Artigo de método

Análise Optogenética do Comportamento no Mosquito Aedes aegypti

248 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso da optogenética para compreender o comportamento do mosquito Aedes aegypti. São apresentados métodos de criação, preparação, ensaios e análise para avaliar a função neuronal durante a atração por animais hospedeiros e a alimentação com sangue. Essas técnicas fundamentais permitirão estudos de circuitos neurais e comportamentais desse importante vetor de doenças humanas.

Resumo

O mosquito Aedes aegypti é um vetor importante de patógenos virais e serve como modelo para outras espécies vetoras. Os patógenos são transmitidos quando um mosquito pica um animal hospedeiro, mas os circuitos neurais que controlam o comportamento de busca e picada permanecem desconhecidos. Este artigo detalha métodos para manipular a atividade neural no mosquito utilizando optogenética, uma técnica fundamental para determinar a relação causal entre circuitos neurais e comportamento. Esses métodos incluem a criação de mosquitos para optogenética e três ensaios projetados para medir diferentes etapas da sequência de ativação, atração, sondagem pelo probóscide e saciedade com sangue do hospedeiro. Esses comportamentos ocorrem em diferentes escalas espaciais e em resposta a diferentes estímulos sensoriais. Cada ensaio comportamental é equipado com LEDs vermelhos (~625 nm) para ativação optogenética. Para detectar ativação em resposta a estímulos olfativos, o voo e a locomoção são quantificados. Para avaliar atração ou pouso, os mosquitos são expostos a uma refeição sanguínea aquecida em uma arena grande. A sondagem pelo probóscide e a saciedade são analisadas com vídeo de maior resolução, permitindo a medição dos apêndices e do tamanho do abdômen. O protocolo descreve modelos de visão computacional para permitir a quantificação temporal de alta resolução do comportamento e medições finais da alimentação. Esses métodos podem ser usados para testar o papel de qualquer população de neurônios acessível geneticamente no comportamento de picada de mosquito e podem ser estendidos a comportamentos adicionais.

Introdução

O mosquito é um dos animais mais perigosos do mundo, não por sua ferocidade ou força, mas por sua eficiência como vetor de doenças. Parasitas causadores de malária transmitidos por mosquitos do gênero Anopheles são responsáveis por centenas de milhares de mortes anualmente, enquanto Aedes aegypti e Aedes albopictus são responsáveis pela disseminação da febre amarela, dengue, chikungunya, febre Zika e muitas outras doenças potencialmente fatais1. Mosquitos estão presentes em todos os continentes exceto a Antártica e representam uma grande preocupação para a saúde pública2. O comportamento de alimentação sanguínea transmite diretamente patógenos, mas também constitui uma etapa essencial no ciclo de vida do mosquito , já que uma refeição de sangue de vertebrado é necessária para a postura de ovos. Conter a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos exige, portanto, compreender seus mecanismos de busca por hospedeiros.

Está bem estabelecido que fêmeas de mosquitos utilizam pistas de longa e curta distância para localizar hospedeiros3,4. O dióxido de carbono (CO2) é um gás altamente volátil presente na respiração humana e é frequentemente a primeira pista percebida pelo mosquito. Ele é detectado em neurônios sensoriais olfativos de Aedes aegypti pelas proteínas Gr1, Gr2 e Gr3, que formam o receptor de CO25. A exposição ao CO2 provoca comportamento de decolagem e voo, também conhecido como ativação6,7, que pode persistir por até 10–15 min, mesmo na ausência de estímulos adicionais8. O CO2 age em sinergia com o odor da pele para aumentar a ativação e a atração5,9. Após a detecção de CO2 e odor da pele, o mosquito fica preparado para perceber pistas adicionais e mais próximas do hospedeiro, como calor, contraste visual e umidade, que o orientam para pousar em um hospedeiro viável para a refeição sanguínea5,10,11,12,13. A integração de múltiplas pistas sensoriais permite que os mosquitos persigam e localizem efetivamente seu hospedeiro.

Quando um mosquito fêmea pousa em um hospedeiro em potencial, ele insere seu probóscide na superfície até localizar uma região da pele, um processo conhecido como sondagem14,15. Após a sondagem, o estilete perfura a pele, localiza um vaso sanguíneo e simultaneamente ingere sangue enquanto injeta saliva, permitindo que o mosquito duplique seu peso corporal em alguns minutos16. O sangue é direcionado ao intestino médio, onde as proteínas são digeridas para a produção de ovos. Curiosamente, a alimentação completa em um hospedeiro não é necessária para a disseminação de patógenos, pois a simples sondagem já pode transmitir doenças16,17. Portanto, compreender cada etapa do comportamento de picada poderia permitir o desenvolvimento de estratégias para interromper a busca e a picada de hospedeiros por fêmeas de mosquitos, e, em última instância, controlar a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos.

Diversas ferramentas foram desenvolvidas em organismos modelo para manipular a atividade neuronal. As primeiras ferramentas funcionavam de forma constitutiva ou por ativação térmica18,19,20,21. Embora úteis, esses reagentes genéticos apresentam certas desvantagens. Ferramentas constitutivas podem afetar o desenvolvimento, levando a fenótipos que não são exclusivamente devidos à função do circuito neuronal. Os mosquitos utilizam o calor corporal para identificar vertebrados hospedeiros, o que torna canais ativados termicamente especialmente inadequados para estudos de seu comportamento22,23. Em estudos de comportamento, optogenética refere-se ao uso de ferramentas genéticas que respondem a comprimentos de onda específicos de luz para controlar a ativação de neurônios de interesse. Esta técnica já foi utilizada em múltiplos sistemas, desde a análise da valência da sede em camundongos até o estudo do comportamento de corte em Drosophila, passando pela restauração da perda de visão causada pela retinose pigmentar em ensaios clínicos com humanos24,25,26. Os canais optogenéticos funcionam absorvendo fótons e permitindo a passagem de tipos específicos de íons através da membrana plasmática, ativando ou inibindo o neurônio. Ao introduzir genes transgênicos codificadores de proteínas sensíveis à luz em um organismo, esta técnica pode ser usada para ativar ou inibir neurônios específicos que, de outra forma, seriam impossíveis de manipular. A optogenética oferece vantagens no controle temporal e espacial, além de uma variedade de controles que permitem inferência experimental.

Os autores descreveram recentemente o primeiro uso de ferramentas optogenéticas para estudar o comportamento de mosquitos8. Essas ferramentas baseiam-se no canal catiônico ativado por luz vermelha CsChrimson, um canalrorodopsina com deslocamento para o vermelho27. As opsinas microbianas, incluindo o CsChrimson, requerem um cofator químico, o retinal trans-total, para absorver fótons28. O CsChrimson é fundido ao repórter fluorescente tdTomato e está sob controle do sistema binário de expressão QF2/QUAS, permitindo sua combinação flexível com diferentes linhagens de promotores29. Para direcionar os neurônios sensoriais de CO2, utilizou-se uma linhagem promotora que expressa o fator de transcrição QF2 em neurônios que expressam a subunidade Gr3 do receptor de CO230. Os mosquitos mostraram resposta comportamental mínima após exposição à luz vermelha isoladamente8; além disso, a luz vermelha é a mais eficaz na penetração de tecidos biológicos, tornando uma opsinas ativada por luz vermelha ideal para optogenética25.

Este artigo descreve protocolos para três ensaios que medem diferentes aspectos do comportamento de busca de hospedeiro e alimentação com sangue combinados com estimulação optogenética (Figura 1A). Primeiro, é fornecido um protocolo para a criação de linhagens de mosquitos optogenéticos. A segunda seção descreve o opto-termociclador, um termociclador de PCR modificado que pode ser usado para acompanhar a excitação e a sondagem quando mosquitos são expostos a estímulos de temperatura e luz. O ensaio com opto-termociclador é projetado para medir esses comportamentos de busca em escalas de tempo prolongadas, utilizando linhagens motoras para controlar a atividade neuronal com optogenética. A terceira seção descreve o ensaio da manta de sangue, no qual os mosquitos têm acesso constante a uma refeição artificial fina de sangue na base de um termociclador modificado, permitindo o rastreamento de voo, sondagem e ingurgitamento sob diferentes condições de luz e temperatura. O ensaio da manta de sangue, baseado no opto-termociclador, fornece um meio para quantificar o ingurgitamento com uma refeição artificial de sangue, possibilitando o estudo dos comportamentos de alimentação de mosquitos com estímulos optogenéticos e térmicos precisamente cronometrados. A seção final descreve o alimentador de membrana optogenético, no qual os mosquitos são expostos a uma refeição de sangue aquecida em um recipiente, permitindo o rastreamento tanto da atração por uma fonte de sangue quanto do ingurgitamento sob exposição a estímulos luminosos. O ensaio com alimentador de membrana optogenético é usado para investigar a sequência completa de comportamentos de busca de hospedeiro e alimentação com sangue em um sistema de voo livre. Além dos resultados esperados para cada ensaio, são descritos modelos de visão computacional para rastrear partes do corpo do mosquito e identificar comportamentos durante os ensaios. Os ensaios com opto-termociclador, manta de sangue e alimentador de membrana optogenético permitem a medição de estágios distintos do comportamento de alimentação com sangue em mosquitos, manipulando a atividade neural com luz. Essas técnicas inovadoras permitem o estudo de como os circuitos neurais dos mosquitos controlam comportamentos que representam uma ameaça à saúde pública.

