Um Procedimento Padronizado In Vitro para Avaliar Mudanças de Microdureza de Superfície em Compósitos de Resina Nanohíbrida Após Exposição a Bebidas de Proteína de Soro

Resumo

Esse protocolo descreve um método padronizado in vitro para avaliar os efeitos das bebidas de proteína whey na microdureza de compósitos de resina. A abordagem permite a avaliação controlada da exposição dietética usando imersão cíclica e testes Vickers, fornecendo um modelo reprodutível para investigar a interação entre bebidas nutricionais e biomateriais restauradores.

Resumo

O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o efeito de diferentes bebidas de proteína de soro de leite na microdureza superficial de três compósitos de resina nanohíbrida. Um total de 90 espércimes em formato de disco foram preparados a partir de três compósitos nanohíbridos de resina (n = 30 por material) e subdivididos em três grupos (n = 10) de acordo com o meio de imersão: concentrado de soro, isolado de soro de leite e água destilada. Os exemplares foram imersos por 10 minutos, duas vezes ao dia, durante 30 dias. A microdureza superficial foi medida na linha de base e após a imersão usando um testador de microdureza Vickers, e a variação de dureza foi calculada como ΔVHN. Os dados foram analisados usando medidas repetidas bidirecionais, ANOVA e testes pós-hoc. A análise revelou que o tipo composto, a solução de imersão e sua interação tiveram efeitos estatisticamente significativos nos valores de ΔVHN (p < 0,0001). A maior perda de dureza foi observada no composto injetável exposto ao concentrado de soro de leite (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), enquanto a menor variação foi registrada no composto altamente preenchido armazenado em água destilada (ΔVHN: 0,9 ± 0,4). A imersão em concentrado de soro resultou em perda significativamente maior de dureza em todos os compósitos em comparação com água destilada (p < 0,05). O isolado de soro também produziu perda de dureza significativamente maior em todos os compósitos, exceto no composto altamente preenchido, no qual nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada (p = 0,076). Esses achados indicam que bebidas de proteína whey podem reduzir a microdureza superficial dos compósitos de resina, com o grau de degradação dependendo tanto da composição do material quanto da formulação da bebida.

Introdução

O sucesso a longo prazo das restaurações com compósitos de resina depende de sua resistência a desafios ambientais orais complexos, incluindo carga mecânica, exposição dietética e degradação química ^1,2. Compósitos de resina nanohíbrida são amplamente utilizados devido às suas propriedades estéticas e mecânicas favoráveis, especialmente a microdureza superficial, que serve como um indicador importante de resistência ao desgaste e deterioração^{estrutural 3,4}.

Investigações anteriores demonstraram que a exposição a bebidas ácidas, como sucos de frutas, bebidas carbonatadas e bebidas energéticas, pode afetar negativamente a restauração de compósitos ao reduzir a microdureza superficial e alterar a integridade^{da superfície} 5,6,7,8. Esses efeitos degradativos são influenciados por múltiplos fatores, incluindo pH, tempo de exposição e composição da matriz de preenchimento. No entanto, a maioria dos modelos experimentais existentes depende de soluções altamente ácidas, que podem não refletir com precisão os desafios químicos encontrados nos hábitos alimentares contemporâneos.

Em contraste, as bebidas de proteína de soro de leite ganharam ampla popularidade devido ao seu valor nutricional e ao aumento do consumo entre pessoas voltadas para o fitness ^9,10. Apesar do pH quase neutro, essas bebidas contêm lactose, proteínas e outros componentes orgânicos que podem interagir com a matriz de resina e influenciar a estabilidade do material. Portanto, avaliar seus efeitos exige um protocolo que considere não apenas a acidez, mas também a composição orgânica e os padrões de exposição repetidos.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método padronizado e reprodutível in vitro para avaliar os efeitos das bebidas de proteína whey, especificamente formulações concentradas e isoladas, na microdureza superficial de compósitos nanohíbridos de resina. Esse método permite simulação controlada da exposição diária à dieta por meio de imersão cíclica, melhorando assim a relevância experimental das condições de teste in vitro .

Comparado aos modelos convencionais de exposição a bebidas ácidas, esse protocolo oferece várias vantagens. Primeiro, permite a investigação da degradação do material sob condições de pH quase neutro, possibilitando a avaliação das respostas do material além dos efeitos impulsionados pelo ácido. Segundo, o design de imersão cíclica reflete melhor os padrões de consumo da vida real. Terceiro, o método facilita a avaliação comparativa de diferentes formulações compostas com base em características estruturais, como conteúdo de enchimento e composição da matriz de resina.

Esse protocolo é particularmente adequado para pesquisadores que buscam avaliar a estabilidade química de materiais restauradores sob condições nutricionalmente relevantes, bem como para estudos que investigam a interação entre componentes dietéticos e biomateriais dentários. Também pode ser adaptado para testar formulações alternativas de bebidas, tratamentos de superfície ou materiais compósitos recém-desenvolvidos.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra

1. Prepare um total de 90 amostras em formato de disco a partir de três compósitos nanohíbridos de resina (n = 30 por material).
2. Fabrice amostras usando moldes cilíndricos de silicone transparente (6 mm de diâmetro × 2 mm de espessura) para garantir dimensões padronizadas.
3. Coloque o material compósito nos moldes em um único incremento (2 mm de espessura) e cubra a superfície com uma lâmina de microscópio transparente para obter uma superfície plana.
4. Polimerize a amostra usando uma unidade de cura de luz LED azul (espectro de emissão ≈440–480 nm) posicionada a aproximadamente 1 mm da superfície com uma intensidade de saída de 1000 mW/^cm2 por 20 s.
5. Verifique a intensidade da luz de cura usando um radiômetro antes de cada ciclo de polimerização para garantir uma exposição constante à luz.
6. Armazene as amostras preparadas em água destilada a 37 °C por 24 horas para permitir a pós-polimerização e simular as condições orais iniciais.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas em água destilada a 37 °C por até 24 horas antes do processamento adicional.

2. Procedimento de acabamento e polimento

1. Finalize e polia as superfícies superiores de todas as amostras usando discos de polimento impregnados de óxido de alumínio. Todos os procedimentos de polimento devem ser realizados por um único operador para garantir a padronização da superfície.
2. Aplique polimento sequencialmente usando discos médio, fino e superfino por 10 segundos cada sob resfriamento a água a aproximadamente 10.000 rpm com leve pressão e movimento rotacional unidirecional.
3. Substitua os discos de polimento a cada cinco amostras para manter a eficiência abrasiva consistente e garantir a padronização da superfície.
4. Após cada etapa de polimento, enxágue as amostras com água destilada por 10 s para remover os resíduos e sece suavemente ao ar por 5 s antes de passar para o próximo disco.
5. Marque a superfície não polida de cada amostra com um código de identificação único para garantir uma orientação consistente durante testes subsequentes.
6. Armazene amostras em água destilada a 37 °C por 24 horas antes do teste inicial de microdureza.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas em água destilada a 37 °C por até 24 horas antes do teste inicial.

3. Medição básica de microdureza

1. Realize o teste de microdureza Vickers (VHN) de base seguindo protocolos previamente publicados usando um testador de microdureza^{Vickers 11}.
2. Aplique uma carga de 200 g por 15 s de tempo de permanência.
3. Faça três reentrâncias por espécime com espaçamento de pelo menos 1 mm. Realize reentrâncias na área central de cada amostra para evitar efeitos de borda.
4. Calcule a média de VHN de base.
5. Realize medições por um único operador calibrado para minimizar a variabilidade.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas em água destilada a 37 °C por até 24 horas antes da imersão.

4. Preparação de mídias de imersão

1. Prepare duas formulações de proteína de soro: concentrado de proteína de soro de leite (WC) e isolado de proteína de soro de leite (WI) usando pós disponíveis comercialmente.
2. Dissolve 25 g de pó de proteína de soro em 200 mL de água destilada (0,125 g/mL) para preparar as soluções de imersão.
3. Misture as soluções usando um shaker de laboratório por 60 segundos até que a dissolução completa seja alcançada.
4. Deixe as soluções se equilibrarem em temperatura ambiente por 5 minutos para minimizar a formação de espuma e garantir homogeneidade.
5. Meça e registre o pH de cada solução usando um medidor digital calibrado antes da imersão.
6. Prepare soluções frescas de soro de leite antes de cada ciclo de imersão para garantir uma composição química consistente e evitar a degradação da proteína.
7. Use 10 mL de solução de imersão por amostra para garantir a submersão completa em cada ciclo.

5. Procedimento de imersão

1. Divida cada grupo composto em três subgrupos (n = 10).
2. Imerga as amostras nas soluções designadas por 10 minutos, duas vezes ao dia. Selecione a duração e a frequência da imersão com base em modelos de exposição a bebidas in vitro previamente estabelecidos, projetados para simular padrões repetidos de consumo^{diário 7}.
3. Após cada ciclo de imersão, enxágue as amostras com água destilada e coloque-as em saliva artificial por 10 minutos para simular a exposição salivar de curto prazo.
4. Armazene as amostras em água destilada entre os ciclos de imersão a 37 °C até o próximo ciclo de exposição.
5. Aplique esse procedimento apenas nos grupos expostos ao soro de lente. Mantenha o grupo controle continuamente em água destilada (DW) a 37 °C durante todo o período experimental.
   NOTA: O protocolo de imersão pode ser pausado entre os ciclos e retomado no dia seguinte sem afetar a consistência experimental.
6. Continue o protocolo de imersão por 30 dias.

6. Medição de microdureza pós-imersão

1. Enxágue as amostras com água destilada e seque suavemente.
2. Realize o teste de microdureza Vickers usando os mesmos parâmetros (200 g, 15 s).
3. Registre três reentrâncias e calcule a média de VHN pós-imersão.
4. Determine ΔVHN para cada espécime.

7. Análise estatística

1. Analise os valores de microdureza de Vickers usando um modelo ANOVA de medidas repetidas, com o ponto de tempo (linha de base e pós-imersão) como fator dentro do sujeito e tipo composto e solução de imersão como fatores entre sujeitos.
2. Quando apropriado, calcule valores de ΔVHN como medidas descritivas para expressar a magnitude da variação de microdureza para cada amostra.
3. Realize comparações post-hoc por pares usando o teste de diferença honestamente significativa (HSD) de Tukey.
4. Calcule intervalos de confiança de 95% para todas as médias de grupo.
5. Relate tamanhos de efeito usando o eta-quadrado parcial (η²p) para os resultados da ANOVA.
6. Compare os valores de pH entre soluções de proteína de soro de leite usando o teste t de Welch.
7. Defina o nível de significância estatística em p < 0,05.
8. Além dos valores absolutos de ΔVHN, calcule a porcentagem de variação da microdureza usando a seguinte fórmula: [(VHN de base − VHN pós-imersão) / VHN de base] × 100.

Resultados

Estatísticas descritivas

Os valores médios de ΔVHN (±SD) das combinações composta-solução são apresentados na Tabela 1.

Resina composta	Solução	ΔVHN (Média ± SD)	IC 95%	n
EA<...

Discussão

O protocolo atual oferece uma abordagem padronizada para avaliar o impacto químico das bebidas de proteína de soro de leite na microdureza dos compósitos de resina. Etapas críticas incluem fabricação uniforme de amostras, condições controladas de cura da luz e parâmetros padronizados de teste Vickers. Manter dimensões consistentes da amostra e intensidade de cura é essencial, pois variações podem influenciar o grau de conversão e a estabilidade mecânica. Além disso, o controle rigoroso d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Disco de polimento de óxido de alumínio	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turkey	5714	Médio, fino, superfino, usado para acabamento e polimento
Balança analítica			Usado para pesar materiais
Solução de saliva artificial	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turkey		Usado para armazenamento entre ciclos de imersão
pHmetro digital	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	Medição do pH da bebida
Água destilada	Não especificado	Não aplicável	Usado como solução de controle e para armazenamento de espécimes
Lâmina de microscópio de vidro	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China	7102	Usado para obter uma superfície plana do espécime durante a colocação do compósito
Cilidro graduado	Não especificado	Não aplicável	Usado para medir volumes líquidos
Compósito de resina nano híbrido altamente preenchido (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokyo, Japan)	10942	Usado como material restaurador; difere no conteúdo do filler e na composição da matriz da resina
Incubadora	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany	UN55	Usado para armazenamento a 37 °C
Compósito de resina nano híbrido injetável (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Tokyo, Japan)	12365	Usado como material restaurador; difere no conteúdo do filler e na composição da matriz da resina
Bêquer de laboratório	Não especificado	Não aplicável	Usado para preparação de soluções de proteína de soro de leite
Agitador de laboratório	Não especificado	Não aplicável	Usado para mistura e homogeneização de soluções
Unidade de fotopolimerização LED e radiometro	Unidade de cura LED Woodpecker (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China)	FD-300	Polimerização e  verificação da intensidade da luz
Mão-de-obra de micromotor	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan	C1056002	Usado no procedimento de polimento
Compósito de resina nano híbrido moderadamente preenchido (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)	6570A2	Usado como material restaurador; difere no conteúdo do filler e na composição da matriz da resina
Molde de silicone	Não especificado	Não aplicável	Em forma de disco, 6 mm de diâmetro × 2 mm de espessura, usado para fabricação de espécimes
Testador de microdureza Vickers	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan	HMV-G31	Teste de número de dureza Vickers (VHN)
Pó concentrado de proteína de soro de leite	Pó de proteína de soro de leite sabor morango, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		Conteúdo de lactose: ~1–2%, conteúdo de proteína: ~85–90%
Pó isolado de proteína de soro de leite	Isolato de proteína de soro de leite sabor chocolate, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		Conteúdo de lactose: ~4–6%, conteúdo de proteína: ~70–80%