Quantificação citométrica do fluxo sanguíneo total de plaquetas fator tecidual positivo: um fluxo de trabalho multicêntrico harmonizado

Resumo

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho harmonizado para a quantificação por citometria de fluxo de plaquetas fator tecidual positivo em estudos multicêntricos. O protocolo descreve procedimentos padronizados para coleta de sangue, fixação de sangue total, coloração e harmonização de instrumentos, permitindo que a análise seja realizada local ou centralmente, dependendo das capacidades laboratoriais.

Resumo

Fator Tecidular (TF)-^{plaquetas pos} representam um subconjunto da população plaquetária. Recentemente, esse subconjunto demonstrou prever a mortalidade cardiovascular em pacientes com doença arterial coronariana, estabelecendo-se como um biomarcador útil para a estratificação do risco trombótico. A quantificação precisa das^{plaquetas pos} TF por citometria de fluxo requer uma padronização rigorosa do manuseio pré-analítico, procedimentos de coloração e configurações de instrumentos, especialmente em estudos multicêntricos onde a variabilidade técnica pode afetar sua medição. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho harmonizado para avaliação de citometria de fluxo sanguíneo total de plaquetas^pós de TF circulantes, projetado para garantir a reprodutibilidade entre laboratórios com diferentes infraestruturas técnicas. O procedimento inclui coleta padronizada de sangue e fixação total de sangue para preservar o fenótipo plaquetar in vivo. Dois métodos diferentes para preparação de amostras são fornecidos de acordo com as capacidades do laboratório local: envio de amostras fixas para o Laboratório Central para coloração, aquisição e análise centralizadas em centros sem instalações de citometria de fluxo, ou coloração e aquisição local para centros equipados com instrumentação de citometria de fluxo e pessoal treinado. A avaliação da porcentagem de plaquetas^pos TF é realizada por marcação direta com anticorpos anti-TF Star Fluor 488 e anti-CD41 PerCP-Cy5.5 para identificar a proteína-alvo e o marcador populacional de plaquetas, respectivamente. A harmonização do citômetro de fluxo é alcançada seja por meio de um modelo de aquisição compartilhado para modelos idênticos de citômetro ou por alinhamento baseado em esferas para diferentes plataformas. O fluxo de trabalho incorpora ainda uma abordagem padronizada de portões e análise centralizada de dados para permitir a comparação confiável das medições^TF pos-plaquetas entre os locais. Resultados representativos demonstraram que esse fluxo de trabalho suporta a quantificação reprodutível de plaquetas^pos TF através das configurações validadas de aquisição multicêntrica. Esse protocolo pode facilitar a aplicação mais ampla da avaliação pós-plaquetária TF na estratificação de risco trombótico e apoiar uma padronização mais ampla da citometria de fluxo plaquetário em pesquisas translacionais e clínicas.

Introdução

O Fator Tissular (TF) é o principal iniciador da cascata de coagulação sanguínea e um determinante fundamental da geração de trombina. Além de sua expressão clássica por células subendoteliais e leucócitos, a TF também está associada às plaquetas^circulantes 1,2,3,4,5. Durante a trombopoiese, megacariócitos transferem TF para um subconjunto de^{plaquetas 6}. Sob condições fisiológicas, aproximadamente 20–30% das plaquetas circulantes contêm TF armazenada no sistema canalicular aberto, separada espacialmente do fator^{VII 7} do plasma. Nesse estado compartimentado, a TF é funcionalmente protegida contra fatores de coagulação circulantes e permanece inativa. Assim, apenas uma pequena fração das plaquetas apresenta TF superficial detectável quando sangue total de indivíduos saudáveis é analisada por citometria de fluxo, refletindo homeostase fisiológica ^2,8. Condições patológicas caracterizadas por ativação plaquetária e desequilíbrio trombo-inflamatório podem desequilibrar esse equilíbrio, levando a um aumento da exposição superficial da TF. Proporções elevadas de plaquetas TF-positivas (TF^pos) foram relatadas em vários distúrbios trombóticos 9,10,11,12,13,14,15. Notavelmente, na doença arterial coronária, níveis de plaquetas^pós de TF superiores a 4% preveem independentemente a mortalidade cardiovascular em acompanhamento de 5 anos, estabelecendo a porcentagem de plaquetas^pós TF como um biomarcador clinicamente relevante de risco^{trombótico 16}.

A quantificação precisa e reprodutível das^{plaquetas pos} de TF é, portanto, essencial tanto para aplicações de pesquisa translacional quanto clínica. Um fluxo de trabalho de citometria de fluxo plaquetário publicado anteriormente para avaliação^{de plaquetas TF pos} melhorou o estudo dessa proteína em ambientes de centro^{único 17} , fornecendo conselhos para otimizar etapas pré-analíticas ou analíticas selecionadas. No entanto, essa abordagem não foi especificamente projetada para enfrentar os desafios logísticos e analíticos adicionais dos estudos multicêntricos, incluindo procedimentos de envio, processamento padronizado de amostras e considerando também a necessidade de harmonizar a aquisição de amostras entre diferentes plataformas de citômetros de fluxo. Além disso, as diferentes infraestruturas e níveis de expertise técnica dos centros participantes também devem ser considerados.

Nesse contexto, o valor agregado do protocolo atual reside em fornecer um fluxo de trabalho detalhado que combina coleta padronizada de sangue e fixação de sangue total, protocolos flexíveis de processamento de amostras, harmonização de aquisição multiplataforma e coloração direta e controle centralizado de qualidade por meio de análise de dados.

O objetivo deste trabalho é, portanto, fornecer uma estrutura operacional para a implementação harmonizada multicêntrica da análise pós-plaquetária TF no sangue total por citometria de fluxo. Esse desenho integrado reduz a variabilidade pré-analítica, analítica e entre instrumentos, estabelecendo assim a condição para a avaliação consistente das^{plaquetas pos} TF em ambientes multicêntricos.

Protocolo

Todos os doadores de sangue forneceram consentimento informado por escrito aprovado pelo Comitê Ético da Instituição (nº 70/24, CE 18.06.24).

O fluxo de trabalho multicêntrico para quantificação de citometria de fluxo sanguíneo total de plaquetas^pos TF está resumido na Figura 1. O protocolo detalhado abaixo guiará o usuário por cinco etapas principais.

Figura 1: Fluxo de trabalho multicêntrico para análise pós-plaquetas TF. Representação esquemática do pipeline analítico para avaliação multicêntrica de plaquetas^pós de TF circulantes por citometria de fluxo sanguíneo total. Após o recrutamento dos participantes e a retirada de sangue, as amostras são fixadas e processadas de acordo com os recursos técnicos disponíveis em cada Unidade Clínica. Centros sem instalações de citometria de fluxo enviam amostras fixas para o Laboratório Central para coloração, aquisição e análise. Centros equipados com citômetros de fluxo podem realizar coloração e aquisição no local usando modelos padronizados de aquisição. A harmonização do instrumento é alcançada por meio de modelos compartilhados (mesmo modelo de instrumento), modelos gerados no Laboratório Central (modelo diferente disponível para alinhamento) ou calibração com esferas fluorescentes quando a harmonização direta de modelos não é viável. A análise de dados é realizada centralmente usando um fluxo de trabalho padronizado de gates. O diagrama foi criado usando o ChatGPT (OpenAI). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Coleta de sangue

NOTA: A avaliação de^{plaquetas pós} TF requer no máximo 50 μL de sangue total.

1. Colete sangue venoso periférico da veia antecubital usando uma agulha borboleta calibre 19. Aplique o torniquete apenas para a venpunctura e libere-o imediatamente após a colocação da agulha para minimizar a ativação plaquetária ex vivo.
2. Descarte o primeiro tubo EDTA. Em seguida, colete sangue em um vacainador de citrato de sódio 0,129 M, preenchendo o tubo até a marca do fabricante para preservar a proporção correta de sangue para anticoagulante.
3. Inverta suavemente 5 vezes para misturar bem sangue e anticoagulante.
4. Mantenha o tubo em pé em temperatura ambiente, evitando agitação, refrigeração ou transporte pneumático.
5. Processe a amostra em até 3 horas após a coleta.

2. Preparação da amostra

NOTA: Todos os anticorpos devem ser adquiridos pelo Laboratório Central e devem vir do mesmo lote. Se uma mudança de lote se tornar necessária durante o estudo em andamento, o novo lote de reagentes deve ser conectado diretamente ao lote em uso por meio de testes paralelos sob as mesmas condições de ensaio e adotado somente se o desempenho comparável for confirmado. Reagentes comumente usados (por exemplo, PBS – soro salino tamponado com fosfato – e PFA – paraformaldeído) podem ser adquiridos por cada centro participante; no entanto, os códigos de produto devem corresponder aos usados pelo Laboratório Central, e a consistência dos lotes deve ser mantida durante todo o estudo.

1. Corriga a amostra.
   NOTA: Antes de iniciar o processamento do sangue, prepare 1% de PFA diluindo 4% com PBS em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: A PFA é tóxica e deve ser manuseada com um capuz químico enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas e proteção ocular). Evite inalar e contato com pele ou olhos. DESCARTE DE RESÍDUOS: Colete todas as soluções contendo PFA, amostras fixas e consumíveis contaminados em recipientes fechados e devidamente rotulados, de acordo com as regulamentações institucionais e locais.
   1. Inverta suavemente o aspirador 5 vezes para misturar sangue e anticoagulante.
   2. Transfira 50 μL de sangue para um tubo de 2 mL contendo 950 μL de 1% de PFA.
   3. Misture delicadamente a amostra e incube por 1 h e 30 minutos em temperatura ambiente.
   4. Adicione 500 μL de PBS.
   5. Centrifuge a 1500 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   6. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em 1 mL de PBS.
      NOTA: Ponto de verificação técnico: Após a centrifugação, confirme que o pellet está visível antes de remover o sobrenadante. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola. Após a ressuspensão, verifique se a amostra está homogênea e livre de aglomerados ou agregados visíveis.
   7. Envie a amostra fixa para o Laboratório Central em embalagem controlada de temperatura, mantida entre 2 e 8 °C dentro de 24 horas após a fixação. Não congele. Tempo de coleta de documentos, tempo de fixação e tempo de envio.
2. Marcagem de amostras para análise de citometria de fluxo.
   NOTA: O anti-TF Star Fluor 488 (clone HTF1; anti-CD142) é direcionado contra o Fator Tecido, enquanto o anti-CD41 PerCP-Cy5.5 reconhece a integrina plaquetária alfaIIb. Antes de iniciar o procedimento de coloração, centrifuge anticorpos a 17000 x g por 5 minutos a +4 °C para remover qualquer^{agregado 18}. Diluir anticorpo anti-TF Star Fluor 488 (1:100) com PBS. O Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 não requer diluição intermediária e deve ser usado no volume recomendado pelo fabricante.
   1. Prepare quatro tubos de polipropileno de 2 mL.
   2. Dispense 80 μL de amostra fixa em cada tubo.
   3. Adicione a cada tubo o volume correto de PBS e anticorpo anti-TF Star Fluor 488, conforme indicado na Tabela 1 (Dia 1).
   4. Misture as amostras com cuidado.
   5. Incube O/N a 4 °C no escuro.
   6. No dia seguinte (Dia 2), adicione Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 nos tubos 3 e 4, conforme indicado na Tabela 1.
   7. Misture as amostras com cuidado.
   8. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
   9. Dilua cada tubo com 300 μL de PBS.
   10. Armazene amostras coradas no escuro até a aquisição da citometria de fluxo.
       NOTA: As amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até três dias^{e 17}. Armazenamento mais longo resulta em decaimento progressivo do sinal e deve ser evitado.

		Dia 1		Dia 2
Não.	ID do Tubo	1X PBS (μL)	Anti-TF Star Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Sem manchas	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabela 1: Protocolo de coloração para avaliação de^{plaquetas TF pos}.

3. Padronização da aquisição de citômetros de fluxo

1. Definição de um modelo de aquisição (pelo Laboratório Central).
   1. Configuração de modelo para o Citômetro de Fluxo A.
      1. Abra o software A v2.6.
      2. Crie o gráfico de pontos FSC-A/SSC-A [Todos os Eventos] em escala logarítmica para visualizar populações celulares (Figura 2A).
      3. Crie um gráfico de pontos CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Todos os Eventos] em escala logarítmica para identificar plaquetas dentro de um portão [Plaquetas] (Figura 2B).
      4. Crie um gráfico de pseudocor PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Todos os Eventos] para verificar o transbordamento/compensação (Figura 2C).
      5. Crie um gráfico de pontos FSC-A/FSC-H na porta [Plaquetas] e defina uma região para identificar singletos ([Singlets]; Figura 2D).
      6. Crie um gráfico de pontos CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A na porta [Singlets] para identificar plaquetas^pos TF (Figura 2E).
      7. Defina o limite para 1000 no SSC-H.
      8. Defina a vazão para "Lenta".
      9. Defina o ganho B525 para 315 para garantir a discriminação ideal entre eventos positivos e negativos; ajuste se necessário de acordo com o instrumento utilizado.
      10. Defina o ganho do B690 de acordo com o controle de qualidade diário. A aquisição é aceitável apenas se a população de plaquetas^{CD41 pos}- estiver totalmente resolvida a partir do fundo negativo e permanecer dentro do portão de referência pré-definido estabelecido no modelo durante a aquisição.
      11. Exporte o modelo usando o "Exportar Modelo de Experimento".
      12. Baixe: O modelo de aquisição para análise^{de plaquetas TF pos} no Citômetro de Fluxo A está disponível para download como Arquivo Suplementar 1 e Figura Suplementar 1.
          NOTA: Um gráfico para verificar o transbordamento/compensação (Figura 2C), embora não seja necessário para esta análise multiparamétrica, está incluído. No entanto, deve-se considerar se uma combinação de fluorocromos diferente daquela proposta neste protocolo será utilizada.
   2. Crie um modelo para o Citômetro de Fluxo B.
      1. Crie um arquivo de protocolo que inclua toda a configuração de aquisição conforme descrito na versão 3.1.1.
      2. Exporte o template usando a função "Exportar Protocolo" no software B v1.6, gerando um arquivo de protocolo.
      3. No instrumento receptor, importe o arquivo do protocolo usando a função "Importar Protocolo" dentro do software.
   3. Criação de templates para o Flow Cytometer C.
      1. Crie um arquivo de espaço de trabalho que inclua toda a configuração de aquisição conforme descrito na 3.1.1. e exportar.
      2. No instrumento receptor, importe o arquivo de espaço de trabalho usando a função "Copiar" do software C v3.1.
2. Harmonização dos citometros de fluxo usando esferas de calibração.
   NOTA: Use esferas de calibração Rainbow de 6 picos.
   1. Definição de Valor-Alvo.
      NOTA: Use a seguinte fórmula para definir a Intensidade de Fluorescência Mediana (MdFI) do primeiro pico no canal de fluorescência B525:
      MdFI_=
      onde: Instrumentos da Unidade Clínica e RI: Instrumento de Referência.
   2. Preparação de Amostras.
      1. Vortex, o frasco de contas.
      2. Adicione 5 gotas de contas a um tubo de amostra.
      3. Adicione 1 mL de PBS.
      4. Vórtice por 5-10 segundos.
   3. Aquisição de contas.
      1. Crie um gráfico de pontos FSC-A/SSC-A em escala logarítmica exibindo [Todos os Eventos], e defina uma região chamada [Contas] (Figura 3A).
      2. Crie um gráfico de pontos FSC-A/FSC-H na porta [Contas] e defina uma região para identificar singlets [Singlet] (Figura 3B).
      3. Crie um gráfico histograma para o canal de fluorescência Star Fluor 488 (B525).
      4. Exiba apenas [Singlet]  no histograma.
      5. Desenhe uma porta ao longo de toda a largura do primeiro pico (região B na Figura 3C).
      6. Na fita de Estatísticas, exiba valores X Median (X-Med).
      7. Remova qualquer compensação existente.
      8. Defina a vazão para "Lenta".
      9. Inicie a aquisição no modo "Executar".
      10. A partir da "Configuração de Aquisição", modifique a tensão/ganho do B525 para alcançar o alvo X-Med calculado de acordo com o valor alvo.
      11. Grave um arquivo de dados de 10.000 eventos na porta [Singlete] somente após esse critério de aceitação ter sido atingido. Não adquira amostras de estudo até que o alvo seja atingido.

Arquivo Suplementar 1: Modelo de aquisição para análise de plaquetas^{TF pos} no Citômetro de Fluxo A disponível para download. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 1: Captura de tela do modelo de aquisição para análise de plaquetas^{TF pos} no Citômetro de Fluxo A. (A) O gráfico de pontos FSC-A vs SSC-A fornece uma representação visual da distribuição geral dos eventos. (B) As plaquetas são identificadas em um gráfico CD41 vs SSC-A e codificadas como [Plaquetas]. (C) Um gráfico PerCP-Cy5.5 vs Star Fluor 488 é incluído para avaliar o possível transbordamento. (D) Os doublets são excluídos dentro da porta [Plaquetas] usando um gráfico FSC-A vs FSC-H, definindo a população [Singlets]. As plaquetas^pos TF (E) são identificadas dentro da porta [Singlets] com base na fluorescência PerCP-Cy5.5 e Star Fluor 488. (F-H) As configurações de aquisição, incluindo taxa de fluxo de amostragem (Lenta), limiar primário (SSC) e ganhos do detector (B525 e B690), conforme implementado no modelo, são mostradas. Detalhes completos da configuração e do fluxo de trabalho de aquisição são fornecidos na seção 3.1. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2: Modelo de aquisição e estratégia de portamento para identificação de plaquetas^pos TF. (A) Gráfico de pontos FSC-A/SSC-A (escala logarítmica) mostrando todos os eventos detectados. (B) Gráfico de pontos CD41-A/SSC-A usado para identificar a população de plaquetas. (C) Gráfico de pseudocor PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 usado para avaliar requisitos de transbordamento espectral e compensação. (D) Gráfico FSC-A/FSC-H na porta [Plaquetas] usado para excluir doublets e definir singlets. (E) Gráfico de pontos PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 em [Singlets] usado para identificar plaquetas^pos TF. Os campos de estatística exibidos entre parênteses são automaticamente preenchidos com valores específicos da amostra quando o template é aplicado durante a aquisição da amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Procedimento de calibração de instrumentos baseado em esferas. (A) Gráfico FSC-A/SSC-A usado para identificar eventos de contas. (B) Gráfico FSC-A/FSC-H dentro de eventos de contas usados para excluir agregados e definir singletes. (C) Histograma da fluorescência do Fluor Estrela 488 exibindo picos de esferas com gating aplicado ao primeiro pico da esfera para determinação da intensidade mediana da fluorescência. As estatísticas visualizadas devem ser consideradas representativas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Aquisição de amostras por citometria de fluxo para análise de^{plaquetas TF POS}

1. Adquira usando um modelo de FCM.
   1. Importe o modelo de aquisição usando a função "Importar Modelo" dentro do software A.
   2. Adquira as amostras preparadas na etapa 2.
   3. Verifique se as portas de plaquetas e singlets correspondem à geometria do gráfico de referência antes do registro dos dados. Ajuste os portões se necessário.
   4. Comece a gravar após 5–10 segundos de fluxo estável. Registre um arquivo de dados de 20.000 eventos dentro do portão  [Singlets] (veja a Figura 2D). Salve arquivos .fcs não compensados e encaminhe-os para o Laboratório Central.
2. Aquisição sem um modelo de FCM.
   1. Recrie uma planilha de aquisição conforme relatado na seção 3.1, incluindo os cinco gráficos descritos e a hierarquia de portas: Todos os Eventos > Plaquetas > Singlets > quadrantes TF/CD41.
   2. Defina o limite para 1000 no SSC-H.
   3. Defina a vazão para "Lenta".
   4. Defina a voltagem/ganho B525 conforme definido na 3.2.3.
   5. Prepare a amostra na etapa 2. Comece a gravar após 5–10 s de fluxo estável; adquirir 20.000 eventos dentro do portão [Singlets]. Salve arquivos .fcs não compensados e encaminhe-os para o Laboratório Central.
      NOTA: A aquisição é aceitável apenas se o instrumento de controle de qualidade diário for aprovado. Se a meta de 20.000 plaquetas CD41 pos– não for atingida, adquira no mínimo 10.000 eventos^{CD41 pos-plaquetas}.

5. Análise de dados

NOTA: O fluxo de trabalho de análise descrito abaixo tem como objetivo apoiar as atividades do Laboratório Central responsável pelo processamento centralizado de dados e controle de qualidade.

1. Abra uma nova planilha de análise e carregue os arquivos .fcs.
2. Para cada amostra, crie um modelo de análise conforme mostrado na Figura 2. Para plataformas não idênticas, use um template equivalente específico de plataforma com a mesma estrutura de portões e resultados estatísticos.
3. Verifique se o gating identifica corretamente a população de plaquetas de acordo com as características de dispersão pré-definidas e a estratégia de discriminação de singlets (Figuras 4A,B,D).
4. Verifique se se é um desvio/compensação por meio de um gráfico de pseudocor [Todos os Eventos] (Figura 4C).
   NOTA: A estrela fluorocroma Fluor 488 tem emissão espectral de 520 nm, em comparação com o PerCP-Cy5.5, que tem emissão espectral de 676 nm, explicando a falta de sobreposição e a necessidade de não haver compensação.
5. Aplique a seguinte sequência de gate no gráfico de pontos Star Fluor 488 (Figura 5):
   1. Não corado: defina quadrantes usando o controle não corado de modo que os^pós-eventos TF de fundo permaneçam em ou abaixo de 0,01% dos eventos plaquetários, excluindo a autofluorescência plaquetária (Figura 5A).
   2. TF: aplicar as coordenadas do quadrante definidas na amostra não corada para identificar o sinal^pos TF em amostras com coloração única (Figura 5B).
   3. CD41: defina quadrantes usando a única amostra colorida CD41 para excluir a fluorescência de fundo das plaquetas (Figura 5C).
   4. TF/CD41: aplicar as mesmas coordenadas dos quadrantes para identificar o sinal^pos TF em amostras coradas com TF/CD41 (Figura 5D).
      NOTA: A porcentagem final de pos-plaquetas TF é obtida a partir das estatísticas geradas pelo software de análise e é reportada como a porcentagem de^pós-eventos CD41 que caem dentro do quadrante^pos TF da população de plaquetas gateadas.
6. Realize controle centralizado de qualidade na identificação de nomes de arquivos, lotes de reagentes, intervalo fixação-aquisição, temperatura de envio, contagem de eventos e distribuições de fluorescência de outlances. Arquivos que mostrem desvios documentados em manuseio local, envio, tempo de fixação ou configurações de aquisição devem ser sinalizados, revisados centralmente e excluídos ou repetidos, conforme o plano específico de gerenciamento de desvios do estudo.

Figura 4: Estratégia sequencial de gate para análise^{de plaquetas pos} de TF. O fluxo de trabalho de análise representativa ilustra a identificação de populações de plaquetas após o carregamento de arquivos .fcs. (A-B) Gráficos de pontos confirmando a correta passagem das populações de plaquetas. (C) Gráfico de pseudocor PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 usado para avaliar o transbordamento espectral. (D) Gráfico FSC-A/FSC-H dentro da porta das plaquetas usado para excluir doublets e definir singlets. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Modelo para análise de dados. Gráficos de pontos representativos do controle (A) não corado usados para definir autofluorescência de linha de base e posicionamento de quadrantes. (B) amostra única de TF; (C) Amostra de coloração única CD41 usada para definir posicionamento de quadrante. (D) Amostra duplamente colorida TF/CD41 usada para análise de^{plaquetas pos} de TF. Os números indicam a porcentagem de plaquetas^pos de TF em uma amostra representativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Esse fluxo de trabalho foi especificamente projetado para permitir que centros com infraestruturas técnicas heterogêneas participem de estudos multicêntricos que exigem quantificação das plaquetas^pos TF. A Figura 1 ilustra o diagrama de fluxo de trabalho organizacional projetado para apoiar estudos multicêntricos voltados para medir plaquetas^pós de TF circulantes por citometria de fluxo sanguíneo total. Diferentes procedimentos de preparação de amostras são implementados dependendo dos recursos técnicos disponíveis nos centros participantes. Especificamente, (i) quando uma Unidade Clínica não possui uma instalação de citometria de fluxo ou pessoal treinado, amostras de sangue total passam por fixação imediatamente após a coleta e são então enviadas ao Laboratório Central para coloração, aquisição e análise centralizadas. (ii) Alternativamente, centros equipados com instalações de citometria de fluxo podem realizar coloração e aquisição localmente. Nesses casos, a aquisição de dados segue um fluxo de trabalho harmonizado definido pelo Laboratório Central. Se o modelo do instrumento corresponder ao utilizado no Laboratório Core, a aquisição é realizada usando um modelo padronizado fornecido pelo Core Laboratory. Quando diferentes modelos de instrumentos são utilizados, a harmonização pode ser alcançada tanto por transferência de molde – quando instrumentos estão disponíveis para alinhamento no Laboratório de Núcleo – quanto por procedimentos de calibração baseados em esferas antes da aquisição da amostra. As amostras podem então ser adquiridas e analisadas de acordo com o fluxo de trabalho padronizado.

Os seguintes resultados representativos têm como objetivo ilustrar a viabilidade do fluxo de trabalho e os principais passos de harmonização, em vez de fornecer validação formal de ensaios multicêntricos. Para garantir a detecção confiável de TF, a estratégia de coloração foi inicialmente avaliada quanto à compatibilidade espectral e estabilidade do sinal. As plaquetas foram identificadas usando anti-CD41 PerCP-Cy5.5, enquanto a detecção de TF dependeu de um anticorpo monoclonal anti-TF conjugado ao Star Fluor 488. Controles de coloração única foram usados para verificar a ausência de transbordamento de fluorescência entre os canais de detecção. Como mostrado na Figura 6A, amostras de coloração única do CD41 PerCP-Cy5.5 não produziram sinal detectável no canal do Star Fluor 488. Consistentemente, a porcentagem de plaquetas^pos TF medidas em amostras duplamente coloridas foi comparável à obtida em amostras TF com coloração única (Figura 6B).

Figura 6: Validação da especificidade da coloração. (A) Amostra anti-CD41 PerCP-Cy5.5 com coloração única analisada em um gráfico de pontos PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 para verificar a especificidade do sinal. (B) As porcentagens de plaquetas^pos TF medidas em amostras com coloração simples com TF versus com coloração dupla TF/CD41 são mostradas como medições individuais pareadas (pontos) e média ± SD (n = 18 sujeitos independentes). Os dados foram analisados pelo teste de pares pareados de Wilcoxon com patente sinalada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.A sensibilidade analítica do ensaio proposto foi avaliada em amostras de n=200 indivíduos saudáveis. Usando amostras biologicamente em branco, o limite calculado de blank (LoB) era 0,39%, o limite de detecção (LoD) era 0,77% e o limite de quantificação (LoQ) era 1,12%, definido como o nível mais baixo associado a um CV ≤ 20%. A reprodutibilidade interoperadora da estratégia de gate foi avaliada em 40 amostras independentes analisadas por 6 operadores usando o modelo de análise pré-definido, resultando em um ICC de 0,985 (IC 95%: 0,978-0,990).

A estabilidade da detecção de TF após fixação com sangue total foi então avaliada por coloração longitudinal de amostras fixas. Comparado às amostras basais coloridas no dia da fixação (D0), os níveis de^{plaquetas pos} da TF permaneceram estáveis por até quatro dias após a fixação (D3-D4), mostrando apenas uma diminuição não significativa de aproximadamente 22% em D3-D4 (77,8 ± 7,2% - percentual relativo na plaqueta-plaquetas pos de TF) em comparação com o nível de D0. Quando a coloração foi realizada em D5-D6, a detecção de^{plaquetas pos} TF diminuiu significativamente para 53,8% ± 20,7% (percentual relativo em plaquetas^pos TF; p< 0,0001; Figura 7). Esses resultados indicam que amostras fixas podem ser analisadas de forma confiável dentro de quatro dias após a fixação, com apenas uma perda modesta de sinal.

Figura 7: Análise de curso temporal após fixação da amostra. A quantificação das^{plaquetas pos} TF medidas em diferentes pontos de tempo após fixação indicou no eixo x da seguinte forma: D0 = dia da coleta de sangue; D1 = dia 1; D2 = dia 2; D3-4 = dia 3 ou 4; D5-6 = dia 5 ou 6. Os dados são expressos como média ± percentual relativa de DS em comparação com D0 (n = 7-10 sujeitos saudáveis, avaliados nos pontos de tempo pós-fixação indicados). Os dados foram analisados usando Anova, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O desempenho do fluxo de trabalho harmonizado de aquisição foi posteriormente avaliado em diferentes plataformas de citometria de fluxo. A harmonização baseada em modelos foi avaliada inicialmente usando instrumentos FACSLyric e MACSQuant como citômetros de referência. Instrumentos adicionais dos mesmos modelos, localizados em instalações externas, foram usados como plataformas de teste. Amostras de sangue total contendo plaquetas em repouso foram coletadas tanto em instrumentos de referência quanto de teste usando o modelo padronizado de aquisição. Como mostrado na Figura 8A,B, porcentagens comparáveis de^{TF pos-plaquetas} foram obtidas em citômetros de referência e de teste, confirmando a reprodutibilidade da abordagem de molde compartilhado.

Figura 8: Reprodutibilidade entre instrumentos usando modelos de aquisição compartilhados. Percentuais de plaquetas^pós de TF medidas no sangue total de n=6 indivíduos saudáveis adquiridos em instrumentos de referência e testes FACSLyric (A) ou MACSQuant (B) por meio de um modelo de aquisição compartilhada aplicado entre os instrumentos. Os dados são expressos como determinações individuais (pontos) e média ± DS. Os dados foram analisados por um teste t pareado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Por fim, a harmonização baseada em contas foi avaliada para alinhar instrumentos de diferentes configurações. O Citômetro A era usado como instrumento de referência, e um FACSymphony como instrumento de teste. O alinhamento foi realizado usando esferas de calibração Rainbow de 6 picos, ajustando a tensão do detector FACSymphony de 488 nm até que a intensidade de fluorescência das esferas caísse dentro da faixa alvo predefinida. Perfis histogramáticos que ilustram as distribuições de picos das contas antes e depois do alinhamento são mostrados na Figura 9A. Amostras de sangue total eram então coletadas no instrumento de teste antes e depois da calibração. Antes da harmonização, as porcentagens de plaquetas^pos da TF variavam entre as duas plataformas. Após o alinhamento baseado em esferas, os valores corresponderam de perto aos obtidos no citômetro de referência (Figura 9B), demonstrando harmonização bem-sucedida entre plataformas e quantificação reprodutível de TF.

Figura 9: Harmonização de instrumentos baseada em contas. (A) Histograma representativo de fluorescência das esferas de calibração Rainbow de 6 picos adquiridas antes (picos vermelhos) e depois do alinhamento do instrumento (picos verdes). (B) Percentuais de plaquetas^pos TF medidas em amostras em repouso preparadas de n=6 indivíduos saudáveis adquiridos no instrumento de teste antes (pré) e depois da harmonização (pós-). As medições obtidas no instrumento de referência são mostradas para comparação. Os dados foram analisados por um teste t pareado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho passo a passo para a quantificação da citometria de fluxo sanguíneo total de plaquetas^pos TF, projetado especificamente para uma implementação multicêntrica. Sua principal vantagem metodológica em relação aos fluxos de trabalho convencionais baseados na análise de citometria de fluxo plaquetário é que padroniza todo o processo analítico, desde a coleta de sangue e fixação total até a rotulagem da amostra, harmonização de instrumentos antes da coleta da amostra e análise centralizada e controle de qualidade dos dados. Isso permite que centros sem capacidade de processamento de amostras participem de estudos multicêntricos, se conseguirem fornecer amostras de sangue. O fluxo de trabalho atual aborda as fontes práticas de variabilidade entre centros que são mais relevantes, considerando que apenas uma pequena proporção de plaquetas apresenta TF associada à superfície detectável sob condições^{fisiológicas 7,8}. Essas fontes incluem diferenças no manuseio local das amostras, acesso a instalações de citometria de fluxo, configuração do instrumento e análise de dados dependente do operador.

Para superar esses problemas, o sangue total é fixado logo após a coleta, estabilizando o fenótipo plaquetário in vivo e evitando a necessidade de marcação imediata e coleta de amostras. Resultados representativos indicam que essa abordagem de amostra fixa permite processamento centralizado atrasado dentro do intervalo pós-fixação validado. Isso amplia o potencial de participação em estudos para centros sem instalações de citometria de fluxo no local, mantendo um fluxo de trabalho pré-analítico consistente. Uma segunda vantagem do protocolo é o uso de uma estratégia simplificada de coloração direta com um painel simples de duas cores, que reduz a complexidade do procedimento.

No painel, usamos o clone monoclonal anticlonal anti-TF HTF1, bem caracterizado, que reconhece o sítio catalítico da TF e compete com a ligação ao fator VII, tornando-se um dos reagentes mais confiáveis disponíveis para a detecção de TF, também nas^{plaquetas 14, 16 e 17}. O anticorpo foi conjugado ao Star Fluor 488, um fluorocromo brilhante e fotostável espectralmente semelhante ao FITC, mas com melhor estabilidade do sinal. Importante, a excitação a 488 nm permite a detecção de amostras com a configuração laser azul disponível em praticamente todos os citômetros de fluxo convencionais, incluindo instrumentos de entrada. Essa combinação de especificidade de epítopo e detecção direta de fluorocromo melhora a sensibilidade analítica e a escalabilidade em múltiplos locais. Neste ensaio, limiares de positividade foram definidos usando controles não colorados e FMO como uma opção melhor em comparação ao controle isotipo para colocação de limiares em populações de baixa^{frequência 18}.

O uso de diferentes citometros de fluxo pode representar uma fonte de variabilidade em estudos de citometria de fluxo^{multicêntrico} 19,20,21. Já fornecemos anteriormente aconselhamento sobre manuseio pré-analítico, montagem de coloração e otimização local de instrumentos¹⁷. Mas essas medidas não garantem sinais de fluorescência consistentes entre diferentes plataformas. O fluxo de trabalho atual aborda essa questão combinando análise centralizada com harmonização de aquisições prospectivas. Modelos de aquisição compartilhada podem ser usados quando citômetros idênticos estão disponíveis, enquanto alinhamento baseado em contas pode ser aplicado quando diferentes plataformas precisam ser incluídas. Essa estratégia dupla oferece uma vantagem prática sobre modelos analíticos multicêntricos que dependem exclusivamente de análise centralizada após aquisição local heterogênea, reduzindo a variabilidade da análise de dados ab initio e apoiando uma aplicação de portas mais reprodutíveis entre os locais.

A generalização do fluxo de trabalho não deve ser subestimada. O protocolo foi validado usando condições específicas de fixação do sangue total, a combinação anti-TF-Star Fluor 488 e anti-CD41 PerCP-Cy5.5, procedimentos de harmonização e um conjunto limitado de configurações de citômetros de fluxo. Se outros clones anti-TF, combinações de fluorocromo, tempos de fixação ou concentrações fixadoras, ou citômetros de fluxo com óptica substancialmente diferente forem usados, o desempenho analítico do fluxo de trabalho deve ser verificado. No geral, quaisquer falhas de protocolo devem ser gerenciadas pelas regras de desvio pré-definidas sugeridas. Dependendo da gravidade do desvio, os dados podem ser sinalizados, repetidos ou excluídos de acordo com o plano de desvio específico do estudo. Dentro desses limites, o atual protocolo deve ser considerado como uma estrutura operacional para a implementação multicêntrica da análise pós-plaquetas TF. Validação analítica formal, incluindo avaliação mais ampla de desempenho interlaboratorial, validação de remessas e repetibilidade de ensaios, está sendo abordada em um estudo internacional dedicado à padronização da Sociedade Internacional de Trombose e Hemostose. A relevância clínica da quantificação precisa das^{plaquetas pos} TF é reforçada por evidências que demonstram seu valor prognóstico na doença arterial coronariana, onde níveis de^{plaquetas pós} TF superiores a 4% preveem independentemente a mortalidade cardiovascular de longo prazo no^{acompanhamento de cinco anos 16}. A medição multicêntrica confiável é, portanto, essencial para validar as^{plaquetas pos} de TF como biomarcador e para estender sua aplicação a ensaios clínicos prospectivos e registros do mundo real. A implementação futura de algoritmos automatizados de normalização e estratégias de autogate pode reduzir ainda mais o viés do operador e apoiar a análise descentralizada, mantendo a comparabilidade entre sites^22,23.

Em conclusão, esse fluxo de trabalho harmonizado oferece uma abordagem prática e reprodutível para a quantificação das^{plaquetas pos} TF por citometria de fluxo sanguíneo total em ambientes multicêntricos. Ao combinar procedimentos pré-analíticos padronizados, processamento simplificado de amostras e estratégias de harmonização de instrumentos, o protocolo permite uma comparação confiável entre locais das medições pos-plaquetas TF. Além de apoiar a avaliação das^{plaquetas pos} TF como biomarcador de risco trombótico, os princípios descritos aqui podem contribuir para esforços mais amplos de padronizar a citometria de fluxo plaquetário para aplicações de pesquisa translacional e clínica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Para anticorpos e diluição de amostra
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anticorpo monoclonal anti human CD41a usado como marcador da população de plaquetas; deve ser fornecido pelo Laboratório Central
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anticorpo monoclonal anti Fator de Tecido (CD142) humano; deve ser fornecido pelo Laboratório Central
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	No texto, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	No texto, software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Para extração de sangue
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	No texto, software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	No texto, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	No texto, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	No texto, software C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Para fixação de sangue total
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Para fixação de amostras
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Para transferência de amostras de sangue
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Para transferência de amostras de sangue
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Para transferência de amostras de sangue
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Necessário para aquisição do flow cytometer
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Para harmonização do flow cytometer
Vacutainer EDTA	BD	368857	Para coletar os primeiros 3 ml de sangue
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Para extração de sangue
Vacutainer one use holder	BD	364815	Para extração de sangue
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Para coleta de sangue