Do Tecido à Morfometria: Um Fluxo de Trabalho Passo a Passo da Golgi–Cox para Análise Neuronal e Dendrítica da Coluna em Camundongos Adultos

Resumo

Este artigo descreve um método passo a passo para a coloração de Golgi–Cox em camundongos adultos, abrangendo preparação de solução, impregnação de tecidos, crioproteção, seccionamento, revelação e montagem. Ele enfatiza a preservação dos tecidos e a coloração homogênea e de baixo fundo, permitindo uma visualização clara da morfologia neuronal. O método rotulou os eixos dendríticos e suporta análise morfométrica quantitativa de espinhos dendríticos.

Resumo

A análise da morfologia neuronal na saúde e na doença é fundamental para entender a função cerebral e para avaliar os efeitos das intervenções experimentais. A coloração de Golgi–Cox permanece uma técnica clássica, porém altamente relevante, para visualizar árvores neuronais completas e espinhos dendríticos. No entanto, protocolos publicados frequentemente diferem em etapas processuais críticas e frequentemente carecem de detalhes metodológicos essenciais, levando a uma variabilidade substancial na qualidade da coloração e tornando a padronização laboratorial demorada e desafiadora. Aqui, é apresentado um protocolo abrangente e passo a passo do Golgi–Cox para camundongos adultos, abrangendo todo o fluxo de trabalho, desde o manuseio in vivo e processamento de tecidos até a extração de dados de imagem e morfometria. Ele detalha considerações práticas e armadilhas comuns que influenciam a eficiência da impregnação, a integridade da seção e a relação sinal-ruído, além de fornecer orientações metodológicas para melhorar a reprodutibilidade. No geral, esse protocolo permite visualização confiável e análise quantitativa de neurônios inteiros, segmentos dendríticos e espinhos dendríticos. Espera-se que esse recurso facilite a implementação da coloração de Golgi–Cox com maior consistência, transparência e rigor técnico, ao mesmo tempo em que oferece uma estrutura clara para adaptar o método a diversos ambientes laboratoriais.

Introdução

O objetivo geral do método de coloração de Golgi–Cox é permitir a visualização em alta resolução da morfologia neuronal completa, incluindo árvores dendríticas e espinhos dendríticos, em tecido cerebral^fixo 1,2,3,4. Essa técnica permite uma análise estrutural detalhada de neurônios individuais dentro de circuitos neurais complexos, tornando-a particularmente valiosa para estudos de plasticidade sináptica, neurodesenvolvimento, neurodegeneração e remodelação estrutural dependente da^{experiência 5,6}.

A razão para o desenvolvimento e uso contínuo dos métodos baseados em Golgi reside em sua capacidade única de produzir uma impregnação neuronal esparsa^{e completa 1,2}. Originalmente descrito por Camillo Golgi em 1873 e refinado em 1891 por^{Cox 7,8}, o método depende da precipitação de cromato de prata dentro de um subconjunto limitado de neurônios, permitindo a reconstrução morfológica completa sem a sobreposição^{de marcação 3}. A modificação Golgi–Cox substitui o nitrato de prata usado no método original de Golgi por cloreto de mercúrio, melhorando a penetração dos tecidos e a consistência da^{coloração 2}. Comparado a técnicas alternativas de marcação neuronal, como expressão de proteínas fluorescentes, rastreamento viral ou abordagens de preenchimento de corantes, a coloração de Golgi–Cox oferece várias vantagens. Não requer manipulação genética, injeções estereotáxicas ou equipamentos especializados de microscopia, e permite a visualização de espinhos dendríticos com alto contraste sob microscopia de campo^{claro 1,2}. Embora métodos modernos baseados em fluorescência forneçam especificidade para tipo celular, a coloração de Golgi–Cox continua particularmente vantajosa para amostragem morfológica imparcial ^9,10 e para uso em espécies ou condições experimentais onde não há ferramentas transgênicas disponíveis.