Protocolo

Os mosquitos utilizados neste protocolo contêm transgenes e, de acordo com as regulamentações do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, devem ser criados em instalações de contenção de artrópodes nível II32. Os mosquitos são contidos para prevenir sua fuga e descartados em resíduos de biossegurança. Os protocolos de biossegurança e contenção de artrópodes foram analisados e aprovados pelo Serviço de Saúde Ambiental de Yale & Segurança. Este trabalho não faz uso de sujeitos humanos ou animais. O genótipo do mosquito pode ser confirmado por marcadores fluorescentes (3xP3-dsRed para Gr3-QF2 e 3xP3-CFP para QUAS-CsChrimson) ou por PCR para o construto inserido8. Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados no Tabela de Materiais.

1. Criação optogenética

  1. Crie linhagens de mosquitos de acordo com o protocolo padrão31, com as seguintes exceções para maximizar a resposta das linhagens optogenéticas durante os experimentos.
  2. Realize cruzamentos usando linhagens homozigotas Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e selvagem de Liverpool para gerar as linhagens experimentais heterozigotas Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ e Gr3>CsChrimson.
  3. Crie os mosquitos dentro de um incubador hermético à luz, ajustado a 28 °C e 80% de umidade, em um ciclo de 14 h de luz azul (450 nm) e 10 h de escuro (Figura 1B).
    NOTA: O uso de luz azul minimiza a ativação de canais ativados por luz vermelha, como o CsChrimson. Todos os passos de criação realizados fora do incubador devem ser conduzidos em condições de pouca luz.
  4. Inicie os experimentos com mosquitos adultos a partir de uma semana após a ecdise.
    NOTA: Embora a idade ideal para experimentos comportamentais seja de 2–3 semanas, mosquitos com até 4 semanas após a ecdise podem ser utilizados. Genótipos controle e experimentais devem ter a mesma idade, registrada em dias após a ecdise. Para padronizar as idades dos animais, todos os ovos devem eclodir no mesmo dia.
  5. Dois dias antes dos experimentos, aspire suavemente fêmeas acasaladas e não alimentadas com sangue das gaiolas e anestesie-as a 4 °C. Usando uma pena ou aspirador, transfira-as cuidadosamente para os recipientes experimentais de acordo com o ensaio utilizado.
  6. Prepare uma alíquota de 0,2 M de retinal-trans-total (ATR) em dimetilsulfóxido (DMSO), armazenada a -20 °C. Forneça sacarose a 10% e ATR a 400 µM por meio de pavios de algodão embebidos na tela do recipiente. Os animais podem se alimentar por 1–3 dias no escuro com esta dieta.
    NOTA: A alimentação no escuro, em vez de sob luz azul, evita o desbotamento do ATR (Figura 1B). Além disso, em todos os passos do protocolo, os mosquitos foram anestesiados pela exposição a 4 °C por 5–10 min, até que deixassem de se mover. Ao final de cada experimento, os mosquitos foram eutanasiados pela exposição a -20 °C por 24 h.
    CAUTELA: O retinal-trans-total pode causar irritação grave ao entrar em contato com a pele e os olhos. Use EPI adequado, como jaleco, luvas e proteção ocular ao manipulá-lo. O dimetilsulfóxido é um líquido combustível que pode ser absorvido pela pele ao entrar em contato e deve ser manipulado em ambiente seco com EPI adequado e proteção ocular. O DMSO também deve ser armazenado em recipientes químicos à prova de fogo.
  7. Um dia (20–24 h) antes dos experimentos, substitua os alimentadores de sacarose por novos contendo água destilada e ATR a 400 µM. Os animais permanecem no escuro até o experimento (Figura 1B). Prossiga para a seção 2, 3 ou 4.
    NOTA: Os experimentos devem ser realizados durante o fotoperíodo diurno dos mosquitos para maximizar a taxa de resposta.

2. Opto-termociclador

  1. Montagem dos componentes do ensaio
    1. Confeccione as placas de acrílico para conter os mosquitos (Figura 2). Consulte Figura 2A para um diagrama, Figura 2B para os componentes eletrônicos, e Figura 2C para uma imagem da placa de acrílico. Consulte os arquivos em (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) para obter os modelos.
      1. Para criar as paredes, corte a laser uma chapa de acrílico de 3 mm em quatro retângulos de 10 cm por 1 cm e seis retângulos de 7 cm por 1 cm. Fixe os retângulos com cola de acrílico em uma matriz de cinco por três, onde cada unidade é uma câmara de 17 mm por 17 mm por 10 mm. O modelo para essas peças está no arquivo “14_animal_thick_v3.ai”.
        ​ATENÇÃO: A cola de acrílico é inflamável e pode causar irritação respiratória e nos olhos. Deve-se usar EPI adequado ao manusear a cola de acrílico, como luvas, jaleco de laboratório e óculos de proteção, e esse solvente deve ser usado em local bem ventilado, longe de chama aberta.
      2. Para o fundo da câmara, corte uma chapa de acrílico de 1,5 mm de espessura em 6,985 cm por 10,16 cm, removendo o orifício inferior direito. Corte uma chapa de acrílico de 1,5 mm de espessura em um retângulo de 6,985 cm por 10,16 cm para a tampa. O modelo para essas peças é “14_animal_thin_v3.ai”.
    2. Corte uma folha de malha preta resistente à radiação UV no mesmo tamanho da peça de acrílico inferior (Figura 2C). Coloque a malha entre as paredes da placa e a peça inferior, fixando-as com cola de acrílico. Remova a malha do orifício inferior direito para que o furo fique desobstruído.
  2. Construa uma estrutura que sustentará a câmera e os LEDs (Figura 2A).
    1. Monte uma estrutura com quatro colunas em cada canto do termociclador, utilizando trilhos ópticos de construção quadrados de 25 mm e 60,96 cm. Use dois trilhos de construção de 22,86 cm e 25 mm para conectar a coluna frontal direita à coluna traseira direita e a coluna frontal esquerda à coluna traseira esquerda, a 30 cm da bancada.
    2. Conecte as colunas direita e esquerda na frente com um trilho de construção de 30,48 cm e 25 mm, elevado a 24 cm da bancada, e na parte traseira com um trilho de construção de 30,48 cm e 25 mm, elevado a 42 cm da bancada.
    3. Fixe hastes ópticas de 30,48 cm nos trilhos de construção dos lados esquerdo e direito da estrutura. Prenda seis LEDs de 627 nm (vermelhos) conectados em série a 24 cm acima do bloco do termociclador PCR em cada haste.
      NOTA: Embora o comprimento de onda da luz que resulta na atividade máxima do CsChrimson seja de aproximadamente 590 nm, comprimentos de onda próximos de ~625 nm equilibram a necessidade de ativar o CsChrimson e evitar respostas comportamentais à luz em controles genéticos27. Fixe um dissipador de calor e uma lente em cada LED para focalizar a luz em direção ao bloco do termociclador PCR.
    4. Fixe uma haste óptica de 30,48 cm no topo das duas colunas frontais dos trilhos de construção. Use uma braçadeira em ângulo reto no meio da haste óptica para prender uma haste óptica de 15,24 cm voltada para dentro, acima do bloco do termociclador. Fixe uma câmera com filtro passa-alta infravermelho na extremidade, apontando para baixo, a 40 cm acima do bloco.
    5. Utilizando hastes ópticas, monte uma estrutura que se estenda a partir dos trilhos de construção em um retângulo ao redor do bloco PCR, elevado logo acima da superfície. Fixe uma fita de LEDs infravermelhos, voltada para o bloco PCR, para iluminar os mosquitos em ângulo reto em relação à câmera.
      NOTA: A iluminação infravermelha usada para a aquisição de vídeo não aquece significativamente a arena, pois a superfície do termociclador é mantida a 24 °C durante todo o experimento.
    6. Cubra a estrutura com uma cortina opaca para evitar interferência da luz ambiente.
    7. Cubra a superfície e os lados do bloco PCR com uma única camada de fita opaca para criar uma superfície plana e uniforme com fundo escuro.
    8. Coloque o sensor do termopar no bloco PCR no canto inferior direito e fixe-o com fita opaca. Confirme a distribuição uniforme da luz sobre o bloco PCR usando um medidor de potência. Ajuste a tensão ou corrente da fonte de alimentação para entregar luz a 12 µW/mm2.
    9. Na borda do bloco PCR, coloque um LED infravermelho para sincronizar a saída do vídeo com a entrega do estímulo (Figura 2C). Cubra a superfície com fita preta para permitir que a luz seja detectada sem causar reflexo na câmera.
    10. Ligue o termopar, o LED de sincronização e os LEDs de luz vermelha conforme o diagrama na Figura 2B. Baixe o software necessário (SpinView (versão 1.27.0.48), CoolTerm (versão 2.0.1), Arduino IDE (versão 1.8.12)). Baixe o código Arduino e o programa do termociclador do repositório GitHub.
      ​NOTA: O código Arduino é programado para entregar luz vermelha, calor na temperatura corporal e a combinação desses dois estímulos. Existem sete programas de estímulo, com a ordem dos estímulos randomizada entre eles, fornecidos como recursos. Esses programas podem ser modificados para entregar diferentes estímulos. Há nove estímulos por experimento: três de calor apenas, três de luz apenas e três de calor e luz simultaneamente. A entrega do estímulo opera com o Arduino detectando mudanças na temperatura da superfície do bloco PCR por meio do termopar, e então entregando os estímulos luminosos nos momentos especificados. Detalhes adicionais podem ser encontrados nos comentários dentro dos programas de estímulo.
  3. Preparação do ensaio
    1. Crie os mosquitos de acordo com o protocolo de criação optogenética; consulte a seção 1 e Figura 1B.
    2. Dois dias antes do experimento, transfira 14 fêmeas de mosquitos com um aspirador para um recipiente separado. Forneça ATR aos mosquitos conforme o passo 1.6. Se forem comparados múltiplos genótipos, mantenha-os em cegamento para o experimentador.
      ​NOTA: Após receberem ATR, os mosquitos devem ser manuseados em luz fraca.
    3. Um dia antes do experimento (20–24 h), aspire 14 fêmeas de mosquitos por placa de acrílico e anestesie-as a 4 °C. Coloque cuidadosamente um mosquito de cada vez em cada um dos orifícios com uma pena ou aspirador.
    4. Fixe a lateral da placa de acrílico com fita adesiva Scotch para manter a tampa no lugar. Não dobre a fita sobre a parte superior ou inferior da placa de acrílico, pois isso obstruiria a visão da câmera.
    5. Coloque a placa de acrílico sobre três pavios de algodão embebidos com 400 µM de ATR em água destilada (consulte o passo 1.6), dispostos em paralelo. Alinhe cada uma das três fileiras a um pavio para que todos os mosquitos tenham acesso à solução de ATR em água. Coloque a placa de acrílico em uma incubadora escura durante a noite.
  4. Execução do ensaio
    1. Conecte a câmera, os LEDs e o Arduino ao computador. Ligue a fonte de alimentação. Limpe a superfície do opto-termociclador com etanol 70% e deixe secar.
      ​ATENÇÃO: O etanol é inflamável e pode causar séria irritação nos olhos. Deve-se usar EPI adequado ao manusear etanol. Além disso, evite chama aberta.
    2. Utilizando um recipiente escuro, transfira a placa de acrílico com os mosquitos para o centro do bloco PCR. Cubra o opto-termociclador com uma cortina opaca.
    3. Abra o SpinView no computador. Clique no nome da câmera para abrir a visualização da câmera. Conecte as luzes infravermelhas e certifique-se de que o bloco PCR e a placa de acrílico estejam visíveis na visualização da câmera.
    4. Se necessário, ajuste a placa de acrílico para que esteja alinhada, centralizada e o termopar visível no canto inferior direito da placa. Certifique-se de que a luz de sincronização esteja no campo de visão (Figura 2C).
    5. Ajuste as configurações da câmera e no SpinView para garantir um vídeo nítido e recortado mostrando a placa de acrílico. Na aba Image Format, ajuste as opções Width, Height, Offset X e Offset Y para garantir que a placa de acrílico e a luz de sincronização sejam visíveis. Na aba Settings, defina Acquisition Frame Rate Enable como true e Acquisition Frame Rate como 30 fps.
    6. Desligue Exposure Auto e Gain Auto. Ajuste os valores de Exposure Time e Gain para criar um contraste limpo entre o fundo preto e os mosquitos. Clique no botão vermelho de gravação no canto superior direito para abrir uma janela separada para salvar o arquivo de vídeo.
    7. Na janela pop-up, defina o caminho do arquivo no topo: clique em Browse, navegue até a pasta do experimento, clique em New folder e nomeie-a com o nome do ensaio. Defina o número de quadros a serem gravados para o número apropriado para o experimento (por exemplo, 43.500) ou defina como 0 para interromper manualmente a gravação.
    8. Na aba Videos, defina os seguintes campos: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, JPEG Compression Quality: 65. Abra o programa ‘optothermo_lightheat_random1’ no termociclador e inicie-o. O termociclador deve começar em um passo de espera a 25 °C.
    9. Abra o programa correspondente, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino’, no Arduino IDE e faça o upload para a placa. Abra o monitor serial e certifique-se de que a temperatura esteja aproximadamente em 25 °C.
    10. Feche o monitor serial no Arduino IDE. Abra o CoolTerm para iniciar a aquisição da saída do monitor serial do Arduino. Certifique-se de que a porta serial e o canal correspondam aos do Arduino IDE. A saída começa a aparecer na janela do CoolTerm.
    11. Inicie a gravação da saída do Arduino em um arquivo Texto/Binário. Inicie a gravação de vídeo no SpinView. Clique em Resume para encerrar o passo de espera do termociclador. Observe a saída do Arduino no CoolTerm para verificar se a temperatura cai para 18 °C e o contador de estímulos aumenta para 1, iniciando o ensaio. Deixe o ensaio prosseguir até sua conclusão.
  5. Limpeza
    1. Interrompa a gravação de vídeo e a aquisição da saída do CoolTerm. Feche ambos os programas. Encerre o programa do termociclador. Remova a placa de acrílico com os mosquitos do termociclador e coloque-a em um congelador a -20 °C durante a noite para eutanasiar os mosquitos.
      ​ATENÇÃO: Ao eutanasiar mosquitos transgênicos, certifique-se de que permaneçam em um ambiente a -20 °C por pelo menos 24 h antes de descartá-los em um recipiente de resíduos biológicos perigosos para garantir a morte.
    2. Se iniciar outro ensaio, repita a seção 2.3. Desconecte os cabos da câmera e do Arduino. Desligue a fonte de alimentação. Desconecte os LEDs infravermelhos. Limpe as placas de acrílico removendo a fita adesiva Scotch e descartando os mosquitos mortos.
    3. Pulverize a tampa e a placa de acrílico com etanol 70% e limpe cuidadosamente todos os lados dos orifícios e da malha com o dedo usando luva. Enxágue abundantemente com água deionizada e, em seguida, empilhe as placas de acrílico para armazenamento, separando as tampas com uma toalha de papel para evitar arranhões.

