Artigo de método

Construção de organoides de câncer de mama humano e quantificação baseada em ensaio de cometa para danos ao DNA induzidos por doxorubicina

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DOI:

10.3791/71299

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28 de julho de 2026

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1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo estabelece um modelo de organoides de câncer de mama humano (BCOs) e avalia quantitativamente o dano ao DNA induzido por doxorubicina usando o ensaio do cometa. A viabilidade de aplicar o ensaio de cometa aos BCOs é demonstrada, e um fluxo de trabalho reproduzível, escalável e operacional é fornecido para detectar danos ao DNA induzidos pelo DOX em BCOs.

Resumo

O câncer de mama é a malignidade mais comum entre mulheres no mundo todo e apresenta grande heterogeneidade. A doxorrubicina (DOX) é amplamente utilizada no tratamento do câncer de mama, e seu principal mecanismo de ação envolve a indução de quebras de fita dupla do DNA e o desencadeio da morte celular. Neste protocolo, foi estabelecido um modelo humano de BCO para avaliar quantitativamente o dano ao DNA induzido por DOX. Células primárias de câncer de mama foram isoladas de tecidos tumorais derivados da paciente por dissociação mecânica e enzimática e, posteriormente, cultivadas em uma matriz tridimensional para gerar BCOs. Os organoides foram então tratados com 8 μM DOX por 2 horas. O dano ao DNA foi avaliado após 2 horas de tratamento. Após o tratamento, organoides foram dissociados em células individuais, embutidos em agarose de ponto de fusão baixo e eletroforizados sob condições alcalinas. Após a eletroforese, os padrões de migração do DNA foram visualizados como estruturas de cometas sob microscopia de fluorescência e analisados quantitativamente usando o software OpenComet para determinar a porcentagem de DNA da cauda (% DNA da cauda). O ensaio do cometa detectou com sucesso danos ao DNA em BCOs. Comparados ao grupo controle, os BCOs expostos a 8 μM de DOX por 2 horas apresentaram caudas de cometa alongadas após dissociação organoide e eletroforese. A análise quantitativa revelou que a porcentagem de DNA da cauda era significativamente maior no grupo tratado, indicando indução de dano ao DNA. Esse método altamente sensível apoia estudos toxicológicos e farmacodinâmicos do DOX e oferece uma plataforma técnica robusta para avaliar danos ao DNA em sistemas BCO derivados de pacientes.

Introdução

O câncer de mama é um tumor maligno que surge dos tecidos epiteliais da mama devido a alterações genéticas, desregulação hormonal e outros fatores patogênicos. É a malignidade mais comum entre mulheres no mundo todo e apresenta padrões epidemiológicos únicos e uma heterogeneidade intratumoralsubstancial 1,2. DOX, um agente quimioterapêutico de primeira linha, intercala-se no DNA, inibe a atividade da topoisomerase II e induz quebras da fita de DNA, desencadeando finalmente a apoptose nas célulastumorais 3. Sistemas tradicionais de cultura celular bidimensional são limitados em sua capacidade de recapitular a complexa organização celular e a heterogeneidade dos tumores de mama. Em contraste, as BCOs são estruturas tridimensionais derivadas dos tecidos tumorais do paciente que mantêm as características-chave do tumor original, incluindo composição celular, arquitetura tecidual e fenótipos moleculares. Notavelmente, os modelos de BCO demonstram alta concordância com respostas clínicas a medicamentos; para um determinado agente terapêutico, a concordância de resposta negativa atinge 100%, e a concordância de resposta positiva chega a 98% entre BCOs e o pacientecorrespondente 4.

As BCOs servem como um modelo avançado in vitro que recapitula características estruturais e funcionais chave dos tumores primários e têm sido amplamente aplicadas para investigar tumorigênese, progressão da doença e resistênciaterapêutica 5. A iniciação tumoral no câncer de mama normalmente depende da inativação cooperativa de múltiplos genes supressores tumorais, como TP53, PTEN, RB1 e NF1, já que alterações em um único gene são insuficientes para conduzir à transformação maligna do epitélio mamário normal. Esse processo é acompanhado por perda de polaridade celular, desorganização arquitetônica e proliferação descontrolada 6,7,8.