Na literatura mais ampla, métodos baseados em Golgi têm sido amplamente empregados para quantificar a densidade e morfologia da coluna dendrítica em estudos sobre aprendizagem e^{memória 5}, estresse e transtornos psiquiátricos¹¹, idade¹² anos e doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer 12,13,14. Seu uso contínuo ao longo de décadas destaca sua confiabilidade para neuroanatomia^{estrutural 2}. Esse método é particularmente adequado para pesquisadores que analisam a arquitetura dendrítica e a morfologia da coluna vertebral em tecido cerebral quando é necessária visualização da célula^{inteira: 1}. É bem adequado para estudos morfológicos comparativos entre grupos experimentais. No entanto, pesquisadores que exigem especificidade de tipo celular, imagem em vivo ou colocalização molecular podem se beneficiar mais de abordagens de marcação fluorescente ou codificada^{geneticamente 9,10}.

Protocolo

Fêmeas adultas de camundongos selvagens B6129SF2/J (n = 3) foram usadas neste estudo. No entanto, coloração semelhante pode ser realizada usando ambos os sexos no estágio adulto. Todos os procedimentos experimentais receberam aprovação anterior do Comitê de Bioética. (#117.A, Instituto de Neurobiologia (INb), Universidade Nacional Autônoma do México)

1. Preparação de soluções

ATENÇÃO: O cloreto de mercúrio é altamente tóxico e corrosivo. Use o cabo dentro de uma cabeceira química enquanto usa luvas, jaleco e proteção ocular. Descarte os resíduos em um recipiente de resíduos perigosos rotulado. Dicromato de potássio e cromato de potássio são oxidantes tóxicos e cancerígenos. Use a manuseia dentro de uma exaustão química e evite contato com a pele ou inalação.

1. Prepare soluções de impregnação de estoque
   1. Pesa 15 g de dicromato de potássio. Dissolva-a em 300 mL de água duplamente destilada para obter uma solução de 5% (p/v).
   2. Pesar 15 g de cloreto de mercúrio. Dissolva-a em 300 mL de água duplamente destilada para obter uma solução de 5% (p/v).
   3. Pesa 15 g de cromato de potássio. Dissolva-a em 300 mL de água duplamente destilada para obter uma solução de 5% (p/v).
   4. Embrulhe todos os recipientes em papel alumínio e guarde em temperatura ambiente, protegido da luz.
2. Preparar a solução de trabalho Golgi–Cox
   1. Misture 50 mL de solução de dicromato de potássio, 50 mL de solução de cloreto de mercúrio e 40 mL de solução de cromato de potássio.
   2. Adicione 100 mL de água destilada e misture bem.
   3. Incube a mistura por 48 horas em temperatura ambiente, protegida da luz.
   4. Deixe o precipitado se depositar. Use apenas o sobrenadante para a impregnação de tecido.
      NOTA: A solução de Golgi–Cox pode ser armazenada por até 1 mês quando mantida protegida da luz. Para reduzir o desperdício de reagentes e garantir a frescura da solução, prepare apenas o volume necessário tanto das soluções padrão quanto da solução final de Golgi–Cox necessária para o experimento. Prepare pelo menos 23 mL por cérebro para obter 20 mL de sobrenadante utilizável após a perda de precipitado.
3. Prepare solução crioprotetora
   1. Dissolva 300 g de sacarose em soro tampão fosfatado (PBS) de 0,1 M, pH 7,4, preparado com dibásico fosfato de sódio anidro, mono-hidratado monobásico fosfato de sódio e cloreto de sódio.
   2. Ajuste o volume final para 1 L.
   3. Armazene a 4 °C por até uma semana.

