Caracterização funcional de parceiros pré e pós-sinápticos individuais no sistema nervoso central larvar de Drosophila usando CaMPARI

Summary

Este protocolo avalia a atividade sináptica funcional entre parceiros neuronais definidos in vivo no sistema nervoso central das larvas de Drosophila melanogaster , utilizando ferramentas geneticamente codificadas. Estimulação optogenética mediada por CsChrimson de neurônios sensoriais cIVda pré-sinápticos induz fotoconversão dependente de cálcio do CaMPARI em interneurônios pós-sinápticos da Bacia-4.

Abstract

Estudos com conectoma ampliaram muito o entendimento da conectividade sináptica nos sistemas nervosos de várias espécies. Enquanto a caracterização dos parceiros sinápticos usando microscopia eletrônica (EM) forneça informações anatômicas detalhadas, aspectos funcionais das redes neuronais exigem abordagens complementares. Estudos recentes em Drosophila revelaram não apenas o conectoma completo da larva, bem como o sistema nervoso central adulto masculino e feminino, mas também os componentes celulares das redes neuronais que regulam comportamentos específicos, como a rede nociceptiva larval. No estágio larvar do terceiro ínstar, os neurônios sensoriais multidendríticos de arborização dendrítica classe IV (nociceptores) estabelecem a maioria dos contatos sinápticos com interneurônios da Bacia-4. Para avaliar a relevância funcional dessas conexões anatômicas, o indicador de cálcio geneticamente codificado CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) foi empregado em larvas vivas e não dissecadas do terceiro ínstar como um repórter dependente da atividade para avaliar a conectividade sináptica entre neurônios cIVda e interneurônios da Bacia-4. CaMPARI é um indicador fluorescente ratiométrico cujo espectro de emissão muda em resposta a níveis elevados de cálcio intracelular. Sob condições de base, CaMPARI fluoresce em verde; Na presença de altas concentrações de cálcio e após exposição à luz de fotoconversão (~400 nm), ela muda irreversivelmente para fluorescência vermelha. Como o influxo de cálcio nos neurônios pós-sinápticos é uma característica marcante da ativação sináptica, a fotoconversão CaMPARI fornece uma leitura da sinalização sináptica funcional. Um método passo a passo é apresentado para imobilizar larvas do terceiro ínstar em uma lâmina de microscópio para ativação optogenética de nociceptores cIVda usando a canalrodopsina CsChrimson deslocada para o vermelho, combinada com fotoconversão simultânea de CaMPARI em neurônios da Bacia-4. A fotoconversão dependente de cálcio nos neurônios da Bacia-4, apesar dos movimentos internos e das mudanças no plano focal, fornece evidências funcionais de conectividade sináptica entre essas células. Isso serve como prova de princípio para o uso do CaMPARI em combinação com estimulação optogenética pré-sináptica em larvas intactas e não dissecadas de Drosophila .

Introduction

Identificar parceiros sinápticos precisos no sistema nervoso central (SNC) permite acompanhar a formação e o refinamento das conexões sinápticas durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Assim, os esforços têm se concentrado no uso da microscopia eletrônica volumétrica (EM) para reconstruir não apenas conectomas completos em poderosos organismos modelo genéticos como Caenorhabditis elegans ^1,2 e Drosophila melanogaster ^3,4,5, mas também volumes eletromagnéticos em escala milimétrica de cérebros complexos de mamíferos, incluindo o córtex visual^{primário do camundongo 6} e o córtex temporal^{humano 7}. Esses estudos fornecem uma visão única dos princípios organizacionais que fundamentam a conectividade sináptica no nível anatômico. No entanto, a caracterização funcional dos parceiros sinápticos fornece insights complementares sobre a conectividade neuronal e é necessária para validar achados anatômicos.