3. Ensaio de cobertura sanguínea

  1. Montagem dos componentes do ensaio (Figura 3)
    1. Monte o ensaio do optotermociclador conforme descrito na seção 2.1. Consulte as figuras para o ensaio (Figura 3A), estímulo térmico (Figura 3B) e placa de alumínio (Figura 3C).
    2. Construa uma placa de alimentação com refeição sanguínea de alumínio conforme mostrado na Figura 3C.
      1. Utilizando um cortador a laser ou jato de água, construa a parte superior e inferior da placa. Construa a parte inferior cortando uma chapa de alumínio de 0,8 mm de espessura em 90 mm por 134 mm. Construa a parte superior cortando uma chapa de alumínio de 1,6 mm de espessura em 90 mm por 134 mm. Corte 15 furos retangulares (17,2 mm por 18,6 mm) na placa superior. Os arquivos de modelo podem ser encontrados no repositório GitHub blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) em "Modelos de placa de alumínio".
      2. Insira entre as peças de alumínio uma junta fina de silicone (0,5 mm de espessura) para evitar vazamentos. Corte com cortador a laser para corresponder à forma da placa superior de alumínio.
      3. Fixe as camadas com oito parafusos hexagonais padrão 4–40 de 0,47625 cm com cabeça abobadada. Use um macho de rosca para criar roscas nos parafusos nas peças metálicas. Conecte-os com arruelas redondas e em forma de “W” na parte inferior da placa para maior segurança quando colocada sobre o bloco do termociclador.
    3. Baixe o código Arduino e o programa do termociclador para o ensaio blood blanket no repositório GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. Prepare alíquotas de ATP 20 mM em NaHCO3 25 mM e armazene a -20 ˚C até o uso.
      ​NOTA: Prepare uma solução fresca de ATP a cada seis meses. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Prepare soluções estoque de NaHCO3 1 M e NaCl 5 M (armazene cada uma em temperatura ambiente). O NaHCO3 é estável em solução apenas por 7 dias.
  2. Preparação do experimento
    1. Crie os mosquitos e transfira-os para placas acrílicas conforme descrito nas seções 1 e 2.2. Se forem feitas comparações entre diferentes genótipos, mantenha o experimentador cego quanto à identidade das amostras.
    2. No dia do experimento, prepare uma refeição sanguínea artificial mínima de 10 mL (NaCl 110 mM, NaHCO3 20 mM e ATP 1,5 mM) adicionando 750 µL de ATP 20 mM, 220 µL de NaCl 5 M e 200 µL de NaHCO3 1 M a 8,83 mL de água deionizada. Misture bem invertendo o tubo.
      NOTA: Prepare a refeição sanguínea artificial fresca antes de cada experimento.
    3. Configure a gravação no SpinView conforme os passos 2.3.4 a 2.3.8.
    4. Abra o arquivo Arduino “Red-light-Only__BB_.ino” (ou o arquivo de estímulo desejado) para o experimento.
  3. Execução dos ensaios
    1. Pipete 650 µL da refeição sanguínea artificial mínima em cada poço da placa, garantindo que a refeição preencha completamente cada poço sem transbordar.
    2. Estique um quadrado de parafina de 10,2 cm por 10,2 cm sobre um anel de 20,3 cm de diâmetro. Coloque a parafina sobre a placa, pressionando as bordas até aderir. Com um bisturi, corte uma borda de 1,3 cm ao redor da placa e dobre o excesso de parafina por baixo para selar a refeição.
    3. Coloque a placa diretamente sobre o bloco do PCR para permitir máxima transferência de calor (Figura 3A).
      NOTA: Fita preta é usada na superfície do bloco do PCR para o optotermociclador, mas não para o blood blanket.
    4. Coloque o termopar sobre a superfície da parafina no canto inferior direito da placa de alumínio. Conecte a câmera, LEDs e Arduino ao computador. Ligue a fonte de alimentação. Inicie o programa “BB_thermocycler_program.x50prog” no termociclador.
      NOTA: A taxa de variação de temperatura é a velocidade máxima de rampa do termociclador, escolhida para imitar melhor o pouso de um mosquito sobre um hospedeiro para alimentação.
    5. Utilizando um recipiente escuro e luz ambiente reduzida para minimizar a exposição à luz, transfira a placa acrílica de mosquitos para a placa de alumínio, garantindo que cada poço esteja alinhado com os mosquitos. Certifique-se de que o termopar esteja no canto inferior direito da placa e em contato com a parafina para medir a temperatura da refeição sanguínea artificial.
    6. Inicie o programa reenviando o programa “Red-light-Only__BB_.ino” no IDE Arduino. Feche o monitor serial. No CoolTerm, pressione Conectar para visualizar a temperatura atual. A partir dessa temperatura inicial, ajuste a temperatura de gatilho no script Arduino para aproximadamente 0,6 °C abaixo dela.
    7. Na janela do CoolTerm, selecione Capturar em Arquivo de Texto/Binário e inicie a coleta de dados. Inicie a gravação de vídeo na janela de gravação no SpinView. Clique em Retomar para encerrar a pausa do termociclador. Observe a saída do Arduino no CoolTerm para garantir que a queda de temperatura foi detectada e que o ensaio foi iniciado.
    8. Após o tempo do ensaio, clique em Parar Gravação. No CoolTerm, na aba Capturar em Arquivo de Texto/Binário, selecione Parar a escrita da saída serial.
    9. Remova a placa de mosquitos da placa blood blanket e transfira-os para a câmara fria para anestesiá-los. Conte o número de mosquitos com abdômen aumentado que contêm a refeição sanguínea artificial como saciados, incluindo aqueles que se alimentaram parcialmente.
    10. Entre os ensaios, limpe a superfície do bloco do PCR passando um lenço de papel umedecido com etanol 70%. Remova a parafina e enxágue a placa de alumínio com água deionizada. Repita a seção 3.3 para ensaios posteriores. Altere a ordem dos ensaios entre os dias para minimizar o efeito dos ciclos de atividade circadiana.
  4. Limpeza final
    1. Encerre todos os programas e saia. Desconecte os cabos USB da câmera, Arduino e luzes infravermelhas. Desligue o computador. Pare o programa “thermocycler_program.x50prog” em execução no termociclador.
    2. Coloque as placas de mosquitos no congelador a -20 °C durante a noite para matar os mosquitos. Lave a placa de alumínio com água deionizada. Enxágue a placa acrílica com etanol 70%, depois enxágue com água deionizada e deixe secar durante a noite antes de carregar novos mosquitos.
      NOTA: As placas devem ser secadas durante a noite após a lavagem para garantir que não reste umidade. Se houver umidade, isso causará condensação na tampa e interferirá na gravação de vídeo.