2. Coleta e impregnação de tecidos

1. Realizar perfusão intracardíaca
   1. Anestesie o animal com pentobarbital de sódio (252 mg/kg, i.p.). Confirme a profundidade adequada da anestesia pela ausência de retirada do pedal antes de prosseguir.
   2. Realize perfusão intracardíaca com aproximadamente 30 mL de 0,1 M PBS (pH 7,4) até que o efluente fique limpo, garantindo a remoção completa do sangue do tecido cerebral. Nenhum fixador foi usado; a própria solução de Golgi–Cox serve como fixador nesse fluxo de trabalho.
   3. Extraia o cérebro cuidadosamente e enxágue-o em água destilada. Certifique-se de que o cérebro esteja devidamente perfundido e livre de resíduos de sangue (Figura 1A).
2. Tecido impregnado
   1. Divida o cérebro em hemisférios ou blocos coronais (~3 mm de espessura) usando uma matriz cerebral para melhorar a impregnação. Blocos de tecido menores facilitam uma impregnação mais uniforme e reduzem a variabilidade, enquanto amostras maiores podem exigir tempos de incubação mais longos e apresentar menos coloração homogênea.
   2. Coloque o cérebro em uma solução de Golgi–Cox de 10 mL. Proteja da luz.
      NOTA: Um volume de 10 mL de solução de Golgi–Cox é suficiente para um cérebro adulto inteiro de camundongo. Ao usar um único hemisfério ou blocos coronais menores (~3 mm de espessura), o volume da solução pode ser reduzido proporcionalmente, desde que o tecido permaneça totalmente imerso. Se todo o cérebro for utilizado, recomenda-se seccioná-lo preservando a região de interesse para garantir a penetração ideal do reagente e impregnação homogênea.
   3. Incube por 24 horas em temperatura ambiente.
   4. Substitua por 10 mL de solução fresca de Golgi–Cox. Incube por 10-14 dias a 22–25 °C no escuro.
      PONTO DE PAUSA: Armazene tecido em solução de Golgi–Cox até 15 dias sem grande perda de viabilidade.
      NOTA: Após a impregnação de Golgi–Cox, o cérebro desenvolve uma aparência dourada escura e se torna altamente frágil; portanto, manusee-a com cuidado (Figura 1B). Recomenda-se o uso de pinças plásticas para manipulação para evitar reações químicas com materiais de aço.

3. Crioproteção

1. Transfira o tecido para uma solução crioprotetora de 10 mL (30% de sacarose (p/v) em 0,1 M PBS, pH 7,4, preparada no passo 1.3).
2. Incubar por 24 horas (4 °C).
3. Na mesma temperatura (4 °C), substitua por uma solução crioprotetora fresca e incube por pelo menos 4 a 7 dias.
   PONTO DE PAUSA: Antes da secção, armazene tecido em solução crioprotetora até 3 semanas a 4 °C.

4. Embedding e seccionamento

1. Tecido embutido
   1. Prepare 8% (p/v) de agarose em água destilada quente. Deixe esfriar até aproximadamente 40 °C.
   2. Coloque o papel em moldes de embutição e oriente adequadamente.
   3. Despeje agarose sobre o tecido e deixe-o solidificar por 1 hora em temperatura ambiente ou 30 minutos a 4 °C (Figura 1C).
   4. Corte o excesso de agarose do bloco (Figura 1D).
2. Tecido seccional
   1. Fixe o bloco de agarose no palco do vibratome usando adesivo. (Figura 1E)
   2. Encha a câmara de corte com solução crioprotetora.
   3. Tecido seccional com espessura de 100–200 μm. Seções mais finas (por exemplo, 100–120 μm) são recomendadas para análise da coluna dendrítica para melhorar a resolução de imagem, enquanto seções mais grossas (por exemplo, 150–200 μm) podem ser usadas para reconstrução de neurônios inteiros. Neste estudo, as seções foram cortadas a 120 μm (Figura 1F).
   4. Colete seções usando um pincel macio.
      NOTA: Registre as configurações do vibratome na Tabela de Materiais. Não enxágue os slides sob nenhuma circunstância depois que as seções estiverem montadas. A sacarose protege o tecido até a etapa de desenvolvimento.

