Artigo de método

Consumo Intermitente Automatizado de Álcool em Ratos Socialmente Abrigados via o Sistema de Teste de Intellicagem

142 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/71345

⸱

5 de junho de 2026

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta métodos para uma avaliação automatizada e de alta taxa dos comportamentos de consumo de álcool em camundongos com abrigo social, realizada pelo sistema de testes IntelliCage. Está fornecida uma metodologia detalhada para um paradigma operante e intermitente de consumo de álcool, juntamente com os arquivos experimentais e o código para analisar os dados resultantes.

Resumo

Apesar das conhecidas confundências do isolamento social no comportamento dos roedores, muitos pesquisadores dependem do uso isolado de camundongos para avaliar a preferência por álcool em modelos pré-clínicos de transtorno por uso de álcool (TA). Esse protocolo descreve uma tarefa social de consumo de álcool que permite uma avaliação automatizada e de alta taxa dos comportamentos de consumo de álcool em camundongos, sem os impactos confusos do estresse induzido pelo isolamento social. O sistema de teste IntelliCage permite que os investigadores avaliem simultaneamente o comportamento operante de consumo de álcool em até 16 camundongos do mesmo sexo, cada um identificado de forma única com um transponder de identificação por radiofrequência (RFID) implantado subcutâneo. O acesso às garrafas de beber é controlado por software e pode ser ajustado individualmente para cada mouse. Nesse paradigma crônico e intermitente de álcool, os camundongos se envolvem voluntariamente em sepoques operantes para acessar garrafas com 20% de álcool por seis semanas consecutivas. Garrafas de álcool só estão disponíveis dia sim, dia não, por 24 horas por vez, e podem ser adulteradas opcionalmente com quinino para avaliar o consumo de álcool insensível a punições. Visitas a cada canto operante, nosecokes e dados de lick são registradas automaticamente para cada mouse. Métodos experimentais detalhados e o código aberto para analisar os dados registrados permitirão que os pesquisadores avaliem comportamentos de consumo de álcool relevantes para a AUD de maneira cada vez mais eficiente e etologicamente relevante.

Introdução

Estudos em modelos pré-clínicos são cruciais para desenvolver uma compreensão mais profunda dos mecanismos neurobiológicos subjacentes a comportamentos semelhantes ao transtorno por uso de álcool (TA). No entanto, muitas medidas tradicionais de consumo de álcool em roedores, comoos testes de escolha de duas garrafas 1,2 e o teste de consumo noescuro 3,4,5, exigem a medição manual dos volumes de líquidos entre roedores isolados, um método de baixo débito e propenso a erros. A recente adoção de sistemas lickômetros de código aberto, utilizando tecnologiacapacitiva 6,7,8,9,10 ou fotoelétrica 11,12 para automatizar a contagem de lambidas representa um avanço significativo na taxa de consumo, precisão e sensibilidade técnica da metodologia de consumo de álcool. No entanto, a maioria dos sistemas de lickômetro de gaiola doméstica ainda exige que os roedores sejam isolados individualmente, causando estresse de isolamento13,14. Embora os achados relatados variemamplamente 15,16, roedores geralmente têm maior preferência por álcool quando alojados individualmente 17,18,19,20. No entanto, os efeitos do isolamento social no consumo de álcool variam com base na idade do animal, sexo, ambiente habitacional e exposição anterior aoestresse 20,21,22. O isolamento social tem potencial para interagir significativamente com manipulações experimentais para limitar a validade de resultados comportamentais avaliados semelhantes ao AUD.

Novos sistemas totalmente automatizados de monitoramento de gaiolas domésticas, como o sistema de testes IntelliCage (TSE Systems23, 24, 25) ou alternativas de código aberto, LIQ PARTI20 e FARESHARE26, resolvem esse problema combinando lickometria com rastreamento de identificação por radiofrequência (RFID) de múltiplos animais alojados em grupo. Esses sistemas de monitoramento em gaiolas domésticas permitem uma quantificação mais eficiente e reprodutível dos comportamentos de consumo de álcool, sem as confusões do estresse induzido pelo isolamento social. Assim, são ideais para estudos confirmatórios de alto rendimento de manipulações experimentais que afetam a vulnerabilidade a comportamentos semelhantes ao AUD. Entre eles, o sistema de teste IntelliCage é único por incorporar cantos operantes programáveis para controlar o acesso de garrafas de beber sipper, permitindo que os investigadores avaliem comportamentos de busca na ausência de acesso a drogas, modulem razões operantes para animais individuais e mais.

Aqui, os autores apresentam um paradigma operante de consumo intermitente de álcool rodado pelo sistema de testes IntelliCage em camundongos com abrigadasocial 27,28. Esse paradigma permite a avaliação automatizada e de longo prazo do consumo de álcool em até 16 camundongos do mesmo sexo, cada um identificado de forma única por transponders RFID implantados subcutâneamente. Como descrito abaixo, camundongos são treinados para operar o nariz com uma razão fixa (FR)-3 para acessar frascos de bebida. Após um breve período de treinamento, garrafas de beber em dois dos quatro cantos operantes são substituídas por álcool de 20% (etanol 95% [190 proof] na água da torneira, v/v). Os camundongos têm acesso contínuo à água, mas acesso intermitente ao álcool dia sim, dia não, por períodos de 24 horas (12h30 às 12h30). As lambidas com álcool são quantificadas ao longo de seis semanas, com um teste de adulteração de quinina de dois dias (0,5 mM, 1,0 mM) no meio do experimento para avaliar o consumo de álcool insensível à punição. Os dados de visita, nasepoke e lick são registrados para cada mouse (Figura 1), extraídos usando o software proprietário da TSE e posteriormente analisados usando o pipelineopen-source 29 para obter insights sobre comportamentos semelhantes ao AUD.

