótimo. O sinal mitocondrial é visivelmente maior e distinto do sinal residual. Picos espectrais da medição obtida são distinguíveis. (C) Métricas de QC obtidas de cada sinal. No geral, o sinal total obtido na leitura subótima é menor do que a leitura ótima. Mais sinal mitocondrial é medido na gravação ótima em comparação com a gravação subótima, com o sinal mitocondrial representando, respectivamente, 17% e 14% do sinal total. O sinal foi medido com erro de 4,3% na leitura ótima, em contraste com 18,5% de erro na leitura subótima. De forma semelhante, o sinal residual inexplicado representa 11% do sinal total na gravação subótima, enquanto representa 3,6% na ótima. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Avaliação da saúde mitocondrial usando RRS

NOTA: A tecnologia de Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS) foi empregada para desenvolver uma métrica de viabilidade mitocondrial (3RMR) que indica a viabilidade de órgãos transplantados. Este estudo tem como objetivo demonstrar como as mudanças na oxigenação – e, por extensão, na respiração celular – se refletem nas tendências do 3RMR em comparação com biomarcadores tradicionais de dano, como lactato e K⁺. Aqui é utilizado um teste de estresse de oxigênio, onde, após 5 minutos de perfusão contínua, o fluxo de perfusão oxigenado é pausado por 5 minutos e retomado por 5 minutos. Medições do RRS, assim como amostras de perfusado de entrada e saída, são feitas durante todo o teste de esforço.

1. Aquisição do fígado:
   1. Sedar animais em uma câmara de indução usando isoflurano 3%–5%. Filtre o excesso de vapor com carvão ativado.
   2. Realize uma hepatectomia completa em ratos Lewis machos (150 g). Liga os ramos da veia porta. Injete 50 U de heparina de sódio pela VCI. Cânule a veia porta com um cateter de 16 G durante a cirurgia e lave o fígado com 50 mL de soro fisiológico.
   3. Coloque os fígados adquiridos no gelo em uma placa de Petri contendo 30 mL de solução da Universidade de Wisconsin (UW).
2. Configuração de perfusão subnormotérmica de máquinas (SNMP) e medições de Raman por ressonância:
   1. Configure o dispositivo RRS conforme descrito anteriormente. Defina o Protocolo Acelular de Fígado de Rato no software de controle do espectrômetro, que automaticamente define o modo largura para largura adaptativa, comprimento médio para 180 e sigma alvo para 1,5. Também seleciona 3RMR e Fluorescência como parâmetros de medição, assim como apenas Mito como biblioteca de regressão. Defina o modo de aquisição para modo contínuo.
   2. Configurar o sistema SNMP conforme descrito em outro^{lugar 18}.
      1. Resumidamente, certifique-se de que o sistema de perfusão consista em uma câmara de perfusão, uma bomba peristáltica, um oxigenador de membrana e uma armadilha de bolhas.
      2. Fornecer oxigênio com uma mistura atmosférica (95%_O2 e 5%_CO-2); Mantenha o_{pO 2} entre 400–500 mmHg. Monitore a pressão intra-hepática com um sensor de pressão e mantenha-a entre 3–5 mmHg. Colete as amostras através de portas de amostragem.
   3. Depois que o software e o sistema de perfusão estiverem configurados, conecte a cânula que penetra o PV ao tubo de entrada da máquina de perfusão. Mantenha o órgão, perfuso e perfusão configurados em temperatura ambiente (21 °C), sem a ajuda de banho-maria.
   4. Administre o perfusado ao órgão através da cânula na PV utilizando uma bomba peristáltica.
      1. Para preparar o perfusado, misture 500 mL de Williams' Medium sem fenol vermelho com 5 g de Albumina Sérica Bovina (BSA), 12 mg de dexametasona solúvel em água, 5 mL de penicilina-estreptomicina, 5 mL de L-glutamina, 2,5 μL de insulina e 1000 U de heparina.
      2. Mexida todos os componentes em uma placa de mexida por cerca de 20 minutos, ou até que todos estejam dissolvidos. Aumente os fluxos de perfusão para pressões de escoamento de 3–5 mmHg.
   5. Em seguida, coloque a fonte do laser RRS no suporte da sonda e posicione-a a 1 cm acima do maior lobo do fígado, o mais próximo possível do PV. Pause o fluxo de perfusão aos 5 minutos (T₅) e retome aos 10 minutos (T₁₀). Realize o teste de esforço em 15 minutos (T₁₅).
   6. Faça medições de RRS durante todo o teste de esforço; faça medições de entrada e saída a cada 5 minutos, começando em T₀ (Figura 4). Plote os valores de 3RMR, assim como os níveis de K⁺ de saída e níveis de lactato para T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Figura 5).
   7. Calcule a taxa de consumo de oxigênio (OCR) em T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ multiplicando a pressão parcial de entrada e saída de oxigênio (_{pO 2}) pelo coeficiente de solubilidade do oxigênio no plasma (0,00314). Plote o OCR para T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Figura 5).
      NOTA: Traços espectrais de Ressonância Raman exemplares em estados perfundidos (T₅), isquêmicos (T₁₀) e reperfusos (T₁₅) de um fígado são mostrados (Figura 6)