5. Montagem

1. Preparação de lâminas revestidas com gelatina
   1. Prepare uma solução de revestimento dissolvendo 0,5 g de gelatina em 100 mL (0,5% w/v) de água destilada aquecida até ferver.
   2. Mexa até que a gelatina esteja completamente dissolvida e deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente.
   3. Adicione 0,05 g de sulfato de cromo potássio (0,05% p/v) e misture até dissolver completamente. Remova a espuma residual se necessário.
   4. Filtre a solução de gelatina através de papel filtro para remover partículas não dissolvidas e espuma residual, garantindo um revestimento uniforme das lâminas.
   5. Lave os lâminas de vidro com detergente neutro e água, enxágue bem e depois enxágue com água destilada.
   6. Imerga as lâminas em etanol 96% até que não restem gotículas visíveis.
   7. Desliza seco no forno a 50–60 °C por 30 minutos ou até ficar completamente seco.
   8. Mergulha na solução de gelatina e deixa o excesso de solução escorrer.
   9. Coloque as lâminas no forno a 50–60 °C por 30 minutos ou até ficarem completamente secas.
   10. Repita o processo de revestimento e secagem pelo menos cinco vezes para garantir a adesão adequada.
   11. Após a etapa final de secagem, deixe as lâminas esfriarem até a temperatura ambiente em um ambiente sem poeira (por exemplo, dentro de uma exaustão química) e armazene-as em um recipiente limpo e fechado até o uso.
       NOTA: Prepare apenas o volume de solução de gelatina necessário para o número de lâminas a serem revestidas. Quantidades de reagentes podem ser escaladas proporcionalmente mantendo as concentrações especificadas (w/v).
2. Coloque as seções sobre lâminas de microscópio revestidas com gelatina usando um pincel macio
   NOTA: Use lâminas de microscópio revestidas com pelo menos cinco camadas de gelatina 0,5%. Prepare as lâminas com cura para garantir a integridade do tecido durante o desenvolvimento. Slides eletrocarregados não foram testados neste protocolo.
3. Deixe o papel absorvente de molho com solução crioprotetora e coloque sobre as seções.
4. Pressione suavemente com a palma da mão para eliminar bolhas de ar e garantir um contato uniforme entre a seção do tecido e a lâmina revestida com gelatina, promovendo aderência estável durante o processamento subsequente.
   NOTA: A pressão suave melhora a adesão ao maximizar o contato entre a seção e a camada de gelatina, reduzindo o risco de descolamento durante o desenvolvimento aquoso.
5. Remova o papel cuidadosamente e deixe as lâminas secarem no escuro por 2 a 3 dias em temperatura ambiente.
   NOTA: Secar em um ambiente de baixa umidade é fundamental para uma aderência estável. A proteção contra a luz minimiza alterações fotoquímicas do tecido impregnado de Golgi–Cox, que é sensível à luz devido à presença de sais de cromato. Além disso, a agarose residual não interfere significativamente no processo de desenvolvimento e pode ser observada ao redor do tecido na seção revelada (Figura 2A). A presença de agarose facilita o manuseio mais seguro do tecido durante a montagem, pois o tecido impregnado com Golgi–Cox é altamente frágil. Se desejado, o excesso de agarose pode ser cuidadosamente removido manualmente após as seções serem montadas nos slides.
   PONTO DE PAUSA: Mantenha os slides protegidos da luz.

6. Desenvolvimento

ATENÇÃO: O xileno é inflamável e tóxico por inalação. Manuse-a em uma exaustão química e evite chamas abertas. A amônia é corrosiva e produz vapores irritantes. Cabo em uma exaustão.

