Construção de organoides de câncer de mama humano e quantificação baseada em ensaio de cometa para danos ao DNA induzidos por doxorubicina

Yijie Wu; Zhen Jin; Jiahui Du; Ling Li; Wang Ouyang; Lei Yin; Shuai Zhao; Jinli Li; Xiaohua Li; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71299

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Construção de organoides de câncer de mama humano e quantificação baseada em ensaio de cometa para danos ao DNA induzidos por doxorubicina

105 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

28 de julho de 2026

Yijie Wu^*¹^,² , Zhen Jin^*³ , Jiahui Du^*² , Ling Li³ , Wang Ouyang² , Lei Yin⁴ , Shuai Zhao⁴ , Jinli Li⁵ , Xiaohua Li⁴ , Song-Bai Liu¹^,²^,³

¹College of Life Science, North China University of Science and Technology, ²Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ³School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ⁴Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, ⁵Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo estabelece um modelo de organoides de câncer de mama humano (BCOs) e avalia quantitativamente o dano ao DNA induzido por doxorubicina usando o ensaio do cometa. A viabilidade de aplicar o ensaio de cometa aos BCOs é demonstrada, e um fluxo de trabalho reproduzível, escalável e operacional é fornecido para detectar danos ao DNA induzidos pelo DOX em BCOs.

Resumo

O câncer de mama é a malignidade mais comum entre mulheres no mundo todo e apresenta grande heterogeneidade. A doxorrubicina (DOX) é amplamente utilizada no tratamento do câncer de mama, e seu principal mecanismo de ação envolve a indução de quebras de fita dupla do DNA e o desencadeio da morte celular. Neste protocolo, foi estabelecido um modelo humano de BCO para avaliar quantitativamente o dano ao DNA induzido por DOX. Células primárias de câncer de mama foram isoladas de tecidos tumorais derivados da paciente por dissociação mecânica e enzimática e, posteriormente, cultivadas em uma matriz tridimensional para gerar BCOs. Os organoides foram então tratados com 8 μM DOX por 2 horas. O dano ao DNA foi avaliado após 2 horas de tratamento. Após o tratamento, organoides foram dissociados em células individuais, embutidos em agarose de ponto de fusão baixo e eletroforizados sob condições alcalinas. Após a eletroforese, os padrões de migração do DNA foram visualizados como estruturas de cometas sob microscopia de fluorescência e analisados quantitativamente usando o software OpenComet para determinar a porcentagem de DNA da cauda (% DNA da cauda). O ensaio do cometa detectou com sucesso danos ao DNA em BCOs. Comparados ao grupo controle, os BCOs expostos a 8 μM de DOX por 2 horas apresentaram caudas de cometa alongadas após dissociação organoide e eletroforese. A análise quantitativa revelou que a porcentagem de DNA da cauda era significativamente maior no grupo tratado, indicando indução de dano ao DNA. Esse método altamente sensível apoia estudos toxicológicos e farmacodinâmicos do DOX e oferece uma plataforma técnica robusta para avaliar danos ao DNA em sistemas BCO derivados de pacientes.

Introdução

O câncer de mama é um tumor maligno que surge dos tecidos epiteliais da mama devido a alterações genéticas, desregulação hormonal e outros fatores patogênicos. É a malignidade mais comum entre mulheres no mundo todo e apresenta padrões epidemiológicos únicos e uma heterogeneidade intratumoral^substancial ^1,2. DOX, um agente quimioterapêutico de primeira linha, intercala-se no DNA, inibe a atividade da topoisomerase II e induz quebras da fita de DNA, desencadeando finalmente a apoptose nas células^{tumorais 3}. Sistemas tradicionais de cultura celular bidime....