4. Ensaio de alimentação com optomembrana

  1. Montagem dos componentes do ensaio (Figura 4)
    1. Monte uma estrutura utilizando componentes optomecânicos e uma plataforma acrílica preta de 30,48 cm por 30,48 cm e 0,635 cm de espessura. Crie um orifício no centro da acrílica com diâmetro de 11,43 cm utilizando um cortador a laser. Faça orifícios a 2,54 cm de cada canto para permitir que a acrílica repouse sobre os suportes da estrutura, aproximadamente 23,495 cm acima da base.
    2. No centro, fixe um anel acrílico preto com diâmetro interno de 19,05 cm e diâmetro externo de 20,32 cm (Figura 4A). Os modelos para todos os componentes acrílicos estão disponíveis no repositório GitHub do alimentador optomembrana (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0), juntamente com os programas Arduino. Veja a figura para a configuração geral (Figura 4A), estímulo (Figura 4B), diagrama do circuito (Figura 4C) e imagem fixa de vídeo (Figura 4D).
      ​NOTA: Os materiais específicos utilizados para montar esta plataforma não são críticos, podendo haver opções mais econômicas.
    3. Fixe uma câmera com filtro infravermelho passa-alta abaixo do orifício central, apontando para cima, em direção ao compartimento dos mosquitos. Ajuste a abertura para ficar totalmente aberta, permitindo foco seletivo na parte superior em malha do compartimento (Figura 4A).
    4. Para fabricar os compartimentos, corte um tubo transparente de policarbonato com diâmetro de 11,43 cm em segmentos cilíndricos de 12,7 cm.
      1. Faça as bases dos compartimentos cortando círculos com diâmetro de 11,43 cm em acrílico transparente de 0,3175 cm de espessura com laser. As bordas dos círculos são gravadas a laser para que fiquem encaixadas no tubo. Fixe-os aos tubos com epóxi plástico.
      2. Crie uma tampa encaixada utilizando acrílico preto de 0,635 cm e 0,3175 cm e malha preta resistente à radiação UV. O anel interno tem diâmetro de 10,795 cm, enquanto o anel externo tem diâmetro de 12,065 cm, com a malha preta esticada sobre o anel menor. A malha deve ser costurada através de orifícios cortados a laser com linha encerada.
        ​NOTA: Os compartimentos devem sempre ser colocados sobre toalhas de papel para evitar arranhões na base acrílica através da qual o vídeo é gravado.
    5. Construa recipientes acrílicos para entrega da refeição sanguínea (Figura 4A).
      1. Corte um anel com diâmetro interno de 5,08 cm e diâmetro externo de 6,6 cm em acrílico transparente de 0,15875 cm. Fixe-o a outro anel transparente com diâmetro interno de 5,842 cm e diâmetro externo de 6,604 cm utilizando cola acrílica.
      2. Coloque um cilindro de malha metálica com altura de 13,97 cm e diâmetro de 19,05 cm dentro do anel acrílico preto no centro da plataforma.
      3. Dentro da malha metálica, fixe uma bobina de luzes LED RGB espaçadas 3,81 cm da parte externa do compartimento, controladas por uma placa Arduino Uno, que repousa sobre a plataforma acrílica preta (Figura 4C).
      4. Utilizando um medidor de potência, meça a intensidade luminosa em toda a parte interna do cilindro e ajuste a posição das luzes para que a arena seja iluminada entre 3,5–6 µW/mm2. Fora da malha metálica, fixe um anel de LEDs infravermelhos de 850 nm à estrutura com braçadeiras plásticas, voltados para dentro.
    6. Conecte um cabo USB à placa Arduino Uno e ligue ao computador. Conecte um cabo USB da câmera ao computador. Desligue a conexão com a internet.
    7. Coloque a estrutura optomembrana em um incubador escuro ou sala ambiental a 26 °C e 80% de umidade relativa durante toda a duração dos experimentos.
  2. Preparação dos compartimentos de mosquitos
    1. Antes do experimento, lave os compartimentos de mosquitos borrifando etanol a 70% e limpando suavemente com uma esponja macia. Enxágue os compartimentos com água desionizada e deixe secar ao ar durante a noite.
    2. Dois dias antes do experimento, separe mosquitos machos e fêmeas sob anestesia a frio e coloque 20 fêmeas em cada compartimento. Forneça acesso ao ATR conforme o passo 1.6.
    3. Neste momento, os genótipos devem ser mascarados para o pesquisador. A ordem dos ensaios deve ser rotacionada entre os dias para minimizar diferenças nos resultados comportamentais devido ao horário experimental.
  3. Execução dos ensaios
    1. Para preparar a refeição sanguínea, coloque frascos de 119 mL de água em um banho térmico a 45 °C, um para cada ensaio. Este volume e temperatura mantêm a refeição sanguínea próxima à temperatura corporal durante todo o experimento.
    2. Prepare alíquotas de 5 mL de sangue ovino desfibrinado. Armazene a 4 °C e inverta antes do uso para evitar separação. Prepare a refeição sanguínea fresca antes de cada experimento.
      CAUTELA: Manipule o sangue ovino desfibrinado utilizando EPI adequado para minimizar a exposição a patógenos. Materiais reutilizáveis que entram em contato com sangue devem ser imersos em água sanitária a 10% e enxaguados com água DI. Como a água sanitária pode causar irritação grave na pele e nos olhos, EPI apropriado deve ser usado durante toda a manipulação.
    3. Coloque a primeira alíquota de sangue no banho térmico a 45 °C por pelo menos 20 minutos antes do ensaio. Deixe o ATP descongelar em gelo. Estique um quadrado de parafilm de 5,08 cm por 5,08 cm sobre a tampa acrílica no lado com o círculo maior e plano, criando um reservatório para a refeição sanguínea (Figura 4A).
    4. Limpe o computador com etanol a 70% para remover odores humanos. Conecte o computador a um disco rígido externo. Conecte a câmera e o Arduino. Ligue as luzes RGB e infravermelhas à fonte de energia.
    5. Abra o software SpinView e o arquivo Arduino para o estímulo apropriado. Crie uma pasta no disco rígido externo para armazenar os dados do experimento. Faça o upload do arquivo Arduino “blue_only.io” para fornecer uma luz azul fraca de 471 nm dos LEDs RGB para a arena (conforme Figura 4B).
    6. Sem expor os mosquitos ao excesso de CO2 da respiração, examine o compartimento do ensaio e registre quaisquer mortes antes do experimento. Coloque o compartimento no centro e permita a aclimatação sob luz azul fraca por 10 a 20 minutos antes da exposição ao estímulo.
      ​NOTA: O passo de aclimatação e o experimento são realizados sob luz azul fraca porque a escuridão total inibe o voo dos mosquitos.
    7. Habilite a captura de vídeo
      1. No programa SpinView, selecione a câmera. Na aba Configurações, ajuste a exposição e o ganho conforme necessário para manter alto contraste entre os insetos de cor clara e o fundo escuro (Figura 4D).
      2. Clique no botão vermelho de gravação na barra superior para ajustar as configurações de captura de vídeo. Defina o caminho do arquivo clicando em Procurar, depois navegue até o disco rígido externo. Crie uma nova pasta com um nome descritivo para cada ensaio. Não inclua espaços no nome da pasta.
      3. Na aba Opções de salvamento, selecione Capturar 0 quadros, o que permitirá que o vídeo grave até ser interrompido manualmente. Em Modo de gravação, selecione Buffered. Na aba Vídeos, defina os seguintes campos: Tipo de gravação de vídeo: MJPG, Tamanho de divisão do arquivo de vídeo: 1000 MB e Qualidade de compressão JPEG: 65.
    8. Imediatamente antes da exposição ao estímulo, pipete 500 µL de ATP 20 mM, para uma concentração final de 2 mM ATP, na alíquota de sangue de 5 mL previamente preparada. Inverta o tubo várias vezes para misturar.
    9. Despeje a solução de sangue com ATP no recipiente da refeição sanguínea. Sobre a refeição sanguínea, coloque um frasco de 119 mL invertido cheio com água a 45 °C para manter a temperatura do sangue próxima à temperatura corporal humana durante todo o experimento.
    10. No software SpinView, selecione Iniciar gravação. Sem estimular os mosquitos com a respiração, coloque a refeição sanguínea sobre a tampa em malha do compartimento para que os mosquitos possam perfurar a membrana de parafilm através da malha.
    11. Faça o upload do programa Arduino para “1sON_10sOFF.io” (Figura 4B), ou o estímulo desejado. Isso fornecerá 1 s de luz vermelha de 624 nm a cada 10 s, até que o arquivo “blue_only.io” seja carregado manualmente. O comprimento de onda de 624 nm é suficiente para ativar optogeneticamente o CsChrimson.
    12. Coloque a alíquota de sangue no banho térmico para o próximo ensaio. Após o ensaio ter durado 15 minutos, selecione Parar gravação. Faça o upload do arquivo “blue_only.io” para interromper o estímulo de luz vermelha.
    13. Remova o suporte da refeição sanguínea e a garrafa de água. Remova o compartimento e anestesie os mosquitos a 4 °C. Para realizar ensaios adicionais, retorne à seção 4.3. Examine visualmente os mosquitos anestesiados para determinar e registrar o número que se alimentou de sangue, identificando o abdômen cheio de sangue.
  4. Limpeza
    1. Feche todos os programas. Ejecte o disco rígido externo e desconecte-o do computador. Desligue o computador.
    2. Limpe os compartimentos de mosquitos conforme descrito anteriormente no passo 4.2.1. Limpe os suportes acrílicos da refeição sanguínea. Encha uma bandeja de policarbonato de tamanho médio até 2/3 com água e adicione 100 mL de água sanitária.
    3. Adicione os suportes acrílicos da refeição sanguínea e garrafas plásticas à bandeja. Cubra com uma tampa e deixe de molho por 10 minutos. Enxágue a água sanitária e remova o parafilm. Escove suavemente e enxágue para remover quaisquer resíduos de sangue.