Este protocolo complementa outros usos publicados do sistema de testes IntelliCage para avaliar comportamentos semelhantes ao AUD 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, bem como outros comportamentos semelhantes a transtornos por uso de substâncias 40,41,42. De acordo com relatos que sugerem que os cronogramas de acesso intermitente aumentam o consumo voluntário de álcool emroedores 1,43,44,45,46,47, esse protocolo apresenta altos níveis de consumo voluntário de álcool na maioria dos camundongos. No entanto, como os autores observam ao longo do protocolo, os parâmetros experimentais podem ser facilmente modificados para responder a questões experimentais. No geral, essa metodologia oferece uma solução eficiente e flexível para que os pesquisadores estudem os mecanismos subjacentes à AUD.

figure-introduction-1
Figura 1: Rastreamento totalmente automatizado de visitas de camundongo, narizes e licks via identificação RFID única. (Um) Diagrama em desenho animado da implantação de transponder RFID de camundongo. Transponders RFID são implantados subcutâneamente na região dorsocervical para permitir o rastreamento individual em um sistema automatizado de monitoramento de gaiolas domiciliares. (B) Esquema das fases de coleta de dados durante o paradigma automatizado e operante do álcool intermitente. A identidade animal é lida, e uma visita ao canto é registrada por meio de duas leituras de anel RFID e sensor de temperatura, ambas necessárias para serem positivas para que a visita seja registrada (à esquerda). Depois, os camundongos são treinados para fazer o noeping em um cronograma FR-3 para acessar as garrafas de copo (meio). O sucesso do nosepoking gera 5 s de acesso à garrafa sipper, momento em que as lambidas do mouse são registradas por um lickômetro baseado em capacitância (à direita). Desenhos feitos a partir de templates BioRender modificados por Lucy Anderson, licenciados sob CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do NIH (IACUC) e estavam em conformidade com a política do Serviço de Saúde Pública sobre o cuidado e uso humanitário de animais de laboratório.

1. Preparação do aparelho

NOTA: Cada aparelho do sistema de teste IntelliCage consiste em uma grande gaiola plástica doméstica (39 cm x 58 cm x 21 cm) dentro da qual podem residir até 16 camundongos do mesmo sexo. As coortes anteriores variavam de 8 a 16 camundongos por gaiola. O aparelho é equipado com quatro cantos operantes, todos conectados a um microprocessador central na tampa superior. O comedor de roedor é acessível a partir de um grande funil metálico colocado no centro da tampa. Dentro da gaiola, camundongos circulam livremente entre cantos operantes e um espaço central de convivência, equipado com cama e materiais de enriquecimento. Cada canto operante possui uma pequena entrada circular que só permite fisicamente a entrada de um rato por vez. A identidade do mouse é lida e registrada com base nas leituras duplas da antena RFID em anel e do sensor de temperatura, ambas devem ser positivas para que a visita seja registrada. Dentro de cada canto operante, os camundongos recebem duas portas de nariz, cada uma controlando o acesso a uma das duas portas motorizadas. Essas portas programáveis e motorizadas dão acesso a uma das duas garrafas de bebida. Os investigadores programam manualmente as condições para acesso à garrafa de bebida, bem como a sensibilidade dos lickômetros baseados em capacitância. Os dados de visita, nasepoke e lick são registrados individualmente para cada mouse e transferidos por meio de um microprocessador central para um computador onde o sistema proprietário de software da TSE é carregado. Embora não seja discutido neste protocolo, cada câmara operante também contém uma válvula de ar programável para uso em condicionamento aversivo.

  1. Equipe a gaiola plástica com cinco almofadas de fibra de algodão comprimida (15,24 x 25,4 cm), dois pequenos quadrados de algodão (5,08 x 5,08 cm) e quatro estruturas plásticas para escavação para cama e enriquecimento.
    NOTA: O uso de almofadas de fibra de algodão comprimida é recomendado por dois motivos: (1) para evitar que a poeira ou lascas dos materiais de cama comumente usados interfiram na mecânica das portas, e (2) para facilitar a identificação das brigas entre animais.
  2. Coloque a tampa superior com cantos operantes dentro da gaiola plástica da casa.
  3. Se desconectado, conecte todos os cantos operantes ao microprocessador central usando os cabos fornecidos e, em seguida, conecte o microprocessador central a um computador pré-carregado com software TSE usando cabos CAN.
    1. Se estiver usando vários aparelhos, conecte todas as gaiolas ao mesmo computador em série.
  4. Conecte o microprocessador à fonte de energia e certifique-se de que as luzes de LED em cada canto acendam e que todas as oito portas motorizadas se movam.
  5. Encha oito frascos com ~250 mL cada um de água da torneira (ou outro líquido), pressione firmemente as tampas para garantir a vedação adequada e depois gire suavemente nas aberturas do lickómetro, garantindo uma conexão firme ao lickómetro.
    NOTA: A sensibilidade dos sensores de visita, nariz e lick pode ser otimizada opcionalmente por meio de um experimento piloto. Para ajustar a sensibilidade de cada canto, siga as instruções do fabricante descritas no arquivo "Ajuda" do programa "Controlador". Todos os estudos utilizaram as seguintes configurações: visitar- 816 LIGADO/768 DESLIGADO; nosepoke - 21 LIGADOS/26 DE FOLGA; lickómetro - 69 ON/80 OFF/15 TIME-out.
  6. Encha o depósito de comida com comida de roedores.
  7. Ligue o computador, abra o aplicativo "Controlador" e carregue o arquivo do experimento desejado.

2. Preparando animais

NOTA: Os animais devem receber transponders RFID implantados pelo menos uma semana antes do início dos testes comportamentais para permitir tempo suficiente de recuperação. Use camundongos envelhecidos pelo menos ~50 dias, com peso corporal superior a 15 g. Implantar camundongos menores aumenta o risco de ferir o camundongo durante a injeção. Dependendo da linha do camundongo, a agressividade pode se tornar um problema em condições de abrigo coletivo, especialmente entre machos. Mitigue esse risco abrigando todos os camundongos juntos durante a adolescência. Os autores não observaram agressividade significativa em estudos com camundongos adultos (~PND 80–150) do tipo selvagem C57BL/6, mas isso não garante a generalização desse protocolo para outros genótipos, idades ou arranjos habitacionais.