Drosophila oferece inúmeras vantagens para o estudo da conectividade neuronal, incluindo a disponibilidade de conectomas completos para a larva³, bem como para o sistema nervoso central adulto^{feminino 4} e^{macho 5}, além de circuitos neuronais bem caracterizados que regulam comportamentos previsíveis ^8,9,10. A rede nociceptiva larval representa um desses circuitos bem adequados para estudar a conectividade sináptica^{precisa 11}. A reconstrução EM dessa rede revelou parcerias sinápticas detalhadas necessárias para processar estímulos nociceptivos, levando ao comportamento característico de escape conhecido como rolamento^{nocifensivo 12,13}.

Dentro dessa rede, os neurônios de arborização dendrítica classe IV (cIVda)¹⁴ funcionam como nociceptores sensoriais primários responsáveis pela detecção da^{dor 11,12,13,15,16}. Seus corpos celulares e dendritos estão localizados periféricamente na parede corporal, enquanto seus axônios projetam-se na medula nervosa ventral larval (VNC⁾¹⁵. Dentro do SNC, os neurônios cIVda arborizam seus terminais axonais em um padrão estereotipado e formam a maioria de seus contatos sinápticos com os interneurônios da Bacia-4 11,12,13,17. Essa relação sináptica definida estabelece neurônios cIVda e interneurônios da Bacia-4 como um par ideal para avaliação funcional da conectividade sináptica in vivo. O desenvolvimento de métodos para analisar conexões funcionais entre parceiros sinápticos individualmente identificados facilitará a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e refinamento sinápticos, especialmente em sistemas geneticamente tratáveis com circuitos neurais estereotipados.

CaMPARI (Integrador Ratiométrico Fotoativable Modulado com Cálcio)¹⁸ é um indicador fluorescente radiométrico geneticamente codificado cujo espectro de emissão se desloca em resposta a níveis elevados de cálcio intracelular. Sob condições de base, CaMPARI fluoresce em verde; Na presença de altas concentrações de cálcio e após exposição à luz de fotoconversão (~400 nanômetros (nm)), ele se converte irreversivelmente em fluorescência^{vermelha 18}. Como o influxo de cálcio nos neurônios pós-sinápticos é uma característica da ativação sináptica, a fotoconversão CaMPARI fornece uma leitura da sinalização sináptica^{funcional 19,20}.

Além do CaMPARI, a atividade neuronal pode ser visualizada usando sensores reversíveis, como indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), incluindo GCaMP ou^{RCAMP 21}, assim como indicadores de voltagem geneticamente codificados (^GEVIs)22 , como Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ ou VARNAM²⁵. Embora esses sensores rápidos e reversíveis sejam bem adequados para monitorar atividade transitória em tempo real, eles são suscetíveis a artefatos de movimento durante imagens in vivo . Em contraste, as propriedades integrativas e irreversíveis de fotoconversão do CaMPARI permitem a captura da atividade em uma janela de tempo definida, possibilitando a detecção da ativação neuronal mesmo quando os planos focais se deslocam durante a imagem²⁰. Além disso, a fotoconversão CaMPARI pode ser ajustada ajustando a intensidade da luz violeta, permitindo a detecção de redução da força sináptica ou entradas^{sublimiares 26}. Essas propriedades permitiram o mapeamento de atividade em animais em movimento livre sem fixação ou amarramento da cabeça, incluindo estudos no córtex de^{camundongo 27}, cérebro de peixe-zebra²⁸, C. elegans²⁹ e Drosophila^{adulta 20}.

Um protocolo é descrito para visualizar parceiros sinápticos funcionais via fotoconversão CaMPARI combinada com estimulação optogenética pré-sináptica usando microscopia confocal em larvas de Drosophila intactas e não dissecadas. Nessa abordagem, o CaMPARI é usado para detectar o influxo pós-sináptico de cálcio em interneurônios da Bacia-4 após a ativação optogenética de neurônios cIVda em larvas vivas do terceiro estágio. Os neurônios cIVda expressam a canalrodopsina ativada pela luz vermelha CsChrimson ^30,31, enquanto os interneurônios da Bacia-4 expressam CaMPARI. A exposição à luz vermelha ativa seletivamente os nociceptores, imitando um estímulo nociceptivo de forma temporalmente^{controlada 16,30}. Essa estratégia permite avaliar se a ativação pré-sináptica induz a fotoconversão CaMPARI dependente de cálcio em neurônios pós-sinápticos, fornecendo assim evidências funcionais da conectividade sináptica.

