É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este estudo combina um modelo de hipertensão ocular em rato com experimentos in vitro mecânicos, agonistas/inibidores e siRNA em fibroblastos esclerais humanos para mostrar que a expressão de Piezo1 é elevada durante a remodelação da matriz extracelular escleral e está funcionalmente envolvida na diferenciação de miofibroblastos.
A diferenciação de miofibroblastos induzida por tensão mecânica é um mecanismo fundamental subjacente à remodelação da matriz extracelular escleral (MEC) no glaucoma. No entanto, a conversão da tensão mecânica em sinais bioquímicos dentro dos fibroblastos esclerais permanece inadequadamente elucidada. Este estudo buscou investigar o papel do Piezo1 na proliferação e diferenciação celular, no contexto da diferenciação de miofibroblastos induzida por tensão mecânica durante a remodelação da ECM escleral. O desenho do estudo combina observações de expressão in vivo de um modelo de hipertensão ocular de rato de uma semana com ensaios mecanicistas in vitro usando estiramento mecânico cíclico (10% a 0,5 Hz por até 24 horas) e modulação farmacológica de Piezo1 (agonista Yoda1, inibidor GsMTx4 e knockdown de siRNA) em fibroblastos esclerais humanos primários (células HSF). Nossas descobertas demonstram que o Piezo1 é expresso no tecido escleral e nas células HSF. No braço in vivo, observou-se um aumento significativo nos níveis de proteína Piezo1 na esclera de ratos hipertensos oculares após uma semana, coincidindo com a expressão elevada de colágeno tipo I (COL1) e actina α-lisa muscular (α-SMA). Nos experimentos in vitro, o estiramento mecânico (8–24 horas) aumentou a expressão de Piezo1 em células HSF. Além disso, a ativação de Piezo1 com Yoda1 (24 h) facilitou a proliferação celular de HSF e aumentou a expressão de α-SMA e COL1. Por outro lado, a redução ou inibição do Piezo1 suprimiu a expressão do COL1 e dificultou a diferenciação dos miofibroblastos sob tensão mecânica. Além disso, a ativação do Piezo1 levou a uma regulação positiva da expressão da proteína associada ao Sim (YAP), enquanto a expressão do YAP induzida por esforço mecânico foi diminuída após a queda ou inibição do Piezo1. Em resumo, nossos achados sugerem que o Piezo1 desempenha um papel na expressão induzida por esforço mecânico de componentes-chave da ECM na esclera no contexto do glaucoma e pode representar um potencial alvo terapêutico que requer validação in vivo adicional.
O glaucoma é uma das principais causas de cegueira irreversível, caracterizado por degeneração progressiva das células ganglionares da retina (RGCs) e dos axônios da cabeça do nervo óptico (ONH), afetando 76 milhões de pessoas em todo o mundo em 2020 1,2. Pressão intraocular elevada (PIO) é o maior fator de risco para oglaucoma 3, e a redução da PIO é atualmente a única opção disponível para atrasar o desenvolvimento e a progressão doglaucoma 4. A ONH, a estrutura onde os axônios RGC saem do olho, é o principal local de dano no glaucoma. A elevação da PIO induz tensão mecânica e deslocamento na ONH, resultando na degeneração dos axônios RGC dentro da cribrosa laminar (LC), levando eventualmente à neuropatia ópticaglaucomatosa 5,6.
A esclera peripapillar (PPS) é o principal tecido portador da ONH, com as propriedades mecânicas da PPS determinando a resposta da ONH à tensão mecânica induzida pelaPIO 7,8. Modelagem por elementos finitos e estudos ex vivo confirmaram que a deformação biomecânica do LC depende da rigidez escleral, e a rigidez aumentada do PPS contribui para a redução da deformação no LC 9,10. Então, a variação na rigidez11,12 e na espessura13 da PPS pode alterar as propriedades biomecânicas relacionadas à PIO do ONH, alterando ainda mais a suscetibilidade a danos no nervo ópticoglaucomato 14,15. Em estudos biomecânicos, a rigidez ocular da esclera glaucomatosa foi maior do que a normal na esclera humana pós-morte 16,17, e o rigidez escleral peripapillar tem sido consistentemente observado tanto em glaucoma humano quanto em modelos animaisexperimentais 18,19,20. Esses dados sugerem que o endurecimento da esclera pode ser uma resposta protetora devido à diminuição da deformação da ONH induzida pela PIO durante o glaucoma.
As características biomecânicas do tecido escleroso são resultado da composição da matriz extracelular sintetizada pelosfibroblastos 21. Evidências recentes sugerem que a tensão mecânica decorrente do aumento da PIO é capaz de ativar fibroblastos esclerais presentes naesclera 22, promover a diferenciação dos miofibroblastos23 e resultar na remodelação daECM 24,25. A transformação mecânica induzida por tensão dos miofibroblastos é um processo chave durante a remodelação da ECM escleral no glaucoma, mas não está claro como a tensão mecânica é convertida em sinais bioquímicos e respostas celulares em fibroblastos esclerais.
Piezo1 é um membro de uma nova família distinta de canais mecanossensíveis catínicos não seletivos, envolvida na fibrose de vários órgãos, incluindo a pele cardíaca e pulmonar26,27. A tensão mecânica pode ativar os canais celulares Piezo1, levando ao aumento do influxo de Ca2+ 28, assim a sinalização dependente do cálcio para regular uma variedade de atividades celulares, incluindo a proliferação, motilidade e diferenciação dosfibroblastos 29,30. Estudos recentes revelaram que, sob tensão mecânica, o Piezo1 promove processos fibróticos da pele estimulando a proliferação, motilidade e diferenciação dosfibroblastos 31. Este estudo inclui dois componentes complementares: um estudo descritivo in vivo da expressão de Piezo1 em um modelo de hipertensão ocular em ratos, e um estudo mecanicista in vitro usando fibroblastos esclerais humanos primários sob tensão mecânica cíclica. Hipotetizamos que a tensão mecânica ativa o Piezo1, que promove a diferenciação de miofibroblastos e a expressão de componentes de ECM em fibroblastos esclerais, potencialmente por meio da sinalização YAP.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Ratos machos Sprague-Dawley (8 semanas de idade) foram obtidos no Centro Experimental de Animais do Hospital Infantil da Universidade Fudan. Todos os ratos estavam improvisados e alojados sob condições de FPS a 22±1 °C e um ciclo de 12 horas de dia/noite. Todos os experimentos com animais seguiram a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmologista e Visual e foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional e pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil da Universidade Fudan (2022JS-EKYY-019). Tecidos esclerais humanos usados para derivar fibroblastos esclerais humanos primários foram obtidos a partir de esclera doadora de acordo com as diretrizes institucionais, e todos os procedimentos relacionados foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Fudan (2024-YS-187).
Desenho experimental
O presente estudo utilizou abordagens tanto in vivo quanto in vitro, conceitualmente conectadas por tensão mecânica, para examinar a contribuição do Piezo1 para a remodelação da ECM escleral. In vivo, usamos um modelo de hipertensão ocular de rato para examinar a expressão de Piezo1 sob PIO elevada. In vitro, submetemos fibroblastos esclerais humanos primários a estiramento mecânico cíclico para modelar a tensão mecânica experimentada pela esclera no glaucoma, e manipulamos a atividade do Piezo1 usando agonista farmacológico (Yoda1), inibidor (GsMTx4) e knockdown do siRNA.
Modelo experimental de hipertensão ocular crônica (OHT)
Um total de 18 ratos machos SD foram utilizados. Em cada rato, o olho direito recebeu injeção de carbomero para induzir hipertensão ocular (OHT), com o olho esquerdo contralateral atuando como grupo controle (NT). Três réplicas biológicas independentes de todo o experimento foram realizadas, totalizando 18 olhos por grupo. A unidade experimental era o olho individual. Os pesquisadores que realizaram medições de PIO e análise de Western blot foram cegos quanto à alocação de grupos.
Um modelo experimental crônico de OHT foi gerado em ratos, conforme descritoanteriormente 25. Brevemente, os ratos foram anestesiados com 10% de cloral hidrato e, após dilatação pupilar por tropicamida, solução de carbômero (0,3%, 20 μL) foi injetada na câmara ocular anterior. Clortetraciclina hidrocloridrata foi aplicada para prevenir infecção. As medições da PIO foram realizadas com um tonômetro de rebote após 3 e 7 dias. Tecidos da esclera foram coletados uma semana após o modelo ter sido considerado estabelecido.
Os tecidos esclerais foram isolados, conforme descrito anteriormente, emdetalhes 25. Após anestesia, os ratos foram perfundidos transcarcádicamente com 4% de formaldeído em PBS. Tecido orbital externo foi dissecado do globo, e as estruturas do segmento anterior (córnea, íris, cristalino) e o vítreo foram cuidadosamente removidos. A retina e a coroide foram suavemente raspadas da parede interna da esclera. Os tecidos da esclera posterior foram coletados e identificados por coloração patológica H&E.
Cultivo celular
Fibroblastos esclerais humanos primários (células HSF) eram uma linha celular previamente estabelecida a partir da esclera32 de doador humano. Três réplicas biológicas independentes (células de três doadores diferentes) foram usadas para cada experimento. As células HSF foram mantidas em DMEM suplementado com 15% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina sob condições padrão de cultura (37 °C, 5% CO2, atmosfera umidificada). As culturas eram divididas a cada quatro dias, e células HSF entre as passagens 5 e 9 eram empregadas em todos os experimentos. As células HSF foram confirmadas por imunofluorescência usando colágeno tipo I e marcadores de células de actina do músculo liso α.
Aplicação da estimulação mecânica
O sistema de estiramento mecânico cíclico foi usado para produzir alongamento cíclico mecânico. Uma densidade de semeadura de 2×105 células/mL foi usada para células HSF placadas em placas de seis poços com fundos flexíveis revestidos de colágeno. Células do grupo de estiramento foram expostas ao alongamento cíclico com amplitude de 10% e 0,5 Hz, conforme descrito em nosso estudoanterior 32. Células cultivadas em placas de estiramento, mas deixando estática, serviam como controles. Experimento de knockdown de siRNA Piezo1: As células receberam uma transfecção de 48 horas de siRNA Piezo1 ou siRNA controle negativo antes do estiramento mecânico. Após a transfecção, as células passaram por alongamento mecânico cíclico por 24 horas. Quatro grupos foram incluídos: (A) células transfectadas por siRNA controle sem estiramento; (B) controlar células transfectadas por siRNA com estiramento; (C) Células transfectadas por siRNA Piezo1 sem estiramento; (D) Células transfectadas por siRNA Piezo1 com estiramento. Experimento do inibidor piezo1 (GsMTx4): As células foram tratadas com 5 μM de GsMTx4 antes e durante o alongamento mecânico. Quatro grupos foram incluídos: (A) células não tratadas sem estiramento; (B) células não tratadas com estiramento; (C) células tratadas com GsMTx4 sem elasticidade; (D) Células tratadas com GsMTx4 com estiramento (com presença de GsMTx4 em todo o processo). Experimento agonista piezo1 (Yoda1): Células foram cultivadas na presença de Yoda1 de 5 μM por 24 horas. Dois grupos foram incluídos: (A) controle não tratado (veículo); (B) Células tratadas com Yoda1.
Western blot
Os níveis de proteína foram avaliados por Western blot seguindo procedimentos rotineiros. Brevemente, lisamos amostras de fibroblastos esclerais ou cultivadas em um tampão RIPA. A proteína (20 μg) foi resolvida por SDS-PAGE e subsequentemente aplicada às membranas de nitrocelulose. As membranas foram então bloqueadas com 5% de BSA por 1 hora à temperatura ambiente, seguida por incubação durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários apropriados. Os anticorpos utilizados incluíam Piezo1, colágeno tipo I, actina α-músculo liso, YAP e GAPDH. O anticorpo Piezo1 foi validado pelo fabricante para Western blot e imunofluorescência em tecidos de ratos e humanos, com dados de knockout/knockdown disponíveis na ficha do produto. Após três lavagens com TBST, incubamos as membranas com anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados (anti-rabbit ou anti-mouse) por 1 hora em temperatura ambiente. As intensidades das bandas eram então medidas usando software de análise de imagem, e o sinal de cada faixa alvo era normalizado para o sinal GAPDH da mesma faixa. Os dados resultantes são apresentados como variação de dobra em relação à condição de controle.
Proliferação celular
A proliferação celular foi avaliada por meio de um ensaio de viabilidade colorimétrica seguindo o protocolo fornecido. Adicionamos um composto de tetrazólio (10 μL/mL) a cada poço e incubamos as placas por 2 horas em condições padrão de cultivo (37 °C, 5% de CO2). A absorção era então lida em 450 nm.
Transfecção de RNA interferente pequena
A transfecção de siRNA Piezo1 foi realizada conforme descritoanteriormente 31. As sequências foram as seguintes: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (sentido) e 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (antissenso), controle negativo (NC) siRNA, 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (sentido) e 5'-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3' (antissenso).
Imunofluorescência
Para imunofluorescência, as células cultivadas foram fixadas com 4% de paraformaldeído (20 min, temperatura ambiente), permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 (40 min) e depois bloqueadas com 10% de BSA. As seções de tecido passaram por fixação noturna em paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente, seguida de permeabilização e bloqueio. As amostras foram incubadas com anticorpos primários contra Piezo1 e α-SMA. Posteriormente, aplicamos anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes: anti-camundongo marcado com verde (para α-SMA) e anti-coelho marcado com vermelho (para Piezo1), cada um com diluição de 1:500. Os núcleos foram contra-tingidos com DAPI, e imagens capturadas com um microscópio de fluorescência.
Tratamento com agonista e inibidor
Células HSF foram tratadas com 5 μM GsMTx4 e 5 μM do agonista Piezo1 Yoda1, com base em estudosanteriores 33.
Análise estatística
Cada experimento foi realizado em triplicado. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Para comparações entre dois grupos, aplicamos um teste t de Student de duas caudas. Comparações múltiplas de grupos foram realizadas com ANOVA unidirecional seguidas pelo teste pós-hoc de Tukey. A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi avaliada usando o teste de Levene. A significância estatística foi definida como p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com software estatístico dedicado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Piezo1 é expresso nos tecidos da esclera de rato e nas células HSF
Primeiro, examinamos a expressão de Piezo1 tanto em tecidos esclerais de rato (in vivo) quanto em fibroblastos esclerais humanos cultivados (in vitro). Para investigar a expressão específica de tecidos do Piezo1, o banco de dados de anotação gênica BioGPS foiutilizado 34. A análise BioGPS revelou que o Piezo1 é altamente expresso em vários tecidos ocular...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Pressão intraocular elevada (PIO) induz tensão mecânica na cabeça do nervo óptico e na cribrosa laminar, contribuindo para a degeneração das células ganglionaresda retina 38,39. A esclera peripapilar (PPS) é um tecido portador importante que influencia a biomecânica daONH 40. Estudos anteriores mostraram que a tensão mecânica induz diferenciação fibroblasto escleral para miofibroblasto e remodelação da mat...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 82401257).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer) | Solarbio, Shanghai, China | — | 20 μL |
| 10% chloral hydrate | Macklin, Shanghai, China | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I) | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| Chlortetracycline hydrochloride | Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China | — | |
| COL1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, Australia | — | |
| GAPDH primary antibody | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism version 8.4 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 microscope | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| Nitrocellulose membranes | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| Rebound tonometer (TonoLab) | Icare, Espoo, Finland | — | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China | — | |
| The Flexcell FX-5000 Tension System | Flexcell International Corporation | — | Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells. |
| Tropicamide | Bausch Lomb Freda, Shandong, China | — | |
| YAP primary antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA primary antibody | Abcam, Cambridge, UK | — |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.