1. Seções de Reidratação
   1. Mergulhe os slides em água destilada por 5 minutos.
   2. Transfira para água destilada fresca por 5 minutos.
   3. Imerga em etanol 50% por 5 minutos.
      NOTA: A etapa de 50% de etanol proporciona uma transição gradual das condições aquáticas para a desidratação, facilitando a penetração do reagente e ajudando a preservar a integridade dos tecidos antes da etapa de desenvolvimento.
2. Desenvolver a coloração
   1. Incube lâminas em solução aquosa de amônia preparada misturando 2 volumes de 25% de amônia com 1 volume de água destilada (2:1, v/v) por 8 minutos
   2. Lave em água destilada por 5 minutos.
   3. Lave novamente em água destilada por 5 minutos.
   4. Incube em tiosulfato de sódio a 5% (p/v) em água destilada por 10 minutos no escuro.
   5. Lave em água destilada por 1 minuto.
   6. Lave novamente em água destilada por 1 minuto.
      NOTA: Conclua o processo de desenvolvimento sem interrupções após o início.
3. Desidratar e Limpar
   1. Imerga os slides em etanol a 70% por 5 minutos.
   2. Imerga os slides em etanol 96% por 5 minutos.
   3. Imerga os slides em etanol 100% por 5 minutos.
   4. Transfira as lâminas para xileno por pelo menos 6 minutos.

7. Montagem permanente

1. Aplique um meio de montagem Permount® (índice de refração ~1,52) em cada seção.
   NOTA: O índice de refração do meio de montagem deve ser compatível com objetivos de imersão em óleo para garantir uma qualidade de imagem ideal.
2. Coloque cuidadosamente uma manta de proteção para evitar bolhas de ar.
3. Vede as bordas com esmalte transparente.
4. Deixe os slides secarem no escuro por 48 horas em temperatura ambiente.

8. Imagem

NOTA: As modalidades de imagem e configurações de aquisição variam conforme a marca do microscópio; As configurações ótimas devem ser determinadas para cada sistema.

1. Ligue o microscópio.
2. Abra o software do microscópio
3. Coloque uma lâmina no palco do microscópio.
4. Capture uma imagem 2D em grande escala da seção cerebral usando um objetivo de baixa ampliação, como 1X/0,04 N.A. ou 4x/0,10 (Figuras 2A, B).

9. Imagem de neurônios inteiros

1. Capture pilhas de imagens de alta resolução da área contendo o neurônio de interesse, usando um objetivo N.A. 10x/0,25 ou 20x/0,40 N.A. (Figura 2C).
   NOTA: Neurônios selecionados para análise devem apresentar impregnação completa e homogênea de Golgi–Cox, com arbores dendríticas claramente definidas e coloração mínima de fundo. Células com processos truncados, impregnação incompleta, estruturas sobrepostas ou alto sinal de fundo devem ser excluídas para garantir uma análise morfométrica precisa.
2. Foque a imagem e ajuste as configurações da câmera, incluindo a exposição e o balanço de branco.
3. Defina os limites superior e inferior para a pilha de imagens.
4. Defina a distância de passo para 0,5 μm dentro da janela de aquisição da imagem.
5. Capture a pilha de imagens usando o comando de software para aquisição da pilha.
6. Repita os passos acima para capturar todas as áreas de interesse.
7. Salve o arquivo de dados e salve todos os arquivos de imagem. Formato TIFF para processamento externo.

10. Imagem de espinhos dendríticos

1. Capture pilhas de imagens de alta resolução da área contendo o neurônio de interesse, usando uma objetiva de imersão em óleo de 63x/1,4 N.A. em um microscópio de campo claro apropriado (Figura 2D).
   NOTA: No presente manuscrito, imagens de alta resolução de espinhos dendríticos mostradas na Figura 2D foram obtidas usando o modo de campo claro de um microscópio confocal, modelo Zeiss LSM 780. No entanto, outros microscópios de campo claro podem servir para obter imagens z-stack de alta qualidade 63x, cujos parâmetros devem ser padronizados por cada laboratório.
2. Aplique 1 a 2 gotas de óleo de imersão no ferrolho e coloque o objetivo sobre o ferrolho, garantindo o contato entre o objetivo e o óleo.
3. Foque a imagem e ajuste as configurações da câmera, incluindo a exposição e o balanço de branco.
4. Defina os limites superior e inferior para a pilha de imagens.
5. Defina a distância do passo para 0,3 μm dentro da janela de aquisição da imagem.
6. Capture a pilha de imagens usando o comando de software para aquisição da pilha.
7. Repita os passos acima para capturar todas as áreas de interesse
8. Salve o arquivo de dados e salve todos os arquivos de imagem no formato TIFF para processamento externo.
   NOTA: Para os passos 9 e 10. Se o microscópio não estiver equipado com um palco motorizado para aquisição por pilha Z, as imagens podem ser coletadas manualmente ajustando o foco micrométrico. No entanto, o espaçamento entre as seções ópticas pode ser menos preciso. Nesse caso, os Z-stacks podem ser reconstruídos posteriormente em softwares de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ) a partir da sequência de imagens adquiridas.

