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Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade Sun Yat-sen (Aprovação nº SYSU-IACUC-2026-B1278) e foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais.
1. Isolamento e cultura de SLCs primários de camundongos
- Dissecar testículos de camundongos C57BL/6 e remover cuidadosamente a túnica albugínea.
- Triturar os testículos em pedaços pequenos.
- Dissocie as células intersticiais dos túbulos seminíferos incubando em 1 mg/mL de colagênase tipo IV em DMEM/F12 a 37 ºC por 15 minutos.
- Adicione DMEM/F12 contendo 10% de soro fetal bovino para interromper a atividade da colagênase.
- Centrifuge a 1500 × g por 3 minutos em temperatura ambiente.
- Ressuspenda o pellet em PBS e filtre através de um filtro de 70 μm.
- Enriqueça células CD51⁺ por meio de filtração celular ativada por fluorescência (FACS) usando um Influx Cell Sorter.
- Semeie as células enriquecidas em meio de cultura SLC composto por DMEM/F12 suplementado com: 1 nM dexametasona, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L de selenita de insulina-transferrina-sódico, extrato de embrião de frango a 5%, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL fator de crescimento fibroblasto básico, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento derivado de plaquetas e oncostatina M.
- Cultive os SLCs sob condições padrão (37 °C, 5% CO₂) até atingirem a densidade desejada para semeadura em hidrogéis.
2. Montar o recipiente de vidro de fundição em gel
- Inspecione e limpe cuidadosamente as placas de vidro especializadas e espaçadores usados para a fundição de géis de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), garantindo que estejam livres de poeira, danos e resíduos.
- Monte corretamente as placas de vidro, espaçadores e grampos conforme as instruções do fabricante, garantindo que o conjunto esteja bem vedado para evitar vazamentos durante a fundição em gel.
- Coloque o recipiente de vidro montado com segurança em um suporte de laboratório, pronto para fundição.
NOTA: O sistema de fundição utiliza placas de vidro Western blot padrão (sulfato de dodecil de sódio [SDS]-PAGE) com espaçadores fixos de 1,0 mm de espessura, garantindo espessura reprodutível do gel e uma superfície plana para cultura celular.
3. Preparando a solução de gel PAGE
- Meça com precisão os seguintes reagentes de acordo com o desenho experimental (ver Tabela 1) em um tubo estéril de centrífuga de 15 mL ou 50 mL: solução de estoque de acrilamida 40%, solução de estoque de bis-acrilamida 2%, tampão HEPES 1M (pH 8,5), ddH₂O estéril.
ATENÇÃO: Acrilamida e bisacrilamida são neurotoxinas. Sempre use luvas e uma máscara contra poeira ao pesar pó seco para evitar contato com a pele e inalação de partículas no ar. Os procedimentos devem ser realizados dentro de uma exaustão exausteira.
4. Adicionar o iniciador e o catalisador, e moldar o gel
- Adicione o seguinte à solução mista sequencialmente: Persulfato de Amônio 10% (APS): Atua como iniciador para iniciar a reação de polimerização. N,N,N',N'--Tetrametiletilendiamina (TEMED): Atua como catalisador para acelerar a reação de polimerização. Para um volume total de gel de 6 mL, adicione 60 μL de APS a 10% e 6 μL de TEMED (veja a Tabela 1 para a avaliação).
NOTA: A reação de polimerização começa imediatamente após a adição de TEMED; portanto, as etapas subsequentes devem ser realizadas rapidamente.
5. Despejando a solução mista
- Imediatamente, pipete ou despeje a solução mista de forma constante ao longo de uma das bordas do recipiente de vidro para evitar criar bolhas.
6. Permitir que o gel polimerize
- Deixe o recipiente de gel fundido descansar tranquilo em temperatura ambiente.
NOTA: A polimerização geralmente leva de 15 a 30 minutos em temperatura ambiente (20–25 °C).
- Prossiga para a próxima etapa assim que uma interface clara entre a mistura de gel não polimerizado e o gel polimerizado estiver visível e o gel estiver completamente sólido (o gel não flui quando o recipiente está inclinado).
- Imediatamente após a fundição, sobrepõe-se cuidadosamente uma fina camada de etanol absoluto (ou etanol saturado em água) sobre a mistura em gel para excluir o oxigênio atmosférico, que inibe a polimerização radical. O etanol também ajuda a formar uma superfície superior plana.
- Após a polimerização, remova o etanol antes de desmontar as placas.
7. Desmontar o recipiente e colher o gel
- Desmonte cuidadosamente as grampos e use uma cunha plástica ou espátula para separar delicadamente as placas de vidro, permitindo que o gel polimerizado PAGE permaneça intacto em uma das placas.
- Prepare um prato de cultura contendo uma quantidade generosa de PBS estéril.
- Cuidadosamente retire o gel do prato de vidro usando uma espátula ou mão enluvada, e deixe deslizar suavemente para dentro do PBS.
- Sele o recipiente contendo o gel em PBS e incube a 4 °C durante a noite.
NOTA: Este passo é crucial. O gel recém-preparado está desidratado e deve absorver totalmente a água e inchar até suas dimensões finais em PBS. Se essa etapa for pulada e o gel for cortado diretamente, ele continuará a expandir em meio de cultura celular subsequente, provavelmente excedendo a área do poço de cultivo e tornando-o inutilizável. A espessura do gel após o inchaço é de 1 mm. Isso é fundamental porque, quando a espessura do gel cai abaixo de 100 μm, as células podem perceber a rigidez da placa rígida subjacente, o que interferiria nas medições mecanobiológicas pretendidas.
