Fabricação de hidrogéis de poliacrilamida sintonizáveis para estudar os efeitos da rigidez da matriz em células-tronco Leydig

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida com rigidez ajustável para estudar os efeitos da mecânica matricial no comportamento das células-tronco de Leydig em um sistema de cultura bidimensional controlado.

Resumo

A rigidez da matriz extracelular (MEC) regula criticamente o comportamento das células-tronco. Anteriormente, demonstramos que aumentos patológicos na rigidez da matriz durante o envelhecimento prejudicam a homeostase das células-tronco de Leydig (SLC), levando a uma queda na testosterona. Com base nessa descoberta, apresentamos aqui um protocolo detalhado — originalmente desenvolvido em nosso laboratório — para fabricar hidrogéis de poliacrilamida (PA) com rigidez ajustável, a fim de modelar o microambiente testicular in vitro. Esse método permite a fundição reprodutível de géis em uma faixa de rigidez de 1 a 100 kPa, abrangendo condições fisiológicas a patológicas. As etapas principais incluem mistura precisa de acrilamida/bis-acrilamida, equilíbrio de inchaço em gel, ativação superficial com Sulfo-SANPAH e revestimento de colágeno para apoiar a adesão e cultura do SLC. Fornecemos formulações otimizadas para rigidez alvo e orientações para resolução de problemas comuns, como polimerização incompleta e fixação deficiente da célula. Esse sistema permite uma investigação sistemática de como a rigidez do substrato modula a proliferação, diferenciação e função esteroidogênica do SLC sob condições 2D definidas. Além da biologia reprodutiva, também serve como uma plataforma valiosa para estudos mecanobiológicos em outros tipos celulares e para triagem de terapêuticas que visam disfunções relacionadas à rigidez.

Introdução

As propriedades mecânicas da matriz extracelular (ECM) desempenham um papel fundamental na regulação do destino das células-tronco, incluindo proliferação, diferenciação e manutenção^{funcional 1,2,3,4}. Nos testículos, o endurecimento da ECM relacionado à idade tem sido implicado na diminuição da produção de testosterona. No entanto, os mecanismos mecânicos subjacentes permanecem pouco compreendidos, em parte devido à falta de modelos padronizados in vitro que recapitulem fielmente a faixa fisiológica de rigidez do nicho testicular. A rigidez fisiológica do tecido testicular de camundongo jovem é de aproximadamente 1–15 kPa, enquanto o tecido envelhecido ou fibrótico pode atingir 20–30 kPa ou mais.

Hidrogéis de poliacrilamida (PA) surgiram como uma plataforma versátil para estudar interações célula–matriz porque sua rigidez pode ser ajustada com precisão variando a razão entre acrilamida e bisacrilamida ^5,6. Comparados a outros substratos, como vidro revestido de colágeno ou hidrogéis comerciais, os géis PA oferecem controle independente sobre rigidez e densidade bioquímica de ligantes, permitindo a dissecação sistemática dos sinais mecânicos. Embora existam vários protocolos para a fabricação de gels^{de PA 7,8,9}, eles frequentemente carecem de otimização detalhada para tipos celulares específicos, especialmente para células primárias raras como SLCs.

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e reproduzível para preparar hidrogéis de PA com rigidez definida (1–100 kPa), adaptado para cultivo de SLCs em camundongos. O método inclui instruções passo a passo para a montagem em gel, equilíbrio de inchaço, funcionalização da superfície com Sulfo-SANPAH e revestimento de colágeno para promover a adesão celular. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores podem gerar substratos com rigidez ajustável (variando de 1 a 100 kPa) que imitam o ambiente mecânico de testículos jovens (macios) e envelhecidos (rígidos), permitindo uma investigação quantitativa das respostas SLC dependentes da rigidez. O sistema também é adaptável a outros tipos celulares mecanossensíveis e oferece uma plataforma para triagem de drogas que visam patologias relacionadas à rigidez.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade Sun Yat-sen (Aprovação nº SYSU-IACUC-2026-B1278) e foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Isolamento e cultura de SLCs primários de camundongos