11. Análise morfométrica

NOTA: Diversas abordagens e programas de software especializados podem ser usados para esse propósito. Algumas ferramentas de acesso gratuito para análise da coluna dendrítica incluem o ImageJ ou, como neste estudo, o PyReconstruct¹⁵. Para uma descrição mais detalhada do PyReconstruct e sua funcionalidade para reconstrução neuronal e análise morfométrica, veja a fonte referenciada.

1. Procedimento para análise morfométrica de espinhos dendríticos
   1. Assim que o arquivo for aberto no ImageJ, mude o formato para RGB selecionando Imagem > Tipo > Cor RGB.
   2. Converta as pilhas Z em uma sequência de imagens no ImageJ: clique em Arquivo > Salvar Como > Sequência de Imagens. Salve cada sequência de imagens em uma pasta separada para análise subsequente. No PyReconstruct, carregue a sequência de imagens clicando em Arquivo > Nova > From Images.
   3. Uma janela de diálogo aparecerá, solicitando a atribuição de um nome ao arquivo (por exemplo, WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Três janelas de diálogo sucessivas então aparecem. Na primeira janela, insira o valor de calibração (μm/px). Essas informações estão disponíveis nos metadados da pilha Z e podem ser acessadas no ImageJ.
   5. Na segunda janela, insira a espessura de cada seção óptica consecutiva (μm). Finalmente, a série de imagens começará a carregar automaticamente (Figura Suplementar 1A).
   6. Uma vez identificado o segmento de interesse, de acordo com os critérios de inclusão definidos pelo pesquisador, prossiga com o rastreamento para obter dados quantitativos.
   7. Atribua um nome e domínio distintos para cada tipo de traço. Localize os domínios no painel inferior, onde são representados por formas geométricas coloridas diferentes (Figura Suplementar 1B).
   8. Desenhe uma linha correspondente ao comprimento desejado da amostra usando a ferramenta lápis. Depois, gerar um segundo traço através da pilha Z ao longo do segmento dendrítico usando a ferramenta Z.
   9. Use o traço inicial para determinar o comprimento apropriado do segmento e verifique-o em Listas > Lista de traços Z (Figura Suplementar 1B).
   10. Navegue pelo Z-stack e identifique as cabeças da coluna dendrítica com foco ideal. Usando a ferramenta lápis, trace a região distal mais larga de cada cabeça de espinho. Depois, use a ferramenta Z para traçar o pescoço da coluna ao longo do Z-stack (Figura Suplementar 1C, D). Repita esse procedimento até que todas as cabeças e pescoços das colunas dentro do segmento dendrítico selecionado tenham sido traçados.
2. Medições de cabeça de coluna de exportação
   1. Abra as listas contendo as medidas de largura e comprimento da cabeça da espinha. Acesse-os em Listas > Lista de Traços (para largura) e Listas > Lista Z-traço (para comprimento), respectivamente.
   2. Exporte os dados para o local desejado no computador. Dois arquivos Excel separados serão gerados, cada um contendo os dados correspondentes de medição.
3. Classifique a morfologia espinhosa e calcule a densidade
   1. Extraia as medidas de largura e comprimento das cabeças e pescoços da coluna a partir dos arquivos Excel previamente gerados.
   2. Os dados devem ser organizados nas colunas correspondentes rotuladas Largura e Comprimento para classificação morfológica com base nos seguintes^{critérios 16}: filópódio (>2 μm), fino (< 2 μm), curto (razão comprimento-largura da cabeça ≤1) e cogumelo (largura da cabeça >0,6 μm). (Figura Suplementar 1E). Filópodias raramente foram observados nos segmentos dendríticos analisados e, portanto, não foram incluídos na análise.
   3. O número total de espinhos por segmento dendrítico analisado é determinado nesta etapa, juntamente com a densidade de espinhos (espinhos por μm linear), bem como o tipo e número de cada subtipo de espinho. O modelo^{Excel 16} usado para essa análise está disponível na fonte referenciada. Usando esse método, a densidade basal dendrítica dos espinhos foi quantificada na região CA1 do hipocampo em camundongos fêmeas de 12 meses.
   4. Exportar dados quantificados e gerar gráficos com softwares científicos especializados projetados para análise de dados, gráficos e estatística. Aqui, o gráfico na Figura 3 foi construído com o software GraphPad Prism.

Resultados

Impregnação e seccionamento de tecidos
O protocolo Golgi–Cox descrito aqui produziu coloração neuronal confiável e homogênea no tecido cerebral de camundongos adultos. Após a impregnação na solução de Golgi–Cox, o cérebro adquiriu uma coloração dourada escura característica, indicando difusão bem-sucedida da solução de coloração por todo o tecido. A secção por vibratomo preservou a integridade estrutural dos processos somatas e dendríticos neuronais.

Discussão

O método de coloração de Golgi–Cox continua sendo uma das técnicas mais amplamente utilizadas para visualizar a morfologia neuronal e espinhos dendríticos em tecido cerebral^{fixo 3,4}. Ao impregnar um pequeno subconjunto aleatório de neurônios, esse método permite a visualização de árvores dendríticas completas com coloração mínima de fundo. No protocolo atual, a técnica permitiu a visualização clara dos neurônios piramidais do hip...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Tecnologias de Vida	15510-027	CAS 9012-56-6
Solução de amônia 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Perigoso.
Dibásico fosfato de sódio anidro	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Microscópio de campo claro	Nikon	Eclipse Ci
Sulfato de cromo potássio	Sigma-Aldrich	243361
Microscópio Confocal	Zeiss	LSM 780
Balanço digital	Instrumentos Accuris	W3200-1200
Embedding moldes	Merck	E6032	Dimensões: 22x22 mm
Etanol	Meyer	394
Animais experimentais	O Laboratório Jackson	2124-01	B6129SF2/J cepa de camundongos
Pó de gelatina	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad Prism Software	GraphPad Software Inc.		Versão 8.0.2
ImageJ Fiji Software	Instituto Nacional de Saúde dos EUA		Versão 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Cloreto de mercúrio	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Perigoso.
Câmera de Microscópio	Nikon	DS-Vi1
Objetivo de microscópio (10x)	Nikon	93183	Plano 10x/0,25 N.A.
Objetivo de microscópio (1x)	Nikon	93180	Plano UW 1x/0,04 N.A.
Objetivo de microscópio (20x)	Nikon	93184	Plano 20x/0,40 N.A.
Objetivo de microscópio (4x)	Nikon	93182	Plano 4x/0.10 N.A.
Objetivo de microscópio (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plano APO 63x/1.4 N.A. DIC de óleo
Lâminas de microscópio	Sigma-Aldrich	S8902
Monobásico monohidratado fosfato de sódio	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Esmalte	CORES PECAMINOSAS	COR FORTE	Transparente
Mídia de montagem permount	Fisher Scientific	SP15-500
Cromato de potássio	Produtos Quí micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Perigoso.
Dicromato de potássio	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Perigoso.
PyReconstruct Software	Universidade do Texas, Austin		Versão 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Cloreto de sódio	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Tiosulfato de sódio	Produtos Quí micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Perigoso.
Sacarose	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 e grau; Rotação específica, reagente ACS
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	VELOCIDADE 20 mm/s, AMPL & ndash; 0,60 mm
Xylene	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Perigoso.