Bioinformática e Análise Quantitativa em Tempo Real da Reação em Cadeia da Polimerase de SUCNR1 e GPR37L1 na esquizofrenia

Resumo

Este estudo avalia SUCNR1 e GPR37L1 como marcadores moleculares associados à esquizofrenia candidatos por meio de análise bioinformática integrada do conjunto de dados GSE54913, validação quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR) e análise de correlação com memória verbal em uma coorte independente.

Resumo

A esquizofrenia é um transtorno mental grave, complexo e multifatorial que envolve diversos elementos genéticos de suscetibilidade, levando a deficiência, morbidade e mortalidade substanciais. Apesar do progresso significativo na compreensão de sua fisiopatologia e etiologia, biomarcadores diagnósticos específicos para esquizofrenia continuam difíceis de alcançar. Este estudo teve como objetivo identificar marcadores moleculares candidatos associados à esquizofrenia. Uma análise integrada de bioinformática foi realizada no conjunto público de microarrays GSE54913. As análises de vias da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaram que os termos GO mais significativamente enriquecidos estavam relacionados à atividade do canal, incluindo atividade passiva do transportador transmembrana, atividade do canal iônico, atividade do canal canalizado e atividade do canal específico do substrato. As cinco principais vias enriquecidas do KEGG foram secreção de insulina, via de sinalização do cAMP, reparo da excisão de nucleotídeos, via de sinalização do TNF e metabolismo do glutatio. A validação foi realizada usando reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) em um conjunto de amostras independentes do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan. Os resultados da qRT-PCR foram amplamente consistentes com a análise de microarray (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). A análise da rede de interação proteína-proteína (PPI) identificou dois genes-hub, SUCNR1 e GPR37L1, que estavam significativamente associados ao termo GO 'atividade de canal iônico' e enriquecidos na via KEGG 'secreção de insulina'. Além disso, a expressão de SUCNR1 mostrou correlação negativa com as pontuações de memória verbal (r = -0,54, P = 0,015), enquanto GPR37L1 expressão mostrou correlação positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Esses achados sugerem que a alteração da expressão de SUCNR1 e GPR37L1 pode estar associada à esquizofrenia e pode representar marcadores moleculares candidatos para investigação adicional.

Introdução

A esquizofrenia é um transtorno mental crônico e complexo de etiologia não identificada, caracterizado por disfunção cerebral severa, comprometimento cognitivo e déficits psicossociais¹. Representa um grande fardo global para a saúde, afetando mais de 21 milhões de pessoas no^{mundo todo 2}. Embora as abordagens diagnósticas e terapêuticas tenham evoluído consideravelmente nos últimos cinquenta anos, a patogênese central permanece incerta, e os desfechos de longo prazo associados a incapacidade, morbidade e mortalidade substanciais não melhoraram^{significativamente 3}. Portanto, identificar genes potenciais fundamentais e alvos reguladores é imprescindível.

A fisiopatologia da esquizofrenia, embora não totalmente elucidada, é amplamente atribuída a polimorfismos genéticos e variações^{de expressão.} Por exemplo, variação genética no gene alfa do estrogênio pode influenciar a suscetibilidade à esquizofrenia por meio de regulação gênica alternativa e processamento de^{transcritos 5}. De forma semelhante, uma variante promotora funcional do NRG1 foi associada à esquizofrenia e correlacionada com a redução da expressão do isoforma^{NRG1 tipo III 6}. Estudos postmortem mostraram uma expressão significativamente reduzida das isoformas de PDE4B em cérebros esquizofrênicos, sugerindo seu potencial^{preditivo 7}. Outros candidatos incluem o transportador de dopamina (DAT), transportador de monoaminas vesiculares (VMAT2) e monoaminooxidase (MAO), que regulam os níveis sinápticos de dopamina e podem servir como^{biomarcadores 8}. Além disso, o TCP1 pode contribuir para déficits do citoesqueleto por meio de dobramento inadequado da actina na^{esquizofrenia 9}. Assim, elucidar perfis de expressão gênica na patogênese da esquizofrenia pode fornecer insights sobre predivisão de risco, compreensão mecanicista e avaliação terapêutica.