  1. Implantam subcutaneamente camundongos com transponders RFID na região dorsocervical para identificação única.
    1. Imprima uma tabela de dados listando todos os animais experimentais com um espaço ao lado de cada identificação para colocar um adesivo de código de barras listando o código RFID deles.
    2. Reúna todos os animais e suprimentos necessários: transponders RFID, injetor transponder RFID recarregável e sistema de indução de isoflurano.
    3. Coloque o primeiro camundongo na câmara de indução e anestesie via isoflurano vaporizado (fluxímetro de oxigênio: 1,5 mL/min, isoflurano: 1,5–3,5%) até que o camundongo esteja respirando profundamente, soluçando, e não responda a uma pinchada no dedo do pé.
      1. Enquanto espera o mouse ser anestesiado, coloque o transponder RFID no injetor rosqueando a agulha pré-carregada na base do injetor e depois ejetando lentamente a seringa até ver o microchip se mover.
      2. Aplique o código de barras identificando o código RFID na tabela de dados impressa ao lado do documento de identificação do animal apropriado.
    4. Retire o camundongo da câmara de indução e implante o transponder RFID pré-carregado subcutaneamente na região dorsocervical.
      1. Após verificar primeiro que o mouse não responde a um beliscão no dedo do pé, use o polegar e o indicador da mão não dominante para beliscar a barba do rato diretamente acima das omoplatas.
      2. Usando a mão dominante, insira a agulha do injetor subcutânea na parte posterior da barba do camundongo, certificando-se de manter a agulha levantada acima e paralela à coluna para evitar ferir o camundongo.
      3. Com a ponta da seringa dentro da barba do rato e firmemente estabilizada entre o polegar e o indicador, mova cuidadosamente a mão dominante para que a pessoa possa pressionar o êmbolo do injetor.
      4. Ejete o transponder RFID, mantendo os dedos da mão não dominante apertados ao redor da nuca para que se possa sentir quando o microchip sair da ponta da seringa.
      5. Enquanto mantém a barba presa, remova o injetor lentamente. Só solte a barba do pelo quando o injetor estiver completamente removido para evitar que o transponder caia.
        NOTA: Opcionalmente, um único nó de sutura pode ser adicionado para fechar a pele enquanto o camundongo está sob anestesia.
    5. Retorne o rato à sua gaiola e monitore a recuperação da anestesia até estar totalmente em movimento.
    6. Monitore o camundongo em busca de sinais de comprometimento físico, incluindo paralisia parcial, mancando ou circulação, que possam indicar uma injeção fora do alvo. Se as deficiências persistirem por mais de 24 horas ou afetarem severamente o bem-estar animal, eutanásia de forma humana.
      1. Aponte o leitor de transponder RFID acima da região dorsocervical do camundongo e faça uma varredura para confirmar a colocação bem-sucedida.
    7. Opcionalmente, colete uma amostra de tecido para genotipagem.
      1. Repita com todos os camundongos experimentais.
  2. Um dia após a implantação inicial do transponder RFID, use o leitor de transponder RFID para verificar se nenhum mouse perdeu seus transponders RFID. Se algum camundongo tiver perdido seus transponders, repita o procedimento com um novo transponder e atualize os registros de acordo.
    NOTA: Normalmente, se o transponder RFID de um camundongo vai cair, isso acontece dentro de 24 horas após a implantação. Isso pode ocorrer devido à colocação incorreta do transponder RFID e/ou ao cuidado do mouse/arranhão no local da injeção. Evite reinjetar em feridas anteriores e exclua camundongos após três implantações fracassadas de transponder RFID.
  3. Antes de recolocar os mouses no aparelho IntelliCage, verifique se todos os transponders RFID podem ser lidos com sucesso. Pese e registre o peso corporal de todos os ratos.

3. Preparação de arquivos experimentais

NOTA: O sistema de testes IntelliCage é controlado e operado por meio de interfaces gráficas fornecidas pela TSE. Existem três aplicações usadas para executar experimentos IntelliCage: "Designer", "Controller" e "Analyzer". Diferentes fases do experimento são executadas por meio de diferentes arquivos experimentais, que são projetados no aplicativo "Designer" e depois executados no aplicativo "Controlador". Informações detalhadas sobre como projetar e adaptar arquivos experimentais já foramdescritas anteriormente 48,49. Modelos dos quatro arquivos experimentais usados no estudo (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermitent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment) foram fornecidos para auxiliar na replicação do protocolo. Nesses arquivos, as mudanças de fase ocorrem às 12h30. Os autores escolheram esse horário porque os animais eram alojados em um ciclo de luz das 6:00 às 18:00. Isso permitiu uma fase escura ininterrupta para medir os hábitos de bebida. No entanto, os investigadores podem querer mudar esse horário para ser consistente com outras metodologias de consumo de álcool, como os procedimentos de "beber no escuro" (50).

  1. Configure arquivos de experimentos no aplicativo "Designer".
    NOTA: Se estiver trabalhando com os arquivos template, exclua os quatro animais de exemplo antes de entrar na coorte atual. Além disso, renomeie os nomes dos grupos para o desenho experimental e adicione grupos conforme necessário. Certifique-se de que os novos grupos comecem todos com o mesmo cluster dos do template.
    1. Abra o arquivo Habituation.experiment na aplicação "Designer" e insira cuidadosamente o ID do animal, o código do transponder RFID e o grupo/genótipo experimental de cada camundongo. Salve o arquivo com um novo nome para manter o arquivo modelo.
      NOTA: Se os códigos do transponder RFID forem digitados incorretamente, os dados não serão registrados. Atribuir os animais aos grupos experimentais relevantes ajudará a monitorar seu comportamento e, em última instância, a analisar os dados.
    2. Exporte as informações dos animais como um arquivo de animais.
    3. Para cada fase do experimento, abra o arquivo correspondente e carregue o arquivo dos animais. Salve e renomeie adequadamente.
    4. Ao projetar arquivos em um computador separado, baixe os arquivos experimentais em um pen drive portátil para transporte até a sala de comportamento.
  2. Baixe todos os arquivos experimentais para o computador conectado ao(s) aparelho(s) IntelliCage e abra o primeiro arquivo no aplicativo "Controlador". Verifique se todas as informações carregam corretamente.
  3. Seja em papel ou eletronicamente, crie um arquivo de registro experimental onde se anotem a data e a hora em que se pode iniciar/parar diferentes fases do experimento. Isso ajudará muito na análise, já que certas condições de drogas (por exemplo, álcool adulterado com quinina) não estão registradas nos arquivos do arquivo IntelliCage.

figure-protocol-1
Figura 2: Linha do tempo experimental para o paradigma operante e intermitente do consumo de álcool. (A) Esquema do aparelho IntelliCage com garrafas contendo álcool em dois dos quatro cantos. (B) Linha do tempo experimental que mostra o cronograma de todas as fases experimentais, conforme usado na publicaçãoanterior 23. A coorte 1 realizou um teste de álcool adulterado com quinina após concluir o consumo intermitente de álcool, enquanto as coortes 2 e 3 retornaram ao consumo intermitente de álcool após adulteração. (C) Calendário experimental detalhado mostrando mudanças de software para todas as fases experimentais: habituação, treinamento com água, consumo intermitente de álcool, teste de álcool adulterado com quinina e consumo de álcool "open bar"/acesso livre. As trocas de gaiolas são agendadas pelo menos uma vez por semana após a conclusão de um módulo "Acesso ao Álcool LIGADO". Desenhos feitos a partir de templates BioRender modificados por Lucy Anderson, licenciados sob CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Conduzir o experimento

NOTA: O paradigma operante e intermitente do consumo de álcool consiste em cinco fases: (1) habituação, (2) treinamento com água, (3) consumo intermitente de álcool, (4) teste de álcool adulterado com quinina, e (5) "open bar"/consumo de álcool de acesso livre. Cada fase do experimento é executada em arquivos experimentais diferentes, exceto para o consumo intermitente de álcool e o teste de álcool adulterado com quinina, que ambos utilizam os parâmetros especificados no arquivo Intermitent Alcohol.experiment . Fora as trocas de gaiola, os experimentadores devem verificar os camundongos pelo menos três vezes por semana para avaliar o bem-estar dos animais e garantir que o software esteja funcionando corretamente. Qualquer camundongo encontrado ferido ou doente deve ser removido do experimento. Para um exemplo de cronograma experimental, veja a Figura 2.

