Imagem quantitativa de células vivas da forma nuclear e dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento e estresse ambiental na raiz de Arabidopsis thaliana

Summary

Esse processo utiliza microscopia confocal em conjunto com um núcleo e linha marcadora de cromatina marcados fluorescentemente em Arabidopsis thaliana para registrar simultaneamente a dinâmica do núcleo e da cromatina nas raízes de Arabidopsis e investigar mudanças nessas dinâmicas em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.

Abstract

O núcleo é o organelo característico dos organismos eucarióticos. Ao contrário da visão clássica dos núcleos estáticos, a forma nuclear é dinâmica em células vivas. A forma nuclear alterada ou deformada é uma marca registrada do câncer em células animais e do estresse ambiental nas plantas. Proteínas do envelope nuclear interagem com a cromatina para regular a expressão gênica. Infelizmente, pouco se sabe sobre o impacto do estresse abiótico na forma nuclear, no movimento e na dinâmica da cromatina. Para enfrentar essa questão, desenvolvemos um pipeline usando microscopia confocal e software de rastreamento de partículas para quantificar a dinâmica nuclear e da cromatina em raízes de Arabidopsis sob controle e condição de estresse abiótico. Esse método de imagem confocal utiliza uma linha de marcadores dupla marcada fluorescente – proteína do envelope nuclear e cromatina – para realizar imagens de células vivas da raiz na planta modelo Arabidopsis thaliana sob controle e condições de estresse salin. Esses filmes capturados são analisados para quantificar a dinâmica nuclear e da cromatina usando o software de processamento de imagem de código aberto Fiji/ImageJ com a ajuda do plugin TrackMate. Para validar esse método, analisamos e quantificamos o movimento da cromatina em raízes de controle e estressadas por sal, revelando uma diminuição na velocidade da cromatina sob condições de estresse salin. Esse método permite a obtenção quantitativa de imagens de células vivas da forma nuclear radicular e da dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento da planta e o estresse ambiental, possibilitando assim a análise de mudanças na dinâmica nuclear e da cromatina causadas por estressores abióticos.

Introduction

A forma nuclear varia entre diferentes tipos celulares e durante o desenvolvimento^{nas raízes 1,2} de Arabidopsis thaliana. Por exemplo, a forma nuclear é esférica nas regiões meristemáticas que se dividem ativamente. Em contraste com a região meristemática, núcleos na zona de transição radicular e alongamento são menos esféricos. Além disso, núcleos em células diferenciadas, como pelos radiculares, passam pela base densa dos pelos radiculares e são ativamente transformados em núcleos ^{alongados 3,4,5}. As mudanças dinâmicas na forma e no movimento nuclear são cruciais para o funcionamento da célula ^6,7. Defeitos na forma nuclear levam a comprometimento funcional, como redução do movimento nuclear ^1,3. Em células de mamíferos, mudanças na forma celular e do núcleo estão diretamente correlacionadas com alterações na expressão gênica e na síntese^{de proteínas 8}.

Durante a interfase, o DNA de uma célula é organizado como cromatina. O DNA da cromatina é agrupado ao redor das histonas, o que pode apertar e soltar o DNA para alterar a expressão. De forma semelhante, o posicionamento da cromatina em relação ao envelope nuclear e a proximidade com a periferia nuclear também são importantes para a expressão^{gênica 9}. O estresse ambiental, como o estresse osmótico, altera a forma nuclear e, consequentemente, altera a expressão de um conjunto de genes sensíveis ao toque nas raízes 10 de A. thaliana. Nesse contexto, estudar a forma nuclear e a dinâmica da cromatina por meio de imagens em timelapse de células vivas é importante. Um aspecto importante da dinâmica nuclear é a velocidade com que os núcleos se movem, já que o posicionamento nuclear dentro da célula impulsiona a expressão gênica, e o reposicionamento nuclear requer movimento^{nuclear 11}. A velocidade do movimento da cromatina dentro do núcleo é igualmente importante, pois o posicionamento dos genes dentro do núcleo é fundamental para determinar a expressão^{gênica 12}.