5. Análise do comportamento

  1. Prepare os vídeos para análise comprimindo-os em arquivos .mp4 usando o ffmpeg (versão 8.0.1). Se os arquivos de vídeo estiverem divididos, una-os em um único vídeo usando qualquer software de edição de vídeo. Abra os vídeos de treinamento no SLEAP (versão 1.4.1) em escala de cinza.
    ​NOTA: Se as configurações de gravação de vídeo forem adequadas, tudo deverá estar dentro do quadro, e os mosquitos em movimento não devem ficar desfocados. Outros softwares de rastreamento de partes do corpo podem ser utilizados. A versão do SLEAP usada neste artigo é a 1.4.1. Consulte a documentação do SLEAP para protocolos atualizados.
  2. Crie um esqueleto que identifique as partes relevantes dos animais de acordo com os comportamentos avaliados (Figura 2D, Figura 3D e Figura 4E).
  3. Usando a opção “Quadro aleatório” na aba Quadro sugerido, selecione aleatoriamente 10 quadros e identifique cada mosquito como uma instância. Se certas partes do mosquito estiverem obstruídas (por exemplo, a ponta da probóscide inserida na malha durante a sondagem), marque a localização aproximada da parte do corpo. Treine um modelo nos quadros identificados com estas configurações
    1. Para um modelo multi-animais de cima para baixo (usado para o opto-termociclador e o cobertor de sangue): Na aba Pipeline de treinamento, defina Máx. de instâncias como 14. Na aba Configuração do Modelo de Centróide, defina Tamanho do recorte como Automático, defina Delta mínimo de platô. Delta como 1e-04, defina Tempo de espera do platô como 10, defina Espaçamento como 8 e a Parte de referência como tórax.
    2. Para um modelo multi-animais de baixo para cima (usado para o alimentador de membrana óptico): Na aba Pipeline de treinamento, defina Máx. de instâncias como sem limite. Na aba Configuração do Modelo de Baixo para Cima, defina Tamanho do recorte como Automático, defina Delta mínimo de platô. Delta como 1e-04, defina Tempo de espera do platô como 10 e defina Espaçamento como 16.
  4. Realize previsões em um número definido de quadros com estas configurações: Na aba Pipeline de inferência, para o opto-termociclador e o cobertor de sangue, defina Máx. de instâncias como 14, Rastreador como Simples, Número máximo de trilhas como 14 e Conectar quebras de trilha única como Verdadeiro.
  5. Para o alimentador de membrana óptico, defina Sem limite para Máx. de instâncias e Número máximo de trilhas, Rastreador como Simples e Conectar quebras de trilha única como Verdadeiro. Corrija os quadros previstos e retreine. Repita ciclos de previsão, identificação e treinamento no conjunto de dados de treinamento.
    NOTA: A validação foi realizada por meio de verificações aleatórias visuais em quadros identificados e identificação de erros consistentes (por exemplo, detecções falsas de mosquitos, previsões duplicadas, orientação incorreta ou atribuições incorretas de partes do corpo), com foco em quadros contendo esses casos extremos. Até 150 quadros identificados podem ser necessários, dependendo da frequência de erros. O SLEAP também fornece métricas de avaliação baseadas em interface gráfica para validação adicional do modelo. Após a inspeção visual confirmar precisão e exatidão suficientes, aplique o modelo aos vídeos experimentais e exporte os resultados como .csv ou .h5 para análise de comportamento. Classificadores de comportamento podem então ser treinados usando as saídas da estimativa de postura, conforme descrito anteriormente8. Os comportamentos são definidos da seguinte forma: caminhando, movimento corporal translacional com movimento das pernas; voando, movimento translacional rápido com asas estendidas; higiene, movimentos repetitivos das pernas sobre partes do corpo (antenas, probóscide, asas ou pernas); e sondagem, inserção da probóscide através da malha na parte inferior do recipiente. Os classificadores de comportamento devem atingir precisão >90% em comparação com anotações humanas.
  6. Realize análise estatística escolhendo testes não paramétricos, já que os dados normalmente não seguem distribuição normal. Realize os testes pós-hoc apropriados com correção para comparações múltiplas. Para dados de ingurgitamento, as réplicas experimentais são grupos de mosquitos, enquanto para dados de comportamento, as réplicas são mosquitos individuais.

Resultados

Três ensaios comportamentais foram utilizados para observar os comportamentos de busca por hospedeiro e alimentação sanguínea em mosquitos, conforme mostrado na Figura 1A. Os mosquitos foram criados sob um ciclo claro-escuro com luz azul (14:10 LD; Figura 1B) para sincronizar os ritmos circadianos, permitindo que os experimentos fossem realizados durante os períodos de vigília. Dois dias antes dos experimentos, os mosquitos foram transferidos para escuridão total e receberam o cofator da opsina ATR. Se os mosquitos estiverem assíncronos ou não receberem ATR, apresentarão baixa atividade nos ensaios comportamentais. Os genótipos utilizados em cada ensaio foram Gr3>CsChrimson e duas linhagens genéticas controle: a linhagem controladora Gr3-QF2 e a linhagem efetora QUAS-CsChrimson.

O ensaio com o opto-termociclador (Seção 2) permite avaliar o comportamento de ativação e sondagem de mosquitos durante longos períodos em resposta a estímulos térmicos e luminosos. A aplicação de calor simula a aproximação do mosquito a um hospedeiro de sangue quente, enquanto a exposição luminosa de 5 segundos simula uma longa expiração de ar.33. O uso de um termociclador permite um aquecimento e resfriamento superficiais rápidos, sincronizados com a ativação optogenética por meio de um termopar e um microcontrolador (Figura 2A, B). Os três genótipos de mosquito foram colocados em placas de acrílico com poços isolados com fundos em malha nos quais exibem comportamento de locomoção, voo e sondagem (Figura 2C). A posição das partes do corpo do mosquito foi detectada usando algoritmos de rastreamento de postura, como o SLEAP34  e DeepLabCUT35 (Figura 2D, E). Algoritmos de classificação de comportamento podem ser utilizados a partir do rastreamento de postura (por exemplo, SimBA36, A-SOiD37) ou de vídeo (por exemplo, FERAL38) entrada. Figura 2E mostra as etiquetas do SLEAP durante voos, caminhadas e sondagens, comportamentos essenciais de busca de hospedeiro e alimentação. Esses comportamentos podem ser classificados pela velocidade do tórax e pela distância entre a base e a ponta do probóscide. Aqui, é apresentada a saída do rastreamento comportamental utilizando APT e JAABA39. Os mosquitos foram expostos a um aumento de temperatura, a um estímulo luminoso ou a ambos os estímulos (temperatura e luz) simultaneamente, seguidos por um intervalo de 20 min antes do próximo estímulo8. (Figura 2F). Quando expostos ao calor, os três genótipos exibem um curto período de sondagem (Figura 2G). Importante, quando expostos a um estímulo luminoso de 5 segundos, os Gr3>CsChrimson os mosquitos tornam-se excitados ou "ativados", exibindo aumento do comportamento de caminhada e voo que dura até 10–15 min. Os mosquitos também exibem sondagem, definida como a inserção repetida do probóscide no fundo em malha das placas. Os dados foram representados como comportamento individual de mosquitos (Figura 2G) e proporção de todos os mosquitos que exibem cada comportamento ao longo do tempo (Figura 2H). O optotermociclador permite estímulos ópticos e térmicos precisos e repetidos em múltiplos indivíduos, tornando-se uma ferramenta útil para o estudo da ativação e investigação do comportamento.