Figura 4: Diagrama que mostra o fluxo experimental. Uma hepatectomia completa foi realizada em fêmeas de rato Lewis. O fígado extraído foi colocado em perfusão subnormotérmica por máquina e fornecido com perfusado oxigenado pelos primeiros 5 minutos. O perfusado flui para o fígado através da veia porta e recircula pela bomba peristáltica (fluxo de perfusão representado com setas azuis). A perfusão oxigenada foi pausada pelos próximos 5 minutos no T5 e reiniciada por mais 5 minutos no T10. Medições 3RMR realizadas durante todo o teste de esforço (representadas como o laser). Amostras de perfusado foram obtidas em T0, T5, T10 e T15. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Fígados frescos foram submetidos a períodos de isquemia e reperfusão utilizando teste de esforço por oxigênio. Em seguida, as mudanças em tempo real na 3RMR foram comparadas durante o teste de esforço com a taxa de consumo de oxigênio, lactato de saída e potássio obtidos pela análise de perfusos em T₀, T₅, T₁₀, T₁₅. Em condições saudáveis, os valores de 3RMR devem estar entre 10% e 30% (Figura 5A). Como esperado, os valores de 3RMR em T₀ e_{T 5} se enquadram nessa faixa, já que o fígado foi continuamente fornecido com perfusado oxigenado entre esses pontos de tempo (Figura 5A). No entanto, o valor de 3RMR ao final do período isquêmico (T₁₀) está fora da faixa ótima (Figura 5A). Esse aumento indica que as mitocôndrias estão se deslocando para seu estado reduzido, à medida que os elétrons se acumulam ao longo da cadeia de transporte devido à desoxigenação. Em T_10, o fluxo oxigenado é retomado; O período de reperfusão começa. Ao final do período de reperfusão (T₁₅), os valores de 3RMR retornam aos níveis ótimos (Figura 5A) à medida que a atividade do ETC é restaurada com a reintrodução do oxigênio como o último aceitador de elétrons. Essas mudanças no fluxo de oxigênio também são visíveis nos espectros brutos. Espectros brutos de RRS em T₀ e_{T 15} possuem características espectrais semelhantes às das mitocôndrias oxidadas (Figuras 6A,C), como um pico de marcador espectral em 1371 ^cm-1 (Figura 6D,F). De forma semelhante, os espectros Raman brutos em T₁₀ (Figura 6B) mostram marcadores RR reduzidos, como um pico espectral de marcador em 1357 ^cm-1 (Figura 6E). Em conclusão, o RRS identifica as mudanças nos estados redox mitocondriais em tempo real, o que é demonstrado tanto no sinal espectral bruto quanto como uma métrica da saúde mitocondrial (3RMR).

O RRS também pode calcular valores de 3RMR com base nos estados redox de cIII e cIV. Um padrão semelhante foi observado nos valores de 3RMR de cIII e cIV (Figura 5B). Em T₀, foram observados valores totalmente oxidados de 3RMR para cIV e valores de 3RMR dentro da faixa ótima para cIII. Esse equilíbrio redox entre os complexos é fisiológico, pois os elétrons fluem do cIII para o cIV para serem rapidamente oxidados. Com o início da isquemia, observou-se um aumento nos níveis de 3RMR para cada complexo. Durante o período isquêmico, o acúmulo de elétrons através do ETC aumenta o estresse redutor sobre cIII e cIV, o que, consequentemente, aumenta cIII-3RMR e cIV-3RMR. No entanto, após a reintrodução do oxigênio, os valores de 3RMR de ambos os complexos diminuem novamente para níveis ideais: cIV totalmente oxidado e cIII fisiologicamente reduzido (Figura 5B). As tendências de 3RMR em ambos os complexos mostram que a cessação do oxigênio impacta todo o ETC, e nenhum complexo individual é especialmente vulnerável à isquemia sem fluxo.

