Artigo de investigação

Farmacologia em Redes, Aprendizado de Máquina e Validação In Vivo da Cápsula Danzhi Jiangtang em Nefropatia Diabética

54 vistas

⸱

DOI:

10.3791/71328

⸱

28 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

A Cápsula Danzhi Jiangtang (DJC) pode atenuar a nefropatia diabética (DN), como evidenciado por mudanças na sinalização de quimiocinas e nos marcadores de piroptose, apoiadas por bioinformática e validação in vivo .

Resumo

Embora a Cápsula Danzhi Jiangtang (DJC) seja uma preparação tradicional chinesa à base de ervas usada clinicamente para diabetes, ainda não foi totalmente esclarecido como ela pode proteger o rim durante a nefropatia diabética (DN). Esta investigação foi projetada para explorar possíveis mecanismos pelos quais o DJC afeta a DN, com foco na cascata de sinalização relacionada à piroptose relacionada ao domínio pirina da família NLR, contendo domínio 3 (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD).

Foi empregada uma estratégia integrada que combinava farmacologia de redes e aprendizado de máquina. O Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP) e a Ferramenta de Análise de Bioinformática para o Mecanismo Molecular da Medicina Tradicional Chinesa (BATMAN-TCM) foram usados para triar ingredientes bioativos e seus respectivos alvos proteicos do DJC. Genes associados à DN foram recuperados do Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Os alvos-principais candidatos foram triados e classificados usando múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina. A afinidade de ligação entre os ingredientes ativos do DJC e os alvos centrais foi avaliada por meio de acoplamento molecular. Por fim, a eficácia terapêutica e os mecanismos previstos foram avaliados em camundongos diabéticos db/db.

A análise de farmacologia em rede identificou 599 alvos de DJC e 68 genes sobrepostos compartilhados com DN. Usando algoritmos de aprendizado de máquina, o ligando quimioquina do motivo C-C 2 (CCL2) e CASP1 foram identificados como alvos candidatos prioritários. O acoplamento molecular previu possíveis fortes afinidades de ligação entre os ingredientes ativos do DJC e essas proteínas centrais. Análises de enriquecimento funcional (GO/KEGG) sugeriram que a modulação do DJC está associada a respostas inflamatórias e à via MAPK. A validação in vivo mostrou que o tratamento com DJC atenuava a lesão renal e os marcadores de fibrose. Esses achados sugerem que o DJC pode atenuar a DN em parte por meio de mudanças na sinalização da piroptose do receptor de quimiocina 2 do motivo CCL2/C-C (CCR2).

Introdução

O peso global do diabetes mellitus (DM) continua a aumentar, apresentando um desafio formidável para a saúde pública. Estima-se que 5,2 milhões de mortes anualmente decorrem de DM e suas complicaçõesrelacionadas 1. A DN é considerada uma complicação microvascular grave e um dos principais fatores para o desenvolvimento da doença renal em estágio terminal (DSR), afetando aproximadamente 30-40% da populaçãodiabética 2,3. Múltiplos fatores interligados contribuem para a progressão patológica da DN, incluindo disfunção metabólica, remodelação hemodinâmica e respostas inflamatórias persistentes. Insultos patológicos, incluindo glicose alta e hiperlipidemia, ativam a via da piroptose mediada por NLRP3/caspase-1/GSDMD, induzindo morte inflamatória programada em células epiteliais mesangiais e tubulares renais, seguida por lesões tubulointersticiaisprogressivas 4. A piroptose é caracterizada pela ruptura da membrana plasmática, que impulsiona a liberação de IL-1β eIL-185. Esses fatores pró-inflamatórios aumentam a transcrição do ligando quimioquina do motivo C-C (CCL2), promovem a infiltração de macrófagos e potenciam ainda mais a ativação piropótica, agravando progressivamente a lesãorenal 6. Na prática clínica, essa condição se manifesta com albuminúria progressiva e redução gradual da taxa de filtração glomerular, o que pode culminar em danos renais irreversíveis e uma deterioração acentuada da qualidade de vida dos indivíduosafetados 7,8. Apesar dos avanços na área médica, as estratégias terapêuticas atuais, que focam principalmente no controle rigoroso glicêmico e da pressão arterial, frequentemente não conseguem interromper completamente a progressão da doença. Embora as novas farmacoterapias, incluindo agentes bloqueadores SGLT2, agonistas do GLP-1 e bloqueadores dos receptores mineralocorticoides, assim como terapias com células-tronco e intervenções alimentares, tenham recebido atenção significativa e estejam se tornando mais prevalentes naprática, o risco residual de DN permanece alto. Portanto, o desenvolvimento de substâncias terapêuticas inovadoras continua sendo uma prioridade urgente em pesquisa, especialmente aquelas da medicina tradicional que podem atingir múltiplas vias patológicas simultaneamente.