O ensaio de cobertor de sangue (Seção 3) baseia-se no ensaio de termociclador óptico, mas fornece uma refeição sanguínea artificial mínima e palatável, permitindo quantificar a fagocitose pelos mosquitos (Figura 3A). Um pulso de luz vermelha de 5 segundos (~627 nm) foi aplicado para ativar optogeneticamente os neurônios sensoriais de CO2, e a camada fina da refeição sanguínea artificial foi aquecida de 25 °C a ~35 °C (medido na superfície por um termopar; Figura 3B). Os três genótipos foram expostos individualmente a uma refeição sanguínea artificial em uma placa de alimentação de alumínio (Figura 3C). Mosquitos Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e Gr3>CsChrimson (n = 10 ensaios por grupo genético, 14 mosquitos cada) foram expostos individualmente a uma refeição sanguínea artificial em uma placa de alimentação de alumínio (Figura 3C). Para medir a fagocitose dos mosquitos ao longo do tempo durante o experimento, utilizou-se o SLEAP para rastrear pontos no corpo do mosquito. Isso foi feito criando um esqueleto que incluía 5 nós no abdômen do mosquito (Figura 3D). Ao final de cada ensaio, o número de mosquitos fagocitados foi contado manualmente. As linhagens de mosquitos controle, Gr3-QF2 e QUAS-CsChrimson, demonstraram uma fagocitose média semelhante (Figura 3E, p = 0,401). Em contraste, a linhagem Gr3>CsChrimson apresentou taxas significativamente maiores de alimentação, com uma taxa média de fagocitose de 53% (Figura 3E, p = 0,00078 em comparação com Gr3-QF2 e p = 0,00097 em comparação com QUAS-CsChrimson). Os dados foram representados graficamente como gráficos de violino e boxplots (mediana, intervalo interquartílico e amplitude) e analisados utilizando o teste de Kruskal-Wallis e o teste de Dunn com correção de Holm em um limiar de significância de p < 0,05. A fagocitose individual ao longo do tempo foi identificada como a variação na área abdominal delimitada por 5 nós (Figura 3F). Esses resultados demonstram que o ensaio de cobertor de sangue pode ser utilizado para avaliar os efeitos da ativação optogenética de populações neuronais responsivas ao CO2 no comportamento de fagocitose de mosquitos em uma refeição sanguínea artificial.

O ensaio de alimentação por membrana com estímulo óptico (Seção 4), no qual mosquitos têm acesso a uma refeição de sangue aquecido em uma arena cilíndrica, permite o estudo da atração do mosquito por uma fonte de sangue e sua alimentação. Para determinar se a ativação optogenética dos neurônios sensoriais de CO2 é suficiente para provocar atração e alimentação em uma fonte de sangue, mosquitos Gr3>CsChrimson e controles (n = 10 para cada genótipo, onde n representa o número de ensaios realizados, com 20 mosquitos por recipiente por ensaio) tiveram acesso a uma refeição de sangue aquecido no alimentador por membrana com estímulo óptico, sob exposição a pulsos repetidos de luz vermelha intensa de 1 segundo a cada 10 segundos, durante 15 minutos (Figura 4B). Para medir a atração ao alimentador por membrana, foi utilizado um modelo SLEAP com três pontos para rastrear a cabeça, o tórax e o abdômen dos mosquitos pousados, contando aqueles localizados na região de interesse (Figura 4D, Figura 4E). Mosquitos Gr3>CsChrimson mostraram aumento na atração pela região da refeição de sangue ao longo do tempo em comparação com o controle Gr3-QF2 (Figura 4F, p = 0,027). Os mosquitos Gr3>CsChrimson não apresentaram atração estatisticamente maior do que o controle QUAS-CsChrimson (Figura 4F, p = 0,310). Os grupos de significância foram determinados pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn com correção de Holm. O limiar de significância foi definido em p < 0,05. Os dados foram representados como a porcentagem média de mosquitos atraídos para a refeição de sangue, com a região sombreada indicando o erro padrão. Os genótipos controle Gr3-QF2 e QUAS-CsChrimson apresentaram taxas semelhantes de alimentação, de 26% e 29%, respectivamente, pontuadas manualmente conforme descrito (Figura 4G, p = 0,351). Em contraste, os mosquitos Gr3>CsChrimson demonstraram uma taxa significativamente maior de alimentação do que qualquer um dos controles, com média de 61% (Figura 4G, p < 0,001 em comparação com Gr3-QF2 e p = 0,002 em comparação com QUAS-CsChrimson). Os dados foram representados em gráficos de violino e boxplots (mediana, intervalo interquartil e amplitude) e analisados utilizando o teste de Kruskal-Wallis e o teste de Dunn com correção de Holm, com limiar de significância de p < 0,05. Esses resultados indicam que o ensaio de alimentação por membrana com estímulo óptico é um método viável para avaliar os efeitos da ativação optogenética dos neurônios de CO2 sobre a atração e alimentação de mosquitos em uma refeição de sangue.

Gráfico do ensaio de comportamento de mosquito; métodos: optotermociclador, cobertor de sangue; estímulos: calor, CO2.
Figura 1: Ensaios e criação de mosquitos para experimentos de optogenética. (A) Esquema dos comportamentos de busca de hospedeiro em mosquitos, com as características dos ensaios comportamentais apresentados. Os estágios da busca de hospedeiro medidos por cada ensaio comportamental são indicados pelas barras cinzas. (B) Cronograma de criação de mosquitos para experimentos de optogenética. A Figura 1 foi criada pelos autores para esta publicação utilizando o Adobe Illustrator, e nenhuma licença é necessária para seu uso. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Comportamento de mosquito, termociclador infravermelho, configuração com LED-luz vermelha, análise de gráfico, resposta ao estímulo.
Figura 2: O opto-termociclador quantifica comportamentos de ativação e busca durante a ativação optogenética. (A) Esquema do ensaio com opto-termociclador, composto por uma placa de mosquitos sobre o bloco de um termociclador de PCR com LEDs superiores e uma câmera. (B) Diagrama do circuito do microcontrolador que detecta a temperatura do termociclador e controla os LEDs. O diagrama do circuito foi criado com o Fritzing sob licença CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Esta licença também permite o reuso completo da imagem, desde que o crédito adequado seja atribuído. (C) Imagem fixa do ensaio mostrando a placa de acrílico que comporta até 14 mosquitos. O termopar está localizado no poço inferior direito. (D) Esqueleto do mosquito utilizado no modelo SLEAP para estimar poses. Os pontos rotulados no corpo incluem: a ponta e a base da probóscide, usados para detectar o comportamento de sondagem (mostrados em vermelho); as patas dianteiras, onde se ligam ao tórax, onde o fêmur se une à tíbia e onde a tíbia se une ao tarso (mostrados em azul); e a ponta do abdômen (mostrada em amarelo). Foi utilizado um modelo multi-animais em vista superior. Estimadores de pose e classificadores comportamentais foram usados para quantificar a ativação e o comportamento de sondagem dos mosquitos. (E) Exemplos de caminhada, voo e sondagem de mosquitos, com as previsões do SLEAP sobrepostas. Caminhada e voo são usados como métricas comportamentais de ativação. (F) Saída da entrega do estímulo. Linhas onduladas amarelas indicam estímulos térmicos de temperatura corporal, e LEDs vermelhos indicam estímulos de luz vermelha. (G) Etogramas dos comportamentos de caminhada, voo e sondagem em mosquitos Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e Gr3>CsChrimson (n = 22–23 mosquitos individuais por genótipo) após a entrega do estímulo. (H) Comportamento de longa duração após a ativação optogenética em mosquitos Gr3>CsChrimson (n = 68–70 mosquitos individuais). Os painéis da figura A–E foram criados pelos autores para esta publicação usando o Adobe Illustrator, e nenhuma licença de direitos autorais é necessária para o uso. Os dados em (F–H) são reproduzidos de Sorrells et al, 2022, com licença CC BY 4.08. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Configuração do experimento de alimentação de mosquitos, gráficos de análise de dados, diagrama da refeição sanguínea artificial, gráfico de temperatura.
Figura 3: O ensaio do cobertor sanguíneo quantifica a alimentação em resposta à ativação optogenética. (A) Esquema do ensaio do cobertor sanguíneo. O mosquito é mantido em uma gaiola de acrílico onde uma refeição sanguínea artificial está disponível sob uma tela de malha. (B) Registro da temperatura e do estímulo de luz vermelha provenientes do ensaio. (C) Esquema da montagem da placa de alimentação em cobertor sanguíneo de alumínio. (D) O esqueleto SLEAP utilizado para estimativa de postura incluía os pontos descritos na Figura 2D, além de quatro pontos ao longo dos lados do abdômen, onde este se encontra com o tórax e nas bordas da parte mais espessa do abdômen. A alimentação foi medida como a área delimitada pelos cinco pontos ao longo do perímetro abdominal, utilizando previsões de um modelo multi-animais com visão superior. (E) Gráfico de violino que mostra a porcentagem média de alimentação na refeição sanguínea artificial por genótipo (n = 10 ensaios com 14 mosquitos por ensaio para cada genótipo). A significância foi determinada utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn com correção de Holm. Letras diferentes indicam significância de p < 0,05 entre os grupos, sendo que grupos com a mesma letra não diferem significativamente entre si. (F) Alimentação ao longo do tempo em um animal Gr3>CsChrimson, medida pela área abdominal. A linha de tendência vermelha exibe uma janela deslizante de 30 segundos ao longo de oito minutos do ensaio, com x = 0 marcando o momento em que a alimentação começa. Todos os esquemas da Figura 3 foram criados pelos autores para esta publicação utilizando o Adobe Illustrator, e nenhuma licença de direitos autorais foi necessária para seu uso. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Montagem de optogenética em mosquitos; controle de luz RGB; Arduino; refeição sanguínea; gráfico de porcentagem de atração; resultados.
Figura 4: O ensaio com alimentador óptico em membrana mede atração e alimentação sanguínea. (A) Esquema do alimentador óptico em membrana com os componentes individuais. (B) Linha do tempo dos ensaios experimentais. A linha azul representa luz azul fraca durante todo o período de aclimatação e experimento. Um segmento do estímulo experimental é mostrado, representando pulsos de 1 segundo de luz vermelha espaçados por 10 s. (C) Diagrama que ilustra a fiação do alimentador óptico em membrana. O diagrama do circuito foi criado com o Fritzing sob licença CC-BY pelos autores. (D) Quadro exemplo do vídeo do alimentador óptico em membrana. Os mosquitos dentro do círculo vermelho são contados para determinar a porcentagem de atração. (E) Exemplos de um mosquito não alimentado e um mosquito saciado, com cabeça, tórax e abdome identificados pelo modelo de rastreamento SLEAP para o alimentador óptico em membrana. Um modelo SLEAP multi-animais de baixo para cima foi utilizado para medir a atração à região de interesse onde a refeição sanguínea é colocada. (F) Gráfico de linhas mostrando a porcentagem média de ocupação na região da refeição sanguínea (usada como métrica comportamental de pouso) ao longo do tempo, por genótipo (n = 10 ensaios com 20 mosquitos por genótipo). A média é plotada a cada 30 s. As áreas sombreadas representam o erro padrão. A significância foi determinada pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn com correção de Holm. Letras diferentes representam grupos significativos; o limiar foi definido como p < 0,05. (G) Gráfico de violino mostrando a porcentagem média de saciação com refeição sanguínea por genótipo. Em (F, G), a significância foi determinada pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn com correção de Holm. Genótipos listados com a mesma letra não diferem significativamente entre si. O limiar de significância é definido como p < 0,05. A Figura 4 foi criada usando o Adobe Illustrator, seus dados foram coletados pelos autores para esta publicação, e nenhuma licença de direitos autorais foi necessária para seu uso. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo descreve protocolos detalhados para avaliar a suficiência de tipos celulares neuronais em induzir etapas na atração do hospedeiro e na picada. O comportamento de picada consiste em uma série de etapas comportamentais, desde a detecção em longa distância até a atração em curta distância, perfuração da pele e saciedade. Em princípio, os tipos neuronais poderiam controlar ações ou etapas específicas, direcionar o comportamento para sequências específicas, aumentar a duração de todo o comportamento ou desempenhar muitas outras funções. Assim, os múltiplos ensaios apresentados são necessários para dissecar a função neuronal nesse processo.

Vários erros comuns podem resultar em respostas inadequadas dos mosquitos nestes ensaios. A baixa atividade e alimentação podem ser evitadas realizando os experimentos durante o período de maior atividade dos mosquitos, próximo aos momentos de transição entre os ciclos de luz e escuro nas câmaras de incubação. Taxas baixas de alimentação no coletor de sangue e no alimentador óptico-membranoso podem ser causadas por uma refeição artificial de sangue de baixa qualidade ou temperatura incorreta. Certifique-se de que todos os reagentes (NaHCO3, ATP, sangue de ovelha defibrinado) não estejam vencidos e sejam armazenados adequadamente. Recomenda-se que todas as soluções sejam preparadas no dia do experimento para garantir a máxima frescor. Certifique-se de que a placa do coletor de sangue entre em contato direto com a superfície do bloco do termociclador PCR. As placas do termociclador óptico e do coletor de sangue podem acumular condensação se houver umidade residual. Antes dos experimentos, coloque as placas sobre toalhas de papel para absorver qualquer umidade. Ao observar uma resposta optogenética fraca, certifique-se de que os mosquitos tenham pelo menos uma semana de idade e recebam tempo adequado para se alimentar de ATR, pois este é um cofator químico essencial para os canais CsChrimson.

Ferramentas optogenéticas foram desenvolvidas que são sensíveis a comprimentos de onda desde o azul (~450 nm) até o vermelho (~650 nm), abrangendo o espectro visível. A luz vermelha é particularmente útil em insetos, pois eles geralmente apresentam baixa sensibilidade e/ou respostas comportamentais a esses comprimentos de onda40Curiosamente, os mosquitos mostram atração durante o voo por manchas de estímulos visuais com comprimentos de onda longos presentes nos tons de pele humana41. Assim, o uso de luz vermelha poderia ser uma limitação que confunde a interpretação da ativação optogenética em ensaios de atração a hospedeiros em mosquitos. No entanto, genético controle os mosquitos apresentaram respostas mínimas à luz vermelha amplamente aplicada, mesmo em intensidades elevadas (Figuras 2–4). Recomenda-se o uso de controles genéticos que carecem da construção do ativador ou do efetor, bem como controles sem luz, para garantir uma interpretação precisa dos efeitos comportamentais. Um controle que falta o cofator rodopsina ATR é frequentemente utilizado em experimentos de optogenética em outras espécies; no entanto, o alimento fornecido às larvas de mosquito contém vitamina A, o precursor do ATR, tornando esse controle menos eficaz neste sistema.

Os estímulos optogenéticos apresentados aqui limitam-se a estímulos contínuos de intensidade luminosa ajustável. Estímulos optogenéticos que reproduzem de perto os padrões naturais de atividade neuronal têm maior probabilidade de provocar o comportamento de interesse. Portanto, se houver registros neurais disponíveis, o estímulo pode ser projetado para corresponder à intensidade observada e à dinâmica temporal. Quando isso não é conhecido, a função dos neurônios pode ser investigada usando diferentes estímulos e contextos comportamentais, com a ressalva de que os resultados podem não refletir a função dos neurônios em comportamentos naturalísticos. Contudo, induzir atividade neuronal fora da faixa natural pode ser usado para investigar circuitos ou propriedades comportamentais de maneiras únicas, assim como a eletrofisiologia pode ser usada para investigar propriedades celulares. Atualmente, ferramentas optogenéticas só foram utilizadas em neurônios sensoriais no mosquito, uma aplicação que oferece algumas vantagens em relação à apresentação de estímulos naturais. Estratégias tradicionais para medir a busca do hospedeiro pelo mosquito dependem da liberação de gás CO2 real. O uso de CO2 real exige fluxo de ar que tenha sido filtrado e umidificado, o que requer montagens experimentais complexas para liberar e remover o gás com precisão em curtos intervalos de tempo9,10,42,43. O fluxo de ar e a umidade são ambos sinais que atraem o mosquito e auxiliam na navegação, tornando a entrega optogenética uma abordagem atrativa para estudar os efeitos de estímulos olfativos separadamente desses outros estímulos. Ferramentas optogenéticas também já foram usadas anteriormente para estudar o efeito do sexo e do estado fisiológico sobre o comportamento8, fornecendo insights sobre essas questões importantes na biologia do mosquito.

Além da optogenética, esses protocolos utilizam ensaios padrão que têm sido empregados para avaliar o comportamento de mosquitos e apresentam algumas limitações. Para facilitar a limpeza, a cobertura de sangue faz uso de uma refeição artificial que contém apenas os substâncias gustativas necessárias para que os mosquitos se alimentem até a saciedade. Essa limitação poderia ser superada com o uso de sangue (como no alimentador óptico com membrana) ou materiais biomiméticos que reproduzam aspectos dos tecidos do hospedeiro. O calor no opto-termociclador e na cobertura de sangue é fornecido a mosquitos andando ou parados, e não a mosquitos em voo, sendo limitado pela velocidade de rampa do termociclador de PCR. Portanto, esses ensaios são capazes de detectar comportamentos de sondagem e alimentação até a saciedade, mas não de atração. Outra limitação dos ensaios laboratoriais é que, para compreender o efeito comportamental de estímulos específicos, outros estímulos utilizados pelos mosquitos são excluídos. Ensaios laboratoriais cada vez mais complexos e ensaios semelhantes ao ambiente natural poderiam ser criados para estudar aspectos adicionais dos ambientes naturais nos quais os mosquitos se alimentam de seus hospedeiros.

Outra limitação da optogenética no mosquito é que poucas linhagens de promotores foram criadas além das destinadas a neurônios sensoriais. Assim, seu potencial completo será alcançado quando combinada com promotores expressos em interneurônios que não podem ser diretamente estimulados por outras abordagens. Recursos recentemente emergentes, como o Atlas de Células do Mosquito Aedes aegypti, abrem caminho para avanços na neurogenética de mosquitos44. Será necessário trabalho futuro para desenvolver tais promotores visando investigar os circuitos neurais dos mosquitos. De forma semelhante, são necessárias ferramentas optogenéticas adicionais para inibição, a fim de determinar se um determinado tipo de neurônio é essencial para um comportamento específico. Embora os ensaios apresentados neste artigo tenham sido projetados para medir atração ao hospedeiro e alimentação com sangue, essas abordagens poderiam ser estendidas para estudar outras etapas da busca pelo hospedeiro e comportamentos como acasalamento, oviposição e alimentação com néctar. Estudos optogenéticos fornecerão novas perspectivas sobre como o comportamento dos mosquitos é controlado ao nível dos circuitos neurais e poderiam levar a novas estratégias para impedir a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini e Yaoyu Jiao pelos comentários sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pela concessão DP2AI177891 do NIH. Agradecemos ao Núcleo de Neurotecnologia, financiado pelo Instituto Yale Kavli de Neurociência, pelo aconselhamento técnico. T.S. é um Bolsista Freeman Hrabowski do HHMI.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1⁄Acrílico Preto de 8 PolegadasMcMaster-Carr8650K32Estrutura do alimentador ópto-membranar
1⁄Acrílico transparente de 20,3 cmMcMaster-Carr8536K134Recipiente alimentador ópto-membranar
¼ Acrílico preto de 1 polegadaMcMaster-Carr8560K259Estrutura do alimentador ópto-membranar
Adaptador CAJameco ReliaPro2197581Estrutura do alimentador ópto-membranar
Cola AcrílicaUnited States Plastic Corp 97562Recipiente do alimentador de membrana óptica, gaiola com manta de sangue
Adenosina 5′cloreto de magnésio hexaidratadoSigma AldrichA6419-1GRefeição sanguínea artificial
Todo Retinal TransSpectrum ChemicalR3041-1GMCriação optogenética
Plataforma de alumínioThorlabsMB12Estrutura do alimentador ópto-membranar
Folha de alumínio 0,03125 inMcMaster-Carr89015K11Placa de alimentação com manta sanguínea
Chapa de alumínio 0,0625 polMcMaster-Carr89015K37Placa de alimentação com manta de sangue
Rastreador de Partes Animais (APT)Laboratório Branson no HHMI Janelia FarmN/AVersão 3.0, dados reproduzidos pelo Opto-thermocycler (Figura 2), baixado em 9 de julho de 2020
Arduino IDEArduinoN/AVersão 1.8.12, utilizada para controle de estímulo do opto-termociclador, manta térmica para sangue, &e alimentador ópto-membranar
Placa de microcontrolador Arduino Uno Rev3ArduinoA000066 Programação do alimentador ópto-membrana
Tela de janela de fibra de vidro pretaProdutos Premium de Inovação IHLRS3684BLCápsula com manta de sangue
Fita pretaThorlabsT137-2.0Opto-termociclador
Abraçadeiras pretas com fecho Cordas de Amarração e Maisct242Estrutura do alimentador ópto-membranar
Tecido para OclusãoDefinir Loja6520SFOpto-termociclador e manta térmica para sangue
Luzes LED azuis21LEDUSARB5730BLWPCriação de mosquitos
FrascoGarrafa SKS & Embalagem0604-07Aquecedor de sangue por membrana óptica
Pelotas para Peixes de FundoAPI5352983Alimentação de larvas
CâmeraMosca-negraU3-13S2M-CS, FLIGravação de vídeo para ensaios
Contador de CliquesULineH-7350Larvas finas
ComputadorAsus X1407QExecução de Ensaios
Água Sanitária Concentrada (8,25% de Hipoclorito de Sódio)VWR89501-620Limpeza do alimentador de membrana óptica
CoolTermFreeware de Roger MeierN/AVersão 2.0.1, utilizada para gravação em porta serial para opto-termociclador, manta térmica para sangue, &e alimentador ópto-membranar
Sangue de Ovelha Desfibrinado Laboratórios de Hemostasia DSB100Refeição sanguínea para alimentador opto-membrana
Parafuso hexagonal com cabeça abobadada 4-40McMaster-Carr92949A105Placa de alimentação com manta sanguínea
EpóxiLoctite1363118Placa acrílica do opto-termociclador, estrutura do alimentador de membrana opto
EtanolDecon Labs2716Sanitização
Unidade de Disco Rígido ExternaLaCieLAC9000298Armazenamento de Vídeo
ffmpegFFmpegN/AVersão 8.0.1, pré-processamento de vídeo
Pavio de Algodão de Quatro PolegadasRichmond Dental201226Alimentação de mosquitos adultos
GitHubGitHub, IncN/ARepositórios para código, arquivos de peças e modelos SLEAP para opto-termociclador (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), manta térmica de sangue (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) e alimentador por membrana opto (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimsonN/AN/ACriado para este estudo, descrito na etapa 1.2
Mosquitos Gr3-QF2N/AN/AReagente genético, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Incubadora com Porta OpacaCaron7340-25Criação de mosquitos
Luz LED de infravermelhoAdafruit387Opto-termociclador e manta térmica para sangue
Faixa de LED infravermelhoIluminação por forma de onda7031.85Opto-termociclador, manta térmica sanguínea e estrutura opto-membranar
Filtro Passa-InfravermelhoEdmund Optics65-796Gravação de vídeo para ensaios 
Gaiola para InsetosBugdormDP1000Recipiente para mosquitos adultos
Anotador Automático de Comportamento Animal Janelia (JAABA)Laboratório Branson na HHMI Janelia FarmN/AOpto-thermocycler reproduziu os dados (Figura 2); Versão 0,5,0
Copo Grande para SopaWebstaurantStore50016SOUPPLACriação de mosquitos
Dissipador de Calor para LEDLuxeon StarN25-15BOpto-termociclador e manta térmica para sangue
Lente de LEDLuxeon Star10209Opto-termociclador e manta térmica para sangue
Suporte para Lente de LEDLuxeon Star10235Opto-thermociclador e manta térmica para sangue
Fita para Lente de LEDLuxeon StarLT-01Opto-termociclador e manta térmica para sangue
Luz LEDLuxeon StarSP-01-D9Estímulo de luz vermelha para Opto-thermocycler e manta térmica de sangue
Fita Térmica de LEDLuxeon StarLXT-S-12Opto-termociclador e manta térmica para sangue
Trilhos de Construção ÓpticaThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Opto-termociclador e estrutura do cobertor sanguíneo
Poste Óptico ThorlabsTR12Estrutura do alimentador ópto-membranar
Papel-toalhaPacific Blue27385Limpeza do recipiente
ParafilmAmcorPM-996Membrana de manta sanguínea, recipiente óptico-membranar para refeição
termociclador de PCREppendorf2231001196Opto-termociclador e manta térmica para sangue
Copo de porção plásticoEscolha999P2CAlimentação de mosquitos adultos
Tampa de Copo de Porção PlásticoEscolha999PL2Alimentação de mosquitos adultos
Painel de policarbonatoCambro21410CWCHCLCriação de larvas 
Painel de Policarbonato Meio TamanhoCambro24CW135 Limpeza óptica da membrana da refeição
Tampa de meio tamanho para bandeja de policarbonatoCambro20CWCH135 Limpeza de refeição por membrana óptica
Tampa de Panela de PolicarbonatoCambro10CWCH135Criação de larvas
Tubo de policarbonatoMcMaster-Carr8585K56Recipiente do alimentador de membrana óptica 
Medidor de PotênciaCoerente1299161Todos os ensaios
Mosquitos QUAS-CsChrimsonN/AN/AReagente genético, DOI: 10.7554/eLife.76663
Luzes RGBDigikey 289-1189-NDEntrega de estímulo por alimentador ópto-membrana
Grampo de Ângulo RetoThorlabsRA90Estrutura do alimentador de membrana óptica
Fita adesiva Scotch Magic3M104Opto-thermocycler e tampa acrílica de manta térmica para sangue
Junta de silicone, 0,5 mmMcMaster-Carr1460N22Placa de alimentação com cobertura de sangue
SLEAPTalmo LabN/AVersão 1.4.1a2, rastreamento de postura de mosquitos em cada um dos ensaios
Bicarbonato de Sódio, solução tampão 1 M, pH 8,0Thermo ScientificJ62495.APRefeição sanguínea artificial
Solução de Cloreto de SódioSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Refeição sanguínea artificial
SpinViewTeledyne Vision SolutionsN/AVersion 1.27.0.48, software de gravação de vídeo para os três ensaios
Garrafa com pulverizadorUlineS-11686Sanitização
SacaroseSigma AldrichS0389-500GAlimentação de mosquitos adultos
Termopar (tipo T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NOpto-termociclador e manta térmica para sangue
Amplificador de termoparAdafruitMAX31856Opto-termociclador e manta térmica para sangue
CronômetroEnduraLightRAC-MTControlando o ciclo de luz para a criação de mosquitos
Pipeta de Transferência Thermo ScientificSAM-225Larvas finas
Saco de LixoUlineS-23040Transporte de insetos
Malha Resistente a Raios UVMcMaster-Carr 87655K13Recipiente alimentador de membrana óptica
ÁguaSigma AldrichW4502-1LRefeição sanguínea artificial para cobertor sanguíneo
Fio enceradoMcMaster-Carr6356K91Tampa do cartucho de membrana óptica
Malha de arameMcMaster-Carr9322T65Estrutura do alimentador ópto-membranar

Referências

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Comportamento de MosquitosCircuitos NeuraisAtivação OptogenéticaEnsaios ComportamentaisBusca do HospedeiroAlimentação SanguíneaVisão ComputacionalEstímulos Sensoriais

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.