Por outro lado, as mudanças na dinâmica de oxigenação não foram refletidas em biomarcadores de dano e analitos de gases sanguíneos obtidos por análise de perfusos. Com o início da isquemia, espera-se que o lactato e o K⁺ aumentem, pois a célula começa a depender da respiração aeróbia e lentamente se degrada para liberar K⁺ intercelular. Também esperamos que o OCR diminua, pois as células não produzem energia suficiente para continuar a respiração celular. Mesmo após um período de isquemia sem fluxo, as taxas de consumo de oxigênio não mostraram sinais de danos. Os níveis de lactato de saída e K⁺ permanecem relativamente consistentes durante todo o teste de esforço, apesar das mudanças na oxigenação (Figuras 5D–E).

Figura 5: Alterações no 3RMR e biomarcadores de dano durante o teste de estresse de oxigênio. Início da isquemia e períodos de reperfusão são representados por linhas pontilhadas nos minutos 5 e 10, respectivamente. Além disso, períodos de fluxo oxigenado são representados com linhas azuis, e períodos de isquemia são representados com linhas vermelhas. (A) Valores de 3RMR durante todo o ensaio mitocondrial. Os valores de 3RMR aumentam quando o fluxo oxigenado é pausado e diminuem novamente para níveis ideais quando o fluxo é reiniciado. (B) 3RMR valores de complexo III e complexo IV. A cessação do fluxo leva a uma redução em ambos os complexos. (C^{) Média de} K+ valores de saída durante o teste de estresse. Os valores de K⁺ permanecem consistentes durante todo o teste de esforço, apesar das mudanças na dinâmica de oxigenação. (D) Níveis médios de lactato de saída durante o teste de esforço. A produção de lactato permanece constante durante todo o teste de esforço. (E) Taxas de consumo de oxigênio em T₀, T₁₀, T₁₅. Como os valores de_{pO 2} são medições baseadas em fluxo, OUR não pôde ser calculado para um período de isquemia sem fluxo. Nenhuma mudança significativa foi observada (p-valor: 0,2500) (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Traços espectrais exemplares brutos de um fígado fresco de rato durante o teste de esforço. Perfis espectrais completos de um fígado em (A) estados oxidados, (B) isquêmicos e (C) reperfados. O deslocamento do marcador RR oxigenado para o marcador RR reduzido é visível ao ampliar o pico espectral das mitocôndrias, marcado com uma caixa vermelha em cada perfil espectral. (D–F) Picos oxidados de marcadores RR (1371 ^cm-1) estão presentes nos estados (D) oxidados e (F) reperfusos e são marcados com uma linha pontilhada vermelha. O pico reduzido do marcador RR (1357 ^cm-1) está presente no estado isquêmico (E) e é marcado com uma linha tracejada azul. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Traços espectrais de complexo III reduzido e oxidado, complexo IV, hemoglobina e mioglobina. (A) Complex III, (B) complexo IV, (C) hemoglobina e (D) mioglobina. A análise de regressão executa os espectros coletados contra essas bibliotecas espectrais (se selecionadas), resultando em um fator para cada espectro de biblioteca que representa a melhor estimativa de sua contribuição relativa no espectro registrado e, portanto, de sua concentração relativa no tecido. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplo de utilização de bibliotecas de regressão para quebrar moléculas sobrepostas contendo heme (hemoglobina e mitocôndrias oxidadas/reduzidas). (A) Foram selecionados traços espectrais brutos do tecido hepático perfundido com perfusado celular, com todas as bibliotecas de regressão necessárias, como hemoglobina, hemoglobina oxidada, mitocôndrias reduzidas e mitocôndrias oxidadas. É claro que a linha de melhor ajuste, derivada das bibliotecas e da análise de regressão, se sobrepõe perfeitamente ao sinal medido, com pouco resíduo inexplicável. (B) Traço espectral bruto do mesmo tecido, mas com apenas bibliotecas de mitocôndrias oxidadas e reduzidas selecionadas. Como há uma grande estrutura residual inexplicada, é claro que o pico espectral mitocondrial está deslocado vários números de onda em relação ao da hemoglobina, que não foi incluída na análise de regressão. Esta figura mostra que o espectrômetro de alta resolução e a análise de regressão em relação a todo o espectro conseguem distinguir espectros intimamente relacionados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Captura de tela do software. (A) Janela principal que exibe valores de medição ao longo do tempo. 