Cápsula Danzhi Jiangtang (DJC), uma formulação exclusiva para hospitais desenvolvida no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (Aprovação de Preparação da Instituição Médica Provincial de Anhui nº Z20090006; Patente nº ZL200310112845.1; Lote nº 20220427), é um candidato terapêutico promissor. Ele deve ser selado, armazenado em um ambiente seco e ventilado, e protegido da luz. A fórmula é composta por seis ervas tradicionais chinesas: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Cortex de Moutan) e Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. Na prática clínica, o DJC demonstrou eficácia hipoglicêmica significativa e a capacidade de reduzir marcadores de lesão renal em pacientesdiabéticos 11. Pesquisas anteriores sugerem que o DJC pode exercer efeitos renoprotetores ao regular os níveis de glicose no sangue e o metabolismolipídico 12,13,14. Estudos anteriores sobre DJC focaram principalmente na validação de via única com seleção não sistemática de alvos. Portanto, integramos farmacologia em rede e aprendizado de máquina para triar componentes ativos e identificar genes centrais, seguidos por validação preliminar in vivo, para fortalecer a análise.

A farmacologia em redes oferece uma estratégia eficaz para dissecar prescrições herbais complexas. Esse arcabouço integra abordagens bioinformáticas e biológicas sistemáticas, química computacional e farmacologia para decifrar os mecanismos "multicomponentes, multi-alvo e multi-vias" das ações dosmedicamentos 15,16,17. Essa abordagem holística facilita um exame estruturado das interações intrincadas entre compostos herbais e redes específicas de doenças, revelando os efeitos sinérgicos inerentes àMTC 18. No entanto, a farmacologia tradicional de redes pode, às vezes, gerar ruído excessivo nos dados. Para superar isso, integrar algoritmos de aprendizado de máquina permite uma triagem precisa dos genes característicos centrais a partir de conjuntos de dados em grande escala. Além disso, o acoplamento molecular oferece uma perspectiva intuitiva e dinâmica para prever potenciais afinidades de ligação fármaco-biomolécula19.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Triagem de compostos bioativos e potenciais alvos do DJC

Compostos bioativos das seis ervas presentes no DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Córtex de Moutan), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) e Whitmania pigra (Hirudo) foram recuperados do banco de dados TCMSP. O rastreamento foi realizado com base em parâmetros farmacocinéticos: biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥ 0,18. Para a Whitmania pigra, que não possui dados no TCMSP, seus compostos ativos e alvos foram obtidos do BATMAN-TCM, usando uma pontuação ≥ 20 e um valor P < 0,05 como critérios de seleção. UniProt foi aplicado para unificar todos os alvos coletados em uma nomenclatura genética padrão.

Aquisição de genes relacionados à DN

Genes relacionados à DN foram coletados de três fontes. Primeiro, foram pesquisados GeneCards e OMIM com "nefropatia diabética" como termo de busca. Genes de GeneCards com pontuação de relevância > 1 foram mantidos. Segundo, três perfis de microarray (GSE30529, GSE104948, GSE96804) foram obtidos do repositório GEO. As amostras em GSE30529 foram derivadas de túbulos renais, enquanto as de GSE104948 e GSE96804 se originaram de glomérulos renais. Todas as buscas no banco de dados foram realizadas em 15 de dezembro de 2024. Genes diferencialmente expressos (DEGs) entre pacientes com DN e controles saudáveis no conjunto de dados GSE30529 foram identificados usando o pacote limma no software R. Os critérios de triagem foram definidos em um valor p ajustado < 0,05 e |log2(Fold Change)| > 0,5. Gráficos vulcânicos e mapas de calor exibiam genes expressos diferencialmente.

Identificação de alvos terapêuticos supostos do DJC para DN

A análise do diagrama de Venn identificou loci compartilhados entre o pool de alvos do DJC e genes associados ao DN de GeneCards, OMIM e GSE30529 DEGs. Esses loci compartilhados serviram como genes terapêuticos candidatos para todos os procedimentos de pesquisa posteriores.

Estabelecimento e perfilamento de redes de interação proteica (IBP)

Loci terapêuticos supostos foram carregados no STRING para construir uma rede de interação proteína-proteína, com um corte de interação definido acima de um valor de confiança de 0,4. O Cytoscape processou os conjuntos de dados da rede para apresentação visual. Índices topológicos como o Degree eram calculados via o plugin CytoNCA para identificar os nós centrais em toda a rede.

Análise de enriquecimento

Para delinear os papéis biológicos e as cascatas de sinalização ligadas a alvos candidatos, o enriquecimento funcional foi analisado em R com o pacote clusterProfer, usando org. Hs.eg.db para anotação e ggplot2 para visualização. Os termos de Ontologia Gênica (GO) foram avaliados em várias categorias de processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e função molecular (MF). As vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram mantidas quando o valor p de enriquecimento estava < 0,05.

Aplicação do algoritmo CytoHubba

O plugin CytoHubba no Cytoscape foi usado para calcular quatro índices de centralidade topológica para cada nó da rede. O grau, a contagem de vizinhos diretamente conectados, reflete a amplitude das interações de cada proteína. O componente de vizinhança máxima (MNC), uma métrica que quantifica o tamanho do maior componente conectado no subgrafo de vizinhança do nó, mede a influência regulatória local. O componente percolado por arestas (EPC) avalia a importância estrutural global por meio de remoção simulada de arestas aleatórias e quantificação do tamanho médio do componente conectado. Genes classificados entre os 20 melhores para cada índice foram intersectados para produzir os genes centrais finais.

Triagem de genes centrais baseada em aprendizado de máquina

Três abordagens de aprendizado de máquina foram aplicadas aos perfis de expressão do conjunto de dados GSE30529 para identificar genes hub confiáveis entre os alvos candidatos.

(1) LASSO (Operador de Menor Encolhimento Absoluto e Seleção): O parâmetro de regularização λ foi ajustado por meio de validação cruzada de cinco vezes, com o valor ótimo determinado pelo desempenho médio entre folds. As características de expressão gênica de entrada passaram por padronização automática do Z-score para eliminar efeitos da magnitude da expressão. Com o parâmetro de penalidade α fixado em 1 para regularização LASSO pura, um painel pré-definido de valores de 100 λ foi usado para a triagem. A penalidade L1 reduziu os coeficientes das características de baixa relevância a zero, permitindo seleção simultânea de características e controle de complexidade, enquanto a força de regularização ajustada em validação cruzada mitigava o risco de superajuste.

(2) SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination): Um framework de validação cruzada 5 camadas de duas camadas foi empregado para garantir uma triagem robusta de características. Cinco subconjuntos não sobrepostos foram gerados dividindo estocasticamente todo o conjunto de dados, sendo quatro usados para treinamento e um para testes em cinco iterações; a média fold-wise mitigava o viés da divisão de amostra única. A eliminação recursiva de características foi aplicada para reduzir a dimensionalidade das características e restringir a complexidade do modelo, aliviando o sobreajuste. A taxa de erro de classificação e a precisão serviam como métricas de desempenho para determinar o número ótimo de características.

(3) Floresta Aleatória (RF): Uma floresta aleatória inicial de 500 árvores foi construída, com o número ótimo de árvores determinado pela taxa mínima de erro de classificação fora da bolsa para reeducar o modelo final. Todos os hiperparâmetros restantes, incluindo o tamanho aleatório do subconjunto de características em cada divisão de nó, foram mantidos nas configurações padrão do pacote. As pontuações de importância gênica do modelo final foram classificadas em ordem decrescente para gerar o conjunto de genes de assinatura da doença. O conjunto final de genes centrais foi determinado pela interseção dos resultados desses três algoritmos.

Verificação independente baseada em conjunto de dados da expressão gênica central

Dois conjuntos de dados externos independentes, GSE104948 e GSE96804, foram usados para validar os níveis de transcritos dos genes hub. Conjuntos de dados de expressão gênica passaram por normalização; Diferenças de expressão entre casos de DN e sujeitos saudáveis foram plotadas usando os kits de ferramentas ggplot2 e ggsignif de R.

Acoplamento molecular

As conformações 3D das proteínas alvo central (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00) foram obtidas do Banco de Dados de Proteínas. As conformações 3D dos compostos bioativos foram obtidas via PubChem. Ácido ursólico, 3β-hidroxiurs-12-en-28-ácido oico e quercetina foram selecionados para acoplamento porque a farmacologia em rede previu interações entre esses compostos ativos e os alvos centrais CCL2 ou CASP1. As estruturas proteicas foram pré-tratadas removendo ligantes nativos e moléculas de água, introduzindo hidrogênios polares e, posteriormente, submetidas a acoplamento molecular usando AutoDock Vina. A afinidade de ligação, representada pelo escore de acoplamento (em kcal/mol), serviu para avaliar a força das interações. Um limiar de energia de ligação de −5,0 kcal/mol foi estabelecido para definir interações intermoleculares estáveis. As conformações acopladas foram visualizadas usando PyMOL.

Animais e desenho experimental

O presente estudo utilizou 30 camundongos machos de 8 semanas de nascimento de db/db com grau específico livre de patógenos (SPF), juntamente com 10 macos machos de FPS db/ m com idade semelhante. Todos os camundongos experimentais foram criados em uma instalação de grau SPF sob um fotoperíodo de 12 horas claro-escuro e mantidos sob condições estáveis: 22 ± 2 °C, 50–70% de umidade relativa e acesso irrestrito a comida e água potável regulares. A aprovação ética para todos os protocolos experimentais in vivo foi concedida pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (Aprovação nº AHUCM-mouse-2023059).

Os roedores passaram por uma fase de adaptação de 7 dias antes do agrupamento aleatório (6 animais cada) e 8 semanas de intervenção diária. A glicose no sangue em jejum foi medida em todos os animais experimentais; os animais foram alocados usando uma tabela de números aleatórios, e histologia, IHC e quantificação western blot foram realizadas sob avaliação cega.

Grupo controle normal (CTL): camundongos db/m recebendo soro fisiológico por gás oral.

Grupo modelo (M): camundongos db/db recebendo soro fisiológico por gavage oral.

Grupo DJC-Dose Média (DJC-M): camundongos db/db recebendo DJC a 0,78 g/kg (equivalente à dose clínica diária para adultos).

Grupo DJC-Dose Alta (DJC-H): camundongos db/db recebendo DJC a 1,56 g/kg (o dobro da dose clínica diária em adultos).

Preparação da dosagem

A escala de dose de humano para rato foi derivada usando a abordagem de normalização da área superficial corporal, conforme descrito em Metodologia de Experimentos Farmacológicos, com um coeficiente de conversão de 9,1. A dose clínica diária de DJC foi de 6 g para um adulto de 70 kg (0,0857 g/kg), resultando em doses equivalentes para camundongos de 0,78 g/kg (dose clínica 1 vezes) e 1,56 g/kg (dose clínica 2 vezes). Todos os camundongos receberam administração intragástrica em volume constante de 10 mL/kg. O pó de DJC foi precisamente pesado e suspenso em solução CMC-Na a 0,5% para formar suspensões uniformes a 78 mg/mL (dose média) e 156 mg/mL (dose alta).

Após 8 semanas de administração diária, a anestesia foi induzida em todos os camundongos experimentais usando pentobarbital de sódio a 1%. Amostras de sangue foram coletadas pela aorta abdominal e centrifugadas para isolar os supernadantes em ensaios bioquímicos baseados em kits. Gaiolas metabólicas foram usadas para coletar amostras de urina murina. Tecidos renais parciais foram fixados com paraformaldeído a 4% para hematoxilina-eosina (HE) e coloração de Masson. Congelados rapidamente em nitrogênio líquido, os tecidos renais residuais foram preservados a −80 °C para ensaios analíticos posteriores.

Análise histológica

Após fixação em paraformaldeído a 4%, os tecidos renais passaram por desidratação graduada por etanol, limpeza, embedding com parafina e seção serial de 4 μm para posterior coloração tricromática de HE e Masson. A coloração com HE foi realizada seguindo procedimentos padrão (desparafinização, reidratação, coloração nuclear de hematoxilina, diferenciação e azulamento acidificados de etanol, contracoloração de eosina, desidratação, limpeza e montagem de bálsamo neutro) para observar alterações histopatológicas renais. As seções foram imersas em coloração de hematoxilina por 3 minutos, seguidas por contracoloração com eosina por 15 segundos. Para a coloração tricromática de Masson, as seções passaram por desparafinização, reidratação, coloração sequencial, diferenciação e separação de cor com ácido acético, seguidas de desidratação, limpeza e montagem para avaliar o acúmulo de colágeno renal e as alterações fibróticas. A microscopia de campo claro foi empregada para inspecionar e fotografar todas as seções de tecido tingidas com ampliação de 200×. As seções coradas com HE foram pontuadas usando o Índice de Esclerose Glomerular (GSI). Para a coloração tricromática de Masson, foi aplicado o preset Tricromo de Masson para isolar o canal azul de colágeno, e calculou-se a razão entre área de colágeno e área do tecido tingido de vermelho.

Imunohistoquímica (IHC)

Após fixação a cada 24 horas com paraformaldeído a 4%, as amostras de tecido foram desidratadas por gradientes seriados de etanol, sendo então incorporadas na parafina e cortadas em seções sequenciais de 5 μm. Após a deparafinização, as seções passaram por coleta de antígeno e bloqueio de peroxidase endógena. Após o bloqueio, lâminas de tecido foram incubadas com anticorpos primários diluídos a 4 °C durante a noite em uma câmara úmida. As lâminas receberam uma incubação secundária de anticorpos em temperatura ambiente após lavagens com PBS, seguida por uma reação cromogênica DAB até que a intensidade ideal de coloração fosse alcançada. As seções então passaram por contracoloração sequencial com hematoxilina, diferenciação, azulamento, desidratação, limpeza, montagem em coverslip e imagem microscópica em campo claro. A coleta de antígeno foi realizada por autoclavagem por 10 minutos, seguida de resfriamento natural até a temperatura ambiente. Após o bloqueio com soro de cabra a 5% por 60 minutos em temperatura ambiente, as seções foram incubadas com anticorpo primário (diluição 1:200) e depois anticorpo secundário anti-coelho IgG conjugado com HRP (diluição 1:300) por 60 minutos cada em temperatura ambiente. A reação cromogênica DAB foi realizada por 3–5 minutos em temperatura ambiente, monitorada microscopicamente e terminada com enxágue com água destilada. As imagens foram adquiridas com ampliação ×200, e a porcentagem da área positiva de coloração foi quantificada usando o ImageJ.

Detecção ELISA

As etapas de ensaio seguiram os protocolos oficiais fornecidos pelos fornecedores de kits. Padrões de amortecimento de lavagem e diluídos em série foram preparados antecipadamente. Poços em branco, padrão e de amostra eram carregados com reagentes e incubados no escuro. As placas eram lavadas cuidadosamente após a incubação e depois incubadas com a enzima conjugada no escuro. Após a lavagem, um substrato cromogênico foi adicionado para uma reação de cor protegida à luz, que foi terminada com um buffer de parada quando gradientes azuis distintos surgiram nos poços padrão. A absorvância (OD) de cada poço foi medida no comprimento de onda alvo usando um leitor de microplacas. As concentrações séricas de IL-1β e IL-18 foram quantificadas usando curvas de calibração geradas a partir dos valores de OD de concentrações padrão (amostras séricas não diluídas; absorvância medida em 450 nm; oito poços técnicos replicados por amostra). Creatinina urinária e proteína urinária de 24 h foram medidas em amostras de urina não diluídas coletadas usando gaiolas metabólicas de 24 h (absorvância lida em 546 nm; oito réplicas técnicas por amostra).

PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)

O RNA total foi isolado dos tecidos renais, e sua pureza e concentração foram determinadas por espectrofotometria. RNA purificado foi transcrito reversamente para gerar moldes de cDNA. O RT-QPCR foi realizado em um instrumento de PCR em tempo real com o seguinte programa de ciclo térmico: pré-desnaturação de 5 minutos (95 °C), seguido por 40 rodadas de amplificação: 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C. O RT-qPCR foi realizado em uma reação de 10 μL contendo 5 μL de SYBR Green Master Mix, 0,2 μL de primer direto, 0,2 μL de primer reverso, 1 μL de molde de cDNA e 3,6 μL de água livre de RNase. A transcrição reversa para síntese de cDNA foi realizada em um volume total de reação de 20 μL. A análise da curva de fusão foi realizada para confirmar a especificidade de amplificação, e cada amostra foi analisada em três réplicas técnicas. Os níveis de transcrito foram avaliados por normalização 2⁻ΔΔCq para β-actina, com todas as sequências de primer listadas na Tabela 1.

Análise do Western blot

Cerca de 40 mg de amostras de tecido renal foram coletadas de cada coorte de camundongos, trituradas em gelo e totalmente homogeneizadas em tampão de lise proteico. Após uma rotação de 15 minutos a 12.000 rpm a 4 °C, o sobrenadante total contendo proteína proveniente de homogênios de tecido foi coletado, aliquotado e criopreservado a −80 °C. O sobrenadante proteico foi misturado com o tampão de carga e desnaturado fervendo em banho-maria. Aproximadamente 10 μL de amostra proteica normalizada foram carregados por via e separados em géis de 10% de SDS-poliacrilamida. As proteínas-alvo foram transferidas para filtros de nitrocelulose por meio de eletroblotting úmido. A transferência foi realizada com uma corrente fixa de 400 mA em banho de gelo por 30–45 min. Após a transferência, os blots foram incubados em leite desnatado frio por 2 horas, depois incubados durante a noite a 4 °C com anticorpos primários de 1:1.000. Os blots lavados foram cobertos com anticorpos secundários correspondentes (1:10.000) a 4 °C por 2 horas, e sinais de banda luminescente foram registrados e quantificados a partir de fotos de blot usando o software ImageJ. Para GSDMD-N, a tubulina foi usada como controle de carga porque seu peso molecular esperado (~35 kDa) se sobrepõe ao do GAPDH (~36 kDa). Todos os experimentos com western blot foram realizados com três réplicas biológicas independentes.

Análise estatística

Os dados quantitativos são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). As diferenças entre os dois grupos foram analisadas com um teste t de Student sem pareamento, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram avaliadas por análise unilateral da variância (ANOVA) seguidas pelo teste post hoc de Tukey. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Identificação de componentes bioativos e alvos do DJC

Um total de 66 compostos bioativos que atenderam aos critérios de triagem (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18) foram identificados das seis ervas que compõem o DJC. Esses incluíam 26 compostos de Pseudostellaria heterophylla, 6 de Paeonia suffruticosa, 8 de Cuscuta chinensis, 6 de Alisma orientale, 10 de Rehmannia glutinosa e 10 de Whitmania pigra. A ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A DN continua sendo uma das principais causas da DSR, caracterizada por uma patogênese complexa e multifatorial que ainda não é totalmentecompreendida 20,21. Embora o DJC tenha demonstrado eficácia clínica promissora na melhoria da DN, os mecanismos moleculares subjacentes permaneceram em grande parte difíceisde elusão 22. Neste estudo, utilizamos um esquema analítico multi-ômico que integra farmacologia d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelos Projetos-Chave de Pesquisa das Universidades Provinciais de Anhui (Bolsa nº 2024AH050968).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxylin Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
nome do softwareversão
AutoDock Vina1.2.3
Software Cytoscape3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
Software R4.2.0

Referências

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

BiologiaEdi o 233Edi o 233Valor VazioEdi oPiroptoseeixo CCL2 CCR2

Artigos relacionados