  1. Mudanças na gaiola
    NOTA: Realize trocas de gaiola pelo menos uma vez por semana. Durante o consumo de álcool, realize essas mudanças apenas após as 12h30 durante o "Acesso APENAS à água" para evitar interromper o consumo de álcool. Para facilitar isso, os arquivos Intermitent Alcohol.experiment e Open Bar.experiment sempre começarão com "Acesso à Água SOSO." Devido ao tamanho das gaiolas, é difícil manusear as gaiolas ocupadas sozinho. Os autores recomendam que pelo menos um investigador adicional auxilie nas mudanças de gaiola. Verifique os camundongos 24 horas após cada troca de gaiola para garantir que o software está rodando corretamente e que não houve agressividade/briga em resposta ao estresse da troca.
    1. Antes de começar a trocar a gaiola, prepare uma gaiola plástica nova e limpa, com cama e materiais de ninho novos. Enche cada uma das oito garrafas/gaiolas com ~250 mL de água da torneira ou 20% de álcool (etanol 95% [190 proof] na água da torneira, v/v).
      NOTA: Opcionalmente, os investigadores podem adicionar uma pequena quantidade do material antigo da cama à nova e limpa gaiola. Isso minimiza a interrupção das hierarquias de grupo estabelecidas e pode reduzir o risco de conflitos.
    2. Pare o experimento na aplicação "Controlador". Após garantir que não há ratos nos cantos operantes, remova o funil metálico de alimentos. Peça para uma pessoa levantar o aparelho de microprocessador metálico alto o suficiente para que a segunda pessoa possa deslizar a gaiola plástica para fora de baixo. Verifique o número correto de mouse.
    3. Retire os camundongos um a um da gaiola suja, escaneie o transponder RFID e registre o peso corporal. Examine visualmente cada camundongo em busca de sinais de lesão ou doença.
      NOTA: Os autores recomendam registrar o peso corporal em uma planilha eletrônica (csv) para que ele possa ser facilmente lido na linha de análise do processo.
    4. Coloque temporariamente os camundongos em um recipiente limpo após registrar o peso do corpo.
    5. Limpe a parte superior e os cantos com uma toalha úmida embebida em desinfetante. Tome cuidado especial para limpar a superfície e a saliência inferior da placa de canto, sem deixar nenhum líquido vazar nas partes eletrônicas.
    6. Levante o microprocessador metálico alto o suficiente para deslizar a nova e limpa gaiola plástica no lugar.
    7. Gire delicadamente novas garrafas de beber nas aberturas do lickómetro, garantindo uma conexão firme ao lickómetro.
    8. Transfira os ratos para um novo aparelho limpo.
    9. Substitua o depósito de comida por um novo e limpo e uma comida fresca para roedores.
    10. Reinicie o mesmo experimento na aplicação "Controlador" ou carregue e inicie um novo arquivo experimental.
    11. Certifique-se de que o programa está rodando corretamente e que todos os ratos estejam tendo visitas, narizes e licks registrados adequadamente.
      NOTA: O programa "Controlador" apresentará automaticamente avisos quando um animal não tiver licks registrados em um período de 12 horas.
    12. Limpe equipamentos sujos. Gaiolas plásticas, garrafas de gole e estruturas plásticas de escavação geralmente podem ser lavadas por sistemas típicos de lavagem de gaiolas.
  2. Dia 0: Habituação
    NOTA: A fase de habituação é executada usando o arquivo Habituation.experiment . Durante essa fase, todas as garrafas de beber contêm água da torneira. Os ratos têm acesso livre a todas as garrafas sem os narizes operantes. Portas motorizadas se abrem quando os ratos entram em um canto operante, revelando acesso aos bicos das garrafas de bebida.
    1. Após verificar a presença do transponder RFID e registrar o peso do corpo do camundongo, enche todas as oito garrafas com ~250 mL de água da torneira e torça suavemente nas aberturas do lickômetro.
    2. Coloque até 16 camundongos do mesmo sexo no aparelho IntelliCage preparado.
    3. Carregue o arquivo Habituation.experiment no aplicativo "Controlador" e comece a gravar.
    4. Verifique se todas as portas motorizadas estão abrindo corretamente quando um mouse entra no canto operante e se todas as visitas, narizes e licks estão sendo registrados com sucesso para cada mouse. Se nenhuma visita, nariz ou lambida foi registrada em um rato em um período de 6 horas, verifique o arquivo .animal para encontrar erros.
  3. Dias 1-3: Treinamento na água
    NOTA: A fase de treinamento aquático é realizada usando o arquivo Water Training.experiment . Todas as garrafas de gole devem continuar contendo apenas água da torneira. Essa fase treina os camundongos para fazerem nosepoke em um FR-1 e, posteriormente, em um esquema FR-3 para acessar os bicos da garrafa de bebida. Após o sucesso do noepoping, portas motorizadas se abrem para fornecer acesso à garrafa de beber por 5 segundos. Quando um camundongo individual atinge uma taxa de sucesso de 60% ou mais, ele é movido para um cronograma FR-3 pelo restante da duração do programa. Normalmente, os camundongos adotam o cronograma FR-3 em até 24–72 horas. Monitore o desempenho dos animais no "Controlador". Se um animal não atingir o esquema FR-3 dentro de 72 horas, exclua-o de novos experimentos.
    1. Se todos os camundongos parecerem hidratados e sem ferimentos após 24 horas de habituação, pare de rodar o arquivo Habitatuation.experiment e comece a rodar o arquivo Water Training.experiment .
    2. Verifique se as visitas, narizes e licks estão sendo registrados com sucesso pelo software para cada mouse e se todas as portas motorizadas estão abrindo corretamente.
  4. Dia 4+: Consumo intermitente de álcool