3RMR, StO2 e qualquer outra série selecionada serão exibidas aqui durante a medição. Além disso, a intensidade do sinal de cada série será exibida como uma linha tracejada no gráfico, e um valor abaixo no lado direito da tela. Por exemplo, a linha sólida capturada aqui representa o 3RMR de um tecido, e a linha tracejada representa o r3RMR (intensidade do sinal do 3RMR). Se alguém quiser ver a qualidade dos espectros gravados, pode clicar na aba Mostrar espectro (circulada em roxo). (B) Tela que exibe os espectros brutos do tecido. Essa é a aba onde se pode avaliar a qualidade do sinal através da intensidade dos espectros medidos em relação ao ruído residual. (C) Aba que mostra tendências em séries ao longo do experimento. Se for realizado, por exemplo, múltiplas medições de 3RMR ao longo de um experimento, cada medição será exibida ao longo do tempo nesta aba. Tendências em outras séries, se selecionadas, também serão exibidas aqui. Essa aba podia ser acessada clicando no botão Tendências na tela principal (circulado em verde sobre A). (D) Aba de informações, onde se pode inserir informações experimentais, como nome e descrição da sessão. (E) Aba de sistema, onde se pode enviar protocolos pré-carregados. Por exemplo, ao selecionar o protocolo LiverContAcell, este protocolo definirá a biblioteca de regressão, a janela de regressão alvo e sigma de acordo com o protocolo de perfusão acelular para fígados de ratos. Para importar um protocolo, é possível clicar em Importar Configurações do Arquivo e importar o protocolo de interesse. Se alguém quiser criar seu próprio protocolo, pode selecionar as bibliotecas necessárias no menu suspenso da Biblioteca de Regressão (F), ajustar o sigma alvo e a janela de regressão, assim como alarmes, e clicar no Salvar (representado com um disco) no canto inferior esquerdo. (F) Aba de plotagem, onde é possível selecionar qual série exibir na janela principal. Se estiver reanalisando um espectro, e alguém quiser adicionar mais séries às medições anteriores, pode selecionar a série de interesse abaixo da seção Recal. Durante a recalibração (Recal), o software reanalisará os espectros brutos medidos e exibirá os resultados das séries recém-selecionadas. Também é possível selecionar para mostrar a intensidade do sinal das séries selecionadas nesta aba. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Explicações de cada métrica de controle de qualidade.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo destaca um método não invasivo, em tempo real e altamente sensível para quantificar a saúde mitocondrial usando um sistema portátil de Espectroscopia Raman por Ressonância, composto por um laser em uma sonda compacta, conectado por um cabo de fibra óptica a uma bomba de laser. Esse método usava um laser de 441 nm para excitar mitocôndrias, que produzem sinais espectrais únicos dependendo de seu estado de oxidação. Assim, o RRS é capaz de quantificar cada estado das mitocôndrias por meio de suas assinaturas espectrais e comparar os espectros emitidos com bibliotecas espectrais pré-medidas usando análise de regressão. Uma métrica de saúde mitocondrial foi então criada com base na razão entre mitocôndrias reduzidas e totais: a Razão Mitocondrial Raman de Ressonância Reduzida (3RMR).

Este artigo foca em demonstrar mudanças em tempo real na 3RMR como função da oxigenação com tecido nativo, sem a necessidade de processamento da amostra. Isso foi alcançado por meio de um teste de estresse por oxigênio: após 5 minutos de perfusão oxigenada contínua, o fluxo de perfusão é pausado por 5 minutos e reiniciado por mais 5 minutos. Medições de 3RMR são feitas durante todo o teste de esforço. Um modelo de teste de estresse, onde alternamos entre períodos isquêmicos e oxigenados, nos permite acompanhar mudanças contínuas nos estados redox mitocondriais – e, por extensão, na função mitocondrial. Em outras palavras, o teste de estresse de oxigênio nos permite acompanhar as tendências na 3RMR em função da oxigenação. Nosso grupo atribuiu o aumento dos valores de 3RMR a condições isquêmicas, interrompendo o fluxo de perfusão, o que faz com que elétrons que passam pelo ETC se acumulem, já que o_O2 não está disponível como aceitador final de elétrons. Esse acúmulo de elétrons causa um estado reduzido, o que se traduz em um aumento nos valores de 3RMR. No entanto, com a reintrodução do_O2, espera-se que as mitocôndrias saudáveis retomem a atividade do ETC e se recuperem aos estados fisiológicos redox, pois seus elementos estruturais e funcionais permanecem intactos.

Como esperado, no presente artigo, foi observado um aumento contínuo e em tempo real da 3RMR durante todo o período isquêmico (Figura 5A). De forma semelhante, a 3RMR retorna gradualmente aos níveis ótimos ao longo do período de reperfusão (Figura 5A). Essa mudança em tempo real nos estados redox mitocondrial também é visível no gráfico espectral, à medida que o pico mitocondrial se desloca de estados oxidados (1371 ^cm-1) para estados reduzidos (1357 ^cm-1) ao longo do período isquêmico, retornando à oxidação ao final da reperfusão (Figura 6). Outros picos reduzidos dos marcadores RR também aparecem durante o período isquêmico. Ao contrário dos ensaios tradicionais de saúde mitocondrial, o Resonance Raman é sensível o suficiente para quantificar os estados redox do complexo III e do complexo IV, o que poderia, e já forneceu, uma visão mecanicista sobre o impacto específico das lesões por isquemia-reperfusão no ETC. Em mitocôndrias saudáveis, os elétrons passam por vários complexos no ETC, começando pelo complexo I, até alcançarem_O2 como o aceitador final de elétrons. Uma pausa no fluxo de oxigênio pode deslocar cada complexo para um estado reduzido, à medida que os elétrons ficam acumulados ao longo do ETC. Como esperado, foi observado um aumento em tempo real nos valores de 3RMR de cIII e cIV com o início da isquemia. Isso indica que a ausência de_O2 impacta todo o ETC, e não um complexo específico (Figura 5B). Como discutiremos a seguir, a sensibilidade do SRR facilita estudos mecanicistas detalhados e orienta o desenvolvimento de terapias direcionadas para IRI.

Tradicionalmente, também esperamos observar níveis elevados de lactato nos órgãos isquêmicos, já que eles dependem do metabolismo anaeróbico na ausência de oxigênio para produzir ATP. Da mesma forma, esperava-se um aumento nos níveis de K⁺ em órgãos danificados, já que a integridade da membrana das células é prejudicada, permitindo um vazamento de K⁺ intercelular. Por fim, células severamente danificadas podem ter metabolismo mais baixo, já que suas vias metabólicas são afetadas por resíduos metabólicos induzidos por isquemias e ROS, levando a uma diminuição do consumo de oxigênio. No entanto, não são observadas alterações no consumo de lactato, K⁺ ou oxigênio durante ou após o período isquêmico. Na verdade, os valores não indicam cessação do fluxo de oxigênio, pois permanecem relativamente consistentes durante todo o teste de esforço (Figura 5B–D). Em essência, utilizando um teste de estresse por oxigênio, este estudo mostra que os valores de 3RMR refletem mudanças nos estados redox mitocondriais durante a isquemia-reperfusão de forma mais rápida, em tempo real e de forma mais sensível do que os biomarcadores tradicionais de dano (Figura 5). Reconhecemos que este estudo comparou a dinâmica do 3RMR com indicadores indiretos de saúde mitocondrial, como lactato e OCR, em vez de comparadores mais diretos a jusante, como NAD+/NADH e ATP. Embora este estudo não correlacione explicitamente mudanças na 3RMR com as concentrações de ATP/NADH, trabalhos anteriores ^9,14 mostraram que a 3RMR é preditiva das mudanças nesses biomarcadores a jusante. Por exemplo, Nguyen et ^al.9 demonstraram que fígados de 3 horas com valores baixos de 3RMR (<10%) apresentam concentrações e razões significativamente menores de ATP e NAD/NADH do que fígados com 1 h (valores de 3RMR de ~15%). Além disso, Jain et ^al.14 não observaram diferenças significativas na razão NAD+/NADH ou na CE em grupos que não apresentaram diferenças significativas em seus 3RMR. Também observaram que as razões NAD+/NADH e a CE eram significativamente diferentes em fígados frio-isquêmicos (IC) de 24 horas após perfusão acelular em comparação com a perfusão celular, que também apresentaram valores estatisticamente significativos de 3RMR. Em conjunto, esses resultados demonstram valores de 3RMR para refletir mudanças em medidas mais diretas da função mitocondrial e do ETC.

Embora este artigo utilize RRS durante uma perfusão de 15 minutos para demonstrar o desempenho do sistema, outros estudos publicados demonstraram a utilidade do RRS em estudos longitudinais. Mais especificamente, em um trabalho anterior, demonstramos que o RRS complementa biomarcadores tradicionais durante perfusões de órgãos mais longas, pois fornece insights sobre a saúde e a função mitocôndrial que diferem significativamente dos métodos tradicionais. Por exemplo, o estudo utilizou RRS para avaliar a viabilidade de fígados de ratos frio-isquêmicos transplantáveis (24 h SCS) e não transplantáveis (72 h SCS) durante a perfusão^{subnormotérmica 10}. Embora a resposta inicial à oxigenação em ambos os grupos tenha sido semelhante, a 3RMR dos fígados não transplantáveis aumentou com a perfusão, enquanto a 3RMR do fígado transplantável permaneceu consistente por meio da SNMP. Da mesma forma, os níveis de potássio e o ganho de peso total para fígados com IC de 72 h foram mais altos em todo o SNMP em comparação com fígados com IC de 24 h. O estudo demonstrou a utilidade do RRS em complementar biomarcadores tradicionais durante longas perfusões. Em outro estudo, utilizamos o RRS para entender a dinâmica da reoxigenação e a recuperação metabólica dos fígados de ratos frio-isquêmicos^{(IC) 14}. Perfundimos fígados minimamente isquêmicos (15 minutos de isquemia fria) e de 24 horas com um fígado acelular ou um perfusado cheio de glóbulos vermelhos (pRBC). Quando fígados de IC de 24 horas foram perfundidos com perfusado acelular, observamos uma diminuição latente na 3RMR em comparação com perfusões com pRBCs. O estudo atribuiu esse aumento tardio na 3RMR ao acúmulo de elétrons nos citocromos mitocondriais durante isquemia fria, que podem ser rapidamente transferidos para as abundantes moléculas de oxigênio no caso do perfusado baseado em pRBC. No entanto, em combinação com outros marcadores de lesão, observamos maior dano hepático em fígados com IC de 24 horas perfundidos com pRBCs. O estudo concluiu que medir a oxigenação mitocondrial em tempo real via RRS pode fornecer insights sobre a recuperação mitocondrial, o que pode ser benéfico para otimizar estratégias de perfusão longa. Em essência, os achados indicam que integrar biomarcadores tradicionais (por exemplo, lactato, OCR, ATP) com insights baseados em RRS sobre estados redox mitocondriais e dinâmica de oxigenação proporciona uma avaliação mais abrangente da recuperação mitocondrial.

Outros estudos utilizaram o RRS como banco de testes para terapêuticas que podem mitigar a lesão isquemia-reperfusão no^{ETC 9}. Em períodos prolongados de isquemia, elétrons se acumulam dentro do ETC, com a capacidade de os elétrons escaparem através dos vários complexos, especialmente durante a reperfusão. Compreender o estado redox de complexos individuais como função da isquemia-reperfusão pode oferecer uma compreensão mais profunda da localização da lesão, com potencial para intervenções mais direcionadas. Por exemplo, nosso grupo utilizou RRS para desenvolver intervenções terapêuticas para disfunção complexa-III em fígados suínos warm-isquêmicos. Em um estudo conduzido por Nguyen et al. (2026)⁹, fígados WI de 1 h e 3 h foram colocados em SNMP por 3 horas. Como mencionado anteriormente, fígados com WI de três horas são conhecidos por sofrer danos ao ETC, resultando em superoxidação e redução do metabolismo. Embora os valores de 3RMR para fígados frescos e de 1 h com WI estivessem dentro da faixa ideal durante toda a perfusão, observamos que os valores de 3RMR de fígados com WI de 3 h caíram continuamente, atingindo abaixo da faixa ideal (10%) às 3 horas. Além disso, não observamos diferenças nos valores de 3RMR do cIV entre nenhum dos grupos, com o cIV totalmente oxidado em cada grupo. A hiperoxidação do cIII, combinada com um estado redox saudável observado no cIV, indica superoxidação induzida pela reperfusão no complexo III. Munidos desse conhecimento, Nyugen et al. (2026)⁹conseguiram selecionar um terapêutico capaz de superar a disfunção do cIII: o azul de metileno (MB), que atua como um transporte eletrônico entre o cI e o citocromo c, contornando o cIII e transferindo elétrons diretamente para o cIV. Os resultados da 3RMR refletiram o efeito terapêutico da MB nas mitocôndrias, já que os valores de 3RMR durante o SNMP do fígado WI de 3h aumentaram para refletir elétrons sendo transportados diretamente para o cIV, e o metabolismo hepático reiniciando. O efeito mitigador do MB também foi validado pela diminuição do lactato de saída e pela melhoria das taxas de consumo de oxigênio. Em essência, a especificidade do RRS possibilitou o desenvolvimento de uma via terapêutica adaptada às necessidades mitocondriais após isquemia quente.