Anteriormente, a forma nuclear e a dinâmica da cromatina eram visualizadas e quantificadas separadamente; Como resultado, a relação entre a forma nuclear e a dinâmica da cromatina permaneceu inexplorada. Ao imagear núcleos e cromatina simultaneamente, é possível observar suas posições relativas um ao outro, o que pode revelar movimentos como rotação nuclear e movimento intra-nuclear da cromatina que seriam difíceis ou impossíveis de demonstrar. Neste método, apresentamos uma técnica de imagem de células vivas para visualizar e quantificar a forma nuclear por meio da proteína do envelope nuclear externo marcada fluorescentemente WPP (WIP1)¹³ e da cromatina via dinâmica da histona centromérica H3 (CENH3)¹⁴ simultaneamente sob controle e condições de estresse salin, com o objetivo de possibilitar a análise de mudanças na dinâmica nuclear e da cromatina causadas por estressores abióticos. Para viabilizar esse método, geramos uma linha WIP1-GFP/CENH3-mRFP de A. thaliana. Além disso, estudamos a dinâmica da cromatina de forma quantitativa usando o plugin TrackMate do software open-source ImageJ/Fiji. Testamos uma linha fluorescente dupla e técnicas de dinâmica da cromatina apresentadas aqui sob condições de estresse salino e descobrimos uma alteração na morfologia e dinâmica dos focos centrméricos devido às condições de estresse. Esse método simples e reproduzível é ideal para o rastreamento de alta taxa da dinâmica nuclear e da cromatina em raízes de Arabidopsis sob várias condições de estresse abiótico.

Protocol

1. Cultivo de mudas de A. thaliana

1. Preparação do meio de cultivo
   1. Coloque 800 mL de água pura em um béquer de 1 L sobre uma placa de mexer. Adicione uma barra de mexer ao béquer.
   2. Ligue a placa de mexeção a 600 rpm.
   3. Adicione 10 g de sacarose ao béquer.
   4. Adicione 2,16 g de meio de crescimento Murashige e Skoog (MS) ao béquer.
   5. Adicione 5 mg de ágar em cada um dos dois frascos de mídia de 1 L.
   6. Rotule uma garrafa como "1/2 MS" e a outra como "100 mM NaCl".
   7. Rotule as tampas das duas garrafas com fita adesiva de autoclave.
   8. Adicione 5,84 g de NaCl ao frasco rotulado como "100 mM NaCl".
   9. Encha o béquer com 1 litro de água pura.
   10. Volte o béquer à placa de mexida e espere até que a sacarose e a esclerose múltipla.
   11. Despeje o conteúdo do béquer em um cilindro graduado de 1 L.
   12. Despeje 500 mL do conteúdo do cilindro graduado em cada garrafa.
   13. Meio de cultivo autoclave e 250 mL de água pura com ciclo líquido de 60 minutos a 121 °C.
       NOTA: Ao autoclavar o meio e a água, certifique-se de que as tampas estejam soltas para evitar explosões potenciais.
   14. Reparafuse as tampas do meio de cultivo.
   15. Inverta as garrafas de meio de crescimento 7 vezes para garantir que o ágar esteja bem distribuído por todo o corpo.
   16. Armazene o meio de cultivo em uma geladeira a 4 °C até ser necessário e coloque no micro-ondas para liquefazer.
2. Fixação das placas de crescimento e sementes
   1. Em um exaustor de fluxo, use uma pistola de pipetas para pipetar 50 mL de meio de crescimento em cada uma das dez placas (Figura 1A).
   2. Enquanto o meio solidifica, limpe as sementes WIP1-GFP x CENH3-mRFP inundando-as em um tubo de microcentrífuga com 1 mL de etanol a 70% por 10 minutos (Figura 1B).
      NOTA: Ao manusear etanol, certifique-se de que não haja chamas abertas nas proximidades.
   3. Após 10 minutos, na capela de fluxo, remova o etanol e enxágue as sementes duas vezes com 1 mL de água autoclavada (Figura 1C).
   4. Depois que o meio firmar, use uma pipeta de 1000 μL para colocar as sementes limpas em placas de crescimento em duas fileiras de 14 sementes por placa (Figura 1D).
   5. Rotule as placas com uma caneta permanente e sele-as com fita microporosa antes de sair da capela de fluxo (Figura 1E).
3. Mudas em germinação
   1. Envolva as placas de crescimento em papel alumínio e estratifique-as a frio em uma geladeira de 4 °C por pelo menos 2 dias (Figura 1F).
   2. Após a estratificação a frio, retire os pratos da geladeira e deixe-os verticalmente sob luzes de crescimento (~80 μmol/^{m 2}/s) por um mínimo de 4 dias (Figura 1G).
   3. Transfira metade das placas para um meio de crescimento NaCl de 100 mM na capela de fluxo, depois sele e rotule as placas (Figura 1H).
   4. Placas de cultivo sob luzes de crescimento por 2 dias antes da imagem (Figura 1I).

2. Imagem de células vivas dos núcleos da raiz de A. thaliana e da cromatina

1. Preparação de lâminas
   1. Pipete 60 μL de água pura em uma lâmina de vidro (Figura 2A).
   2. Coloque 3 raízes de mudas de A. thaliana com 6 dias na água (Figura 2B).
   3. Coloque uma cobertura deslizante de 22 mm × 22 mm #1,5 sobre as raízes sem cobrir as folhas (Figura 2C).
2. Configurações do microscópio confocal
   1. Ajuste o tempo de exposição do laser para 1000 ms (1 s).
   2. No combinador a laser, ajuste o laser de 488 nm para 50% para proteína fluorescente verde (GFP) e 561 nm para 50% para proteína fluorescente vermelha (RFP) (Figura 2D). Imagem com lente objetiva de 20× sem zoom óptico. Se gravar por mais de 10 minutos, diminua a intensidade para diminuir o fotobranqueamento.
   3. Defina o tamanho do passo da fatia Z para 0,3 μm.
   4. Defina o intervalo para 1 minuto e a duração total para 10 minutos.
3. Imagem
   1. Localize raízes e selecione até 20 z-slices e capture imagens de 16 bits.
   2. Comece timelapse.
   3. Economize timelapse como arquivo TIFF usando compressão lossless.
   4. Transferir dados para um computador para análise.

3. Rastreamento e análise de dados

NOTA: Será necessário usar a versão Fiji do software open-source ImageJ (recomendado o v. 1.54), que vem com o TrackMate pré-instalado.