Diversas vantagens técnicas apoiam o uso do CaMPARI em combinação com o CsChrimson para análise da conectividade cIVda–Bacia-4. Primeiro, os dendritos cIVda formam um mosaico completo e não sobreposto da parede corporal^{larval 32}, permitindo a ativação optogenética de neurônios sensoriais intactos sem efeitos de confusão causados por danos induzidos^{por dissecação 16}. Segundo, embora as larvas estejam fisicamente imobilizadas em uma lâmina de microscópio, movimentos internos frequentemente alteram a posição do SNC e o plano focal durante a imagem; A fotoconversão CaMPARI é menos sensível a esses artefatos de movimento e fornece uma leitura estável e integrada no tempo da atividade neuronal. Terceiro, as propriedades integrativas e ajustáveis do CaMPARI permitem a detecção da atividade sináptica mesmo quando a força sináptica ou o número de contato são reduzidos, como durante estágios iniciais do desenvolvimento, apoiando assim estudos futuros sobre formação e refinamento das sinaptes.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo Drosophila melanogaster foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais. O genótipo w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (obtido ao recombinar RRID:BDSC_54899¹² e RRID:BDSC_32079¹⁶) foi usado para impulsionar a expressão optogenética e CaMPARI (usando a linha w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo obtido pela recombinação de RRID:BDSC_81085 com marcadores do segundo cromossômico) em parceiros pré e pós-sinápticos, respectivamente. As ferramentas de pesquisa usadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação das larvas

1. Estabelecer cruzamentos genéticos entre fêmeas virgens UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) e machos de uma linha de moscas contendo dois sistemas binários, por exemplo, com o neurônio pré-sináptico de interesse impulsionando a expressão de GAL4 e o neurônio pós-sináptico de interesse impulsionando^{LexA 33,34}.
2. Coloque cruzamentos genéticos em frascos plásticos contendo meio padrão de ágar de farinha de milho 35,36,37,38, suplementado com 0,5 mM de retinal all-trans (ATR) para ativação de^{CsChrimson 30,33}. Prepare frascos paralelos sem ATR como controles sem ATR.
   NOTA: Derreta o meio de ágar de farinha de milho sem ferver. Deixe esfriar sem solidificar. Prepare uma solução de ATR de 40 mM (ATR em pó diluído em etanol a 95% conforme as instruções do fabricante), depois dilua para 0,5 mM no meio e misture bem.
3. Cubra completamente os frascos com papel alumínio para evitar exposição à luz.
   NOTA: Mantenha condições de criação em escuridão constante devido à natureza sensível à luz da ATR e para evitar ativação neuronal não intencional. Embora o CsChrimson seja mais sensível à luz vermelha (590–680 nm), ele também pode ser ativado por outros comprimentos de onda^{visíveis 31,39}.
4. Incubar frascos a 25 °C e elevar as larvas para o terceiro estágio de instar.

2. Imobilização larvara

1. Colete uma larva de terceiro estágio usando um pincel. Lave as larvas em uma placa micro pontual de três poços contendo 0,1 M PBS para remover o alimento.
   NOTA: Não remova o excesso de PBS; Ajuda a manter a hidratação.
2. Coloque uma pequena quantidade de argila de modelar em cada canto de uma capa limpa (18 × 18 mm). Coloque a larva em uma gota de PBS no coverslip e permita que ela se oriente com o lado ventral para baixo.
   NOTA: Para imagens da medula nervosa ventral (VNC), monte-se a larva em seu lado dorsal de modo que a superfície ventral entre em contato com o revestimento. Essa orientação permite que interneurônios da Bacia-4 no VNC fiquem voltados para o objetivo através do coverslip.
3. Coloque uma lâmina limpa no microscópio sobre a cobertura contendo a larva.
4. Fixe a cobertura aplicando mais argila de modelar nos cantos. Aplique pressão suficiente para imobilizar a larva evitando a ruptura da larva ou o coverslip.

3. Fluxo de trabalho de estimulação, fotoconversão e imagem

1. Adquira um conjunto z-stack de neurônios pós-sinápticos expressando CaMPARI usando canais simultâneos verdes (488 nm, 0,8% de potência do laser) e vermelhos (~561 nm, 0,8% de potência do laser). Use um passo Z de 1 μm, resolução de 256 × 256 pixels, média de linha de 2, varredura bidirecional e velocidade de varredura de 9 em um microscópio confocal equipado com objetivo 40×/1,2. Realize todas as imagens em um ambiente escuro. Mantenha parâmetros idênticos da pilha z durante todo o experimento.
   NOTA: Espere corpos celulares verdes brilhantes em posições estereotipadas no VNC larval e nenhuma fluorescência vermelha detectável no início do jogo.
2. Estimule a larva continuamente por 30 s usando luz de fotoconversão simultânea (405 nm, 0,5% de potência do laser) e luz de estimulação optogenética (594 nm, 0,8% de potência do laser).
3. Adquira um z-stack pós-estimulação usando os mesmos parâmetros do passo 3.1 sob canais vermelho (~561 nm) e verde (488 nm). Espere corpos de células VNC em posições semelhantes às do ponto de partida. Detectar fluorescência vermelha de CaMPARI em neurônios ativados durante a estimulação em larvas alimentadas com ATR, com fotoconversão mínima em controles sem ATR.
   NOTA: Fluxo de trabalho e parâmetros são resumidos na Figura 1.

Figura 1: Fluxo de trabalho para estimulação, fotoconversão (PC) e imagem. Três fases sequenciais de imagem foram usadas para avaliar a atividade do cálcio nos neurônios da Bacia 4. Durante a fase inicial, z-stacks foram adquiridos usando lasers de 488 nm e 561 nm para capturar a fluorescência verde e vermelha do CaMPARI antes da estimulação. Durante a fase de estimulação, os neurônios cIVda foram ativados optogeneticamente via CsChrimson (594 nm), enquanto a iluminação simultânea de 405 nm fotoconverteu CaMPARI ativo de fluorescência verde para vermelha; Nenhuma imagem foi realizada durante esse período de 30 anos. Durante a fase pós-estimulação, os z-stacks foram readquiridos usando as mesmas configurações de laser do início para detectar sinais vermelhos fotoconvertidos nos corpos celulares da Bacia-4. Todas as pilhas z foram adquiridas a 256 × 256 pixels com passos Z de 1 μm, média de linha de 2 e varredura bidirecional em condições de escuridão usando um microscópio confocal equipado com um objetivo de 40×/1,2 NA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Análise de imagem

1. Abra imagens z-stack em Fiji (RRID:SCR_002285) com Bio-Formatos ativados. Defina a visualização de pilha para Hyperstack, o modo de cor para Composto e ative a escala automática. Role pelos planos Z e selecione o plano com foco ideal. Duplique o plano selecionado (Imagem → Duplicar; Canais: 1–2; Z-plane selecionado).
2. Divida os canais vermelho e verde (Imagem → Cor → Canais Divididos).
   NOTA: Ajuste o brilho e o contraste usando o Image → Ajuste → Brilho/Contraste → Auto para ambos os canais.
3. Subtraia fundo de ambos os canais (Processo → Subtrair Fundo) usando um raio de bola rolante de 50 px.
4. Configure medições (Analise → Conjunto de Medições) para incluir Área, Valor médio de cinza, Densidade integrada (IntDen), desvio padrão e valores de cinza Mínimo e Máximo.
5. Desenhe regiões de interesse (ROIs) ao redor de cada célula no canal verde usando a ferramenta à mão livre. Adicione ROIs ao Gerenciador de ROI e meça. Aplique os mesmos ROIs ao canal vermelho e meça.
6. Registre todas as medições em uma planilha, incluindo identificadores de larvas e células.
   NOTA: Realize medições tanto para imagens pré quanto pós-estimulação.
7. Calcule as razões de fluorescência vermelho-verde usando valores de densidade integrados para obter (R/G)_post e (R/G)_pre para cada célula. Valores médios em nível celular por larva.
   NOTA: A Densidade Integrada (Área × Média) permite a comparação entre células de diferentes tamanhos.
8. Calcule Δ(R/G) como (R/G)_post − (R/G)_pre usando médias larvais. Interprete valores positivos de Δ(R/G) como aumento da atividade pós-sináptica do cálcio durante a fotoconversão.
   NOTA: Valores negativos de Δ(R/G) podem surgir de ruído ou assimetria de fundo. Defina valores negativos para 0. Neste conjunto de dados de dados, uma larva apresentou um valor negativo (−0,008), que foi definido como 0.

Results

Seguindo esse protocolo, a conectividade funcional entre neurônios cIVda e interneurônios da Bacia-4 foi avaliada em larvas vivas e não dissecadas de D. melanogaster do terceiro estágio, usando CaMPARI (Figura 2). Antes de qualquer estimulação com luz de fotoconversão (PC) ou ativação optogenética, os interneurônios da Bacia-4 apresentavam fluorescência verde devido à expressão citosólica de CaMPARI (Figura 2A). Nenhuma fluorescência vermelha foi detect...

Discussion

O protocolo descrito aqui permite a avaliação qualitativa e quantitativa da conectividade sináptica entre parceiros sinápticos definidos em larvas intactas de D. melanogaster . Essa abordagem utiliza a combinação da estimulação optogenética de neurônios sensoriais cIVda com a visualização baseada em CaMPARI de interneurônios pós-sinápticos ativados da Bacia-4 para monitorar a atividade sináptica no sistema nervoso central (SNC) de larvas não dissecadas. Aplicações anteriores de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Produto químico usado na solução para hidratar e montar larvas
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Produto químico adicionado à comida para ativar ferramentas optogenéticas
Microscópio confocal	ZEISS	LSM900 Confocal	Microscópio confocal, Lente objetiva (40×/1.2 NA), Fonte de luz/laser (405, 488, 561 nm)
Lâminas de cobertura (18x18mm)	VWR	48366-205	Usado para montar animais para imagens
Álcool etílico (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Usado como solvente para o pó ATR
Fiji (ImageJ)	Código aberto	RRID:SCR_002285	Usado para análise de imagens
Prism versão 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Usado para análise estatística
Lâminas de microscópio	VWR	48300-041	Usado para montar animais para imagens
Massa de modelar	Flinn scientific	FB0600	Usado para segurar o slide de vidro no slide do microscópio com larvas no meio
Pincel	Genesee scientific	59-204	Usado para transferir larvas entre locais
Meio padrão de ágar de fubá	Genesee scientific	66-123	A comida também pode ser preparada usando receitas e ingredientes padrão semelhantes
Vidro padrão de Drosophila (frasco estreito de Drosophila de 25mm x 95mm)	Genesee scientific	32-109	Frascos ou garrafas grandes também podem ser usados
Prato de micro manchas de três poços	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Prato usado para separar e limpar larvas individuais
Estoque de Drosophila (genótipo: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Obtido pela recombinação de RRID:BDSC_54899 e RRID:BDSC_32079
Estoque de Drosophila (genótipo: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Obtido pela recombinação de RRID:BDSC_81085 com marcadores do segundo cromossomo