1. Dissecar testículos de camundongos C57BL/6 e remover cuidadosamente a túnica albugínea.
2. Triturar os testículos em pedaços pequenos.
3. Dissocie as células intersticiais dos túbulos seminíferos incubando em 1 mg/mL de colagênase tipo IV em DMEM/F12 a 37 ºC por 15 minutos.
4. Adicione DMEM/F12 contendo 10% de soro fetal bovino para interromper a atividade da colagênase.
5. Centrifuge a 1500 × g por 3 minutos em temperatura ambiente.
6. Ressuspenda o pellet em PBS e filtre através de um filtro de 70 μm.
7. Enriqueça células CD51⁺ por meio de filtração celular ativada por fluorescência (FACS) usando um Influx Cell Sorter.
8. Semeie as células enriquecidas em meio de cultura SLC composto por DMEM/F12 suplementado com: 1 nM dexametasona, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L de selenita de insulina-transferrina-sódico, extrato de embrião de frango a 5%, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL fator de crescimento fibroblasto básico, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento derivado de plaquetas e oncostatina M.
9. Cultive os SLCs sob condições padrão (37 °C, 5% CO₂) até atingirem a densidade desejada para semeadura em hidrogéis.

2. Montar o recipiente de vidro de fundição em gel

1. Inspecione e limpe cuidadosamente as placas de vidro especializadas e espaçadores usados para a fundição de géis de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), garantindo que estejam livres de poeira, danos e resíduos.
2. Monte corretamente as placas de vidro, espaçadores e grampos conforme as instruções do fabricante, garantindo que o conjunto esteja bem vedado para evitar vazamentos durante a fundição em gel.
3. Coloque o recipiente de vidro montado com segurança em um suporte de laboratório, pronto para fundição.
   NOTA: O sistema de fundição utiliza placas de vidro Western blot padrão (sulfato de dodecil de sódio [SDS]-PAGE) com espaçadores fixos de 1,0 mm de espessura, garantindo espessura reprodutível do gel e uma superfície plana para cultura celular.

3. Preparando a solução de gel PAGE

1. Meça com precisão os seguintes reagentes de acordo com o desenho experimental (ver Tabela 1) em um tubo estéril de centrífuga de 15 mL ou 50 mL: solução de estoque de acrilamida 40%, solução de estoque de bis-acrilamida 2%, tampão HEPES 1M (pH 8,5), ddH₂O estéril.
   ATENÇÃO: Acrilamida e bisacrilamida são neurotoxinas. Sempre use luvas e uma máscara contra poeira ao pesar pó seco para evitar contato com a pele e inalação de partículas no ar. Os procedimentos devem ser realizados dentro de uma exaustão exausteira.

4. Adicionar o iniciador e o catalisador, e moldar o gel

1. Adicione o seguinte à solução mista sequencialmente: Persulfato de Amônio 10% (APS): Atua como iniciador para iniciar a reação de polimerização. N,N,N',N'--Tetrametiletilendiamina (TEMED): Atua como catalisador para acelerar a reação de polimerização. Para um volume total de gel de 6 mL, adicione 60 μL de APS a 10% e 6 μL de TEMED (veja a Tabela 1 para a avaliação).
   NOTA: A reação de polimerização começa imediatamente após a adição de TEMED; portanto, as etapas subsequentes devem ser realizadas rapidamente.

5. Despejando a solução mista

1. Imediatamente, pipete ou despeje a solução mista de forma constante ao longo de uma das bordas do recipiente de vidro para evitar criar bolhas.

6. Permitir que o gel polimerize

1. Deixe o recipiente de gel fundido descansar tranquilo em temperatura ambiente.
   NOTA: A polimerização geralmente leva de 15 a 30 minutos em temperatura ambiente (20–25 °C).
2. Prossiga para a próxima etapa assim que uma interface clara entre a mistura de gel não polimerizado e o gel polimerizado estiver visível e o gel estiver completamente sólido (o gel não flui quando o recipiente está inclinado).
3. Imediatamente após a fundição, sobrepõe-se cuidadosamente uma fina camada de etanol absoluto (ou etanol saturado em água) sobre a mistura em gel para excluir o oxigênio atmosférico, que inibe a polimerização radical. O etanol também ajuda a formar uma superfície superior plana.
4. Após a polimerização, remova o etanol antes de desmontar as placas.