Abordagens computacionais recentes avançaram na identificação de genes associados a doenças por meio de análise integrada de redes e métodos de aprendizado^{de máquina} 10,11,12. Apesar de inúmeros estudos genéticos, nenhum biomarcador diagnóstico baseado em sangue confiável foi traduzido na prática clínica da esquizofrenia. Para suprir essa lacuna, o presente estudo utilizou uma abordagem integrada de bioinformática para reanalisar o conjunto de dados GSE54913, que contém dados transcriptômicos derivados do sangue de pacientes bem caracterizados com esquizofrenia e controles saudáveis. O conjunto de dados foi selecionado porque (1) as amostras de sangue periférico são minimamente invasivas e clinicamente práticas, (2) inclui um tamanho de amostra relativamente grande entre os conjuntos de dados de microarrays de esquizofrenia disponíveis publicamente, e (3) dados brutos estavam disponíveis para reanálise. Os objetivos deste estudo foram: (1) identificar genes expressos de forma diferencial em pacientes com esquizofrenia em comparação com controles saudáveis usando o conjunto de dados GSE54913; (2) realizar análises de enriquecimento funcional e redes de PPI para identificar genes hub; (3) validar a expressão de genes candidatos por qRT-PCR em uma coorte independente; e (4) explorar a correlação entre a expressão do gene central e o desempenho da memória verbal. Até onde os autores sabem, este é o primeiro estudo a identificar SUCNR1 e GPR37L1 como marcadores moleculares sanguíneos candidatos para esquizofrenia.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan (código de identificação do projeto, YF-IRB202310215) e conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os participantes eram residentes da comunidade chinesa e forneceram consentimento informado por escrito.

Sujeitos do estudo e coleta de sangue
Dez adultos diagnosticados com esquizofrenia e dez voluntários saudáveis do controle sem histórico familiar de doença mental em três gerações foram inscritos. Critérios de inclusão para pacientes com esquizofrenia: (1) diagnóstico de esquizofrenia segundo os critérios do DSM-5 confirmado por dois psiquiatras seniores independentes; (2) idade de 18 a 65 anos; (3) nenhuma alteração na medicação antipsicótica por pelo menos 4 semanas antes da coleta de sangue; (4) disposição para fornecer consentimento informado por escrito. Critérios de exclusão: (1) doenças médicas graves comórbidas (por exemplo, diabetes, doenças cardiovasculares, câncer); (2) abuso ou dependência de substâncias nos últimos 6 meses; (3) deficiência intelectual; (4) gravidez ou lactação. Critérios de inclusão para controles saudáveis: (1) sem histórico pessoal ou familiar (em três gerações) de qualquer doença mental; (2) não usar medicamentos antipsicóticos atuais ou passados; (3) compatível com o grupo de esquizofrenia por idade e sexo; (4) não há doenças médicas graves. A duração média da doença para pacientes com esquizofrenia foi de 12,5 ± 6,8 anos; Todos os pacientes estavam em medicação antipsicótica estável (6 com risperidona, 4 com olanzapina); a média do escore total do PANSS foi de 76,4 ± 12,3. Os controles foram pareados por idade (±5 anos) e sexo (5 homens, 5 mulheres por grupo). A memória verbal foi avaliada usando a pontuação total de recordação no Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Todos os participantes foram recrutados do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan entre 1º de janeiro e 31 de julho de 2025. A demografia de base está resumida na Tabela 1.

O tamanho da amostra foi determinado usando software de cálculo de tamanho amostral para um teste t independente de duas caudas, com tamanho de efeito de 1,2, α = 0,05 e potência (1-β) = 0,80, resultando em um mínimo de nove participantes por grupo.

Sangue venoso era retirado para tubos anticoagulados com EDTA e processado sem demora. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram então separadas das amostras por centrifugação por gradiente de densidade usando meio de gradiente de densidade. Brevemente, o sangue foi diluído 1:1 com soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4), aplicado em camadas sobre o meio gradiente de densidade e centrifugado a 400 × g por 30 minutos a 20 °C com o freio desligado. Após a centrifugação, a interface contendo PBMC foi cuidadosamente transferida para um novo tubo. As células foram enxaguadas duas vezes com PBS, com cada lavagem seguida de centrifugação a 300 × g por 10 minutos a 4 °C, e o pellet final foi suspenso em PBS. A viabilidade foi avaliada usando o método de exclusão de corante trypan blue, e apenas preparações com células viáveis ≥95% foram usadas. PBMCs isolados foram alicotados e armazenados a −80 °C por um máximo de 3 meses antes da extração de RNA.

Dados de microarranjos
O fluxo de trabalho do estudo é mostrado na Figura 1. O conjunto de dados de microarrays GSE54913 foi baixado do banco de dados GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Este conjunto de dados foi selecionado porque (1) contém dados transcriptômicos de amostras de sangue periférico, que são minimamente invasivas e clinicamente práticas para a descoberta de biomarcadores; (2) inclui uma amostra relativamente grande entre conjuntos de dados de microarray de esquizofrenia disponíveis publicamente (18 pacientes, 12 controles); (3) os dados brutos estavam disponíveis para reanálise. De acordo com o registro GEO, as amostras foram derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), não de plasma. A descrição original 'amostras de plasma' na versão anterior era um erro e foi corrigida.