1. Inicialização
   1. Imagem AbertaJ/Fiji.
   2. Clique e arraste um arquivo .vsi para a janela principal do aplicativo ImageJ/Fiji (Figura 3A).
   3. Um prompt intitulado Opções de Importação de Bio-Formatos será exibido; clique em Ok no canto inferior direito (Figura 3B).
   4. Um prompt intitulado Bio-Formats Series Options será exibido. Certifique-se de que a Série 1 esteja selecionada e clique em Ok no canto inferior esquerdo (Figura 3C).
      NOTA: O arquivo pode levar um minuto para carregar, especialmente se tiver muitas camadas Z ou pontos de tempo.
   5. Uma vez que a imagem seja aberta (Figura 3D), divida os sinais navegando pela janela principal do ImageJ até a Imagem > cor > canais divididos (Figura 3E). Isso criará duas janelas separadas, uma para núcleos marcados com GFP e outra para cromatina marcada com RFP (Figura 3F).
2. Pré-processamento da cromatina
   1. Determine qual das duas janelas corresponde à cromatina.
   2. Clique na janela de cromatina (Figura 3F) e aplique a operação do projeto Z navegando pela janela principal do ImageJ até imagens > pilhas > projeto Z (Figura 4A).
   3. Mude o tipo de projeção para Intensidade Máxima e certifique-se de que Todos os Quadros de Tempo esteja ativo, depois clique em Ok (Figura 4B).
   4. Abra o menu de contraste pressionando Ctrl+Shift+C ou navegando na janela principal do ImageJ para a imagem > ajustar > Brilho/Contraste (Figura 4C).
   5. Deslize a segunda barra (rotulada como Máximo) para a esquerda até que a cromatina fique facilmente visível (Figura 4D).
3. Rastreamento da cromatina
   1. Navegue até plugins (Figura 5A).
   2. Clique na seta para baixo no menu de plugins para deslizar até a opção de rastreamento (Figura 5A).
   3. Clique em rastrear, depois em TrackMate.
   4. As configurações iniciais vão aparecer. Confirme que as configurações de calibração estão corretas, então clique em Próximo (Figura 5B).
   5. Selecione Detector de Limiar e clique em Próximo (Figura 5C).
   6. Na janela da imagem, avance para o último quadro do timelapse (Figura 5D).
   7. Ao lado do limiar de intensidade, clique em Auto, depois clique em Prévia.
   8. Ajuste o limiar de intensidade e clique em Prévia. Ajuste e pré-visualize repetidamente o limiar até que a prévia inclua toda a cromatina e o mínimo de ruído, então clique em Próximo (Figura 5D).
   9. A detecção inicial de limiar ocorrerá; clique em Próximo (Figura 5E).
   10. Limite manualmente até que apenas a cromatina seja visível, então clique em Próximo (Figura 5F).
   11. Esta página permite filtrar os pontos. Ignore isso e clique em Próximo (Figura 6A).
   12. Selecione Rastreador LAP simples e clique em Próximo (Figura 6B). O rastreador LAP é aplicável quando objetos rastreados não se fundem ou se dividem.
   13. Defina a distância máxima de ligação para 5 micrômetros, a distância máxima de fechamento de lacunas para 15 micrômetros e a distância máxima de fechamento de distâncias para 1. Clique em Próximo (Figura 6C).
   14. O rastreamento vai acontecer. As faixas aparecerão na janela original da imagem. Clique em Próximo (Figura 6D).
   15. Esta página permite filtragem de faixas. Pressione o botão verde + no canto inferior esquerdo para criar um filtro, depois escolha o número de pontos no modo pista e pressione Auto (Figura 6E).
   16. Certifique-se de que o modo esteja definido para Acima. Isso elimina manchas que aparecem e desaparecem rapidamente.
   17. Clique em Próximo (Figura 6E).
   18. A página de opções de exibição permite exportar dados como um arquivo csv. No final da página, clique no botão Trilhas e depois Exportar para CSV (Figura 7A).
   19. Esta página permite plotamento embutido; ignore e clique em Próximo.
   20. Na última página, salve o vídeo usando a sobreposição Capture e pressione executar. Clique nele, depois navegue até o arquivo > salvar como > GIF (Figura 7B).
4. Análise básica de velocidade
   1. Abra o CSV das pistas em um software de planilha.
   2. Exclua todas as colunas, exceto TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME e RADIUS.
   3. Os lugares em cada faixa estarão fora de ordem. Para ordená-las, primeiro congele as quatro primeiras linhas e depois crie uma nova coluna intitulada TRACK_FRAME e copie e cole essa fórmula na coluna: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Selecione a coluna TRACK_FRAME , clique com o botão direito nela e depois clique em Ordenar planilha A–Z. Os espaços dentro de cada faixa agora devem estar em ordem.
   5. Para confirmar que não há pontos faltando no meio de nenhuma faixa, crie uma nova coluna e use esta fórmula: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Garanta que o primeiro lugar de cada faixa retorne "NA" e o restante 1.
   6. Crie uma coluna para Velocidade (micrômetro/quadro) e cole nela a seguinte fórmula: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Isso usará o teorema de Pitágoras para calcular a distância entre dois pontos.
   7. Para traduzir isso em Velocidade (micrômetro/segundo), crie uma nova coluna e cole a seguinte fórmula nela: =SE(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Isso vai encontrar os segundos/frame e traduzir micrômicas/frame de acordo.

Results

Imagem de células vivas da dinâmica do envelope nuclear e da cromatina
Geramos uma linha dupla de marcadores fluorescentes, que inclui a proteína do envelope nuclear externo WIP1-GFP e a cromatina centromérica CENH3-mRFP (Figura 8). Mudas de 4 dias foram transferidas para placas de controle ou placas contendo NaCl de 100 mM por 2 dias. Após 2 dias de incubação, observa-se uma clara inibição do crescimento radicular para o tratamento com s...

Discussion

O método apresentado aqui é ideal para acompanhar a dinâmica da cromatina. Comparado aos métodos anteriores de imagem de células vivas com imagens separadas, a imagem simultânea dos núcleos e da cromatina permite explorar a relação entre a dinâmica nuclear e a da cromatina. Isso pode revelar movimentos como rotação nuclear e movimento intra-nuclear da cromatina que, de outra forma, seriam difíceis de demonstrar.

Como um método de imagem de células vivas, é mai...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Mídia Murashige e Skoog (MS)	bioWorld	30630058
Fitas microporosas 3M	Amazon	A-1530-0
Software de aquisição	Olimpo/Evidente	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cobertura	Genesee	29-116
Slide de vidro	Genesee	29-101
Imagem/Fiji	Código aberto	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscópio	Olimpo/Evidente	IX83
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-212
Disco giratório	Yokogawa	CSU-W1
Placas de Petri quadradas	Simport	26-275
Sacarose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987