7. Desmontar o recipiente e colher o gel

1. Desmonte cuidadosamente as grampos e use uma cunha plástica ou espátula para separar delicadamente as placas de vidro, permitindo que o gel polimerizado PAGE permaneça intacto em uma das placas.
2. Prepare um prato de cultura contendo uma quantidade generosa de PBS estéril.
3. Cuidadosamente retire o gel do prato de vidro usando uma espátula ou mão enluvada, e deixe deslizar suavemente para dentro do PBS.
4. Sele o recipiente contendo o gel em PBS e incube a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Este passo é crucial. O gel recém-preparado está desidratado e deve absorver totalmente a água e inchar até suas dimensões finais em PBS. Se essa etapa for pulada e o gel for cortado diretamente, ele continuará a expandir em meio de cultura celular subsequente, provavelmente excedendo a área do poço de cultivo e tornando-o inutilizável. A espessura do gel após o inchaço é de 1 mm. Isso é fundamental porque, quando a espessura do gel cai abaixo de 100 μm, as células podem perceber a rigidez da placa rígida subjacente, o que interferiria nas medições mecanobiológicas pretendidas.

8. Cortar e transferir o gel para uma placa de cultura

1. No dia seguinte, retire o gel de 4 °C. Usando um punção de biópsia estéril ou cortador de lâmina (com diâmetro correspondente ao tamanho do poço da placa de cultura, por exemplo, placa de 6 poços), corte o gel em condições estéreis.
2. Dentro de um gabinete de biossegurança, use uma pinça estéril para pegar suavemente o disco de gel cortado e colocá-lo no centro de um poço de cultura vazio e estéril.

9. Lavagem inicial e irradiação UV

1. Adicione PBS estéril suficiente ao poço contendo o gel, garantindo que ele fique completamente submerso.
2. Balance suavemente a placa de cultura para lavar a superfície do gel.
3. Aspire o PBS usando uma pipeta.
4. Repita esse processo de lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos.
5. Após a lavagem, adicione PBS estéril suficiente para cobrir o gel novamente. Coloque toda a placa de cultura com a tampa levemente entreaberta sob uma lâmpada UV (dentro de um gabinete de biossegurança ou um crosslinker UV dedicado) e irradie por 1 hora para esterilização básica.

10. Ativação do cruzador Sulfo-SANPAH

1. Dentro do gabinete de biossegurança, aspire cuidadosamente o PBS do poço.
2. Antes de aspirar, separe suavemente o gel das paredes e do fundo do poço usando uma ponta de pipeta para evitar danificar o gel devido à tensão superficial do líquido.
3. Transfira o gel para outro poço limpo na mesma placa de cultura usando pinças estériles.
   NOTA: Ao transferir o gel, primeiro adicionar uma pequena quantidade de PBS ao poço limpo pode ajudar a expulsar as bolhas de ar presas entre o fundo do poço e o gel na colocação, além de servir como lavagem adicional.
4. Prepare a solução de trabalho para reticulação: Prepare uma solução de trabalho de 0,2 mg/mL de Sulfo-SANPAH diluindo a solução original (ver Tabela 1) usando água estéril ou o tampão recomendado (por exemplo, PBS).
   NOTA: Proteja a solução da luz.
5. Adicione solução de trabalho suficiente de Sulfo-SANPAH para cobrir o gel (por exemplo, 250 μL para uma placa de 12 poços, 500 μL para uma placa de 6 poços), garantindo que o gel esteja completamente coberto.
6. Coloque a placa sob luz UV de 365 nm de comprimento de onda /120 mJ/cm² e irradie por 1 hora.
   NOTA: Esta etapa ativa o Sulfo-SANPAH, permitindo que ele se ligue a grupos funcionais na superfície do gel.

11. Ativação do reticulador e lavagens finais

1. Após a irradiação, aspire a solução de Sulfo-SANPAH do poço dentro do gabinete de biossegurança.
2. Adicione PBS estéril suficiente ao poço, balance suavemente para lavar a superfície do gel e aspire o PBS.
3. Repita esse processo de lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos, para remover completamente qualquer Sulfo-SANPAH não reagido.