O ensaio do cometa (também chamado de eletroforese em gel de célula única, SCGE) é um método clássico para avaliar danos ao DNA no nível de célula única. A técnica foi introduzida pela primeira vez por Rydberg e Johanson em 1978, e posteriormente refinada por Ostling e Johanson, que estabeleceram o ensaio de cometa neutro para detectar quebras de fita dupla de DNA. Em 1988, Singh e colegas incorporaram condições de eletroforese alcalina, permitindo a detecção de quebras de fita simples de DNA, sítios abásicos e lesões álcalis-lábiles, expandindo substancialmente a aplicabilidade doensaio 9. O princípio fundamental do ensaio de cometa é que a mobilidade eletroforética do DNA depende da integridade do DNA. Após a incorporação e lise da agarosa para remover membranas e proteínas celulares, fragmentos de DNA danificados migram em direção ao ânodo durante a eletroforese para formar uma "cauda de cometa", enquanto o DNA intacto permanece próximo ao local de carga, formando a "cabeça do cometa"10. Parâmetros como comprimento da cauda, porcentagem de DNA caudal (% de DNA da cauda) e momento da cauda oliva permitem uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa do dano ao DNA, e desenhos experimentais ao longo do tempo podem ser usados para avaliar a capacidade de reparo do DNA. Devido à sua alta sensibilidade, baixos requisitos de entrada de amostras e relativa simplicidade procedimental, o ensaio cometa tem sido amplamente utilizado em toxicologia genética, biologia do câncer e estudos de resposta a medicamentos, especialmente para avaliar danos ao DNA induzidos por agentes quimioterapêuticos e radioterapia, bem como mecanismos de resistência das células tumorais. O ensaio é altamente sensível a condições experimentais e variabilidade procedimental, e a reprodutibilidade e comparabilidade entre laboratórios dependem de fluxos de trabalho padronizados e análise automatizadade imagens 11. Nos últimos anos, a incorporação de softwares de imagem de alta produtividade, modelos organoides e sistemas de edição genética aumentou ainda mais a utilidade do ensaio de cometa na investigação de danos e mecanismos de reparo do DNA e na avaliação das respostas ao tratamento tumoral.

Comparado aos ensaios tradicionais de dano ao DNA, como a coloração por imunofluorescência γ-H2AX ou citometria de fluxo, o ensaio de cometa fornece um meio direto para quantificar quebras físicas de fitas de DNA no nível de célula única. Como essa metodologia opera independentemente da expressão específica de proteínas ou especificidade de anticorpos, ela elimina efetivamente resultados falsos negativos decorrentes de variações nos estados do ciclo celular ou aberrações nas vias de resposta ao danoao DNA 12. Além disso, ao contrário das culturas monocamadas bidimensionais convencionais, o modelo organoide tridimensional usado neste estudo recapitula de forma mais fiel a arquitetura espacial complexa, as interações extracelulares da matriz e os gradientes de permeação de fármacos dos tumores in vivo. Enquanto modelos tradicionais de linhagem celular frequentemente superestimam a genotoxicidade devido à superexposição artificial a medicamentos, a plataforma organoide avalia danos ao DNA induzidos por DOX em um microambiente que reflete de perto condições fisiológicas clínicas, aumentando substancialmente a confiabilidade e o valor translacional desse paradigmade triagem 13.

Apesar das vantagens substanciais do ensaio de cometa integrado por organoides estabelecido neste estudo para avaliar danos ao DNA, sua implementação prática exige uma consideração cuidadosa de várias limitações técnicas e parâmetros de aplicabilidade relacionados à entrada da amostra. O protocolo requer uma dissociação enzimática completa, porém suave, dos organoides para obter uma suspensão altamente viável de célula única. Uma densidade de semeadura de 15.000–20.000 células primárias de câncer de mama por 100 μL da matriz da membrana basal (~200 células/1 μL) sustenta a sinalização paracrina intercelular necessária para a formação robusta da esfera, enquanto previne a necrose central induzida pela hiperdensidade e rápida depleção de nutrientes. Quanto à janela terapêutica, este ensaio requer uma calibração cuidadosa da concentração de DOX e da duração da exposição para evitar morte celular excessiva (>20–30%). A exposição supraletal a drogas gera uma abundância de cometas "ouriços", que obscurecem sinais legítimos de danos ao DNA e confundem a interpretação dos dados. Quanto às limitações do ensaio, a baixa taxa de produção do ensaio padrão de cometa alcalino o torna inadequado para triagem de drogas de alta produção. Além disso, essa técnica exige rigorosa padronização dos procedimentos experimentais — incluindo estabilidade da adesão do gel, duração do desenrolamento alcalino e uniformidade eletroforética — pois mesmo pequenas variações operacionais podem introduzir erros sistêmicos substanciais.

Em conclusão, este protocolo estabelece BCOs humanos e demonstra a viabilidade de aplicar o ensaio do cometa para quantificar danos ao DNA induzidos pelo DOX. Após o tratamento DOX de 8 μM em BCOs totalmente estabelecidos, o dano ao DNA foi avaliado usando o ensaio do cometa. Essa abordagem permite uma avaliação estável e direta do dano ao DNA induzido pela DOX.

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Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Popular Suzhou Wuzhong (Aprovação nº 20251w03) e foi conduzido de acordo com os padrões éticos médicos. Todos os participantes desta pesquisa forneceram consentimento informado por escrito.

1. Construção de BCOs humanos

  1. Transporte e armazenamento de tecido com câncer de mama
    1. Imediatamente coloque o tecido humano recém-ressecado do câncer de mama em uma solução pré-resfriada para preservação de tecido (4 °C).
      NOTA: Certifique-se de que o tecido permaneça totalmente submerso durante o transporte.
  2. Dissociação mecânica do tecido do câncer de mama
    1. Realize todos os procedimentos em um gabinete de biossegurança. Coloque o tecido do câncer de mama em uma placa de cultura de 6 cm e remova o tecido adiposo visível usando bisturis e pinças estéreis.
    2. Adicione 3 mL de PBS ao recipiente de cultura de 6 cm e lave o tecido três vezes.
    3. Aspire e descarte a solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    4. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 mais duas vezes.
    5. Transfira o tecido do câncer de mama para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL usando tesoura cirúrgica estéril e corte o tecido em pequenos fragmentos de aproximadamente 2 x 5 mm de tamanho.
  3. Digestão enzimática do tecido do câncer de mama
    1. Adicione 1 mL de solução de dissociação organoide ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL.
    2. Adicione mais 8 mL de solução de dissociação organoide ao tubo centrífugo de 15 mL.
    3. Incube o tubo centrífugo de 15 mL a 37 °C por 40 minutos.
    4. Agite o tubo em um shaker por 1 minuto a cada 10 minutos durante a digestão.
    5. Após 40 minutos, adicione 6 mL de PBS ao tubo centrífugo de 15 mL para terminar a digestão.
      NOTA: Adicione PBS diretamente à mistura digestiva para interromper a atividade enzimática.
  4. Isolamento de células primárias de tumor de mama e incorporação de organoides
    1. Coloque um filtro de célula de 100 μm sobre um tubo centrífugo de 50 mL.
    2. Adicione 1 mL de meio de cultura celular completo sobre o peneirador.
      NOTA: Prepare o meio completo de cultura celular usando 500 mL de meio basal, 50 mL de soro bovino fetal e 5 mL de penicilina-estreptomicina.
    3. Aspire 1 mL da suspensão de tecido digerido do tubo centrífugo de 15 mL e aplique sobre o peneiro celular.
    4. Repita o passo 1.4.3 até que toda a suspensão passe pelo peneiro.
    5. Enxágue o penador celular com 1 mL adicional de meio completo de cultura celular.
    6. Centrifuge o tubo da centrífuga de 50 mL a 350 × g por 3 minutos a 4 °C.
    7. Aspire e descarte o sobrenadante.
    8. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de meio completo de cultura celular e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifuge a suspensão a 370 × g por 5 minutos a 4 °C.
    10. Aspire e descarte o sobrenadante.
    11. Adicione 100 μL da matriz da membrana do basamento ao tubo da microcentrífuga de 1,5 mL e misture bem.
      NOTA: Mantenha uma densidade de semeadura de 15.000–20.000 células primárias de câncer de mama por 100 μL da matriz da membrana basal (200 células/1 μL). Isso sustenta a sinalização paracrina intercelular para a formação robusta de esferas e previne a necrose central.
    12. Dispense 25 μL da mistura matriz membrana basal e célula em cada poço de uma placa de 24 poços.
    13. Inverta a placa de 24 poços e incube-a a 37 °C por 10 minutos para permitir a polimerização da matriz da membrana basal.
    14. Adicione 500 μL de meio de cultura BCO a cada poço da placa de 24 poços.
      NOTA: Cultivar BCOs usando um meio comercial pronto para uso com uma formulação proprietária.
    15. Incube a placa em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO₂.
      NOTA: Após a semeadura na matriz extracelular, os BCOs foram cultivados por 7 a 10 dias para permitir o desenvolvimento estrutural 3D adequado. Os organoides foram considerados totalmente estabelecidos e prontos para tratamento medicamentoso quando apresentaram morfologias 3D densas e esféricas e atingiram um diâmetro médio de aproximadamente 50–100 μm, sem sinais de necrose central. Uma vez que esses critérios de desfecho foram atendidos, os BCOs foram posteriormente tratados com DOX.

2. Detecção de danos ao DNA induzidos por DOX em BCOs usando o ensaio de cometa

O protocolo experimental foi adaptado a partir das diretrizes estabelecidas e ainda mais otimizado para atender a condições laboratoriaisespecíficas 14.

ATENÇÃO: Execute todos os procedimentos de manuseio DOX — incluindo pesagem de pó seco, preparação da solução de estoque e diluição em série das soluções de trabalho — exclusivamente dentro de um gabinete de segurança biológica certificado Classe II ou em uma exaustão química. Evite estritamente qualquer manipulação em bancadas de laboratório abertas. Use luvas de nitrilo de duas camadas e proteja o medicamento da luz durante todos os procedimentos. Por fim, segregar todos os consumíveis contaminados por DOX (por exemplo, pontas de pipeta e tubos de microcentrífuga) estritamente como 'resíduos citotóxicos' para descarte especializado; Nunca misture esses itens com resíduos bio-perigosos rotineiros.

  1. Tratamento DOX dos BCOs
    1. Aspire e descarte o meio de cultura gasta.
    2. Adicione 500 μL de meio de cultura de BCOs frescos a cada poço
    3. Remova e descarte 4 μL do meio de cada poço
    4. Adicione 4 μL de solução DOX stock de 1 mM a cada poço.
      NOTA: Para estabelecer uma concentração final de trabalho de 8 μM, determine o volume de estoque necessário usando a equação padrão de diluição: C1V1 = C2V2. Onde C1 representa a concentração inicial do estoque DOX (1 mM), C2 é a concentração-alvo (8 μM) e V2 é o volume final do poço (500 μL). Resolver para V1 resulta em 4 μL. Consequentemente, o protocolo exige adicionar 4 μL do estoque DOX de 1 mM aos restantes 496 μL de meio de cultura por poço, e depois misturar cuidadosamente para garantir uma distribuição homogênea.
    5. Incube a placa em uma incubadora a 37°C com 5% de CO₂ por 2 horas.
  2. Dissociação dos BCOs
    1. Aspire e descarte o meio de cultura BCO da placa de 24 poços.
    2. Adicione 500 μL de solução de dissociação organoide a cada poço.
    3. Pipete para cima e para baixo repetidamente para desintegrar completamente a matriz da membrana do basamento e as estruturas organoides.
    4. Incube a placa a 37 °C com 5% de CO₂ por 10 minutos.
    5. Transfira 500 μL da suspensão resultante de cada poço para um tubo centrífuga de 15 mL.
    6. Centrifuge a suspensão a 350 × g por 3 minutos a 4 °C.
    7. Aspire e descarte o sobrenadante.
    8. Adicione 1 mL de meio de cultura completo ao tubo da centrífuga de 15 mL para resuspender o pellet da célula e, posteriormente, transfira a suspensão resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifuge a suspensão a 350 × g por 3 minutos a 4 °C.
    10. Aspire e descarte o sobrenadante.
      NOTA: Após a centrifugação, o pellet organoide permanece no tubo da centrífuga.
  3. Ressuspensão celular e embedding de agarose
    1. Pré-aqueça o bloco de aquecimento metálico a 95 °C.
    2. Coloque 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) em um bloco de aquecimento metálico e incube por 10 minutos para garantir o derretimento completo.
    3. Pipete 100 μL de agarose fundida a 0,5% de baixo ponto de fusão em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL contendo BCOs.
    4. Transfira imediatamente as amostras para um banho-maria a 37 °C e deixe-as se equilibrarem por 10 minutos.
    5. Misture cuidadosamente e imediatamente pipete 50 μL da suspensão de célula-agarosa em uma lâmina de microscópio.
  4. Lise celular e desenrolamento do DNA
    1. Imerga as lâminas em solução fria de lise e incube a 4 °C no escuro por 12 horas.
    2. Remova as lâminas da solução de lise e imerga-as imediatamente em uma solução alcalina de desenrolamento.
      NOTA: Para preparar a solução alcalina de desenrolamento, dissolva 0,6 g de NaOH em 4,975 mL de água ultrapura e depois adicione 250 μL de 200 mM de EDTA. Para preparar o tampão de eletroforese alcalina, dissolva 12 g de NaOH em 995 mL de água ultrapura, depois adicione 5 mL de 200 mM de EDTA.
      ATENÇÃO: NaOH no tampão de ensaio de cometa é uma base forte altamente corrosiva, capaz de causar queimaduras cutâneas e oculares graves. Durante a preparação da solução, adicione os pellets sólidos de NaOH à água de forma lenta, incremental e sob agitação magnética contínua. Nunca despeje água diretamente sobre os pellets secos, pois a reação exotérmica violenta pode fazer o líquido cáustico ferver e respingar. Além disso, executar toda a pólvora seca pesada exclusivamente dentro de uma coifa química para evitar a inalação de poeira corrosiva.
    3. Imerga as lâminas em solução de lise e incube a 4 °C no escuro por 1 hora.
  5. Eletroforese
    1. Transfira as lâminas da solução alcalina de desenrolamento para a câmara de eletroforese.
    2. Adicione 1 L de tampão de eletroforese alcalina no tanque para garantir a imersão completa das lâminas.
    3. Realize eletroforese a 25 V e 300 mA por 30 minutos.
  6. Lavagem e fixação do ferrolho
    1. Imerga as lâminas em 5 mL de etanol a 70% e incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
      NOTA: O etanol apresenta um risco severo de inflamabilidade. Ao realizar preparações de grande volume ou desidratação de tecidos, mantenha uma ventilação robusta no ambiente experimental. Isolar estritamente a área operacional de todas as fontes de ignição, incluindo chamas abertas (como queimadores de álcool) e faíscas eletrostáticas. Após o uso, fele imediatamente os recipientes de reagentes e guarde-os dentro de um armário de armazenamento inflamável dedicado à prova de explosão.
    2. Coloque os lâminas em uma incubadora a 37 °C e deixe secar por 15 minutos.
  7. Coloração e imagem de DNA
    1. Adicione 1 μL de coloração fluorescente de ácido nucleico a 10 mL de água ultrapura.
      ATENÇÃO: Trate esses agentes intercalantes de ácidos nucleicos como potenciais mutagênicos e manusee-os com precauções rigorosas. Para evitar contaminação cruzada em ambientes de trabalho rotineiros, estabeleça uma 'zona de coloração de ácidos nucleicos' dedicada equipada com pipetas dedicadas. Se estiver suplementando agarose derretida com corantes, deixe o gel esfriar até aproximadamente 60 °C antes de adicioná-lo para evitar a inalação de vapores perigosos carregados de corantes. Por fim, descarte todas as soluções de coloração e géis de resíduos gastos estritamente em recipientes designados para riscos de ácido nucleico.
    2. Imerga as lâminas na solução de coloração preparada no Passo 2.7.1 e incube por 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
    3. Faça uma única lavagem de 5 minutos com 5 mL de água ultrapura.
    4. Seque as lâminas ao ar por 15 minutos em uma incubadora a 37 °C.
    5. Visualize estruturas de cometas usando um microscópio de fluorescência com filtro de excitação verde e detecte fluorescência vermelha.

3. Processamento de dados

  1. Realize uma análise quantitativa automatizada de imagens de ensaios de cometas usando o plugin OpenComet em Fiji (distribuição oficial) para obter parâmetros relacionados a danos ao DNA.
    NOTA: Quanto à análise estatística, este trabalho incluiu estritamente apenas cometas de alta resolução, claramente fotografados, que apresentam morfologia intacta e sem sobreposição. Por outro lado, o protocolo de triagem excluía cometas 'ouriços' ou 'fantasmas' (que apresentam cabeça diminuída e cauda extensa, indicando apoptose ou necrose severa), assim como imagens com bordas borradas, agrupamento celular ou artefatos de fundo.
    1. Abra o software Fiji (Figura Suplementar 1A).
    2. Clique em Plugins na barra de menu (Figura Suplementar 1A).
    3. Selecione OpenComet (Figura Suplementar 1B).
    4. Clique em Navegar em Arquivos de Entrada e selecione as imagens do ensaio do cometa para análise (Figura Suplementar 1C).
    5. Clique em Navegar no diretório de Saída e defina a pasta de destino para arquivos de saída (Figura Suplementar 1C).
    6. Clique em Executar para iniciar a análise automatizada (Figura Suplementar 1C). Esta etapa conclui o fluxo de processamento e análise de dados.
      NOTA: Para cada grupo experimental, este estudo quantificou a porcentagem de DNA caudal (% DNA cauda) de uma seleção randomizada de pelo menos 50 células. Análises estatísticas subsequentes usaram uma análise unidirecional da variância (ANOVA) para comparar médias de grupo, sendo p < 0,05 considerada estatisticamente significativa.

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Resultados

Estabelecimento das BCOs

Este estudo estabeleceu com sucesso organoides do câncer de mama a partir de amostras primárias de tecido tumoral. No estágio inicial da cultura, um grande número de células individuais ou pequenos agrupamentos celulares foi claramente observado, com células distribuídas de maneira relativamente dispersa e sem organização esférica tridimensional óbvia. Algumas células apresentavam morfologias redondas ou quase arredond...

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Discussão

O ensaio do cometa representa um avanço significativo nos métodos de avaliação de genotoxicidade. Devido à sua resolução de célula única e à visualização direta dos padrões de dano ao DNA com base na migração eletroforética, essa técnica oferece vantagens claras em relação aos ensaios convencionais degenotoxicidade 15.

Várias etapas críticas durante o procedimento experimental influenciam a reprodutibilidade e a interpretação dos dados....

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Projeto do Centro de Pesquisa em Engenharia da Província de Jiangsu para Terapia Molecular de Alvos e Diagnóstico Complementar em Oncologia (SGK2202319), pela equipe de pesquisa inovadora da instituição de ensino superior de Jiangsu para ciência e tecnologia (2021), pelo Programa do Centro de Pesquisa em Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), pela Fundação Chave de Ciências Naturais das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (Bolsa nº 24KJA310008). os Programas-Chave da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (szwzy202406), o Projeto do Laboratório Estadual Chave de Medicina e Proteção de Radiação, Universidade de Soochow (nº GZK1202506), o Programa de Talentos em Saúde de Dongwu (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPMeio de cultura BCO
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Bloco de aquecimento
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTMeio de cultura celular completo
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Banho de água
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareSoftware de análise estatística
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pSoftware de processamento de imagem / imagem
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Agarose de baixo ponto de fusão 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrífuga
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Solução de lise
MatrigelMogenel Biotechnology82755A matriz da membrana basal
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SSolução de dissociação de organoides

Referências

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