8. Cortar e transferir o gel para uma placa de cultura
- No dia seguinte, retire o gel de 4 °C. Usando um punção de biópsia estéril ou cortador de lâmina (com diâmetro correspondente ao tamanho do poço da placa de cultura, por exemplo, placa de 6 poços), corte o gel em condições estéreis.
- Dentro de um gabinete de biossegurança, use uma pinça estéril para pegar suavemente o disco de gel cortado e colocá-lo no centro de um poço de cultura vazio e estéril.
9. Lavagem inicial e irradiação UV
- Adicione PBS estéril suficiente ao poço contendo o gel, garantindo que ele fique completamente submerso.
- Balance suavemente a placa de cultura para lavar a superfície do gel.
- Aspire o PBS usando uma pipeta.
- Repita esse processo de lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos.
- Após a lavagem, adicione PBS estéril suficiente para cobrir o gel novamente. Coloque toda a placa de cultura com a tampa levemente entreaberta sob uma lâmpada UV (dentro de um gabinete de biossegurança ou um crosslinker UV dedicado) e irradie por 1 hora para esterilização básica.
10. Ativação do cruzador Sulfo-SANPAH
- Dentro do gabinete de biossegurança, aspire cuidadosamente o PBS do poço.
- Antes de aspirar, separe suavemente o gel das paredes e do fundo do poço usando uma ponta de pipeta para evitar danificar o gel devido à tensão superficial do líquido.
- Transfira o gel para outro poço limpo na mesma placa de cultura usando pinças estériles.
NOTA: Ao transferir o gel, primeiro adicionar uma pequena quantidade de PBS ao poço limpo pode ajudar a expulsar as bolhas de ar presas entre o fundo do poço e o gel na colocação, além de servir como lavagem adicional.
- Prepare a solução de trabalho para reticulação: Prepare uma solução de trabalho de 0,2 mg/mL de Sulfo-SANPAH diluindo a solução original (ver Tabela 1) usando água estéril ou o tampão recomendado (por exemplo, PBS).
NOTA: Proteja a solução da luz.
- Adicione solução de trabalho suficiente de Sulfo-SANPAH para cobrir o gel (por exemplo, 250 μL para uma placa de 12 poços, 500 μL para uma placa de 6 poços), garantindo que o gel esteja completamente coberto.
- Coloque a placa sob luz UV de 365 nm de comprimento de onda /120 mJ/cm2 e irradie por 1 hora.
NOTA: Esta etapa ativa o Sulfo-SANPAH, permitindo que ele se ligue a grupos funcionais na superfície do gel.
11. Ativação do reticulador e lavagens finais
- Após a irradiação, aspire a solução de Sulfo-SANPAH do poço dentro do gabinete de biossegurança.
- Adicione PBS estéril suficiente ao poço, balance suavemente para lavar a superfície do gel e aspire o PBS.
- Repita esse processo de lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos, para remover completamente qualquer Sulfo-SANPAH não reagido.
12. Preparando solução de trabalho de colágeno tipo I para cauda de rato
- Use uma solução de ácido acético 0,02 M como solvente para diluir a solução de colágeno tipo I tipo rato I.
- Ajuste a concentração final da solução de trabalho para 60–100 μg/mL. Por exemplo, se a concentração de estoque de colágeno for 4 mg/mL, adicione 15–25 μL de estoque a 985–975 μL de 0,02 M ácido acético para obter 1 mL de solução de trabalho.
13. Revestimento e incubação de colágeno
- Adicione o volume apropriado de solução de trabalho de colágeno a cada poço contendo o gel ativado de acordo com o tipo de placa: adicione 2 mL para uma placa de 6 poços, ou 1 mL para uma placa de 12 poços.
- Gire suavemente a placa de cultura para garantir que a solução de colágeno cubra uniformemente o gel e o fundo do poço.
- Cubra a placa e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO₂ para permitir que o colágeno se fixe na superfície do gel por meio da reticulação Sulfo-SANPAH.
14. Irradiação e fixação de UV secundária
- No dia seguinte, remova a placa e irradie novamente sob cerca de 120 mJ/cm 2 de luz UV por 1 hora.
15. Remover as células de colágeno e sementes não ligadas
- Dentro do gabinete de biossegurança, aspire cuidadosamente a solução de trabalho de colágeno tipo I do rabo de rato dos poços.
- Adicione PBS estéril aos poços, abaixe suavemente para lavar a superfície do gel e aspire o PBS.
- Repita a lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos.
- Após a lavagem, a matriz de gel está pronta. Resuspenda as células-tronco de Leydig preparadas no meio de cultivo completo de SLC (composição detalhada na etapa 1).
- Seme a suspensão celular diretamente sobre a superfície do gel. A densidade de semeadura recomendada é de 2 × 104 células/cm2 (por exemplo, aproximadamente 2 × 105 células por poço para uma placa padrão de 6 poços).
- Incube as placas de cultivo a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
- Para manter a viabilidade celular ideal e a função esteroidogênica, troque o meio de cultivo a cada 48 horas.