12. Preparando solução de trabalho de colágeno tipo I para cauda de rato

1. Use uma solução de ácido acético 0,02 M como solvente para diluir a solução de colágeno tipo I tipo rato I.
2. Ajuste a concentração final da solução de trabalho para 60–100 μg/mL. Por exemplo, se a concentração de estoque de colágeno for 4 mg/mL, adicione 15–25 μL de estoque a 985–975 μL de 0,02 M ácido acético para obter 1 mL de solução de trabalho.

13. Revestimento e incubação de colágeno

1. Adicione o volume apropriado de solução de trabalho de colágeno a cada poço contendo o gel ativado de acordo com o tipo de placa: adicione 2 mL para uma placa de 6 poços, ou 1 mL para uma placa de 12 poços.
2. Gire suavemente a placa de cultura para garantir que a solução de colágeno cubra uniformemente o gel e o fundo do poço.
3. Cubra a placa e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO₂ para permitir que o colágeno se fixe na superfície do gel por meio da reticulação Sulfo-SANPAH.

14. Irradiação e fixação de UV secundária

1. No dia seguinte, remova a placa e irradie novamente sob cerca de 120 mJ/^{cm 2} de luz UV por 1 hora.

15. Remover as células de colágeno e sementes não ligadas

1. Dentro do gabinete de biossegurança, aspire cuidadosamente a solução de trabalho de colágeno tipo I do rabo de rato dos poços.
2. Adicione PBS estéril aos poços, abaixe suavemente para lavar a superfície do gel e aspire o PBS.
3. Repita a lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens, cada uma com duração de 3 minutos.
4. Após a lavagem, a matriz de gel está pronta. Resuspenda as células-tronco de Leydig preparadas no meio de cultivo completo de SLC (composição detalhada na etapa 1).
5. Seme a suspensão celular diretamente sobre a superfície do gel. A densidade de semeadura recomendada é de 2 × 10⁴ células/cm² (por exemplo, aproximadamente 2 × 10⁵ células por poço para uma placa padrão de 6 poços).
6. Incube as placas de cultivo a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
7. Para manter a viabilidade celular ideal e a função esteroidogênica, troque o meio de cultivo a cada 48 horas.

Resultados

A execução bem-sucedida desse protocolo resulta em hidrogéis de poliacrilamida com rigidez definida (variando de 1 a 100 kPa) que permanecem firmemente fixados à placa de cultura e suportam adesão e espalhamento robustos do SLC. A Figura 1 oferece uma visão geral esquemática de todo o fluxo de trabalho, desde a fundição em gel até a semeadura de células, permitindo que os usuários visualizem as principais etapas do protocolo.

A va...

Discussão

As propriedades mecânicas da matriz extracelular desempenham um papel fundamental na regulação do comportamento das células-tronco, mas as ferramentas para estudar sistematicamente esses efeitos nas células reprodutivas permanecem limitadas. Nossos trabalhos anteriores demonstraram que o endurecimento patológico da matriz durante o envelhecimento desregula a homeostase das células-tronco de Leydig (SLC) através dos eixos Piezo1/ROS/Gli1, levando ao declínio da^{testostero...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido acético	Sigma-Aldrich	Cat#A6283	Diluente para colágeno de rabo de rato (0,02 M)
Acriamida	Sangon Biotech	Cat#A100341-0500	Monômero para preparação de gel de poliacrilamida
Persulfato de amônio (APS)	Sangon Biotech	Cat#A100486-0100	Iniciador para polimerização em gel
Suplemento B27	Invitrogen	Gato#A1486701	Suplemento definido enriquecido para antioxidantes e hormônios; Apoia a sobrevivência neuronal e das células-tronco (2% v/v)
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Invitrogen	Cat#13256029	fator de crescimento mitogênico; promove a proliferação e a formação de SLC (20 ng/mL)
Bis-acrilamida	Biotecnologia yuanye de Xangai	Cat#S14002	Crosslinker para géis de poliacrilamida
Extrato de embrião de frango	Biológicos dos EUA	Cat#C3999	Fonte rica em fatores de crescimento e nutrientes; apoia o crescimento e a viabilidade do SLC (5% v/v)
Colágeno, tipo I, proveniente do rabo de rato	YEASEN	Cat#40125ES50	Revestem a superfície do hidrogel de poliacrilamida ativada por Sulfo-SANPAH para promover a adesão e a cultura do SLC.
Colanase Tipo IV	Gibco	Cat#17104-019	1 mg/mL em DMEM/F12 para digestão do tecido testicular
Anticorpo CYP11A1	GeneTex	Gato#GTX56293	Para o western blotting
Dexametasona	Sigma-Aldrich	Cat#D1756	Agonista receptor de glucocorticoide; apoia a proliferação de SLC e manutenção da caule (1 nM)
DMEM/F12 médio	Gibco	Gato#11320033	Meio basal para digestão, lavagem e cultura de SLC
Fator de crescimento epidérmico (EGF)	PeproTech	Cat#AF-100-15	Estimula a proliferação de SLC e mantém o estado indiferenciado (20 ng/mL)
Soro Bovino Fetal (FBS)	VISTECH	Cat#SE100-011	Usado a 10% para interromper a atividade da colagênase
Fiji	N/A	https://imagej.net/Fiji	Software de análise de imagens
Anticorpo GADPH	Proteintech	Cat#60004-1-IG	Para o western blotting
Enzimas de digestão em gel	Biotecnologia Precisa	Cat#GXDLFA	Mistura enzimática para digestão de tecido testicular e isolamento de SLC
HEPES	Cytiva	Cat#SH30237.01	Buffer para manter pH 7,0 e ndash; 7.4
HSD3 & beta; anticorpo	Santa Cruz	Cat#SC-515120	Para o western blotting
Classificador de Células de Influxo	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
Selenita de Insulina-Transferrina-Sódico (ITS)	Sigma-Aldrich	Gato#11074547001	Promove a sobrevivência celular, a absorção de glicose e a defesa antioxidante (5 & mu; g/L)
KnockOut de substituição sérica (KSR) e nbsp;	Gibco	Cat#10828-028	Substituto sérico para meio de cultura SLC
LIF (Fator Inibitório da Leucemia)	Millipore	Gato#LIF1010	Citocina que mantém a pluripotência e a autorrenovação das células-tronco (1 ng/mL)
Testículos de camundongos	Este artigo	N/A	Isolado de camundongos C57BL/6
Kit ELISA de Testosterona para Rato	Biotecnologia Fina	Cat#40203ES80	Para quantificação da testosterona em supernadantes de cultura
Mouse: C57BL/6	Shenzhen TopBiotech	N/A	Cepa de camundongo usada para coleta de testículos
Mouse: Células-tronco testiculares (SLCs) & nbsp;	Este artigo	N/A	Células primárias isoladas de testículos de camundongos
Suplemento N2	Invitrogen	Cat#17502001	Suplemento definido sem soro que apoia culturas neurais e de células-tronco (1% v/v)
Aminoácidos não essenciais	HyClone	Cat#SH30050.03	Fornece fontes de nitrogênio para síntese de proteínas e metabolismo celular (1% v/v)
Oncostatin M (OSM)	PeproTech	Cat#300-10T	Citocina envolvida na regulação da diferenciação do SLC e maturação das células de Leydig (20 ng/mL)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	Gato#10010023	Amortecedor de lavagem e ressuspensão
Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)	PeproTech	Cat#100-14B	Suporta proliferação celular, migração e sobrevivência (20 ng/mL)
Prism 9.0	GraphPad	https://www.graphpad.com/	Software para análise estatística e gráficos
Anticorpo StAR	Proteintech	Cat#67130-1-IG	Para o western blotting
Sulfo-SANPAH	MACKLIN	Cat#102568-43-4	Cruzamento heterobifuncional para ativação da superfície do gel
TEMED	Phygene	Cat#PH0341	Catalisador para polimerização
β-Mercaptoetanol	Invitrogen	Gato#21985023	Reduz o estresse oxidativo e favorece o crescimento celular em cultura (0,1 mM)