    NOTA: A fase de consumo intermitente de álcool é executada usando o arquivo Intermitent Alcohol.experiment . Nessa fase, garrafas de tampa em dois dos quatro cantos operantes são substituídas por álcool de 20%. Os cantos de água versus álcool são pré-especificados via recurso "Clusters" no arquivo experimental. No modelo, a água é entregue nos cantos um e três (rotulados como "neutro") enquanto o álcool está nos cantos dois e quatro (rotulados como "incorretos"). Os camundongos têm acesso contínuo à água, mas acesso intermitente ao álcool por períodos de 24 horas (12h30 às 12h30) dia sim, dia não. O acesso de 5 s de garrafa de beber é fornecido por um FR-3 para todos os cantos. Durante essa fase do experimento, realize trocas de gaiola durante os períodos de "Acesso APENAS à Água" para evitar interromper o consumo de álcool. Os pesquisadores devem garantir que os grupos experimentais demonstrem preferência aproximadamente igual pelos quatro cantos durante o treinamento aquático antes de designar os cantos de álcool para consumo intermitente de álcool. Em cada uma das coortes, os grupos experimentais apresentaram visitas e golpes aproximadamente iguais nos quatro cantos durante o treinamento aquático. Por essa razão, os autores mantiveram as atribuições de canto fixas entre as coortes. Experimentadores podem facilmente visualizar a proporção de licks e visitas nos cantos via o programa "Controlador". Certifique-se de monitorar os dados de visita e lambida regularmente durante o experimento para garantir que não surjam problemas (por exemplo, falhas no equipamento ou "monopolizando" certos cantos por ratos).
    1. Depois que todos os camundongos alcançarem com sucesso um esquema FR-3 para acessar frascos de bebida, prepare álcool a 20% (etanol 95% [190 proof] em água da torneira, v/v; ~250 mL/garrafa).
    2. Pare de rodar o arquivo Water Training.experiment .
    3. Remova as garrafas de copo no canto operante dois e quatro (ou os cantos que você especificou no arquivo experimental, se diferentes) e substitua cada uma por ~250 mL de álcool a 20%.
    4. Torça suavemente garrafas novas contendo álcool nas aberturas do lickómetro, garantindo uma conexão firme ao lickómetro.
    5. Carregue o arquivo Intermitent Alcohol.experiment e comece a gravar.
    6. Verifique se as visitas, narizes e licks estão sendo registrados com sucesso pelo software para cada mouse e se todas as portas motorizadas estão abrindo corretamente.
    7. Após as 12h30 do dia seguinte, verifique se o programa mudou com sucesso do módulo "Acesso à Água SOMENTE" para o módulo "Acesso ao Álcool LIGADO" e que os licks foram registrados nos cantos operantes contendo álcool.
  5. Dia 16+: Teste de álcool adulterado com quinina
    NOTA: A fase do teste de álcool adulterado com quinina é realizada usando o arquivo Intermitent Alcohol.experiment. Nesta fase, as garrafas de beber em dois cantos operantes que antes continham 20% de álcool são substituídas por 0,5 mM, e subsequentemente, 1 mM de quinina adulterada com 20% de álcool para avaliar o consumo insensível à punição. Essas concentrações de quinina, que correspondem a 0,016% e 0,032% de quinina (v/v), respectivamente, já foram encontradas como aversas em testes realizados pelo grupo27,28 eoutros 31. Os camundongos têm acesso contínuo à água, mas acesso intermitente a álcool adulterado com quinina por períodos de 24 horas a cada dois dias (ou seja, um dia de 0,5 mM de quinina, um dia de acesso apenas à água, um dia de 1,0 mM de quinina). O acesso é fornecido em um cronograma FR-3 para todos os cantos. Neste estudo, os camundongos realizaram essa fase da tarefa após 16 ou 24 dias consecutivos de consumo intermitente de álcool puro. Não foram feitas trocas de gaiola no dia da água entre os testes de adulteração para evitar impactos confusos do estresse. Após essa fase do experimento, os camundongos podem começar a beber álcool em "bar aberto"/acesso livre ou voltar a beber intermitentemente para avaliar o consumo de rebote após a adulteração.
    1. Prepare 0,5 mM e 1 mM de álcool adulterado com quinina, 20% (etanol 95% [190 proof] em água da torneira, v/v; ~250 mL/garrafa).
    2. Faça uma troca de gaiola, removendo todas as garrafas de bebida.
    3. Encha cada garrafa de copo nos cantos do álcool com ~250 mL de solução de 0,5 mM adulterada com 20% de álcool.
    4. Torça suavemente garrafas novas contendo álcool nas aberturas do lickómetro, garantindo uma conexão firme ao lickómetro.
    5. Carregue o arquivo Intermitent Alcohol.experiment e comece a gravar.
    6. Verifique se as visitas, narizes e licks estão sendo registrados com sucesso pelo software para cada mouse e se todas as portas motorizadas estão abrindo corretamente.
    7. Após 12h30, verifique se o programa mudou com sucesso do módulo "Acesso à Água SOSO" para o módulo "Acesso ao Álcool LIGADO" e que as lambidas foram registradas nos cantos operantes contendo álcool.
    8. Antes das 12h30 do próximo dia de consumo de álcool, substitua cada garrafa no canto do álcool por ~250 mL de solução de álcool 20% adulterada com quinina. Não há necessidade de interromper o experimento para a troca de garrafa.
    9. Antes das 12h30 do próximo dia de consumo alcoólico, retire as garrafas de copo contendo álcool adulterado e substitua cada uma por ~250 mL de álcool 20% puro.
  6. Dia 20+: "Open bar"/acesso gratuito ao consumo de álcool
    NOTA: Pode-se opcionalmente realizar um dia de "bar aberto"/consumo de álcool de acesso livre para servir como controle não operante. Esta fase é executada usando o arquivo Open Bar.experiment . Nesta fase, garrafas de beber em dois dos quatro cantos operantes contêm 20% de álcool, ao qual os camundongos têm acesso por um período de 24 horas (12h30 às 12h30). Uma visita ao canto vai abrir as portas sem precisar de nariz. Neste estudo, os camundongos realizaram essa fase da tarefa após as fases de teste de consumo intermitente de álcool ou de álcool adulterado com quinina.
    1. Se necessário, prepare álcool com 20% (etanol 95% [190 proof] em água da torneira, v/v; ~250 mL/garrafa).
    2. Antes das 12h30 do próximo dia de álcool, pare de rodar o arquivo atual do experimento.
    3. Se necessário, retire as garrafas de bebo nos cantos do álcool e substitua cada uma por ~250 mL de álcool a 20%.
    4. Torça suavemente garrafas novas contendo álcool nas aberturas do lickómetro, garantindo uma conexão firme ao lickómetro.
    5. Carregue o arquivo Open Bar.experiment e comece a gravar.
    6. Verifique se as visitas, os narizes e os licks estão sendo registrados com sucesso pelo software para cada mouse e se todas as portas motorizadas estão abertas livremente.
    7. Após 12h30, verifique se o programa mudou com sucesso do módulo "Acesso à Água SOSO" para o módulo "Acesso ao Álcool LIGADO" e que as lambidas foram registradas nos cantos operantes contendo álcool.

5. Análise de dados

NOTA: Os dados de cada experimento são armazenados internamente até que o programa seja interrompido. Nesse momento, um arquivo de dados compactado é criado e armazenado no disco rígido local em C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. O nome do arquivo consiste na data e hora em que o programa foi iniciado e termina em .zip.  Os arquivos de arquivo de dados contêm todas as informações relevantes sobre o experimento, incluindo visitas a cantos (horário de início, horário de término, duração, sequência de visitas), nosepokes (hora de início, hora de término, duração), licks (hora de início, hora de término, duração), horários de luz e de escuridão, e dados de temperatura. Esse arquivo de dados pode ser lido e analisado com o programa "Analyzer". Embora existam outros pacotes open-source para analisar os dados do IntelliCage (Ruffini et al., 2021; Gastaldi et al., 2025), os autores criaram um pipeline de análise de dados em R usando pacotes públicos do tidyverse para analisar dados do paradigma do consumo intermitente de álcool. O pipeline inclui múltiplas etapas de controle de qualidade, incluindo análise da ocupação de cantos por mouse; frequência média de visita, nariz e lambida ao longo do ritmo circadiano; Taxa de aquisição de lambidas FR-3 por mouse; e contagens diárias de lambidas por rato. Além disso, os autores fornecem análises básicas de roteiro sobre medidas de consumo de álcool. A base é um arquivo modelo de caderno R usando a linguagem de marcação Quarto, que processa os arquivos de dados e pode ser adaptado para variações específicas de coorte animal. A análise é feita usando a versão gratuita do RStudio. Um arquivo modelo de projeto para R está localizado no repositório29 do GitHub.

  1. Compile todos os dados, incluindo arquivos zip gerados pelo aplicativo "Controlador" e o arquivo CSV contendo os dados do peso do corpo do mouse.
    NOTA: Os pesos são necessários para normalizar a ingestão pelo peso corporal. Nesse fluxo de trabalho, fazia mais sentido coletar os dados de peso em um arquivo separado do que adicioná-los a cada arquivo experimental. A primeira coluna precisa corresponder ao Animal ID dos arquivos de arquivo.
  2. Baixe o modelo do projeto R do repositório do GitHub.
    1. Renomeie o projeto para combinar com o experimento.
    2. O modelo vem com arquivos de dados de exemplo para ilustrar como a análise funciona, localizados na subpasta data/C1. Substitua os arquivos de arquivo por arquivos de dados personalizados.
  3. Inicie o RStudio e abra o projeto.
    1. Na seção de arquivos da janela no canto inferior direito do RStudio, navegue até a pasta qmd e abra o arquivo IC_template.qmd.
    2. Duplique o arquivo modelo e renomeie para combinar com o experimento.
    3. Ajuste os metadados na parte do cabeçalho YAML do arquivo duplicado e no bloco inicial de código.
    4. Ajuste os nomes dos grupos no arquivo IC_Commons.R no diretório R para corresponder aos grupos experimentais. (O modelo usa dois grupos: Control e LBN.)
  4. Execute o arquivo do caderno.
    NOTA: Instruções mais detalhadas são fornecidas com os arquivos README.md no repositório do GitHub.

figure-protocol-2
Figura 3: Acesso comparável aos cantos operantes entre todos os camundongos durante as fases de treinamento e consumo intermitente de álcool. Entre os camundongos da primeiracoorte 23, mapa térmico mostrando o tempo total passado em cada canto por dia por camundongo durante (A) habituação e treinamento na água versus (B) os primeiros quatro dias de consumo intermitente de álcool (n = 15 F, 16 M). Cores vermelhas mais escuras indicam mais tempo no canto por dia. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-protocol-3
Figura 4: Ratos realizam visitas, narizes e lambidelas consistentes com o ritmo circadiano e adquirem com sucesso acesso à garrafa operante em um cronograma FR-3. Entre os camundongos da primeiracoorte, 23, densidade média de visitas ao canto operante (A), (B) sepoques do nariz e (C) lambidas durante o tempo da sessão durante os primeiros oito dias de teste. (D) Tempo até que cada camundongo lamba com sucesso uma proporção FR-3 durante o treinamento na água. (E) Taxa de sucesso nas visitas (= % de visitas resultando em lambidas / visitas totais) entre camundongos durante a habituação e o treinamento com água (esquerda) versus os primeiros quatro dias de consumo intermitente de álcool (direita). Símbolos circulares indicam mulheres (n = 15); símbolos quadrados denotam homens (n = 16). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-protocol-4
Figura 5: Os ratos participam de taxas diárias de lambição comparáveis durante o treinamento e fases intermitentes de consumo de álcool. Entre (A) fêmea (n = 15) e (B) macho (n = 16) coorte umcamundongo, 23, número total de lambidas diárias de água (azul) e álcool (vermelho) durante a habituação e o treinamento com água (dia -4–0) versus consumo intermitente de álcool (dia 1–4). C indica erguida controlada; L indica criação LBN. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-protocol-5
Figura 6: Ratos expostos à adversidade na infância bebem mais álcool do que os controles no paradigma operante e intermitente do consumo de álcool. (A) Média de lamedas de álcool por dia normalizadas pelo peso corporal (g; medido semanalmente) durante 8 dias de acesso intermitente ao álcool entre camundongos controle (cinza; esquerdo) e criados com LBN (rosa; direito). (B) Média de lambidas de álcool por dia normalizadas pelo peso corporal antes, durante e após a adulteração de quinina (0,5 mM, 1 mM). (C) Gráfico de densidade mostrando a média de lambidas de álcool por dia normalizadas pelo peso corporal durante um único dia de acesso ao álcool "Open Bar" com FR-0. Símbolos circulares indicam mulheres (n = 15); símbolos quadrados denotam homens (n = 16). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Os autores utilizaram testes automatizados de gaiolas domésticas via IntelliCages para avaliar como a adversidade na infância (ELA) altera a vulnerabilidade a comportamentos semelhantes aos doAUD 27. Para induzir adversidades, eles usaram o paradigma de cama e anidificação limitada (LBN), um modelo de escassez de recursos que induz cuidados maternos imprevisíveis efragmentados 51,52,53,54,55,56. O estudo foi inovador na avaliação dos efeitos do ELA nos comportamentos de consumo de álcool entre camundongos que vivem em casas sociais, sem os impactos confusos do estresse induzido pelo isolamento social. Isso foi importante, já que o isolamento social na vida adulta é conhecido por impactar de forma diferenciada camundongos expostos aoELA 22,57. Para alcançar o máximo de rendimento, os autores mediram simultaneamente os comportamentos de consumo de álcool em quatro aparelhos IntelliCage, dois para cada sexo.

Os autores iniciaram a linha de análise realizando um controle de qualidade rigoroso dos dados brutos. Os gráficos incluídos aqui mostram dados representativos da primeira coorte (n = 15 F, 16 M) do estudopublicado 23. Scripts para toda análise e plotagem estão incluídos no repositório29 do GitHub. O dia 0 experimental foi excluído devido a uma mudança na gaiola, que interrompeu a coleta de dados. Entre as considerações para a exploração de dados e controle de qualidade, os autores garantiram que todos os camundongos tivessem acesso aproximadamente igual a todos os cantos operantes tanto durante o treinamento (Figura 3A) quanto durante a fase intermitente de consumo de álcool (Figura 3B). Isso exclui impactos significativos de ratos "monopolizando" os cantos operantes, impedindo que outros ratos acessem as garrafas de bebida. Os autores validaram então que os camundongos realizaram visitas, narizes e lambidas em um ritmo circadiano esperado ao longo dos dias experimentais (Figura 4A–C) e que todos os camundongos realizaram com sucesso a primeira lambida com uma razão FR-3 dentro de seis horas após o início do módulo (Figura 4D). Ao final da fase de treinamento na água, todos os camundongos alcançaram uma taxa relativamente alta de sucesso na lambida (= % das visitas resultando em lambida / total de visitas), confirmando ainda mais que o treinamento foi bem-sucedido ao final do treinamento na água (Figura 4E).

Durante a habituação, o treinamento com água e o início do consumo intermitente de álcool, os camundongos mantiveram números aproximadamente comparáveis de lambidas diárias (Figuras 5A–B). Embora alguns camundongos tenham apresentado queda no total de lambidas diárias no início do treinamento operante na água no dia experimental -3 (por exemplo, P241260-1), a maioria dos camundongos adquiriu rapidamente um cronograma de nariz FR-1 e FR-3 o suficiente para manter as taxas de lambida basal. Assim, é improvável que os camundongos tenham sofrido desidratação excessiva durante o treinamento com água. Todos os camundongos aprenderam o esquema FR-3 em uma taxa razoável. Uma vez que o consumo intermitente de álcool começou no primeiro dia experimental, quase todos os camundongos optaram por consumir álcool, embora em taxas variadas. Em geral, os camundongos não aumentaram significativamente o total de lambidas diárias ao consumir álcool. Em vez disso, os camundongos passaram a usar menos lambidas de água para acomodar o aumento do consumo de álcool.

Em todos os dias de consumo intermitente de álcool, os camundongos da primeira coorte variaram amplamente nas relambidas diárias de álcool em relação ao peso corporal (Figura 6A). Os autores descobriram que camundongos que passaram pelo paradigma LBN tinham pesos corporais significativamente menores do que os controles cruzados23. Assim, ao examinar as diferenças entre grupos no consumo de álcool, optaram por normalizar as lambidas diárias de álcool pelo peso corporal, que os autores avaliavam semanalmente durante as trocas de gaiola. Os camundongos criados com LBN geralmente beberam mais álcool por grama de peso corporal do que os controles tanto durante o consumo intermitente (Figura 6A) quanto durante a adulteração de quinina (Figura 6B). Essa tendência permaneceu durante um único dia de acesso aberto não operante (Figura 6C). Esses achados da primeira coorte são consistentes com os resultados publicados, nos quais os autores relatam que camundongos expostos à ELA beberam consistentemente mais álcool por grama de peso corporal do que os controles cruzados durante o acesso intermitente, efeito particularmente pronunciado nosmachos 23.

Possibilitado pela eficiência dos sistemas automatizados de monitoramento de gaiolas domésticas, o estudo publicado confirmou aumento no consumo de álcool entre roedores expostos socialmente a ELA em tamanhos de amostra extremamente robustos, incluindo ambos os sexos (n = 54 controle, 43 LBN)23. Esses resultados representam um avanço na modelagem dos comportamentos semelhantes ao AUD observados em pacientes com histórico de experiências adversas na infância 58,59,60,61,62, e abrem caminho para futuros estudos mecanicistas que identificam a neurobiologia subjacente ao aumento da vulnerabilidade ao AUD após o ELA.

Discussão

Como exemplificado pelo uso do IntelliCages pelos autores para avaliar robustamente comportamentos semelhantes ao AUD em camundongos expostos aoELA 27 , bem como pelos trabalhos anteriores em linhastransgênicas 28, sistemas automatizados de monitoramento doméstico oferecem uma solução eficiente e flexível para estudar modelos pré-clínicos de AUD. A avaliação simultânea de até 16 camundongos que vivem juntos aumenta significativamente a capacidade de uso da metodologia de consumo de álcool, evitando os impactos confusos do estresse induzido pelo isolamento social. O paradigma operante e intermitente do consumo de álcool permite que experimentadores investiguem múltiplas facetas do comportamento semelhante ao AUD ao longo de um único período de ~5–6 semanas, incluindo consumo excessivo de álcool, escalada ao longo do tempo e consumo insensível a punições. Embora o paradigma ofereça um método para avaliar comportamentos semelhantes ao AUD, o desenho pode ser facilmente adaptado para medir o consumo intermitente de consumo de forma mais crônica, testar o consumo insensível à punição em resposta a uma baforada de ar, ou adicionar uma razão operante variável, entre outras possibilidades. No geral, sistemas automatizados de monitoramento de gaiolas domésticas aumentam substancialmente o fluxo de trabalho e a especificidade com que os investigadores podem avaliar comportamentos semelhantes ao AUD, impulsionando a identificação de novos circuitos e tratamentos subjacentes.

Como em toda tecnologia, os autores ocasionalmente enfrentam falhas mecânicas e técnicas. Apesar da tentação de permitir que o sistema funcione sem supervisão, é fundamental que os investigadores continuem monitorando regularmente o aparelho para garantir o funcionamento adequado. Falhas mecânicas ocasionais nas portas magnéticas resultavam na inacessibilidade dos frascos de gole para os ratos. Isso ocorria raramente com limpeza e manutenção adequadas e geralmente causava pouca perturbação para a coleta de dados. Para identificar erros rapidamente, é importante monitorar as garrafas de beber para quedas comparáveis de líquido e verificar regularmente o aplicativo "Controlador" para verificar se as lambidas estão sendo registradas em todos os cantos para todos os animais. Para conselhos mais detalhados, Masuda e colegas apresentam uma excelente descrição de como configurar e realizar manutenção no IntelliCages48.

Também é essencial observar regularmente o comportamento animal para monitorar possíveis brigas ou outros comportamentos de confusão. Embora os autores não tenham tido grandes problemas de luta ao executar esse paradigma com camundongos C57/BL6, a co-habitação de machos com genótipos mais agressivos resultou em problemas significativos. Monitore regularmente se sangue seco, animais mancando ou outros sinais de briga, especialmente após trocas de gaiola. Se alguém notar esses sinais, remova prontamente o(s) animal(es) infrator(es) e exclua-os de novos experimentos. Use a seção "Desempenho individual de camundongos" do código fornecido para avaliar se, e por quanto tempo, a agressividade impactou o comportamento de consumo de camundongos individuais. Exclua todos os dias afetados da análise. Como mencionado anteriormente, os autores não podem garantir a generalização do protocolo para diferentes genótipos ou arranjos de habitação.

Relacionado a isso, os autores ocasionalmente tiveram problemas com ratos "monopolizando" cantos operantes, dormindo ou ocupando o mesmo canto por horas a fio. Esse comportamento impede outros ratos de acessarem as garrafas de copo naquele canto. Essas situações podem confundir os resultados do consumo de álcool se não forem devidamente consideradas na análise. Use as seções "Ocupação de Canto (Duração das Visitas)" e "Desempenho individual do rato" do código fornecido para decidir se o "monopolização" impactou significativamente o comportamento do camundongo para excluir certos dias experimentais. Em geral, a incapacidade de registrar ou quantificar comportamentos sociais durante os experimentos é uma grande limitação desse sistema automatizado de monitoramento.

Por fim, como cada vez mais acontece com métodos neurocientíficos avançados, sistemas automatizados de monitoramento homecage produzem grandes quantidades de dados. Por meio de código aberto como o apresentadoaqui 29 e desenvolvido poroutros 63,64, os experimentadores dispõem de múltiplas ferramentas para organizar e analisar os dados que saem. No entanto, modificações no protocolo apresentado aqui exigirão a adaptação do código. Além disso, inúmeras análises adicionais poderiam ser realizadas sobre o acervo de dados de saída não apresentados aqui.

Por exemplo, os investigadores podem se interessar em quantificar o consumo de álcool (g de álcool por kg de peso de camundongo por dia). Os autores discutem isso brevemente e fornecem alguns códigos preliminares para realizar essa análise no repositório29 do GitHub. Lá, os autores usam um fator de conversão lick-para-volume de 1,94 μL/lick, consistente com cálculos feitos por Kasia Radwanska e colegas30,37. Embora esse fator de conversão de lick tenha sido usado para estimar o consumo de álcool por outros naárea 30, 37, 38, 39, ele foi calculado medindo o consumo de água. Assim, pode não ser uma medida precisa do consumo de álcool de 20% devido às diferenças na tensão superficial entre água e álcool. Outros na área usaram um fator de conversão lick de 3 μL/lick 31,34,36,38, destacando a necessidade de resolver essa medição. Não se pode descartar a possibilidade de camundongos se envolverem em licks de tamanhos diferentes, o que complica ainda mais esse cálculo. Se os pesquisadores estiverem interessados em obter uma medida precisa do consumo de álcool (g/kg/dia), os autores recomendam calcular um fator de conversão de lambição para volume consistente com o desenho experimental.

Em conclusão, o avanço e o aumento da acessibilidade dos sistemas automatizados de monitoramento de gaiolas domésticas oferecem aos pesquisadores de AUD novas e aprimoradas ferramentas para avaliar o consumo de álcool de forma pré-clínica. Paradigmas operantes de consumo intermitente de álcool como este permitem que experimentadores avaliem simultaneamente múltiplos aspectos do comportamento semelhante ao AUD em um débito muito maior e com maior relevância etológica do que a metodologia tradicional. Por meio dos sistemas de teste IntelliCage e das alternativas de códigoaberto 20,26, os pesquisadores podem investigar de forma mais eficiente e flexível os comportamentos de consumo de álcool consistentes com AUD, acelerando a identificação de intervenções eficazes.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por financiamento do Programa de Pesquisa Intramuros do NIH dos Institutos Nacionais de Saúde para a V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). Gostaríamos de agradecer a Miriam Bocarsly, Anoo Maskeri e Erin Murray pela ajuda no desenvolvimento deste protocolo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol, 190 ProofLaboratórios de Descontaminação2801G
Sistema de Testes IntelliCageSistemas TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Inclui 1x 2000P Static Cage (Tecniplast, 2000P001),   4x Mouse Houses (Tecniplast, ACRE011) e 8x Sipper Bottles (Techniplast, ACBT0252) e tampas (Techniplast, ACCP3521)
IntelliCage Software ("Designer", "Controlador", "Analisador")Sistemas TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Versão 3.6.9.0
Isopads, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Almofadas de fibra de algodão comprimida (15,24 x 25,4 cm)
IsofluranoBaxter10019-360-40
Isoflurano VXP & trade; Vaporizador de Bem EnchidoMedVet91305535
Dieta de Roedores de LaboratórioLabDiet5001
Câmara de Indução Medium Sure-Seal para Rato/Rato  Instrumentos de Precisão MundialEZ-178
NestletsAncareNES 3600Pequenos quadrados de algodão (5,08 x 5,08 cm)
OHAUS Compass & Trade; Balança CX - 2.200 gramas x 1 gramaUlineH-8110Para medições do peso corporal do camundongo
PC + DisplaySupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Vendido como parte do sistema de testes IntelliCage
Transponder RFID (1,25 x 7 mm)Sistemas TSE290000-IC-60400
Injetor de Transponder RFIDAVIDAVID2028
Leitor de Transponder RFIDSistemas TSE290000-IC-50800
RStudioPostularhttps://posit.co/download/rstudio-desktopVersão 2026.01.1+403; com Tidyverse (2.0.0) e Quarto (1.9.37)
Béquer Descartável Tri PourPlásticos Consolidados45317Para medições do peso corporal do camundongo

Referências

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Comportamento OperanteSistema IntelliCageTranstorno por Uso de ÁlcoolAvaliação AutomatizadaAcesso Intermitente ao ÁlcoolTransponder RFIDIngestão VoluntáriaTestagem de Alto Rendimento

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.