Ao longo deste artigo, apresentamos a Espectroscopia Raman por Ressonância como um método não invasivo, em tempo real e altamente específico para medir a saúde mitocondrial. O estudo demonstra como o RRS pode medir mudanças sutis nos estados redox sem perturbar o tecido antes que tais mudanças fisiológicas tenham efeitos posteriores. No entanto, é importante notar as várias limitações do sistema Raman de Ressonância. Primeiramente, a RRS exige que todas as moléculas que são ressonantemente aprimoradas em um tecido sejam identificadas e consideradas na regressão, com cada molécula tendo diferentes fatores de aprimoramento para levar em conta a intensidade relativa do sinal. Embora tenhamos criado bibliotecas espectrais para todos esses componentes em um dado comprimento de onda e tecido, o usuário pode precisar criar e validar novas bibliotecas para cada tecido e comprimento de onda de interesse. Além disso, alguns tecidos podem ter elementos espectrais complexos, o que pode dificultar a medição de citocromos mitocondriais que existem em concentrações mais baixas. Por exemplo, fígados de porco ou humano contêm beta-caroteno, e sangue contém hemoglobina, ambos com sinais espectrais fortes que aumentam o número de assinaturas espectrais que RRS precisa considerar na regressão. Por fim, o laser de 441 nm usado para essas medições tem diâmetro de feixe de 2 mm e profundidade de penetração inferior a 1 mm. Tais medições localizadas e de superfície podem promover o erro de amostragem, já que diferenças no estado redox em outras partes do órgão podem ser negligenciadas. Para superar esses desafios, medições poderiam ser feitas a partir de biópsias feitas no núcleo do órgão, ou um sistema multi-laser poderia permitir medições em uma área de superfície maior para fornecer uma compreensão mais completa da saúde do órgão inteiro.

Em conclusão, mostramos que a Espectroscopia Raman por Ressonância é sensível a mudanças sutis na dinâmica mitocondrial em comparação com analitos de gás sanguíneo. Uma explicação detalhada sobre como configurar e operar o sistema está aqui fornecida. Destacamos a natureza não invasiva, altamente específica e avaliadora em tempo real do RRS, e explicamos como ele pode ser usado como uma abordagem diagnóstica e mecanicista. Também enfatizamos seu uso no desenvolvimento de vias terapêuticas específicas para disfunção mitocondrial. Estudos futuros podem focar na adaptação do sistema RRS para avaliar a saúde mitocondrial a partir de biópsias, fatias de tecido cortadas com precisão ou outros produtos derivados de tecidos, incluindo tecido humano para pesquisa translacional. A adoção do RRS oferece uma abordagem poderosa na pesquisa metabólica, aprimorando nossa compreensão dos processos bioenergéticos celulares com maior facilidade do que os métodos tradicionais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Usado para canular a veia porta
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Usado para filtrar vapor em excesso durante a anestesia
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Composição do perfusato
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Composição do perfusato
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Composição do perfusato
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Usado para fazer o perfusato fluir através do fígado
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Usado para fazer o perfusato fluir através do fígado
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Usado para oxigenar o perfusato.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Composição do perfusato
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Para análise de gás sanguíneo
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Entre em contato com a Pendar Technologies para informações sobre este produto