Pré-processamento de dados e triagem diferencialmente expressa de genes (DEG)
Dados brutos (. arquivos CEL) eram pré-processados usando software de pré-processamento de microarrays. A correção de fundo foi realizada usando o método Robust Multichip Average (RMA), seguida pela normalização de quantil e transformação log2. Os sondeios sem qualquer anotação genética foram filtrados. Foram excluídas sondas com >20% de valores ausentes entre as amostras; Os valores faltantes para sondas restantes foram imputados usando o algoritmo de k-vizinhos mais próximos (k = 10) implementado em softwares de imputação de valores faltantes. Os efeitos do lote não estavam presentes, pois todas as amostras foram processadas em um único lote, de acordo com o registro GEO. Após o pré-processamento, os valores de expressão de 17.200 genes foram obtidos para análise posterior. As DEGs entre pacientes com esquizofrenia e controles saudáveis foram identificadas usando software de análise diferencial de expressão. Genes com taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05, mudança absoluta de dobra (FC) > 1,2 e P < 0,05 foram considerados expressos de forma diferencial. Um limiar relativamente baixo de FC (FC absoluto > 1,2) foi escolhido porque a esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico complexo no qual as diferenças de expressão gênica individual são frequentemente sutis, e não drasticas.

Análises de GO e enriquecimento de vias
Análises de enriquecimento funcional para termos de Ontologia Gênica (GO) e caminhos da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) foram realizadas usando software de análise de enriquecimento funcional. O conjunto de genes de fundo consistia em todos os genes que passaram pelo pré-processamento (17.200 genes). Termos e caminhos de enriquecimento com valores P brutos < 0,05 foram reportados. Como os valores P brutos foram usados para saídas de enriquecimento GO e KEGG, esses resultados devem ser interpretados como exploratórios.

Análise de redes de PPI e identificação de genes centrais
Um banco de dados de interação proteína-proteína foi usado para construir uma rede de IBP, com uma pontuação combinada de interação > 0,9 definida como limiar. A rede foi visualizada usando software de visualização de rede. Os genes hub foram identificados usando um plugin de identificação de genes hub com o algoritmo Degree. Os 10 principais nós com as maiores pontuações foram selecionados como genes hub. A sub-rede dos genes principais do hub foi extraída usando um plugin de extração de subrede com parâmetros padrão (corte de grau = 2, corte de pontuação de nó = 0,2, K-core = 2, profundidade máxima = 100).

Isolamento total de RNA e qRT-PCR
β-Actina era usada como gene de referência interno (de manutenção doméstica). A estabilidade da expressão de β-actina entre amostras foi confirmada por não haver diferença significativa nos valores de Ct entre os grupos esquizofrenia e controle (P > 0,05). A quantificação relativa foi realizada usando o método 2^−ΔΔCt . Todas as reações foram realizadas em triplicada, e o valor médio de Ct foi usado para o cálculo (veja as sequências de detonadores na Tabela 2). Os dez principais DEGs (cinco mais significativamente aumentados e cinco mais significativamente reduzidos por mudança de dobra) foram selecionados para validação inicial qRT-PCR para confirmar a confiabilidade geral dos dados do microarray. Posteriormente, SUCNR1 e GPR37L1 foram selecionados para validação focada com base em três critérios: (1) foram identificados como genes hub na análise da rede PPI (grau ≥ 7); (2) eles estavam significativamente associados ao termo GO altamente enriquecido 'atividade de canal iônico' e à via KEGG 'secreção de insulina'; (3) ambos codificam GPCRs, que são alvos conhecidos de medicamentos na esquizofrenia.

Análise estatística
A normalidade foi avaliada com o teste de Shapiro–Wilk. Variáveis que apresentaram uma distribuição aproximadamente normal (P > 0,05) foram analisadas usando métodos paramétricos, incluindo o teste t de Student para comparações em dois grupos e ANOVA unidirecional para comparações envolvendo mais de dois grupos. Quando a suposição de normalidade não foi cumprida, foram usados testes Mann– Whitney U ou Kruskal–Wallis, conforme apropriado. Todos os testes estatísticos foram de duas caras. Para comparações múltiplas (por exemplo, em testes pós-hoc ANOVA), foi aplicado o método da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg (FDR), com um limiar FDR de 0,05. Para as análises de correlação, nenhuma correção por múltiplas comparações foi aplicada, pois apenas duas correlações foram realizadas; os valores P brutos são reportados com cautela.

Resultados

Identificação de DEGs e agrupamento hierárquico
A análise do conjunto de dados GSE54913 identificou 473 genes diferencialmente expressos (DEGs), incluindo 357 genes regulados para cima e 116 para baixo, entre pacientes com esquizofrenia e controles (Figura 2A,B). O agrupamento hierárquico desses DEGs distinguiu amostras de esquizofrenia dos controles (Figura 2C).

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Discussão

A esquizofrenia é um distúrbio grave e multifatorial que envolve diversos fatores de suscetibilidade genética^13,14. Embora haja progresso na compreensão de sua fisiopatologia, ainda faltam biomarcadores diagnósticos confiáveis. Neste estudo, uma abordagem integrada de bioinformática identificou 473 DEGs em amostras de sangue de pacientes com esquizofrenia. Análises GO e KEGG destacaram o enriquecimento em termos e vias relacionad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction