Bioinformática e Análise Quantitativa em Tempo Real da Reação em Cadeia da Polimerase de SUCNR1 e GPR37L1 na esquizofrenia

Resumo

Este estudo avalia SUCNR1 e GPR37L1 como marcadores moleculares associados à esquizofrenia candidatos por meio de análise bioinformática integrada do conjunto de dados GSE54913, validação quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR) e análise de correlação com memória verbal em uma coorte independente.

Resumo

A esquizofrenia é um transtorno mental grave, complexo e multifatorial que envolve diversos elementos genéticos de suscetibilidade, levando a deficiência, morbidade e mortalidade substanciais. Apesar do progresso significativo na compreensão de sua fisiopatologia e etiologia, biomarcadores diagnósticos específicos para esquizofrenia continuam difíceis de alcançar. Este estudo teve como objetivo identificar marcadores moleculares candidatos associados à esquizofrenia. Uma análise integrada de bioinformática foi realizada no conjunto público de microarrays GSE54913. As análises de vias da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaram que os termos GO mais significativamente enriquecidos estavam relacionados à atividade do canal, incluindo atividade passiva do transportador transmembrana, atividade do canal iônico, atividade do canal canalizado e atividade do canal específico do substrato. As cinco principais vias enriquecidas do KEGG foram secreção de insulina, via de sinalização do cAMP, reparo da excisão de nucleotídeos, via de sinalização do TNF e metabolismo do glutatio. A validação foi realizada usando reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) em um conjunto de amostras independentes do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan. Os resultados da qRT-PCR foram amplamente consistentes com a análise de microarray (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). A análise da rede de interação proteína-proteína (PPI) identificou dois genes-hub, SUCNR1 e GPR37L1, que estavam significativamente associados ao termo GO 'atividade de canal iônico' e enriquecidos na via KEGG 'secreção de insulina'. Além disso, a expressão de SUCNR1 mostrou correlação negativa com as pontuações de memória verbal (r = -0,54, P = 0,015), enquanto GPR37L1 expressão mostrou correlação positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Esses achados sugerem que a alteração da expressão de SUCNR1 e GPR37L1 pode estar associada à esquizofrenia e pode representar marcadores moleculares candidatos para investigação adicional.

Introdução

A esquizofrenia é um transtorno mental crônico e complexo de etiologia não identificada, caracterizado por disfunção cerebral severa, comprometimento cognitivo e déficits psicossociais¹. Representa um grande fardo global para a saúde, afetando mais de 21 milhões de pessoas no^{mundo todo 2}. Embora as abordagens diagnósticas e terapêuticas tenham evoluído consideravelmente nos últimos cinquenta anos, a patogênese central permanece incerta, e os desfechos de longo prazo associados a incapacidade, morbidade e mortalidade substanciais não melhoraram^{significativamente 3}. Portanto, identificar genes potenciais fundamentais e alvos reguladores é imprescindível.

A fisiopatologia da esquizofrenia, embora não totalmente elucidada, é amplamente atribuída a polimorfismos genéticos e variações^{de expressão.} Por exemplo, variação genética no gene alfa do estrogênio pode influenciar a suscetibilidade à esquizofrenia por meio de regulação gênica alternativa e processamento de^{transcritos 5}. De forma semelhante, uma variante promotora funcional do NRG1 foi associada à esquizofrenia e correlacionada com a redução da expressão do isoforma^{NRG1 tipo III 6}. Estudos postmortem mostraram uma expressão significativamente reduzida das isoformas de PDE4B em cérebros esquizofrênicos, sugerindo seu potencial^{preditivo 7}. Outros candidatos incluem o transportador de dopamina (DAT), transportador de monoaminas vesiculares (VMAT2) e monoaminooxidase (MAO), que regulam os níveis sinápticos de dopamina e podem servir como^{biomarcadores 8}. Além disso, o TCP1 pode contribuir para déficits do citoesqueleto por meio de dobramento inadequado da actina na^{esquizofrenia 9}. Assim, elucidar perfis de expressão gênica na patogênese da esquizofrenia pode fornecer insights sobre predivisão de risco, compreensão mecanicista e avaliação terapêutica.

Abordagens computacionais recentes avançaram na identificação de genes associados a doenças por meio de análise integrada de redes e métodos de aprendizado^{de máquina} 10,11,12. Apesar de inúmeros estudos genéticos, nenhum biomarcador diagnóstico baseado em sangue confiável foi traduzido na prática clínica da esquizofrenia. Para suprir essa lacuna, o presente estudo utilizou uma abordagem integrada de bioinformática para reanalisar o conjunto de dados GSE54913, que contém dados transcriptômicos derivados do sangue de pacientes bem caracterizados com esquizofrenia e controles saudáveis. O conjunto de dados foi selecionado porque (1) as amostras de sangue periférico são minimamente invasivas e clinicamente práticas, (2) inclui um tamanho de amostra relativamente grande entre os conjuntos de dados de microarrays de esquizofrenia disponíveis publicamente, e (3) dados brutos estavam disponíveis para reanálise. Os objetivos deste estudo foram: (1) identificar genes expressos de forma diferencial em pacientes com esquizofrenia em comparação com controles saudáveis usando o conjunto de dados GSE54913; (2) realizar análises de enriquecimento funcional e redes de PPI para identificar genes hub; (3) validar a expressão de genes candidatos por qRT-PCR em uma coorte independente; e (4) explorar a correlação entre a expressão do gene central e o desempenho da memória verbal. Até onde os autores sabem, este é o primeiro estudo a identificar SUCNR1 e GPR37L1 como marcadores moleculares sanguíneos candidatos para esquizofrenia.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan (código de identificação do projeto, YF-IRB202310215) e conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os participantes eram residentes da comunidade chinesa e forneceram consentimento informado por escrito.

Sujeitos do estudo e coleta de sangue
Dez adultos diagnosticados com esquizofrenia e dez voluntários saudáveis do controle sem histórico familiar de doença mental em três gerações foram inscritos. Critérios de inclusão para pacientes com esquizofrenia: (1) diagnóstico de esquizofrenia segundo os critérios do DSM-5 confirmado por dois psiquiatras seniores independentes; (2) idade de 18 a 65 anos; (3) nenhuma alteração na medicação antipsicótica por pelo menos 4 semanas antes da coleta de sangue; (4) disposição para fornecer consentimento informado por escrito. Critérios de exclusão: (1) doenças médicas graves comórbidas (por exemplo, diabetes, doenças cardiovasculares, câncer); (2) abuso ou dependência de substâncias nos últimos 6 meses; (3) deficiência intelectual; (4) gravidez ou lactação. Critérios de inclusão para controles saudáveis: (1) sem histórico pessoal ou familiar (em três gerações) de qualquer doença mental; (2) não usar medicamentos antipsicóticos atuais ou passados; (3) compatível com o grupo de esquizofrenia por idade e sexo; (4) não há doenças médicas graves. A duração média da doença para pacientes com esquizofrenia foi de 12,5 ± 6,8 anos; Todos os pacientes estavam em medicação antipsicótica estável (6 com risperidona, 4 com olanzapina); a média do escore total do PANSS foi de 76,4 ± 12,3. Os controles foram pareados por idade (±5 anos) e sexo (5 homens, 5 mulheres por grupo). A memória verbal foi avaliada usando a pontuação total de recordação no Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Todos os participantes foram recrutados do Hospital Rongjun Youfu de Wuhan entre 1º de janeiro e 31 de julho de 2025. A demografia de base está resumida na Tabela 1.

O tamanho da amostra foi determinado usando software de cálculo de tamanho amostral para um teste t independente de duas caudas, com tamanho de efeito de 1,2, α = 0,05 e potência (1-β) = 0,80, resultando em um mínimo de nove participantes por grupo.

Sangue venoso era retirado para tubos anticoagulados com EDTA e processado sem demora. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram então separadas das amostras por centrifugação por gradiente de densidade usando meio de gradiente de densidade. Brevemente, o sangue foi diluído 1:1 com soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4), aplicado em camadas sobre o meio gradiente de densidade e centrifugado a 400 × g por 30 minutos a 20 °C com o freio desligado. Após a centrifugação, a interface contendo PBMC foi cuidadosamente transferida para um novo tubo. As células foram enxaguadas duas vezes com PBS, com cada lavagem seguida de centrifugação a 300 × g por 10 minutos a 4 °C, e o pellet final foi suspenso em PBS. A viabilidade foi avaliada usando o método de exclusão de corante trypan blue, e apenas preparações com células viáveis ≥95% foram usadas. PBMCs isolados foram alicotados e armazenados a −80 °C por um máximo de 3 meses antes da extração de RNA.

Dados de microarranjos
O fluxo de trabalho do estudo é mostrado na Figura 1. O conjunto de dados de microarrays GSE54913 foi baixado do banco de dados GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Este conjunto de dados foi selecionado porque (1) contém dados transcriptômicos de amostras de sangue periférico, que são minimamente invasivas e clinicamente práticas para a descoberta de biomarcadores; (2) inclui uma amostra relativamente grande entre conjuntos de dados de microarray de esquizofrenia disponíveis publicamente (18 pacientes, 12 controles); (3) os dados brutos estavam disponíveis para reanálise. De acordo com o registro GEO, as amostras foram derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), não de plasma. A descrição original 'amostras de plasma' na versão anterior era um erro e foi corrigida.

Pré-processamento de dados e triagem diferencialmente expressa de genes (DEG)
Dados brutos (. arquivos CEL) eram pré-processados usando software de pré-processamento de microarrays. A correção de fundo foi realizada usando o método Robust Multichip Average (RMA), seguida pela normalização de quantil e transformação log2. Os sondeios sem qualquer anotação genética foram filtrados. Foram excluídas sondas com >20% de valores ausentes entre as amostras; Os valores faltantes para sondas restantes foram imputados usando o algoritmo de k-vizinhos mais próximos (k = 10) implementado em softwares de imputação de valores faltantes. Os efeitos do lote não estavam presentes, pois todas as amostras foram processadas em um único lote, de acordo com o registro GEO. Após o pré-processamento, os valores de expressão de 17.200 genes foram obtidos para análise posterior. As DEGs entre pacientes com esquizofrenia e controles saudáveis foram identificadas usando software de análise diferencial de expressão. Genes com taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05, mudança absoluta de dobra (FC) > 1,2 e P < 0,05 foram considerados expressos de forma diferencial. Um limiar relativamente baixo de FC (FC absoluto > 1,2) foi escolhido porque a esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico complexo no qual as diferenças de expressão gênica individual são frequentemente sutis, e não drasticas.

Análises de GO e enriquecimento de vias
Análises de enriquecimento funcional para termos de Ontologia Gênica (GO) e caminhos da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) foram realizadas usando software de análise de enriquecimento funcional. O conjunto de genes de fundo consistia em todos os genes que passaram pelo pré-processamento (17.200 genes). Termos e caminhos de enriquecimento com valores P brutos < 0,05 foram reportados. Como os valores P brutos foram usados para saídas de enriquecimento GO e KEGG, esses resultados devem ser interpretados como exploratórios.

Análise de redes de PPI e identificação de genes centrais
Um banco de dados de interação proteína-proteína foi usado para construir uma rede de IBP, com uma pontuação combinada de interação > 0,9 definida como limiar. A rede foi visualizada usando software de visualização de rede. Os genes hub foram identificados usando um plugin de identificação de genes hub com o algoritmo Degree. Os 10 principais nós com as maiores pontuações foram selecionados como genes hub. A sub-rede dos genes principais do hub foi extraída usando um plugin de extração de subrede com parâmetros padrão (corte de grau = 2, corte de pontuação de nó = 0,2, K-core = 2, profundidade máxima = 100).

Isolamento total de RNA e qRT-PCR
β-Actina era usada como gene de referência interno (de manutenção doméstica). A estabilidade da expressão de β-actina entre amostras foi confirmada por não haver diferença significativa nos valores de Ct entre os grupos esquizofrenia e controle (P > 0,05). A quantificação relativa foi realizada usando o método 2^−ΔΔCt . Todas as reações foram realizadas em triplicada, e o valor médio de Ct foi usado para o cálculo (veja as sequências de detonadores na Tabela 2). Os dez principais DEGs (cinco mais significativamente aumentados e cinco mais significativamente reduzidos por mudança de dobra) foram selecionados para validação inicial qRT-PCR para confirmar a confiabilidade geral dos dados do microarray. Posteriormente, SUCNR1 e GPR37L1 foram selecionados para validação focada com base em três critérios: (1) foram identificados como genes hub na análise da rede PPI (grau ≥ 7); (2) eles estavam significativamente associados ao termo GO altamente enriquecido 'atividade de canal iônico' e à via KEGG 'secreção de insulina'; (3) ambos codificam GPCRs, que são alvos conhecidos de medicamentos na esquizofrenia.

Análise estatística
A normalidade foi avaliada com o teste de Shapiro–Wilk. Variáveis que apresentaram uma distribuição aproximadamente normal (P > 0,05) foram analisadas usando métodos paramétricos, incluindo o teste t de Student para comparações em dois grupos e ANOVA unidirecional para comparações envolvendo mais de dois grupos. Quando a suposição de normalidade não foi cumprida, foram usados testes Mann– Whitney U ou Kruskal–Wallis, conforme apropriado. Todos os testes estatísticos foram de duas caras. Para comparações múltiplas (por exemplo, em testes pós-hoc ANOVA), foi aplicado o método da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg (FDR), com um limiar FDR de 0,05. Para as análises de correlação, nenhuma correção por múltiplas comparações foi aplicada, pois apenas duas correlações foram realizadas; os valores P brutos são reportados com cautela.

Resultados

Identificação de DEGs e agrupamento hierárquico
A análise do conjunto de dados GSE54913 identificou 473 genes diferencialmente expressos (DEGs), incluindo 357 genes regulados para cima e 116 para baixo, entre pacientes com esquizofrenia e controles (Figura 2A,B). O agrupamento hierárquico desses DEGs distinguiu amostras de esquizofrenia dos controles (Figura 2C).

Análise de enriquecimento funcional de DEGs
A análise de enriquecimento GO identificou termos relacionados à atividade do canal, incluindo atividade passiva do transportador transmembranar, atividade do canal iônico, atividade do canal com portas e atividade do canal específico do substrato (P < bruto 0,05; Tabela 3). A análise da via KEGG identificou secreção de insulina, via de sinalização do cAMP, reparo da excisão de nucleotídeos, via de sinalização do TNF e metabolismo da glutationa como as vias mais enriquecidas (P < bruto 0,05; Figura 3C e Tabela 4).

Validação dos DEGs topos por qRT-PCR
Os cinco genes com melhor regulação negativa (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 e BRIP1) e os cinco genes com maior regulação para alta (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS e C12orf68) foram validados por qRT-PCR. Os genes validados e os valores correspondentes de microarray logFC estão listados na Tabela 5, a validação qRT-PCR é mostrada na Figura 4, e os valores brutos de Ct são fornecidos na Tabela Suplementar S1. As mudanças de dobra do qRT-PCR foram direcionalmente consistentes com dados de microarray para todos os dez genes (todos P < 0,05 pelo teste Mann-Whitney U). A correlação de Pearson entre microarray logFC e qRT-PCR logFC foi r = 0,89 (IC 95%: 0,66–0,97, P = 0,0004), indicando forte concordância. Diferenças de expressão entre SUCNR1 e GPR37L1 também foram confirmadas (Figuras 5A,B).

Análise de redes PPI
Uma rede PPI foi construída a partir de todos os DEGs (score de interação > 0,9; Figura 6A). As dez principais proteínas hub baseadas no grau de conectividade foram RTP5 (grau = 14), CXCL1 (grau = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (grau = 7) e ATM (grau = 5) (Figura 6B e Tabela 6). Uma sub-rede de genes centrais chave foi extraída usando um plugin de extração de subrede com parâmetros padrão. O algoritmo de extração de subrede identificou um cluster densamente conectado contendo RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 e SUCNR1, com uma pontuação de cluster de 6,2. O ATM não foi incluído na subrede porque tinha menor conectividade com o cluster central (Figura 6C).

Associação entre memória verbal e SUCNR1/GPR37L1
A expressão de SUCNR1 foi significativamente elevada, enquanto GPR37L1 expressão foi reduzida, em pacientes com esquizofrenia em comparação com controles saudáveis (Figuras 5A,B). A expressão do SUCNR1 mostrou correlação negativa com as pontuações de memória verbal (r = -0,54, IC 95%: -0,79 a -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Figura 5C), enquanto GPR37L1 expressão mostrou correlação positiva com os escores de memória verbal (r = 0,59, IC 95%: 0,20 a 0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Figura 5D). Análises de correlação foram realizadas em todos os 20 participantes, incluindo 10 pacientes com esquizofrenia e 10 controles saudáveis. Com um tamanho amostral de 20, o estudo tinha 80% de poder para detectar um coeficiente de correlação de |r| > 0,6 a α = 0,05. Dado o tamanho modesto da amostra, esses achados correlacionais são preliminares e exigem validação em coortes independentes maiores.

Declaração de Disponibilidade de Dados
O GSE54913 conjunto de dados analisado neste estudo está disponível publicamente pelo Gene Expression Omnibus. Os valores brutos de qRT-PCR Ct são fornecidos na Tabela Suplementar S1. Os scripts de análise, arquivos de saída DEG, resultados de enriquecimento, arquivos de rede PPI e arquivos fonte de figuras estão disponíveis em https://sandbox.zenodo.org/records/514960 ou 10.5072/zenodo.514960.

Figura 1: Diagrama de fluxo: coleta de dados, pré-processamento, análise e validação. Análises de microarranjos de mRNA em PBMCs obtidas de GSE54913. Análises funcionais e de enriquecimento de vias GO foram realizadas nos DEGs. Os 10 melhores genes classificados por variação de dobra foram selecionados para validação de dados de microarray usando qRT-PCR. A análise da rede de IBP identificou dois genes centrais. Por fim, foi realizada uma análise ex vivo dos dois genes centrais SUCNR1 e GPR37L1 . Abreviações: DEGs = genes expressos diferencialmente; mRNA = RNA mensageiro; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico; qRT-PCR = reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real; PPI = interação proteína-proteína. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Seleção de DEG e análise de agrupamento hierárquico. (A) Plot vulcão dos DEGs. O eixo horizontal representa log₂ (mudança de dobra), e o eixo vertical representa –log₁₀(valor P). Pontos verdes e vermelhos representam genes expressos diferencialmente, e pontos pretos representam genes não diferencialmente expressos. (B) Número de DEGs sob e alta regulação. (C) Mapa térmico de genes diferencialmente expressos. Vermelho indica regulação para cima e verde para baixo regulação. Abreviação: DEGs = genes expressos diferencialmente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análises de enriquecimento GO e KEGG de DEGs. (A,B) o enriquecimento GO e (C) o enriquecimento KEGG são mostrados com base nos valores brutos P. Abreviações: DEGs = genes expressos diferencialmente; GO = Ontologia Gênica; KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto; BP = processo biológico; CC = componente celular; MF = função molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Validação dos dados de microarrays para os dez genes mais desregulados usando qRT-PCR. (A) Reduziram os cinco principais DEGs. (B) Aumento dos cinco principais DEGs. Os dados são a média ± erro padrão da média. Os valores p são mostrados nos painéis correspondentes. Abreviações: DEGs = genes expressos diferencialmente; qRT-PCR = reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Expressão de SUCNR1 e GPR37L1 em pacientes com esquizofrenia e controles saudáveis. (A) SUCNR1 e (B) GPR37L1 expressão determinada por qRT-PCR. Correlação entre memória verbal e (C) SUCNR1 e (D) GPR37L1 expressão. Os dados são mostrados como média ± erro padrão da média, quando aplicável. Os valores p para correlações são mostrados nos painéis correspondentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Análise de redes de interação proteína-proteína. (A) Rede PPI analisada usando um banco de dados de interação proteína-proteína. (B) Proteínas classificadas pelo grau de associação na rede de IBP. (C) Subrede visualizada usando software de visualização de rede após análise de extração de subrede. Abreviação: PPI = interação proteína-proteína. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Variável	Sujeitos controle (n = 10)	Pacientes com esquizofrenia (n = 10)
Idade (ano)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Sexo feminino, n (%)	5 (50)	5 (50)
Horário de sono diário (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Índice de massa corporal (IMC; kg/m²)	25,2 ± 4,1	22,9 ± 2,3
Pontuação da memória verbal	61 ± 18	30,2 ± 10,8
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão ou número (%).

Tabela 1: Características de base de pacientes com esquizofrenia e sujeitos controle.

Símbolo genético	Sequência de estonador frontal (5'→3')	Sequência reversa de espoleta (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTGTGGGG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTTTTGGGCACC	CCTTGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAGTCAG
β-Actin	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: reação em cadeia quantitativa em tempo real da polimerase.

Tabela 2: Primers de PCR para qRT-PCR.

GO ID	Mandato	Valor p bruto	Conde
VAI:0015267	Atividade do canal	0.000000056	13
GO:0022803	Atividade passiva do transportador transmembranar	5.78E-08	13
VAI:0005216	Atividade no canal iônico	0.000000127	12
VAI:0022839	Atividade em canais ionizados	0.000000131	11
VAI:0022836	Atividade em canal fechado	0.000000136	11
VAI:0022838	Atividade do canal específico do substrato	0.00000017	12
VAI:0005261	Atividade do canal catiônico	0.00000668	9
VAI:0015276	Atividade em canal iônico ligado	0.000315	5
VAI:0022834	Atividade de canal com ligandos	0.000315	20
VAI:0022890	Atividade do transportador transmembranar de cátions inorgânicos	0.000487	20
VAI:0008324	Atividade do transportador transmembrana de cátions	0.0009	18
VAI:0099094	Atividade do canal catiônico ligado por ligantes	0.00128	16
VAI:0005244	Atividade de canal iônico dependente de tensão	0.001382	16
VAI:0022832	Atividade de canal dependente de tensão	0.001382	18
VAI:0046873	Atividade do transportador transmembrana de íons metálicos	0.001836	21
VAI:0022824	Atividade do canal de íons com transmissão	0.002762	19
GO:0022835	Atividade de canal com transmissão com limite	0.002762	13
Nota: Os valores P são brutos e não ajustados; significância foi definida como P < bruto 0,05.

Tabela 3: Análise da ontologia gênica de genes diferencialmente expressos (P < bruto 0,05).

ID	Descrição	Valor p bruto	Conde
HSA04911	Secreção de insulina	0.007066	6
HSA04024	Caminho de sinalização cAMP	0.010661	10
HSA03420	Reparo da excisão de nucleotídeos	0.013724	4
HSA04668	Via de sinalização TNF	0.023694	6
HSA00480	Metabolismo da glutationa	0.02466	4
HSA04740	Transdução olfativa	0.032104	15
HSA05222	Câncer de pulmão de pequenas células	0.03572	5
HSA00590	Metabolismo do ácido araquidônico	0.035991	4
HSA04080	Interação neuroativa ligante-receptor	0.037546	12
HSA05031	Vício em anfetaminas	0.045653	4
HSA05203	Carcinogênese viral	0.046404	8
HSA04933	Via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas	0.04831	5
Nota: Os valores P são brutos e não ajustados; significância foi definida como P < bruto 0,05.

Tabela 4: Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas análise de enriquecimento de genes (raw P < 0,05).

Símbolo genético	Nome completo oficial	logFC	Valor p bruto
Regulação reduzida
HCN3	Canal 3 cíclico ativado por hiperpolarização e ligado por nucleotídeos	-1.489	0.0001
OLFML2A	Proteína semelhante à olfactomedina 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH oxidase 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Membro receptor acoplado à proteína G relacionado a MAS X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Anemia de Fanconi grupo J	-1.699	0.0018
Regulação aumentada
CCL22	Quimoquina com motivo C-C 22	2.517	0.0041
PNMA2	Antígenos Ma paraneoplásicos	2.159	0.0062
TBX20	Fator de transcrição T-box TBX20	1.866	0.0001
ERAS	GTPase Eras	1.846	0.0008
C12orf68	Domínio de bobina enrolada contendo 184	1.839	0.0002
Nota: logFC e valores P brutos são da análise diferencial de expressão de microarrays.

Tabela 5: Os dez principais DEGs classificados por variação de dobra em genes regulados para cima e para baixo.

Símbolo genético	Descrição	Co-genes (n)	Valor p
RTP5	Proteína transportadora receptora 5	14	0.000276
CXCL1	Alfa proteína 1 regulada pelo crescimento	8	0.011423
CXCL10	Quimocina com motivo C-X-C 10	7	0.046144
GPR37L1	Receptor de prosaposina GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Receptor de ácido hidroxicarboxílico 1	7	0.046572
OPRL1	Receptor de nociceptina 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Receptor de somatostatina tipo 4	7	0.006742
SUCNR1	Receptor succinato 1	7	0.000105
ATM	Quinase da proteína serina ATM	5	0.004961
PPI: interação proteína-proteína; DEGs: genes diferencialmente expressos.

Tabela 6: Os 10 principais genes hub identificados na rede de PPI para DEGs.

Tabela Suplementar 1: Valores brutos de qRT-PCR Ct, Fluxo de Trabalho Completo de Análise Bioinformática e Resultados Processados (DEG, GO/KEGG e PPI) do Estudo Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

A esquizofrenia é um distúrbio grave e multifatorial que envolve diversos fatores de suscetibilidade genética^13,14. Embora haja progresso na compreensão de sua fisiopatologia, ainda faltam biomarcadores diagnósticos confiáveis. Neste estudo, uma abordagem integrada de bioinformática identificou 473 DEGs em amostras de sangue de pacientes com esquizofrenia. Análises GO e KEGG destacaram o enriquecimento em termos e vias relacionadas à atividade dos canais, incluindo secreção de insulina, sinalização de cAMP, reparo de excisão de nucleotídeos, sinalização de TNF e metabolismo da glutationa. A análise de redes de IBP identificou ainda SUCNR1 e GPR37L1 como genes hub, e sua expressão esteve associada ao desempenho da memória verbal, sugerindo sua possível relevância como marcadores moleculares associados à esquizofrenia.

O enriquecimento dos termos GO de "atividade de canais" está alinhado com pesquisas anteriores sobre esquizofrenia. Canais de cálcio dependentes de voltagem (por exemplo, CACNA1C, CACNB2) e canais de potássio (por exemplo, Kv3, Kv2.1) foram implicados na suscetibilidade à esquizofrenia e excitabilidade neuronal 15,16. Da mesma forma, as principais vias KEGG identificadas são consistentes com a literatura existente. Hiperinsulinemia e anormalidades na secreção de insulina são relatadas no início da^{esquizofrenia 17}. A via de sinalização do cAMP está cada vez mais ligada à fisiopatologia^{da doença 18}. Mecanismos de reparo por excisão de nucleotídeos, incluindo modificação de H2AX na variante de histonas, também podem desempenhar um papel 19,20,21,22^. Além disso, a sinalização do TNF e o metabolismo do glutationa têm sido associados à patogênese da^{esquizofrenia 23,24}.

O comprometimento da memória verbal é um déficit cognitivo central na esquizofrenia, está presente no início da doença e está associado a resultados funcionais. O Teste de Aprendizagem Verbal Hopkins–Revisado (HVLT-R) é uma medida bem validada de aprendizagem verbal e memória. Avaliar a correlação entre a expressão dos marcadores candidatos e o desempenho da memória verbal ajuda a estabelecer relevância clínica, já que o comprometimento cognitivo é um dos principais determinantes da deficiência na esquizofrenia.

Embora os dez principais DEGs validados pelo qRT-PCR tenham correspondido aos dados de microarrays, eles não se alinharam de perto com os principais achados do GO/KEGG. Em contraste, SUCNR1 (regulado para cima) e GPR37L1 (para baixo) estiveram significativamente associados à "atividade dos canais iônicos" e enriquecidos em "secreção de insulina". Ambos os genes codificam receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que são alvos críticos dos antipsicóticos e modulam a atividade dos canais^{iônicos 25}.

SUCNR1 (GPR91) liga o estresse metabólico à secreção e resistência à insulina^26,27, e a resistência à insulina é um fator de risco conhecido para^{esquizofrenia 28}. GPR37L1, um receptor órfão altamente expresso no cérebro, está envolvido no desenvolvimento cerebelar e na função^{motora 29}, e tem sido implicado na doença de Parkinson³⁰ e no transporte renal^{de sódio 31}. Seu papel na esquizofrenia pode envolver a modulação da atividade dos canais iônicos.

O comprometimento da memória verbal é uma característica central da esquizofrenia, refletindo a responsabilidade genética e a gravidade da^{doença 32,33}. A correlação inversa entre a expressão de SUCNR1 e a correlação positiva da expressão GPR37L1 com as pontuações de memória verbal reforçam ainda mais sua possível relevância na esquizofrenia.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, o tamanho da amostra para a coorte de validação (n = 10 por grupo) era pequeno, o que limita o poder estatístico e a generalizabilidade. Segundo, todos os pacientes com esquizofrenia estavam recebendo medicamentos antipsicóticos, então as mudanças observadas na expressão podem refletir efeitos da medicação, e não patologia da doença. Estudos futuros devem incluir pacientes que não usam drogas no primeiro episódio. Terceiro, a coorte de validação não apresentou confirmação RNA-seq; O sequenciamento em todo o transcriptoma em coortes independentes maiores é justificado. Quarto, o desenho transversal impede a avaliação das relações causais entre os níveis de biomarcadores e a progressão da doença. Quinto, as análises de correlação com a memória verbal foram exploratórias e requerem replicação. Sexto, o conjunto de dados GSE54913 foi gerado em uma plataforma de microarray que tem sensibilidade menor que o RNA-seq. As direções futuras incluem estudos longitudinais para acompanhar os níveis de SUCNR1 e GPR37L1 ao longo da doença e do tratamento, estudos funcionais para elucidar os papéis mecanicistas desses GPCRs na fisiopatologia da esquizofrenia e o desenvolvimento de um ensaio clinicamente validado para esses biomarcadores.

Em resumo, esta análise integrada sugere que a alteração da expressão de SUCNR1 e GPR37L1 está associada à esquizofrenia e ao desempenho da memória verbal. Esses genes podem representar marcadores moleculares associados à esquizofrenia candidatos. No entanto, as limitações incluem um tamanho de amostra relativamente pequeno e a avaliação parcial da gravidade da esquizofrenia por meio da memória verbal. Estudos adicionais são necessários para validar esses achados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction